【目的】为避免未知基因和遗传背景等不可控因素对育种实践的影响,将高通量SNP分型技术与传统育种相结合,培育新品种,以提高育种效率,实现育种方法的改进,为优质食味稻米新种质的鉴定和创制方法提供参考。【方法】以鉴真2号和鄂中5号为亲本,通过杂交、回交及系谱法选育,在BC₁F₂—BC₁F₄群体开展稻米品质分析评价,至BC₁F₇初步选定优良株系4W1-056,进一步利用捕获测序的方法,对鉴真2号、鄂中5号及66个4W1-056单株中的68个DNA片段进行PCR扩增,并测序,分析908个SNP位点。基于SNP位点的基因型,采用p-distance方法,使用MEGA7软件进行系统进化分析。结合系统进化分析、农艺性状和稻米品质的鉴定,对新品系的选育和鉴定进行评价。【结果】经杂交、回交和自交获得株型好、分蘖力强、茎秆粗壮、抗倒性好、外观品质优的稳定优良株系4W1-056。系统进化分析表明,从4W1-056优良株系中筛选的66个单株分成3个类群：类群Ⅰ、类群Ⅱ和类群Ⅲ。3个类群之间的碱基替代率为0.1398,类群Ⅰ和类群Ⅱ之间的碱基替代率为0.0662,而在各类群内的碱基替代率为0,表明同一类群内的单株没有遗传差异。结合农艺性状和稻米品质的鉴定,将类群Ⅱ作为新的品系,命名为ZY56,与4W1-056相比,其外观品质更好,垩白度为0.9,更接近鄂中5号。利用水稻8K SNP芯片检测ZY56及2个亲本（鉴真2号和鄂中5号）,显示ZY56有14.13%的染色体片段来源于鉴真2号,85.87%的染色体片段来源于鄂中5号,进一步说明ZY56的主要基因源于鄂中5号,验证了杂交、回交和自交后的选择结果。特征特性研究结果显示,ZY56完成基本营养生长所需要的最低有效积温为760.5℃,生殖生长的临界光照长度为14 h 13 min,完成幼穗分化需要的有效积温高于711.5℃。不同播期的品质分析结果表明,ZY56对光照长度的反应明显弱于鄂中5号,但生长平稳,有利于稻米品质的形成,表明ZY56的稻米品质具有更好的稳定性。【结论】在资源创制高代选择中,利用高通量SNP分型技术进行遗传一致性筛选,将通过农艺性状测定等常规方法难以细分的材料进行类群细分,最终确定符合目标要求的株系。该方法克服了传统系谱法在高世代选择中针对农艺性状难以继续选择的困难,避免了同类单株重复选择和不同类单株漏选的问题,降低了高世代选择工作量,提高了选择效率,具有推广价值。

【目的】基因拷贝数变异是一种常见又重要的基因结构变异,往往影响个体表型。低分子量麦谷蛋白（low-molecular-weight glutenin subunit,LMW-GS）是小麦贮藏蛋白的主要组成部分,位于Glu-3位点。小麦作为异源六倍体,其庞大且复杂的基因组结构导致难以利用传统方法检测目的基因的拷贝数,针对小麦基因组,筛选可靠稳定的内参基因和体系,探索适合复杂基因组的拷贝数变异测定技术,测定Glu-3位点LWM-GS基因拷贝数。【方法】以Acc1为内参基因,根据基因序列设计内参引物和探针,通过定性和定量PCR测定内参基因在12个普通小麦品种中的拷贝数,分析该基因拷贝数在不同品种间的稳定性;又以小麦品种篙优2018的5个稀释浓度的基因组DNA为模板,利用qRT-PCR验证Acc1内参系统的重复性和准确性;根据Glu-A3位点LMW-GS基因序列设计特异性引物及探针,利用qRT-PCR和ddPCR 2种方法检测8个小麦品种Glu-A3位点基因拷贝数,比较后选择更优的高通量基因拷贝数检测方法;再根据Glu-B3和Glu-D3位点LMW-GS基因序列设计相应的特异性引物及探针,并利用ddPCR技术检测和分析了231份小麦品种的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上LMW-GS基因拷贝数。【结果】Acc1在12个普通小麦品种间、同一品种5个DNA稀释浓度间的拷贝数测定结果一致,技术重复间的变异系数仅为0.07%—0.77%,所构建的Acc1内参系统稳定;比较qRT-PCR和ddPCR 2种拷贝数检测方法,8个品种所测的Glu-A3位点拷贝数结果一致,分别为3、5、3、4、3、3、3和3;且ddPCR检测重复间的变异系数为0.30%—1.67%,远低于qRT-PCR的3.14%—12.72%,更加可靠;利用ddPCR对231份普通小麦品种的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上LMW-GS基因拷贝检测后分析发现,大多数小麦品种在3个位点上的拷贝数为4,所占频率分别为51.95%、32.03%和28.57%,Glu-3位点总拷贝数变异范围为10—21,变异系数为16.12%。【结论】Acc1内参系统具有良好的稳定性和重复性,可以用作小麦Glu-3位点和其他目的基因拷贝数检测的内参;qRT-PCR和ddPCR均可用于小麦基因拷贝数的检测,但后者更稳定、可靠,且操作简单、检测通量高。

【背景】大豆是重要的经济作物,能够为人类提供大量的植物蛋白和油脂。大豆在生长过程中,能够与根瘤菌形成共生体系进行共生固氮,该形式的共生固氮能够将空气中的氮气还原成氨,为大豆生长发育提供丰富氮源。根瘤菌Ⅲ型分泌系统是根瘤菌中重要的蛋白分泌结构,能够通过分泌Ⅲ型效应因子在共生体系建立过程中发挥重要调控作用。根瘤菌rhcN编码一种ATP转移酶,是根瘤菌Ⅲ型分泌系统的重要组成部分,能够保障根瘤菌Ⅲ型效应因子向宿主细胞的正常分泌。【目的】探索rhcN突变情况下对根瘤菌结瘤能力的影响,提高大豆-根瘤菌共生体系的固氮效率,为大豆农业生产提供必要的参考和支持。【方法】通过三亲杂交和同源重组,在rhcN起始密码子ATG下游插入了一个Km抗性基因,利用PCR扩增和Southern blot对插入情况进行验证,从而构建rhcN插入突变体HH103ΩrhcN。利用大豆染料木苷（Genistin）对野生型根瘤菌HH103及HH103ΩrhcN突变体进行诱导,并对处理组合对照组进行胞外蛋白纯化,通过Western blot检测rhcN突变对根瘤菌III型效应因子NopC及NopT分泌的影响。利用双层钵植物培养系统对大豆Williams82进行野生型根瘤菌HH103和HH103ΩrhcN突变体接种,分析rhcN突变对根瘤表型的影响。利用前期收集的100份基因型差异的大豆品种进行结瘤能力鉴定,分析根瘤菌Ⅲ型效应因子分泌异常情况下在不同基因型大豆品种中的结瘤表现。【结果】通过PCR扩增和Southern blot验证了成功构建的HH103ΩrhcN突变体,胞外蛋白鉴定表明rhcN突变能够抑制根瘤菌Ⅲ型效应因子NopC和NopT分泌。利用HH103ΩrhcN突变体和野生型HH103在Williams82进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够显著抑制根瘤数和根瘤干重。对100份基因型差异的大豆品种进行结瘤鉴定,结果表明,rhcN突变能够引起其中80份大豆资源根瘤数目降低,13份根瘤数目显著升高,7份不发生显著性变化。【结论】rhcN突变能够引起根瘤菌Ⅲ型效应因子的异常分泌,进而能够影响共生体系的建立。根瘤菌III型效应因子在大豆-根瘤菌共生体系形成过程中发挥着重要作用,并且不同基因型大豆遗传背景对根瘤菌Ⅲ型效应因子具有不同应对反应。

棉花是一种重要的经济作物,棉花优质高产高效生产对于我国具有战略意义。棉花生长发育模拟模型从棉花的内部生理过程、外部形态结构及其与生长环境的动态交互出发,实现作物生长发育和产量品质形成过程的动态描述和精确模拟,为棉田生产管理措施的优化决策提供了极大的帮助和便利。本文在综合介绍棉花生理生态过程模型、棉花形态结构模型和棉花功能-结构模型的技术原理、组成结构和功能特点的基础上,深入探讨了棉花生长发育模拟模型在国内外研究进展,对棉花生长发育模型在我国棉花生长发育和产量形成、灌溉优化、施肥决策、病虫害管理及棉花生产区域系统评估方面的应用现状进行了系统介绍。根据我国棉花生产的实际情况,结合我国农业信息化发展方向,从模型的本地化研究、尺度提升及其推广示范方面为我国棉花生长发育模拟模型研究、发展和应用提出了建议,以期进一步推动我国棉花产业的现代化发展。

【目的】明晰栽培条件互作对谷子叶片光合特性、茎秆生物力学性质指标的耦合影响,为运用谷子茎秆生物力学性质进行抗倒伏特性评价,为优化谷子种植栽培条件及抗倒伏优种筛选提供合理农艺措施和理论支持。【方法】采用裂区试验设计方法,主区选取4个在生产中具有代表性的谷子品种,副区为基于不同的播种密度与施肥量、播种密度与水分、水分与施肥量互作处理栽培条件,系统研究了栽培措施对谷子生长发育以及茎秆抗倒伏生物力学性质的影响。【结果】（1）除水分对谷子茎秆节平均直径影响不显著外,谷子品种、施肥量、播种密度及水分4个因素对谷子的产量、光合生理特性及茎秆形态特性均有极显著影响（P＜0.001）;（2）谷子的千粒重、产量均随施肥量和水分的增加而增加;随播种密度的增加,千粒重呈下降趋势,产量呈现先上升后下降趋势;谷子旗叶SPAD值及最大荧光值（Fm）开花期显著高于灌浆期,开花期旗叶SPAD值、灌浆期旗叶Fm可作为谷子育种的目标性状;（3）播种密度对谷子田间倒伏率的影响最大,其次是水分、品种,施肥量的影响最小;（4）谷子茎秆倒数第二节的抗拉倒力与株高、节平均长度及茎秆节含水率显著负相关,与节平均直径显著正相关。【结论】不同农艺措施互作栽培条件下,单因子对谷子的产量、植株光合生理特性及茎秆力学性能影响最大;选择优良品种、合理密植（≤70万株/hm²）、适当水肥是提升谷子籽粒品质、增加产量、减少田间倒伏率的有效措施。

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的dsRNA,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsRNA,浸润本氏烟（Nicotiana benthamiana）,24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总RNA和蛋白质,以CP基因mRNA水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsRNA对TMV的抑制效果。同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）上的过敏性坏死反应（hypersensitive necrosis reaction）,通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsRNA,筛选出高效抑制TMV的dsRNA片段。为了获取大量的dsRNA,将dsRNA对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至RNase III缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）HT115（DE3）中,并对原核表达制备的dsRNA喷施烟草后生成的siRNA进行深度测序,比较外源施用dsRNA后,对TMV侵染的small RNA表达特征和富集带的影响。【结果】筛选出高效影响TMV CP基因表达的dsRNA RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的dsRNA的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsRNA,菌液中提取的dsRNA喷施于烟草上对TMV的防治效果显著。TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少。小RNA测序结果显示TMV侵染引起的RNAi过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生siRNA,而外源性dsRNA的浸润会引起靶向区域siRNA的富集,siRNA反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsRNA的施用能够引起siRNA表达丰度的变化。【结论】通过比较dsRNA介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsRNA序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsRNA能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量。同时构建了RdRP1461-1774基因的dsRNA原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsRNA在植物病毒方面的防治应用打下了基础。

【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL^-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL^-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVY^N及PVY^O样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。

【目的】热激蛋白（heat shock protein,HSP）是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质,在生物抗逆过程中发挥重要作用。当生物体遭受不利环境条件胁迫时,其迅速产生可保证生物体的正常生理活动。本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,对其热激蛋白HSP70基因（Ld-hsp70）进行克隆,并对其在温度胁迫下的表达特性进行分析,明确HSP70在马铃薯甲虫温度胁迫中的作用。【方法】基于NCBI数据库检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列,利用RT-PCR和RACE技术对Ld-hsp70的全长cDNA进行克隆;利用DNAMAN软件对其全长序列进行拼接;采用生物信息学方法对Ld-hsp70及其编码氨基酸的序列特性进行分析;使用MEGAX软件的邻接法（neighbor-joining,NJ）构建马铃薯甲虫HSP70与其他昆虫HSP70的系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对Ld-hsp70在不同温度胁迫条件下的表达模式进行分析;利用Primer 5.0软件设计试验所用的特异性引物。【结果】基于NCBI数据库获得3类马铃薯甲虫HSP70 cDNA序列,分别命名为HSP70a、HSP70b和HSP70c,经克隆、拼接获得其全长序列,分别命名为Ld-hsp70a、Ld-hsp70b和Ld-hsp70c,GenBank登录号分别为KC544268、KC544269和KC544270。序列分析表明,3个Ld-hsp70编码的氨基酸序列均包含了完整保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列,且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序。Ld-hsp70a和Ld-hsp70c的氨基酸C末端具有保守基序EEVD,属于胞质型热激蛋白;Ld-hsp70b的氨基酸C末端具有保守基序KDEL,属于内质网型热激蛋白。系统进化树分析显示,Ld-hsp70a和Ld-hsp70b与其他物种的HSP70分别聚为一支,Ld-hsp70c与已报道的马铃薯甲虫HSP70聚为一支。其中,Ld-hsp70a与龟纹瓢虫（Propylaea japonica）的Pj-hsp70,Ld-hsp70b与稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）的Lo-hsp70,Ld-hsp70c与大猿叶甲（Colaphellus bowringi）的Cb-hsp70同源性最高。qRT-PCR结果表明,高、低温均能诱导马铃薯甲虫雌、雄成虫的3个Ld-hsp70的表达。不同温度胁迫处理1 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫体内3个Ld-hsp70的相对表达量未见显著变化;而4 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫Ld-hsp70a的相对表达量与对照相比分别在低温-10℃和高温44℃时显著上调至2.24和2.41倍,Ld-hsp70b和Ld-hsp70c相对表达量在胁迫4 h后与对照相比差异均不显著。另外,无论是雌虫还是雄虫,3个Ld-hsp70的相对表达量在同一温度不同的胁迫处理时间之间均无显著差异。【结论】Ld-hsp70a可以响应高、低温胁迫,可能在马铃薯甲虫抵御温度胁迫中发挥作用,而Ld-hsp70b和Ld-hsp70c对高、低温均不敏感,表明马铃薯甲虫3个Ld-hsp70在抗温度胁迫中发挥不同的作用。

【目的】探究添加秸秆对不同耕作措施下土壤有机碳及其相关因素的影响,为北方旱作农田固碳增产管理提供理论依据。【方法】采集长期进行传统耕作（CT）和免耕（NT）的大田土壤样品进行室内培养试验,共设置4个处理,分别为传统耕作土壤不加秸秆（CT）、免耕土壤不加秸秆（NT）、传统耕作土壤加秸秆（CTS）和免耕土壤加秸秆（NTS）,每个处理15次重复。在25℃恒温培养箱中进行通气培养,培养时间共180 d,此间定期取样进行有机碳含量、水稳性团聚体构成、土壤微生物量碳和相关土壤酶活性的测定。【结果】（1）添加秸秆显著提高土壤有机碳含量和大团聚体含量。与CT相比,CTS提高土壤有机碳含量15%—46%;与NT相比,NTS提高土壤有机碳含量12%—21%;培养结束时,CTS、NTS处理的有机碳含量较初始分别提高26.8%和7.0%。CTS和NTS处理以2 000—250 μm团聚体含量最高,占全部团聚体的41%—50%,CTS较CT提高>250 μm团聚体比例235%—310%,NTS较NT提高>250 μm团聚体比例96%—149%。（2）添加秸秆显著增加土壤有机碳δ¹³C值,CTS处理为80.93‰—115.22‰,NTS为48.92‰—80.49‰;CTS秸秆来源碳所占比例显著高于NTS,较NTS处理提高13%—66%。（3）添加秸秆显著提高微生物量碳（MBC）含量、β-葡萄糖苷酶（BG）、β-纤维二糖苷酶（CBH）和β-木糖苷酶（BXYL）活性。CTS较CT提高MBC含量239%—623%,提高BG、CBH和BXYL活性58%—170%、52%—337%和117%-170%;NTS较NT处理提高MBC含量124%—555%,提高BG、CBH和BXYL活性28%—181%、4%—304%和13%—118%。（4）土壤有机碳含量与BG、CBH和BXYL活性、MBC及>2 000 μm、2 000—250 μm团聚体比例呈显著正相关关系,与250—53 μm、＜53 μm团聚体比例呈显著负相关关系;BG、CBH、BXYL 3种酶活性彼此之间表现为极显著正相关关系,且均与MBC、>2 000 μm团聚体、2 000—250 μm团聚体显著正相关,与＜53 μm团聚体极显著负相关。线性相关分析结果表明水稳性大团聚体（>250 μm）可解释有机碳变化的48%,MBC可解释有机碳变化的45%,BG、CBH和BXYL酶活性分别可解释有机碳变化的66%、44%、53%。【结论】添加秸秆可显著提高土壤有机碳和大团聚体含量,促进微生物数量增加和土壤酶活性增强,且对传统耕作土壤有机碳及其相关因素的影响更大,有机碳在土壤中的固定除了受团聚体物理保护外,还受土壤中微生物作用的调节。

【目的】研究玉米不同生育时期长期不同施肥处理下土壤微生物量磷（MBP）的动态变化与周转特性,探究长期施用磷肥和有机肥对土壤磷转化与供应能力的影响。【方法】依托贵阳黄壤肥力长期定位试验,选取不施肥（CK）、氮钾化肥（NK）、氮磷钾化肥（NPK）、有机肥（M）、1/2有机肥+1/2氮磷化肥（0.5MNP）、全量有机肥+全量氮磷钾化肥（MNPK）6个处理,在玉米播种前、苗期、拔节期、开花期、收获后分别采集0—20 cm土层样品,测定土壤微生物量磷含量、有效磷含量、酸性磷酸酶活性,并计算微生物量磷周转期和周转量。【结果】与NK处理相比,施用磷肥和有机肥各处理土壤微生物量磷（MBP）和微生物含磷量（MPC）分别显著提高了123.9%—446.2%和85.0%—268.2%,均以MNPK处理增幅最大。施磷量基本一致的条件下,M和0.5MNP处理MBP含量较NPK处理显著提高了26.7%—32.7%;NK处理MBP和MPC含量均在开花期最低,施用磷肥和有机肥各处理MBP含量在玉米生长期均较高,MPC含量则随生育时期变化呈“双峰”曲线,苗期和开花期最高;与CK相比,NK处理MBP周转期缩短了405 d,MBP周转量提高了50.9%。与NK处理相比,施用磷肥和有机肥各处理MBP周转量提高了19.2%—156.4%,MBP周转期延长了248—391 d,说明施用磷肥和有机肥可不同程度增加MBP库容并降低其周转速率;施用磷肥和有机肥各处理土壤有效磷和植株吸磷量分别是NK处理的3.63—7.27倍和1.77—1.97倍;各处理酸性磷酸酶活性表现为NK处理>M、MNPK处理>CK、NPK、0.5MNP处理,NK处理较其他处理显著提高了10.2%—21.0%;相关分析表明,土壤有效磷是MBP及其周转量最重要的影响因子,而酸性磷酸酶活性则是MBP周转期最重要的影响因子。【结论】MBP可反映黄壤磷素的供应水平,MBP含量及其周转对于提高黄壤潜在供磷能力具有重要意义,长期施用磷肥和有机肥可提高土壤MBP周转库容,增强土壤磷素转化和供给能力,提高玉米植株吸磷量。

【目的】miR172是植物生长发育的重要调节因子,阐释vvi-miR172s及其靶基因应答赤霉素在葡萄果实不同组织发育过程中的作用,从miRNA角度认识GA调控葡萄果实发育的作用机制。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄为材料,以miR-RACE和PCR技术克隆vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,由psRNA Target软件预测vvi-miR172s的靶基因;利用RLM-RACE技术验证vvi-miR172s剪切靶基因的裂解作用及其作用位点;采用生物信息学软件对靶基因、靶蛋白进行系统进化、序列结构分析及亚细胞定位预测;通过在线软件PLANTCARE进行启动子作用元件分析;通过qRT-PCR和芯片数据分析vvi-miR172s和靶基因在不同器官、不同发育阶段的基因表达图谱,以及应答GA₃在果实不同组织中的时空表达模式。【结果】克隆鉴定了vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,预测到VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2和VvRAP2-3四个靶基因,验证到裂解产物及其裂解位点,证明它们为vvi-miR172s的真实靶基因。序列结构分析显示,VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均含有10个外显子和9个内含子,其motif元件的种类和数量相似,均含有两个排列顺序相近的AP2蛋白结构域,表明其结构和功能具有一定的保守性;且VvAP2、VvRAP2-1和VvRAP2-2与杨树的亲缘关系较近,VvRAP2-3与大豆具有较高的同源性;靶基因蛋白二级结构均为α-螺旋,可进一步折叠为稳定的三级结构;4个靶蛋白亚细胞定位主要位于细胞核内。启动子作用元件分析发现vvi-miR172c和VvRAP2-1中含有赤霉素响应元件,表明它们可能响应赤霉素调控葡萄生长发育;芯片数据分析显示vvi-miR172c和靶基因的表达模式具有组织或器官特异性,且它们之间呈现一定的负相关,表明它们之间存在负调控作用;RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,果皮中vvi-miR172a/b/d呈下降的表达趋势,而靶基因VvRAP2-1的表达模式相反,表明vvi-miR172a/b/d对VvRAP2-1负调控;果肉中vvi-miR172d的表达水平降低,而靶基因VvAP2的表达水平增加,表明vvi-miR172d与VvAP2呈负相关性。另外,GA₃处理改变了vvi-miR172s的靶模式,增强了果肉和果皮组织中vvi-miR172d与VvRAP2-1的负相关性,同时诱导了vvi-miR172c对VvAP2/VvRAP2-2/VvVvRAP2-3的负调控作用。【结论】VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均为葡萄miR172a/b/c/d的真实靶基因,vvi-miR172家族可能通过vvi-miR172a/b/d和vvi-miR172d分别介导靶基因VvRAP2-1和VvAP2调控果皮和果肉组织的发育过程,而vvi-miR172c和vvi-miR172d及其靶基因可能是GA调控葡萄果皮与果肉组织发育的主要作用因子。

【目的】利用胚挽救技术创制抗寒无核葡萄新种质,为选育抗寒无核葡萄新品种奠定基础。【方法】分别以抗寒欧美杂交无核葡萄品种‘Jupiter’和欧山杂种有核优系‘00-1-5’（‘玫瑰香’ב山葡萄黑龙江实生’）为父本,5个欧亚种无核品种‘Ruby Seedless’‘秦红1号’‘秦红2号’‘Crimson Seedless’和‘秦秀’为母本杂交,在各母本最佳胚珠取样时期取样,以固-液双相培养基MM3和ER分别作为胚发育培养基进行胚珠培养,比较不同母本和2种培养基对胚发育率、萌发率、成苗率及畸形苗率的影响;以WPM+0.2 mg?L^-1 6-BA+0.1 mg?L^-1 IAA固体培养基作为胚萌发培养基,获得胚挽救后代,经炼苗后移栽至田间;分别在2MS+0.2 mg?L^-1 6-BA+0.1 mg?L^-1 IAA培养基中添加0、1.0和1.6 mg?L^-1 ZnSO₄进行畸形苗转化正常苗培养,以筛选最适宜转化培养基;利用无核基因分子标记SCF27-2000对胚挽救后代进行无核性状分子检测。【结果】5个杂交组合的胚珠接种至MM3培养基的数量为2 158个,获得发育胚175个和胚挽救苗118株;接种至ER培养基的胚珠数为894个,获得发育胚74个和胚挽救苗58株。以‘00-1-5’为父本的2个杂交组合中,‘秦红2号’比‘秦秀’更适合作为母本,其杂种胚的发育率和成苗率最高,分别为17.04%和7.41%;以‘Jupiter’为父本的3个杂交组合中,‘Ruby Seedless’בJupiter’效果最好,胚发育率和成苗率分别为13.71%和10.67%,其次是‘秦红1号’בJupiter’,胚发育率和成苗率分别为14.39%和4.71%,而‘Crimson Seedless’בJupiter’胚发育率和成苗率最低,分别为9.55%和1.76%。接种至MM3培养基的胚珠,获得的胚发育率和成苗率均高于ER培养基。畸形苗率最高的是‘秦红1号’בJupiter’,而‘Ruby Seedless’בJupiter’未出现畸形苗,ER培养基比MM3培养基形成的畸形苗率高。‘秦红2号’ב00-1-5’组合畸形苗接种至2MS+1.6 mg?L^-1 ZnSO₄+0.2 mg?L^-1 6-BA+0.1 mg?L^-1 IAA转化培养基效果最好,转化率为40.00%。利用无核标记SCF27-2000对5个杂交组合176株杂种后代检测表明,159个株系拥有无核基因分子标记。【结论】‘Ruby Seedless’‘秦红1号’和‘秦红2号’适宜作为胚挽救育种的母本,而‘Crimson Seedless’和‘秦秀’不适合作为胚挽救育种的母本,培养基MM3比ER更适宜作为胚发育培养基,拥有无核基因分子标记的159株胚挽救苗为培育抗寒无核葡萄新品种提供了种质基础。

【目的】明确植酸（PA）、矿质元素含量及其有效性在蜜柚果实中的空间分布特征,为蜜柚矿质营养的生物强化以及果实综合营养评价提供理论参考。【方法】以平和蜜柚产区5个代表性蜜柚品种（白肉蜜柚、黄金蜜柚、红肉蜜柚、三红蜜柚、红棉蜜柚）为供试材料,将成熟期蜜柚果实从外到内细分为黄皮层、白皮层、囊衣和果肉,分别利用铁沉淀法、ICP-MS（Inductively coupled plasma mass spectrometry）、PA与矿质元素的摩尔比,分析蜜柚果实不同空间区位的PA、矿质营养的含量及其有效性;并在此基础上利用三元模型模拟锌在人体肠道内的有效吸收。【结果】蜜柚果实中,磷组分（磷、无机磷）以果肉中含量最高,但PA含量最低。PA含量从外到内总体表现为持续降低的趋势（黄皮层>白皮层>囊衣>果肉）。果肉中植酸磷（PAP）含量仅占总磷的4%,而果皮为30%。此外,果肉中PA表现出显著的基因型差异。不同蜜柚品种果肉中PA含量以红肉蜜柚最高,三红蜜柚和白肉蜜柚最低,最大相差2.6倍。而果肉中磷和无机磷在不同蜜柚品种之间差异不显著。从矿质元素的分布角度看,果皮（黄皮层、白皮层和囊衣）中钙（Ca）的含量较高,果肉中磷的含量较高,而铁（Fe）在果皮不同部位均显著高于果肉,且以在黄皮层和果肉中变异最大。受蜜柚果实不同部位PA和矿质元素含量的共同影响,黄皮层中的[PA]/[Mg]和[PA]/[Fe]最高,白皮层中[PA]/[Zn]和[PA]/[Mn]最高,而果肉中[PA]/[Ca]最高。此外,果肉中矿质元素的有效性也表现出显著的基因型差异。黄金蜜柚的[PA]/[Fe]是红棉蜜柚的将近6倍。红棉蜜柚的[PA]/[Zn]是白肉蜜柚和三红蜜柚的3.6倍。5个供试蜜柚品种中,三红蜜柚和白肉蜜柚属低PA、高矿质元素有效性品种。【结论】蜜柚果实的PA、矿质元素及其有效性在不同蜜柚品种之间,以及果实不同空间部位均存在显著差异。果肉中磷主要以无机磷的形态存在,而非PA。推测果肉的低PA背景对矿质元素的抑制效应相对有限。而果皮中（黄皮层、白皮层）PA含量相对较高,在果皮深加工过程中需注意其矿质元素的有效发挥。

【目的】基于现有3种稻米食味评价方法,研究西南稻区不同杂交籼稻品种食味品质特点,并优选出优良食味杂交籼稻品种。【方法】在2017年品种筛选试验的基础上,于2018年在云南永胜和四川大邑分别采用单因素随机区组田间试验,应用2种国标感官评价和食味计进行评价,比较分析20个杂交籼稻品种的食味品质差异及其对食味评价方法的响应。【结果】稻米食味品质受多种因素共同调控,食味优良的品种具有在2种感官评价下稻米的气味、外观、适口性、滋味和冷饭质地,以及食味计评价下的外观和口感评分均优良的共性,进而具有较高的食味品质。通径分析表明,适口性对食味贡献率最大,滋味和外观次之,冷饭质地最低。不同品种间稻米食味品质差异明显。3种评价方法下,宜香优2115、内5优39、繁优609、花香优1618、川优6203和隆两优1146在2生态点均具有优良食味品质。相较于绿优4923和川优8377等低食味品种,宜香优2115和花香优1618等品种具有较高的气味、外观、适口性、滋味,进而食味较好。品种对不同评价方法的响应存在差异,永胜渝香203和大邑Y两优1号在2种感官评价下均属于低食味品种,但在食味计评价下则显著高于食味计平均食味。线性拟合结果表明,感官百分制评分和等级综合评分线性拟合度高,相关系数r=0.94^***,而食味计评分与感官百分制评分和等级综合评分相关系数分别为r=0.49^***和r=0.53^***,离散程度较大,不足以解释相互之间关系。【结论】稻米食味品质受生态条件和品种共同作用,采用单一食味评价方法不能准确评价各品种稻米食味品质。因此,综合运用3种现行食味评价方法,筛选出宜香优2115、内5优39、繁优609、花香优1618、川优6203和隆两优1146等6个食味优良且稳定的品种,可以用作西南优质食味品种推广。

【目的】研究两种外源蛋白添加对全麦面团混合特性、流变学特性和微观结构及对全麦面包品质的影响,为进一步利用外源蛋白提升全麦食品品质及其新产品的开发提供依据。【方法】利用混合实验仪、动态流变仪和扫描电子显微镜分析外源蛋白（蛋清粉（EW）和酪蛋白酸钠（SC））添加对全麦面团热机械学、动态流变学和微观结构的影响,结合全麦面包的制作分析其对面包比容和质构特性的影响。【结果】随着（EW）添加量的增加,全麦面团吸水率降低,形成时间和稳定时间增加,加热过程中全麦面团的峰值黏度和回生值升高。全麦面团的弹性模量（G'）和黏性模量（G"）持续降低,损耗角正切值（tan δ）持续上升。面团微观结构得到有效改善,内部孔洞显著减少,面团结构连续均匀,很好地弥补了麸皮对面团的破坏;全麦面包的比容增大,面包的内瓤结构疏松柔软。全麦面包的硬度下降,咀嚼度降低,弹性、黏聚性和回复性变化不显著。随SC添加量的增加,全麦面团的吸水率和蛋白弱化度增加,形成时间和稳定时间先增加后降低,加热过程中,全麦面团的峰值黏度随SC添加量增加而降低,回生值变化趋势相反;当SC添加量大于1%时,全麦面团的G'和G"上升;面团微观结构逐渐变得致密,孔洞和缝隙逐渐减少;全麦面包的比容随SC添加量增加先增大后减小,内瓤结构相对紧密;全麦面包硬度和咀嚼度逐渐增加,黏聚性和回复性逐渐降低,弹性变化不显著。【结论】蛋清粉的添加一定程度上可以代替谷朊粉,有效改善全麦面包品质;而酪蛋白酸钠的使用要考虑其自身的高吸水率。

【目的】通过分析不同温度、湿度环境下肉鸡体表温度的变化,构建不同日龄肉鸡温湿指数（THI）模型。【方法】分别在28、35、42和49日龄时,选择30只AA肉公鸡,饲养于2个人工环境控制舱内。舱内相对温度分别设定为50%和80%,舱内温度均由18℃开始,每0.5h升高1℃,至33℃并维持0.5h。一共设定2个湿度和16个温度梯度。利用微型温度记录仪连续监测肉鸡体表温度、体核温度和环境温度,每2 min记录1次,同时每10 min检测一次环境湿度。【结果】在24—33℃的范围内,肉鸡体表温度随环境温度升高而线性升高,且受到环境湿度的影响,因此选择环境温度≥24℃后的数据进行分析。通过计算THI与肉鸡体表温度最大相关时干球和湿球温度的权重值,得到不同日龄肉鸡的THI模型,分别为THI_28日龄=0.82×T_干球+0.18×T_湿球;THI_35日龄=0.69×T_干球+0.31×T_湿球;THI_42日龄=0.67×T_干球+0.33×T_湿球;THI_49日龄=0.61×T_干球+0.39×T_湿球。根据干湿球温度的权重值计算出的THI与体表温度之间的线性相关系数达到0.96以上。经2个独立试验验证,THI计算值与体表温度仍存在较强的线性关系,线性相关系数达到0.94以上,且THI模型预测的体表温度与实际测定结果基本一致。【结论】本研究得出的THI模型与体表温度存在良好的线性关系,适用24—33℃范围内温热环境的评价;不同日龄肉鸡THI模型存在差异,随肉鸡日龄增加,湿球温度的权重逐渐增大。

【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间）,为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×10⁶细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞）,摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h）,确定PCV2最佳生产工艺。【结果】（1）贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×10⁶/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×10⁶/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;（2）3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到10^6.4TCID₅₀/mL,克隆PK15-2F11（10^5.5TCID₅₀/mL）、PK15-1E5（10^5.6TCID₅₀/mL）,3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（10^4.7TCID₅₀/mL）,但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;（3）使用贴壁细胞来源的种毒（10^6.4TCID₅₀/mL）感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为10^6.5TCID₅₀/mL。以来源于悬浮细胞的种毒（10^6.3TCID₅₀/mL）感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达10^7.3TCID₅₀/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达10^7.3TCID₅₀/mL,可用于工厂化疫苗生产。

【目的】利用已获得的纳米孔全长转录组数据对现有的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）参考基因组的基因序列和功能注释进行完善。【方法】采用TransDecoder软件预测东方蜜蜂微孢子虫基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）及相应的氨基酸。利用gffcompare软件将全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,对基因组注释基因的非编码区向上游或下游延伸,修正基因的边界。利用MISA软件鉴定长度在500 bp以上的全长转录本的简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点,包括单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复、混合SSR等类型。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库,从而获得功能注释。【结果】共预测出2 353个完整ORF,其中长度分布在0—100个氨基酸的ORF最多,占总ORF数的72.12%。共对东方蜜蜂微孢子虫的2 340个基因进行了结构优化,其中5′端延长的基因有1 182个,3′端延长的基因有1 158个。共鉴定到1 658个SSR,其中单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复的数量分别为1 622、23、7和6个;单核苷酸重复类型的SSR密度最大,达到182.32个/Mb,其次为混合SSR、双核苷酸重复和三核苷酸重复,分别达到6.90、2.78和0.73个/Mb。共鉴定出954个新基因,其中分别有951、333、371、422和321个新基因可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。此外,还鉴定出6 164条新转录本,其中分别有6 141、2 808、2 932、3 196和2 585条新转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。新基因和新转录本注释数量最多的物种均为东方蜜蜂微孢子虫,其次是蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）。【结论】研究结果较好地完善了现有的东方蜜蜂微孢子虫参考基因组已注释基因的序列和功能注释,并补充和注释了大量参考基因组未注释的新基因和新转录本。