【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pD345L蛋白(pD345L)的单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAbs),并分析其识别的线性B细胞表位,为探究pD345L在ASFV感染与致病中的功能奠定基础。【方法】构建pET-28a-D345L重组原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,表达并用亲和层析方法纯化重组的pD345L蛋白(rpD345L)。将纯化的rpD345L与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠,每隔两周免疫一次,共免疫3次。第二次和第三次免疫均用弗氏不完全佐剂乳化。第三次免疫一周后通过小鼠颌下静脉采血,分离血清,利用ELISA方法检测血清抗体效价,选取抗体效价高的小鼠加强免疫。免疫3 d后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。将重组GST-pD345L作为包被抗原,利用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次筛选得到能够稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株,注入小鼠腹腔制备腹水。使用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定mAbs的重、轻链类型。利用外源过表达的pD345L和ASFV HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)为抗原,用制备的mAbs作为一抗,分别进行Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定。随后将截短的pD345L与GST融合表达,用筛选的mAbs鉴定抗原表位,分析鉴定的抗原表位在不同ASFV毒株中的保守性。【结果】IPTG诱导后,pD345L以包涵体形式表达,分子量为40.5 kDa。将其免疫BALB/c小鼠后经间接ELISA方法筛选得到2株稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株,命名为10H3和5G1。亚类鉴定结果显示,2株mAbs重链类型均为IgG1型,轻链类型为κ链,抗体效价为1:1 638 400。Western blot和IFA结果显示,制备的mAbs均能识别天然表达的pD345L。经Western blot确定抗原表位,结果显示10H3和5G1 mAbs的最小线性B细胞表位分别为1METFVRLFKD10和321YEKICCSEES330,这两个抗原表位在ASFV不同毒株中具有保守性。【结论】本研究原核表达并纯化了rpD345L,制备了2株pD345L mAbs,并鉴定了其识别的抗原表位,且这2株mAbs均能有效识别ASFV感染过程中表达的pD345L,为进一步研究ASFV pD345L功能奠定基础。