中国农业科学

一个水稻早衰突变体基因的精细定位

赵春德1, 2, 张迎信1, 2, 刘群恩1, 2, 余宁1, 2, 程式华1, 2, 曹立勇1, 2

中国农业科学. 2014, 47(11): 2069-2077. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.001

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【目的】对水稻叶片早衰突变体W330进行遗传分析及精细定位，获得控制突变表型的基因。【方法】用60Co-γ辐射诱变籼型水稻恢复系中恢8015，从突变体库获得一份叶片早衰突变体W330。对该突变体进行表型观察和主要农艺性状调查。利用多代自交稳定的突变体W330与粳稻品种02428杂交，观察F1和 F2的表型，并统计F2群体中早衰突变表型与正常野生型的分离情况，分析该突变表型的遗传行为。利用构建的F2群体进行精细定位和候选基因分析，然后对候选基因进行DNA测序、酶切分析、表达分析、酶活测定及进化分析。【结果】突变体W330从三叶期开始出现叶片衰老，直至抽穗期及黄熟期。与野生型相比，突变体W330株高变矮、分蘖减少、叶片变窄、抽穗期不变、每株有效穗数、每穗着粒数和结实率亦显著降低。W330与02418杂交的F1表现正常，F2群体中正常植株与早衰突变植株的分离比符合3﹕1，表明突变体W330的突变性状受1对隐性核基因控制。利用F2定位群体及SSR、Indel标记，最终将目标基因定位在第3染色体短臂上2个分子标记CD-5与CD-7之间，物理距离约为21.5 kb。基因预测表明该区域共有4个完整的ORFs。其中，LOC_Os03g0131200编码一个过氧化氢酶OsCATC，基因组序列分析表明，W330突变体中的该基因从ATG开始第109位，在第一个内含子的末位发生了一个C到G的颠换，造成第一个内含子没有剪切，最终导致翻译提前终止，酶切试验验证了这一突变位点。与野生型亲本中恢8015相比，W330突变体在三叶期叶片中的过氧化氢酶的活力下降了47.8%，而过氧化氢含量上升了2.7倍。由此，推定W330与OsCATC等位。系统进化分析发现，OsCATC与水稻中同源的过氧化氢酶不在同一进化分支上。实时荧光定量PCR发现，与其野生型相比，突变体W330叶片中的OsCATA和OsCATB的表达量显著上升，而OsCATC的表达量没有明显的变化。推测，这3个高度同源的基因在水稻体内可能存在互补机制。【结论】W330突变体基因是已报道的过氧化氢酶基因OsCATC的等位基因。W330突变体在第一个内含子上发生的一个点突变造成可变剪切的发生，使得水稻一个过氧化氢酶失活，导致突变体W330突变表型的出现。

基于基因特异性标记分析Pm21在中国冬小麦品种（系）中的分布

江峥1, 2, 王琪琳1, 3, 吴建辉1, 3, 薛文波1, 2, 曾庆东1, 3, 黄丽丽1, 3, 康振生1, 3, 韩德俊1, 2

中国农业科学. 2014, 47(11): 2078-2087. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.002

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【目的】来自小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系的抗病基因Pm21对小麦白粉病具有持久和广谱抗性，开发该基因的特异性标记，分析其在全国冬麦区中的应用情况，为Pm21的合理布局及分子标记辅助选择育种提供理论依据和技术支撑。【方法】根据已克隆的与Pm21抗性途径紧密相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因Stpk-V的序列（GenBank登录号为HQ864471.1），提取其蛋白序列并利用Pfam软件分析其保守结构域起止位点，在其保守结构域外设计开发特异序列标记WS-1；构建Pm21载体品种92R137和感病品种Avcoet S（AvS）的F2群体，以小麦白粉病菌E09对该群体每个单株进行苗期抗白粉病表型鉴定，同时利用WS-1对F2群体进行分子检测，分析检测表型与抗病表型，以验证WS-1标记的准确性；利用WS-1标记对来自中国不同冬麦区的662份小麦品种（系）进行分子标记检测，分析Pm21在不同麦区小麦品种（系）的分布情况，并将检测到含有Pm21的品种（系）在田间进行抗白粉病鉴定；选取WS-1已检测到及没有检测到Pm21的品种（系）各50份，利用曹爱忠等开发的标记NAU/xibao15902进行PCR扩增，进一步证明WS-1的准确性。【结果】（1）开发的Pm21特异标记WS-1为显性标记，含Pm21的小麦材料在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中扩增出一条大小为949 bp的片段，而不含该基因的小麦材料中无该片段。（2）在包含377个株系的F2群体中，286个单株为抗病，91个单株为感病，抗感比符合3﹕1的分离比例，表明在该群体中Pm21表现为显性单基因，WS-1对F2群体的每个株系的检测结果与抗/感表型完全一致。（3）供试的662份小麦材料中，49份携带Pm21，平均分布频率为7.4%，其中，西南冬麦区中检测到33份，占该区参鉴品种（系）数的34.4%，而北部冬麦区、黄淮冬麦区和长江中下游冬麦区，分别检测到4份、9份和3份，各占该区参鉴品种（系）数的5.3%、3.1%和1.5%。【结论】开发的Pm21特异性标记WS-1可以作为该基因的检测标记，也可应用到今后的基因聚合育种中；该基因在不同麦区分布相差很大，其中，西南冬麦区四川、贵州省的小麦品种（系）中Pm21使用频率过高，有促进病原菌定向选择的风险，在当前小麦育种中应给以重视。

绿豆高密度分子遗传图谱的构建

吴传书1, 2, 王丽侠2, 王素华2, 陈红霖2, 吴健新2, 程须珍2, 杨晓明1, 3

中国农业科学. 2014, 47(11): 2088-2098. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.003

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【目的】在前期研究的基础上，进一步利用绿豆基因组SSR、EST-SSR、STS和普通菜豆基因组SSR等标记构建绿豆遗传连锁图谱，为绿豆重要性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选育新品种等研究搭建技术平台。【方法】利用澳大利亚引进的Berken（高感豆象绿豆栽培种）× ACC41（高抗豆象绿豆野生种）及其重组自交系（recombinant inbreed line，RIL）群体，对6 686对引物进行PCR扩增及多态性筛选，包括6 100对绿豆基因组SSR、149对EST-SSR、13对STS和424对普通菜豆基因组SSR引物，将亲本间多态性引物，进一步分析重组自交系群体。结合前期研究的分子标记数据，利用Mapmarker/Exp 3.0软件构建遗传图谱，并设置LOD≥3.0，最大图距50.00 cM。用Joinmap 4.0软件进行图谱整合。【结果】用2个亲本共筛选了6 686对SSR引物，共有3 691对引物有稳定的扩增产物，得到有多态的引物有588对。其中，通过磁珠富集法开发的绿豆SSR引物6 100对，有效扩增3 459对，有效扩增率56.7%，得到多态性引物559对；通过转录组测序开发的绿豆MGCP引物149对，有效扩增126对，有效扩增率84.6%，得到多态性引物21对；通过磁珠富集法开发的菜豆SSR引物424对，有效扩增97对，有效扩增率22.9%，得到多态性引物6对；绿豆STS引物13对，有效扩增9对，有效扩增率69.2%，得到多态性引物2对。表明不同来源和种类的SSR引物在RIL群体亲本中的有效扩增率有明显差别，绿豆EST-SSR引物（84.6%）最高，绿豆STS引物（69.2%）和SSR引物（55.7%）次之，菜豆SSR引物（22.9%）最低。获得一张含有585个标记（499个SSR标记、74个RFLP标记、9个STS标记和3个RAPD标记）的绿豆遗传图谱，图谱总长732.9 cM，包括11个连锁群，每个标记间的平均距离为1.25 cM，平均长度为66.63 cM。每个连锁群长度为45.2—112.8 cM，每条染色体上面的标记数为35—92个，平均53.18个。标记位点数最多的连锁群LG1含92个标记，长度为112.8 cM；标记位点数最少的连锁群LG11仅含有35个标记，长度为48.7 cM。对图谱的585个标记位点进行χ2测验，在P＜0.05和P＜0.01条件下，分别有79个和151个标记表现为偏分离，占总标记位点数的39.3%。【结论】构建了一张目前国内外发表的标记数最多、密度最高的绿豆遗传连锁图谱。

精确定量施肥对贵州高原山区杂交籼稻产量与群体质量的影响

罗德强1, 2, 王绍华1, 江学海1, 2, 李刚华1, 周维佳2, 李敏2, 姬广梅2, 丁艳锋1, 凌启鸿1, 刘正辉1

中国农业科学. 2014, 47(11): 2099-2108. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.004

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【目的】水稻产量在很大程度上受环境、栽培技术等多种因素的影响。根据各地的气候特点有针对性地采用栽培技术，可以充分挖掘水稻产量潜力，大幅度提高单产。论文旨在探明精确定量施肥对贵州高原山区杂交籼稻群体质量及产量形成的影响效应。【方法】于2010—2011年在贵州省黄平、绥阳、余庆、兴义4个不同生态稻区，以当地具有高产潜力的杂交籼稻品种为试材，设计精确定量施肥模式（accurate fertilizer，AF）与常规施肥模式（conventional fertilizer，CF），通过对两种施肥模式的比较，研究不同施肥模式的群体质量及产量形成的差异。精确定量施肥模式以斯坦福（Stanford）方程为基础，根据目标产量需氮量、土壤供氮量及氮肥当季利用率计算总施氮量，各阶段的施肥量根据目标产量的阶段需氮量确定。精确施肥模式的总氮按照基肥﹕分蘖肥﹕促花肥﹕保花肥为30%﹕20%﹕35%﹕15%施用，常规施肥模式氮素总量按基肥﹕分蘖肥﹕促保花肥为20%﹕60%﹕20%施用。在有效分蘖临界叶龄期、拔节期、抽穗期、成熟期分别取地上部分测定叶面积和干物质量，成熟期考查穗数、穗粒数、结实率和千粒重。【结果】精确定量施肥模式显著提高了黄平、绥阳、余庆、兴义4个点的水稻产量，增产幅度为12.4%—48.0%，从产量构成因素看，穗数和穗粒数均较常规施肥模式有不同程度提高，穗数增加8.1%以上，穗粒数增加2.5%以上，群体颖花量增加14.3%以上，而结实率和千粒重两种施肥模式的差异较小；比较分析两种施肥模式的穗型大小，精确定量施肥模式较常规施肥模式穗粒数小于100粒的小穗比例降低、100—250粒的大穗和250粒以上的特大穗比例增加，小穗比例减少了36.7%—100%，大穗比例提高了2.2%—11.4%，特大穗比例提高了23.3%—94.9%；在叶面积指数与粒叶比方面；精确定量施肥模式比常规施肥模式的群体叶面积指数拔节前有所降低（4.2%—11.8%）、抽穗期显著提高（4.2%—13.9%）；粒叶比明显增大，其中颖花/叶为9.3%—32.7%、实粒/叶为12.8%—35.7%、粒重/叶为10.1%—36.3%；干物质积累量表现为精确定量施肥模式比常规施肥模式拔节前有所降低，拔节至抽穗期提高了9.8%—50.8%，抽穗至成熟期提高了26.9%—62.7%。【结论】精确定量施肥模式显著提高了贵州杂交籼稻产量，其途径主要通过控制拔节前的群体生长，促进拔节后的群体发展，适度减小拔节前群体叶面积和干物质积累，扩大拔节后尤其是抽穗后群体叶面积和干物质积累，在稳定提高穗数的基础上，控制晚生小穗数量、促进大穗形成，提高穗粒数和粒叶比，实现抽穗后群体干物质的高积累，从而获得高产。

高温和外源ABA对不同持绿型小麦品种籽粒发育及内源激素含量的影响

杨东清1, 王振林1, 倪英丽1, 2, 尹燕枰1, 蔡铁1, 杨卫兵1, 彭佃亮1, 崔正勇1, 江文文1

中国农业科学. 2014, 47(11): 2109-2125. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.005

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【目的】探讨花后高温和外源脱落酸（ABA）对不同持绿型小麦籽粒胚乳细胞增殖、籽粒灌浆和内源激素的影响，为高温逆境下采用激素调控措施提高粒重提供理论依据。【方法】选用持绿型汶农6号和非持绿型济麦20，花后1—5 d，用透明聚乙烯塑料膜搭设增温棚进行高温处理，同时花后1—3 d喷施10 mg?L-1的ABA于穗部，用量100 mL?m-2，3次重复。定期取籽粒样，用高效液相色谱法测定4种内源激素，用简易胚乳细胞计数法测定胚乳细胞数目，Richard方程对籽粒增重及胚乳细胞增殖动态模拟并计算相关参数。【结果】高温处理显著降低了两品种强弱势籽粒的胚乳细胞数目，降低胚乳细胞增殖速率，但延长了籽粒胚乳细胞活跃分裂期和实际分裂终期；显著降低两品种弱势籽粒的灌浆速率，缩短了两品种弱势粒的生长活跃期及实际灌浆终期。高温处理显著降低两品种千粒重和穗粒数，其中汶农6号强、弱势粒分别减少3.7和8.2 粒/穗，济麦20强、弱势粒分别减少1.3和4.3 粒/穗；显著降低两品种产量，汶农6号和济麦20产量分别降低19.65%和26.22%。常温及高温下喷施ABA均显著提高了两品种灌浆速率，提高了籽粒胚乳细胞增殖速率，扩大胚乳细胞数目。高温处理降低了强弱势籽粒ZR含量，显著提高了济麦20强、弱势粒花后3—27 d的GA3含量，显著提高汶农6号花后12—27 d的GA3含量；但降低了弱势粒花后15—27 d的IAA含量。高温处理下喷施ABA，降低了济麦20强势粒花后3—9 d ZR含量，但显著提高济麦20强势粒花后3—28 d内源ABA含量，显著提高汶农6号强势粒花后3—18 d ABA含量。常温下喷施ABA显著降低了济麦20和汶农6号强、弱势粒的GA3含量；高温下喷施ABA，显著降低了汶农6号强弱势粒的GA3含量，降低济麦20强势粒花后3—12 d的GA3含量，显著降低弱势粒花后6—15 d的GA3含量。常温下喷施ABA显著提高济麦20强势粒花后12—18 d的IAA含量；提高了汶农6号强势粒花后6—18 d IAA含量，显著提高两品种弱势粒花后6—27 d IAA含量。持绿型汶农6号的千粒重和产量均显著大于非持绿型济麦20。【结论】高温胁迫对非持绿型品种的产量和两品种弱势粒粒数影响较大，高温降低了两品种籽粒胚乳细胞数目，降低籽粒灌浆速率，最终导致粒重及产量降低。喷施外源ABA通过调节内源激素水平，促进胚乳细胞分裂，扩大了常温及高温下籽粒库容量，提高了籽粒灌浆速率，从而提高了籽粒产量。

硒减轻油菜幼苗硼毒害机理的研究

段碧辉, 刘新伟, 矫威, 赵竹青, 胡承孝

中国农业科学. 2014, 47(11): 2126-2134. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.006

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【目的】硼是植物生长发育所必需的微量元素，但在土壤中过量存在会对植物产生毒害。在干旱半干旱地区硼毒害是限制作物生长的重要因子，此外，硼矿开采以及硼肥用量过大或施用不均匀均会导致硼浓度过高，从而限制作物生长。适量硒能提高作物抗性，减轻作物因逆境产生的伤害，本文旨在通过适量硒处理，研究硒对高硼条件下油菜生物量及油菜活性氧代谢的变化，探讨硒缓解高硼对油菜生长抑制作用的机理，进而提高作物对硼的适宜范围，减轻硼毒害对农业生产的危害。【方法】本文以油菜（湘农油571）为试验材料,设置硼和硒2因素2水平（硼水平为：50、500 μmol•L-1，分别用B50、B500表示，硒水平为：0、1 μmol•L-1，分别用Se0、Se1表示）完全随机试验，共4个处理，通过苗期溶液培养，研究硒对高硼（500 µmol•L-1）胁迫条件下油菜幼苗生长、硼吸收累积和抗氧化酶及非酶系统的影响。【结果】高硼胁迫条件下油菜幼苗地上部和地下部干物质重显著降低，与正常硼（50 μmol•L-1）处理相比分别降低20.1%和32.0%；硼含量和累积量显著增加，与正常硼处理相比分别增加2.95和2.97倍；油菜幼苗因硼毒害导致叶片内抗氧化酶（过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX））活性和非酶抗氧化物（谷胱甘肽（GSH））含量显著降低，与正常硼处理相比，CAT、POD和APX活性分别降低19.7%、11.0%和15.0%；而过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）含量显著增加，比正常硼处理分别增加19.0%和18.5%。高硼条件下，经1 μmol?L-1硒处理，与无硒处理相比，地上部和地下部干物质重分别增加22.8%和28.6%，硼含量和累积量分别降低38.6%和31.9%；油菜幼苗叶片内抗氧化酶活性和非酶抗氧化物含量显著增加，CAT、POD和APX活性分别增加12.8%、15.1%和15.3%，GSH和ASA含量分别增加9.7%和21.0%；而过氧化氢和丙二醛含量分别降低25.1%和21.2%。【结论】适量硒可降低高硼胁迫下油菜幼苗硼的吸收累积，增强抗氧化酶和非酶系统抗氧化作用，降低活性氧累积，减轻细胞质膜因过氧化作用而产生的损伤，从而显著减轻过量硼对油菜生长的影响，提高油菜幼苗对硼过量的适应性。

基于边界域修正粗糙熵模型的遥感影像分类不确定性评价

竞霞1, 2, 魏曼3, 王纪华1, 宋晓宇1, 胡荣明2

中国农业科学. 2014, 47(11): 2135-2141. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.007

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【目的】遥感影像分类是获取地表覆盖信息的有效技术手段，客观合理地评价遥感影像分类的不确定性对农业资源调查、作物估产等方面的遥感应用具有重要的意义。论文针对修正粗糙熵模型在评价遥感影像分类不确定性时存在的问题，构建基于边界域修正粗糙熵模型的遥感影像分类不确定性评价指标，以期更好地度量地物类别尺度上的遥感影像分类的不确定性。【方法】考虑边界域对遥感影像分类结果不确定性的影响，对修正粗糙熵模型进行改进，以类别的边界域被分类知识划分的结果取代所有像元被分类知识划分的结果作为衡量分类知识不确定性的依据，建立基于边界域的修正粗糙熵模型。首先依据粗集理论对所建模型的合理性进行数学推导，然后以北京市的Landsat TM影像和新疆石河子地区的IKONOS影像为例，分别应用修正粗糙熵模型和基于边界域的修正粗糙熵模型对分类结果在地物类别尺度上的不确定性进行评价，用不同空间分辨率和不同研究区域的试验数据的不确定性评价结果印证理论推导结论。【结果】与修正粗糙熵模型相比，基于边界域的修正粗糙熵模型在评价遥感影像分类的不确定性时能够更好地刻画分类知识所引起的不确定性，使遥感影像分类结果的评价更加客观和合理。通过对两种模型下试验数据的分析表明，当所研究的地表覆盖类型在研究区域内的分布比较零碎，成片区域不多，类别与类别之间的边界部分所占比重较大，混合像元现象比较严重的时候，采用修正粗糙熵模型计算遥感影像分类结果的不合理性还不是非常明显，还能够比较客观地反映遥感影像分类的不确定性问题。但是如果评价分布比较集中，面积比较大的地物类型的分类精度时，修正粗糙熵模型则难以客观地反映遥感影像分类的不确定性问题，其评价结果的不合理性也更为明显。【结论】采用修正粗糙熵模型进行遥感影像分类的不确定性评价时，放大了由于边界域存在所产生的不确定性，而基于边界域的修正粗糙熵模型则可以较好地避免这一情况的发生，更合理地度量地物类别尺度上的遥感影像分类的不确定性。

通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株

田李1, 刘娜1, 徐荣旗2, 曲志才1, 刘乾1

中国农业科学. 2014, 47(11): 2142-2150. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.008

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【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能，构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法，构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段（Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌，通过同源区段的重组，潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80，从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型，即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80作为受体菌株，采用上述基因敲除方法测试2个几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株ΔVdku80在PDA培养基上的菌落形态相似，且培养8 d后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80产孢高峰均出现在摇瓶培养后第5天，且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为0.02%的MMS对野生型和突变体菌株ΔVdku80的生长均有明显的抑制作用，且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4周后，棉株真叶均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状，野生型和突变体菌株ΔVdku80对棉花造成的病情指数分别为54.2±4.9和53.6±5.4，亦无明显变化。因此，突变体菌株ΔVdku80的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株，几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为44%和31%；而使用ΔVdku80作为基因敲除的受体菌株，几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作为受体菌株可以提高其他基因的基因敲除效率，且Vdku80的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响，因此不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。

柑橘木虱黄龙病菌携带量与其内生菌群相关性

孙丽琴, 殷幼平, 王芳, 吴晓芳, 王中康

中国农业科学. 2014, 47(11): 2151-2161. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.009

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【目的】分析柑橘木虱（Diaphorina citri）体内可能与黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）互作的内生细菌，为黄龙病菌的人工培养及其病害防控奠定基础。【方法】首先通过传统分离培养方法比较不同地理来源带黄龙病菌（带菌）和不带菌黄龙病菌（不带菌）的木虱中可培养内生细菌的差异。其次将带菌状况不同的木虱分别分为头、胸、腹3部分，经PCR扩增其16S rDNA的V6—V8区，用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法，比较带菌状况不同的木虱内生细菌的差异和木虱不同部位内生细菌的差异。选择3种差异的内生细菌：Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.，在8份带菌状况不同的木虱样品中通过q-PCR分别对其进行实时荧光定量分析，再以总细菌量为校正计算包括黄龙病菌在内的4种细菌的相对含量，数据经LSD检验，以各种细菌相对含量的-lg值作图，先比较同一样品中3种细菌分别与黄龙病菌的相对含量关系，再比较同种细菌在不同样品中的特性，分析3种内生细菌和黄龙病菌的互作关系。【结果】不带菌木虱中可培养内生菌菌落丰富度和菌落形成单位均大于带菌木虱中。在不带菌木虱中共获得14株形态不同的菌株，分属于芽孢杆菌属（Bacillus，3株）、欧文氏菌属（Erwinia，1株）、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella，1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus，2株）、节杆菌属（Arthrobacter，1株）、泛菌属（Pantoea，2株）、果胶杆菌属（Pectobacterium，1株）、沙门氏菌属等（Salmonella，1株）、链霉菌属（Streptomyces，1株）、Massilia brevitalea（1株）等10个细菌属。在带菌木虱中分得的4株细菌在不带菌木虱中均分离到，分属于克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、果胶杆菌属。其中Dc-11（嗜气芽孢杆菌属）在带菌木虱和不带菌木虱中分离频率均达到100%，表明其为木虱体内常驻细菌；对木虱不同部位（头、胸、腹）内生细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱显示，带菌与不带菌木虱中细菌种群差别明显，带菌状况相同的木虱不同部位之间差别不明显。其中优势条带10 （Wolbachia sp.）、12（Wolbachia pipientis）、13（Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri）、14（Uncultured bacterium）、19（Serratia marcescens）、21和22（均为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia）在木虱体内稳定存在，带菌木虱腹部特有优势内生细菌为Enterobacter sp.，木虱中同样也存在次级内生菌Wolbachia。q-PCR的结果验证了所选的3种细菌在前期传统分离培养和16S rDNA-PCR-DGGE中结果的可靠性，同时表明肠杆菌属在8份样品中与黄龙病菌呈正相关关系。【结论】黄龙病菌进入木虱体内会改变木虱内生细菌菌群种类和结构；嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus）在柑橘木虱体内稳定存在，为木虱体内常驻菌群；Enterobacter sp.与黄龙病菌带菌量呈正相关，推测其可能与黄龙病菌互作。

绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

谭永安, 肖留斌, 孙洋, 赵静, 柏立新

中国农业科学. 2014, 47(11): 2162-2172. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.010

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【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP），获得原核表达的重组蛋白，为ALUSP的功能研究奠定基础，也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物，获得ALUSP的保守序列；再通过设计特异性引物，利用RACE方法，分别克隆ALUSP 5′及3′段序列，然后通过拼接获得ALUSP全长序列；应用生物信息学方法，对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析，建立系统进化树；将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切，构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP，将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达，再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp，编码334个氨基酸，预测分子量56.63 kD，理论等电点8.42；序列特征分析表明，该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征，由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成，其中C域高度保守，包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒，且含有由8个氨基酸构成的核定位信号，D域含有1个识别DNA元件的T-盒，E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构；氨基酸比对结果表明，ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%），与其他昆虫的USP序列一致性较低，如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）；系统进化树分析结果显示，半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化，位于不同分支，ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近，可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上，命名为pEGX6P1-ALUSP；经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白，并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在；收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析，最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带，表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长，其具有昆虫超气门蛋白的典型特征，并获得了原核表达的重组蛋白。

长期不同施肥红壤粒径分布的多重分形特征

孙梅1, 2, 孙楠2, 黄运湘1, 徐明岗2, 王伯仁2, 张旭博2

中国农业科学. 2014, 47(11): 2173-2181. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.011

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【目的】通过探讨长期不同施肥后红壤粒径分布非均匀性和异质性的变化特征，揭示不同施肥模式对土壤粒径分布的影响，为农田土壤发育过程以及科学合理利用红壤提供理论支撑。【方法】以湖南省祁阳试验点红壤旱地长期定位试验（1990年至今）为依托，采用激光粒度分析仪测定1990年初始土样（O）与连续22年不施肥（CK）、单施化肥（NPK）、有机无机配合施用（NPKM）和单施有机肥（M）4种施肥模式下小麦-玉米轮作系统中耕层土壤（0—20 cm）颗粒分布；应用多重分形理论以盒计维方法分析了土壤粒径分布多重分形参数的变化趋势；并对多重分形参数、土壤颗粒与土壤有机质进行相关性分析，阐明多重分形参数表征土壤粒径分布的精准性。【结果】多重分形参数可以反映土壤粒径分布的非均匀程度，与红壤黏、粉粒含量、土壤有机质含量显著相关；运用多重分形参数表征土壤粒径分布具有较高的灵敏性与精准度。红壤粒径广义维数（D(q)）在﹣10≤q≤10的范围内，其中D(q＜0)比D(q＞0)更为敏感，表明广义维数（D(q)）在稀疏区域的标度性低于密集区域的标度性。与初始土样（O）相比，长期不同施肥对容量维数（D0）与信息维数（D1）无显著影响，但显著提高了关联维数D2（0.864—0.883）、D1/D0（0.921—0.932）；处理间均表现为M、NPKM＞NPK、CK、O，也显著提高了奇异强度α0（1.129—1.177）和奇异谱宽Δα（1.966—2.707）等多重分形参数，处理间均表现为NPK、CK＞M、NPKM＞O。【结论】在成土条件、种植制度和管理措施均一致的条件下，无论是单施有机肥（猪粪）还是有机肥（猪粪）配合施用化肥均可以显著提高红壤粒径分布局部密集程度，促进土壤细化，加快土壤不均匀性发展，增强了土壤颗粒异质性。多重分形参数可以表征土壤粒径分布的细微差别，为土壤粒径分布的精准研究提供了技术支持。

辣椒生长对土体构造和水分条件的响应

姬雅琳1, 邵明安2, 魏孝荣3

中国农业科学. 2014, 47(11): 2182-2192. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.012

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【目的】土体构造和土壤水分条件直接影响水分有效性，从而影响植物生长与生理过程。辣椒是中国重要的经济作物之一，研究不同土体构造和水分条件处理对辣椒植株开花结果期比叶面积、光合作用和总蒸发量的影响，旨在揭示其生理机理和土壤物理学机制，从而为沙土区土壤改良提供科学依据。【方法】采用盆栽试验，以湘研5号为供试材料，设计了4种土体构造模式（上土下沙、上沙下土、沙土混合和土壤）和3种水分条件（正常供水：75%—90%田间持水量（Field capacity，FC；适度缺水：60%—75% FC；严重缺水：45%—60% FC）处理，于开花结果初期（6月28日）、中期（7月10日）、后期（7月28日）和末期（8月10日）分别测定辣椒叶片的比叶面积（SLA）、净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr），同时记录4个时期的总蒸发量数值。【结果】整个开花结果期内，上土下沙处理的比叶面积显著高于其它处理；土壤和沙土混合处理中的叶片光合速率分别比上沙下土处理高35%和27%，土壤、沙土和上土下沙处理的蒸腾速率分别比上沙下土高53%、34%和31%，在不同水分条件下光合和蒸腾速率差异不显著，土壤、沙土混合和上土下沙处理中的叶片气孔导度分别比上沙下土处理高64%、41%和40%，正常供水和适度缺水处理分别比严重缺水处理高29%和36%，表明土体构造处理对辣椒光合和蒸腾速率的影响大于水分的影响。土体构造对光合性能的影响与生育期与水分条件有关，光合速率在开花结果初期、中期和后期受土体构造影响，气孔导度和蒸腾速率在初期受土体构造影响。正常供水和适度缺水条件下土壤和沙土混合处理叶片光合和蒸腾速率以及气孔导度高于上沙下土处理，但严重缺水条件下不同土体构造处理差异不显著。辣椒生长受生育期的显著影响，末期的叶片比叶面积显著高于其他3个时期；后期的叶片的净光合速率和蒸腾速率显著高于初期、中期和后期；初期、中期和后期的气孔导度显著高于末期。土体构造和水分条件对整个开花结果4个时期的总蒸发量影响显著，土壤处理总蒸发量最高、上沙下土最低。【结论】土体构造处理对辣椒生长的影响大于水分对其的影响，同时土体构造对光合性能的影响与生育期和水分条件有关。半干旱沙土区土体构造改良可采用上土下沙和沙土混合模式，土壤水分条件控制在田间持水量的60%—75%为宜。

新疆红肉苹果杂种一代的遗传变异及功能型苹果优株评价

陈学森, 张晶, 刘大亮, 冀晓昊, 张宗营, 张芮, 毛志泉, 张艳敏, 王立霞, 李敏

中国农业科学. 2014, 47(11): 2193-2204. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.013

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【目的】研究新疆红肉苹果与苹果品种杂种F1群体童期、果实性状的遗传变异特点，并进行功能型苹果优株评价，旨在为功能型苹果育种技术体系的创建及新疆野苹果资源的利用保存提供基本资料。【方法】以新疆红肉苹果与‘寒富’等苹果品种6个杂交组合的杂种一代868株实生苗及从中选育出的4个优株为试材，以国外引进的红肉苹果‘德红脆’及苹果栽培品种‘金冠’为对照，检测童期、果实单果重、硬脆度、可溶性固形物、可滴定酸、果皮与果肉总酚、抗氧化能力以及类黄酮含量与组分，讨论功能型苹果育种技术。【结果】新疆红肉苹果为亲本的5个杂交组合在定植第3年的开花株率均在15%以上，童期仅2.33—4.33年，而对照‘金帅’×‘寒富’苹果杂交组合在定植第4年的开花株率仅为8.0%，童期3.33—5.33年；果肉花青苷含量等各性状均出现广泛分离，变异系数均在20%以上，进一步选择的潜力很大；果皮与果肉总酚及花色苷含量的广义遗传力均在85%以上，遗传能力较强；新疆红肉苹果的5个杂交组合均出现了红-绵肉及红-脆肉等株系的分离现象，其中红肉和脆肉株系分离比率分别为26.2%—37.5%和23.9%—27.5%；红肉面积较大的红脆1号和10号总酚与花青苷含量、抗氧化能力及类黄酮含量和种类数极显著地高于果肉略带红色的红脆8号和白脆1号及其对照‘德红脆’和‘金冠’。【结论】新疆红肉苹果与苹果品种杂种F1结果年龄早，果皮与果肉总酚含量等功能成分遗传能力强，从杂种F1代群体中能够选育出抗氧化能力强、类黄酮含量含量高的功能型红肉脆肉优良株系。

苹果细菌人工染色体双色DNA纤维荧光原位杂交体系的建立及应用

王三红, 章镇, 蔡斌华, 渠慎春

中国农业科学. 2014, 47(11): 2205-2213. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.014

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【目的】建立苹果DNA纤维荧光原位杂交（Fiber FISH）技术体系，从而为利用该技术确定苹果基因组DNA序列间的位置关系、构建精细物理图谱等方面的应用奠定基础。【方法】以‘Florina’苹果幼叶为试材，通过液氮研磨，尼龙膜过滤和TritonX-100去除叶绿素等步骤提取细胞核。细胞核经碱裂解，采用盖玻片拉伸方法制备DNA纤维。比较细胞核不同裂解时间和在5种不同包被类型的载玻片上DNA纤维拉伸的效果。用碱裂解方法提取来自苹果‘Florina’自交不亲和S9基因座的4个细菌人工染色体（Bacterium Artificial Chromosome）BAC 34G16、 BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的质粒经PEG纯化，用地高辛或生物素标记探针。探针与DNA纤维制片经过80℃变性、37℃杂交2—3 d和洗片，采用“三明治”方法进行信号放大和检测，在荧光显微镜下观察试验结果。【结果】建立了以苹果幼叶为材料，液氮研磨提取细胞核，碱裂解细胞核和盖玻片拉伸制备DNA纤维的试验方法。提取的细胞核纯净、结构完整，细胞核浓度＞5×103个/μL。试验结果表明，细胞核裂解4 min，在多聚赖氨酸包被的载玻片上制备的DNA纤维平直、伸展均匀，纤维量多、细长，效果好。经原位杂交和信号检测，获得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的“念珠状”杂交信号。对已知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19进行杂交信号测量和分析，得出BAC 克隆大小（Y，Kb）与信号长度（X，μm）的相关方程为Y=3.47X（R2=0.9215），其斜率即为该试验技术体系Fiber FISH的分辨率3.47 kb•μm-1。试验对未知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地进行了鉴定，它们大小分别为(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3 )kb，之间有（90.2±7.3）kb的重叠区域。【结论】建立了以苹果幼叶提取细胞核，制备DNA纤维和原位杂交的方法，获得了高分辨率的苹果DNA纤维原位杂交试验技术体系。

60Co-γ辐照处理对低温储藏糙米品质及微结构的影响

陈银基1, 陈霞1, 蒋伟鑫1, 董文2, 陈兆波2, 戴炳业2

中国农业科学. 2014, 47(11): 2214-2223. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.015

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【目的】中国是稻谷消费大国，稻谷储藏关系国家安全和社会稳定。辐照处理在食品储藏加工领域广泛应用。本研究欲通过分析60Co-γ辐照处理后糙米在1年的储藏过程中蒸煮品质和质构品质的变化，阐明60Co-γ辐照处理对储藏糙米品质的影响机理，为确定适用于糙米储藏的γ辐照剂量水平参数和技术方法提供理论依据。【方法】晚粳稻谷收获后，经去壳处理制成糙米，装入塑料薄膜样品袋，用辐照剂量分别为0.2、0.5、1.0和2.0 kGy的60Co-γ射线进行辐照。在测量初始指标后，恒温(15±0.5℃)储藏的1年期中，每3个月进行一次品质测定：用直链淀粉仪测定直链淀粉含量，用RNA黏度测定仪测定糊化参数，用物性测定仪测定米饭的质构品质，用扫描电镜观察辐照糙米淀粉颗粒的微观结构。【结果】①糙米糊化峰值黏度随储藏时间延长而增加，不同辐照剂量处理后糊化峰值黏度增加趋势不同，热浆黏度和崩解值随储藏时间延长而增加；60Co-γ辐照降低了储藏糙米蒸煮时糊化峰值黏度、热浆黏度、最终黏度、回升值及崩解值，糊化温度随辐照剂量增加而升高，糊化温度高糙米耐蒸煮，其蒸煮品质越高，各糊化品质中以辐照对糙米的糊化消减值和最终黏度影响最大，0.2 kGy就能显著提高糙米的冷糊稳定性（P＜0.05）、改善蒸煮品质，最终黏度的变化趋势与消减值类似。②直链淀粉含量随储藏时间延长呈升高趋势，60Co-γ辐照后糙米直链淀粉含量上升；对低表观直链淀粉含量的大米，硬度与直链淀粉含量相关性不明显（P＞0.05）。③糙米在1年储藏期内，蒸煮硬度随储藏时间呈上升趋势，而辐照后糙米蒸煮硬度降低，0.5 kGy及以上剂量（1.0和2.0 kGy）的蒸煮糙米的硬度与未辐照糙米相比差异达显著水平（P＜0.05）；辐照处理可以达到延缓黏着性下降的效果，所以，0.5 kGy的辐照就可改善储藏糙米的蒸煮品质。④辐照处理对淀粉颗粒的结构和形态有修饰作用，淀粉颗粒间空间变大，糙米在蒸煮时可渗入更多水分，进而可以改善蒸煮品质。【结论】60Co-γ辐照处理可改变糙米淀粉颗粒形态和结构，0.5 kGy以上且不超过2.0 kGy的辐照剂量可改善储藏糙米的蒸煮品质和质构品质。

应用表面增强拉曼光谱技术快速检测较大婴幼儿配方奶粉中的香兰素

王石, 程劼, 苏晓鸥

中国农业科学. 2014, 47(11): 2224-2232. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.016

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【目的】香兰素（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）是一种婴幼儿配方食品中常用的食品添加剂，因具有浓郁奶香被广泛使用，但过量使用香兰素会引起婴儿肝肾损伤。目前，国家尚未出台相关检测标准，现场检测手段相对缺乏，建立婴幼儿配方奶粉中香兰素检测方法特别是现场快速检测方法迫在眉睫。本文建立了基于纳米金粒子的表面增强拉曼光谱对较大婴幼儿配方奶粉中香兰素的速测方法，为政府监管提供技术支撑。【方法】本文主要从样品前处理方法优化，增强基底的制备以及上机参数的选择3方面进行研究。比较不同萃取溶剂对香兰素提取效率的影响，确立较佳的样品前处理方法；研究不同粒径的纳米金胶溶液对香兰素的表面增强拉曼光谱信号强度的影响，确定较佳的增强基底；探明pH、离子强度等对上机液的影响，得到较优的检测条件。【结果】确立了较优的前处理方法：首先以饱和醋酸铅溶液作为沉淀剂去除基质中蛋白，之后以二氯甲烷为萃取溶剂对香兰素进行提取，最终使用pH为9的氢氧化钠水溶液对提取液进行纯化；确立了较佳的检测条件：以粒径约58 nm的金胶溶液作为增强基底，同时，在上机液中加入200 μL 1%硝酸溶液、50 μL 1%硝酸钾溶液，此时香兰素特征拉曼信号最强，有利于进行定性定量分析。本文建立的速测方法以1 149、1 497、1 575 cm-1处拉曼位移作为定性依据，以1 531 cm-1峰强度作为归一化标准，绘制1 497 cm-1处峰强度对香兰素浓度的标准曲线，在质量浓度30—300 μg•mL-1内实现定量计算，线性相关系数0.9913，检出限为10 μg•mL-1。在50、100和200 μg•mL-1 3个添加水平下，回收率为80.5%—86.9%，相对标准偏差小于8.6%。【结论】通过实际样品检测并将结果与现有文献报道方法相比较发现，该方法样品前处理简单、分析时间短（单个样品分析时间约5 min），检测结果可靠，适用于对较大婴幼儿奶粉的现场快速检测，为市场监管提供了新的手段。

饲粮油菜籽添加水平对肉牛生长性能、瘤胃发酵及血液生化指标的影响

张杰杰1, 2, 赵红波1, 游伟1, 成海建1, 刘晓牧1, 万发春1, 孙国强2, 宋恩亮1, 刘倚帆1

中国农业科学. 2014, 47(11): 2233-2241. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.017

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【目的】旨在探讨饲粮中不同油菜籽添加水平对肉牛生长性能、瘤胃发酵及血液生化指标的影响,从而为肉牛育肥过程中合理使用油菜籽提供依据。【方法】试验采用单因子完全随机设计，选取18月龄、平均初始体重为（447±35.67）kg的西门塔尔杂交公牛40头，依据饲粮中油菜籽含量随机分为对照组（0%）、低菜籽组（8.7%）、中菜籽组（17.4%）、高菜籽组（26.0%），预饲期10 d，正试期90 d。试验结束后称重，计算饲料成本，并采集瘤胃液和血液分别用气相色谱法、比色法和放射免疫法测定瘤胃液挥发性脂肪酸、氨态氮和血清中三碘甲状腺原氨酸酸（T3）、甲状腺素（T4）、促甲状腺素（TSH）。用SAS9.2软件中一般线性模型对试验数据进行方差分析。【结果】试验结束各组牛末重之间差异不显著（P＞0.05），中菜籽组日增重最高，为1.33 kg•d-1，显著高于高菜籽组（P＜0.05），比对照组和低菜籽组分别高6.40%和7.25%；高菜籽组干物质采食量最高，对照组最低，但各组之间差异不显著（P＞0.05）。随油菜籽添加水平的提高，饲料成本降低（P＞0.05）；中菜籽组料重比最低，高菜籽组最高，各组之间差异不显著（P＞0.05）；不同油菜籽添加水平不显著影响瘤胃液pH、氨态氮以及挥发性脂肪酸的含量（P＞0.05），但随油菜籽添加水平的提高瘤胃液中氨态氮、丁酸和乙酸/丙酸的含量呈降低的趋势，丙酸呈上升趋势，总的挥发性脂肪酸先上升后降低；血清中三碘甲腺原氨酸（T3）和甲状腺素（T4）各组之间差异不显著（P＞0.05），中菜籽组和高菜籽组血清中促甲状腺素（TSH）显著低于对照组（P＜0.05），与低菜籽组差异不显著（P＞0.05）。饲粮油菜籽添加水平对血清中谷丙转氨酶、肌酐、胆固醇含量影响差异不显著（P＞0.05），对照组和低菜籽组的谷草转氨酶活性显著低于中菜籽组和高菜籽组（P＜0.05），中菜籽组尿素氮水平显著低于对照组（P＜0.05），与其它各组差异不显著（P＞0.05）。【结论】添加不同水平的油菜籽对瘤胃发酵参数无显著影响，肉牛育肥期间饲粮油菜籽添加到17.4%时日增重不受影响，饲粮中添加油菜籽可加重甲状腺和肝脏的代谢负担。

复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒的PK-15细胞中Bcl-2/BAX mRNA转录的影响

邵秋红, 凌榕镔, 朱兆荣, 刘娟, 郭志兴, 王鹏

中国农业科学. 2014, 47(11): 2242-2250. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.018

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【目的】探讨中药复方苦芩对感染猪传染性胃肠炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)的猪肾细胞（PK-15）中凋亡基因Bcl-2/BAX mRNA转录的影响。【方法】体外扩增TGEV，用TGEV感染PK-15细胞的模型进行体外试验研究，试验中设有复方苦芩组、空白组、模型组及黄芪多糖组，在测定了病毒半数感染细胞量（TCID50），复方苦芩及黄芪多糖药液对PK-15细胞的最大无毒浓度后，制作细胞爬片采用瑞士染色法染色观察PK-15细胞的形态变化;按试剂盒操作提取各试验组RNA并及时反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Bcl-2和BAX mRNA转录情况。【结果】与空白组相比，模型组的PK-15细胞发生了明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,细胞变细长，细胞间成网状，细胞核着色较浅，出现核浓缩、固缩、碎裂等现象；与模型组比，复方苦芩组与黄芪多糖组细胞病变得到改善，而复方苦芩组效果更加明显，大部分细胞核结构清晰，染色质着色均一，少部分细胞核变大或碎裂；与空白组相比，模型组Bcl-2 mRNA转录量减少（P＜0.01），复方苦芩组Bcl-2基因转录量增加，为模型组的1.403倍（P＜0.01）、黄芪多糖组的1.078倍（P＞0.05）；与空白组相比，模型组BAX mRNA转录量明显升高，而其他3组BAX基因转录差异不明显（P＞0.05），模型组BAX基因转录量为空白组的1.440倍、复方苦芩组1.290倍、黄芪多糖组的1.490倍，差异极显著（P＜0.01），复方苦芩组、黄芪多糖组BAX基因转录量分别为空白组的1.116倍、0.966倍，差异不显著（P＞0.05）；与空白组相比，模型组Bcl-2/BAX mRNA转录比值降低，差异极显著（P＜0.01）；与模型组相比，复方苦芩组、黄芪多糖组Bcl-2/BAX mRNA转录比值均增加，分别为模型组1.809倍和1.940倍，差异极显著（P＜0.01），复方苦芩组Bcl-2/BAX mRNA转录比值分别为空白组的0.749倍（P＜0.01）、黄芪多糖组的0.933倍（P＞0.05）。【结论】复方苦芩可通过上调PK-15细胞Bcl-2 mRNA转录，下调BAX mRNA的转录，从而抑制TGEV引起的PK-15细胞凋亡。

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

贾国超1, 2, 职爱民1, 李梦琴2, 宋春美1, 王玲玲1, 刘儒彪1, 胡骁飞1, 王方雨1, 张改平1

中国农业科学. 2014, 47(11): 2251-2261. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.019

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【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原，制备FLE高亲和力抗体，通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA，用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA，通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6—7周龄Balb/c雌性小鼠5只，采用多点免疫法，对小鼠背部皮下4-6点注射免疫，免疫剂量为30 μg/只，初免，用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫；20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫，免疫间隔3周，4次免疫后，利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性，选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清，建立、优化FLE的icELISA检测方法，确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件，制备出FLE快速检测试剂盒，同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标，并与高效液相色谱法做相关性比较，同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定，以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定，结果显示BSA与FLE偶联后，FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA，初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104，抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法，其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1；抗体工作浓度：1﹕6400；二抗稀释度：1﹕1000；底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1，标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956），与同系药物及其它药物均无明显交叉反应，阳性猪肝样的回收率在67.5%—87.9%，平均78.7%，变异系数在9.34%—10.7%，平均10.0%；阳性猪肉样的回收率在74.0%—88.2%，平均81.42%，变异系数在8.3%—10.4%，平均9.48%；平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%—6.68% ，批间变异系数在4.69%—9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%，且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988)，通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%—110%)，进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原，利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法，制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点，为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。

棉花2个新的PPR基因的克隆及表达模式分析

何鹏, 黄鹏, 黄圣, 钱慧, 俞嘉宁

中国农业科学. 2014, 47(11): 2271. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.020

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【目的】从棉花中克隆2个新的PPR基因，分析其序列结构、基因表达和亚细胞定位，为深入研究这2个基因在棉花中的功能提供依据。【方法】利用棉花EST库，通过RT-PCR从陆地棉徐州142中克隆得到2个PPR基因：GhPPRH1和GhPPRH2；应用生物信息学方法对2个基因编码蛋白序列进行预测分析，利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法分析目的基因在不同组织及纤维不同发育时期的表达模式；利用棉花子叶瞬时表达系统对上述2个基因编码的蛋白进行亚细胞定位。【结果】GhPPRH1和GhPPRH2均属于PPR基因家族的PLS亚家族；GhPPRH1和GhPPRH2的开放读码框的长度分别为1 917和2 556 bp，编码638和851个氨基酸；GhPPRH1蛋白有18个PPR基序，包含1个E+结构域和1个DYW结构；GhPPRH2蛋白有17个PPR基序，包含1个E结构域，1个E+结构域和1个DYW结构；将GhPPRH1和GhPPRH2蛋白的氨基酸序列与GenBank数据库中的9条同源蛋白以及棉花中已经报道的5个PPR蛋白的氨基酸序列进行比对，构建系统进化树，结果显示，GhPPRH1与水稻RF1b蛋白亲缘关系较近，推测其可能与胞质雄性不育的育性恢复相关，而GhPPRH2与玉米PPR5蛋白亲缘关系最近，推测可能会影响细胞器一些转录本的RNA编辑；半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的结果表明，GhPPRH1和GhPPRH2在根、茎、叶、花及纤维发育不同时期均有表达，GhPPRH1在根中表达较高，而GhPPRH2在根、叶及15 d的纤维中表达较高；亚细胞定位结果显示，GFP标记的GhPPRH1蛋白的绿色荧光与线粒体Marker的红色荧光重叠，表明该蛋白可能定位于线粒体，GFP标记的GhPPRH2蛋白的绿色荧光与叶绿体自发的红色荧光重叠，表明GhPPRH2可能定位在叶绿体。【结论】从棉花中获得2个新的PPR基因，均属于PLS亚家族成员，亚细胞定位显示可能在线粒体和叶绿体中，推测其功能可能与细胞器中RNA的加工、修饰等过程有关。

不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库的构建与分析

陈华1, 2, 邓烨1, 2, 张冲1, 蔡铁城1, 2, 郑奕雄1, 2, 3, 庄伟建1, 2

中国农业科学. 2014, 47(11): 2272-2280. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.021

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【目的】深入了解花生胚发育的分子机制，获得花生胚发育相关基因。【方法】以优质花生品种闽花6号为材料，分别取花生果针入土后10、20、30、40、50和60 d（day after pegging，DAP）的胚作为试验材料，用CTAB法提取花生胚总RNA，采用SMART（Switching Mechanism At 5’ end of RNA Transcript）技术合成双链cDNA，经SfiⅠ酶切后胶回收纯化双链cDNA，连接到质粒载体pDNR-LIB上，电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库，进行小规模测序。采用生物信息学分析手段对所获得的EST进行功能注释。【结果】构建了不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库，文库的库容为3.5×106 cfu/mL，重组率95.8%，插入片段长度在500—2 000 bp，平均长度超过1 000 bp。随机挑取 60 个克隆进行5′端测序，共得到60条高质量的EST序列，BLASTX结果显示，有39条序列（65%）与GenBank中大豆、花生、苜蓿等植物上已公布的序列有较高同源性，其中，有32条具有已知或推测的功能，7条序列功能未知。其余21条（35%）序列在NCBI的非冗余蛋白数据库中没有找到与之相匹配的序列，可能为花生新的EST序列。利用BLAST2GO对所得序列进行GO注释分析，结果表明，参与抗逆与防御、蛋白质合成与运输、油脂合成与代谢、转录与调控以及种子萌发、休眠、胚发育相关的基因比较丰富，还有部分基因参与信号传导以及光形态建成等过程。KEGG代谢途径分析表明，随机测序所获得的序列中主要包括α-亚麻酸代谢和亚油酸代谢。【结论】利用SMART技术成功构建了不同发育时期花生胚混合全长cDNA文库；小规模EST测序分析获得了部分与花生胚发育相关的基因，如亚油酸9S-脂肪氧合酶、油体蛋白、锌指蛋白、热休克蛋白90、胚胎发育晚期丰富蛋白、脂肪氧合酶以及DREB转录因子等。

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