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中国农业科学. 2022, 55(15): 0. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.0578-1752-55-15-0

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PSORA：一种基于高通量测序的T-DNA插入位点分析方法

马雪萌,余成敏,赛小玲,刘贞,桑海洋,崔百明

中国农业科学. 2022, 55(15): 2875-2882. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.001

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【目的】建立一种批量分析T-DNA插入位点的简单、有效的方法。【方法】提供一种基于高通量测序技术的T-DNA插入位点的分析方法,将其命名为PSORA：Parallel sequencing of one round amplicons。首先对一轮交错式热不对称PCR（TAIL-PCR）的扩增产物进行高通量测序,随后通过生物信息学分析T-DNA插入位点,该方法降低了TAIL-PCR过程中对特异性扩增的要求。PSORA中使用的引物一侧为简并引物,另一侧为T-DNA特异性引物。在特异性引物的5’端设计6 nt的样品标签（Barcode）,用于标记不同的转化事件。所使用的5个转基因烟草株系（L1、L6、L9、L15和L19）由农杆菌介导质粒pBI121转化获得。此外,通过标准PCR对PSORA的结果进行验证。【结果】利用PSORA对5个转基因株系的T-DNA插入位点进行分析,结果显示,L6含2个插入位点（NW_015801367的36 316 bp处和NW_015950898的42 202 bp处）,L9、L15和L19各含1个插入位点（L9的插入位点为NW_015943682的235 969 bp处;L15的插入位点为NW_015802951的60 529 bp处;L19的插入位点为NW_015863435的12 188 bp处）,L1的插入位点未能成功获取。对生物信息学分析结果进行PCR验证,含不同插入位点的转基因株系之间可互为阴性对照,野生型（WT）作为空白对照,结果表明,在各转基因株系中均得到与预期一致的特异性扩增,该结果验证了PSORA的有效性。【结论】PSORA是一种分析T-DNA插入位点的有效方法,可以同时分析多个插入事件,相对于传统的染色体步移方法更简便、快速。

谷子生育期及穗相关性状的QTL定位

郭淑青,宋慧,柴少华,郭岩,石兴,杜丽红,邢璐,解慧芳,张扬,李龙,冯佰利,刘金荣,杨璞

中国农业科学. 2022, 55(15): 2883-2898. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.002

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【目的】谷子生育期及穗部性状是影响谷子品种适应性及产量的关键因素。通过对相关性状进行QTL定位分析,为探明谷子复杂产量性状的分子遗传机制奠定基础。【方法】以优良品种豫谷18和冀谷19为亲本构建的包含400个家系的RIL群体为试验材料,于2018—2019年分别在4个不同环境下调查谷子抽穗期、抽穗-成熟天数、全生育期及穗长、穗粗和单穗重等穗相关性状的表型值。同时,利用已构建的由1 304个bin标记组成的全长为2 196 cM,标记间平均距离为1.68 cM的高密度遗传连锁图谱。采用复合区间作图法（composite interval mapping,CIM）对生育期及穗部性状进行QTL定位分析,并对所获得的QTL置信区间进行候选基因的预测。【结果】重组自交系群体生育期及穗部性状在4个环境中均表现为连续分布且存在双向超亲分离现象,符合数量性状的遗传特征,适宜进行QTL分析。相关分析表明,谷子抽穗期与全生育期呈极显著正相关,与抽穗-成熟天数呈显著负相关,穗长与穗粗呈显著正相关。共检测到88个与谷子生育期及穗部性状相关的QTL,分布在第1、3、5、6、8和9染色体上。其中45个QTL与抽穗期相关,单个QTL能够解释表型变异的1.61%—27.60%;7个QTL与抽穗-成熟天数相关,单个QTL能够解释表型变异的2.65%—12.14%;20个QTL与全生育期相关,单个QTL能够解释表型变异的1.98%—16.97%;9个QTL与穗长相关,单个QTL能够解释表型变异的3.51%—11.65%;5个QTL与穗粗相关,单个QTL能够解释表型变异的3.74%—8.34%;2个QTL与单穗重相关,单个QTL能够解释表型变异的5.16%—5.20%。本研究共检测到12个主效QTL,其中,qEHD-9-1、qEHD-9-2、qHMD-9-2、qGRP-9-2和qPL-5-1在至少2个环境和BLUP值中被重复检测到。控制生育期的主效QTL（qEHD-9-1、qHMD-9-1、qGRP-9-1）与控制穗长的主效QTL（qPL-9-1）在第9染色体重叠;qEHD-9-2、qHMD-9-3、qGRP-9-2和qPL-9-3也在第9染色体重叠;控制穗长的主效QTL（qPL-5-1）和控制穗粗的QTL（qPD-5-1）在第5染色体重叠。对3个QTL簇的置信区间进行基因注释,筛选出5个与生育期及穗部性状相关的候选基因,其中,2个候选基因在谷子生育期调控和穗部性状发育中均发挥重要作用。【结论】共检测到88个与谷子生育期及穗部性状相关的QTL,12个为主效QTL,其中5个主效QTL在多个环境被重复检测到,且成簇分布。基于基因注释,共筛选了5个与谷子生育期和穗部性状相关的候选基因。

酸性土壤中丛枝菌根真菌菌剂多样性对玉米产量及其磷钾吸收的影响

张晨曦, 田明慧, 杨硕, 杜嘉琪, 何堂庆, 仇云鹏, 张学林

中国农业科学. 2022, 55(15): 2899-2910. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.003

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【目的】明确酸性土壤中丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizae fungi,AMF）菌剂多样性在玉米籽粒产量和磷、钾养分吸收方面的作用,能够为农田微生物肥料配施、养分利用率提高等方面提供理论依据。【方法】2019和2020年玉米生育期,选用4种不同种丛枝菌根真菌类型（摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae,A;扭形球囊霉Glomus tortuosum,B;地表球囊霉Glomus versiforme,C;地斗管囊霉Funneliformis geosporum,D）,设置不接菌处理（CK）,接种单一AMF菌剂、2种AMF混合菌剂、3种AMF混合菌剂和4种AMF混合菌剂共16个处理,研究玉米籽粒产量、植株各器官生物量及其磷、钾累积量对不同菌剂类型以及菌剂多样性的响应。【结果】与对照相比,两个试验年度所有接菌处理均能增加玉米籽粒产量及其磷、钾累积量,其中接种A、B、C、D 4种单一菌剂处理的玉米籽粒产量均值分别增加57.9%,26.9%,40.5%和32.9%;磷累积量增加77.8%,48.2%,26.2%和75.8%;钾累积量增加85.5%,62.1%,59.0%和63.5%。随AMF菌剂多样性增加,两个试验年度玉米籽粒产量呈增加趋势,表现为4种混合菌剂>3种混合菌剂>2种混合菌剂>单一菌剂,其中4种混合菌剂处理籽粒产量比单一菌剂处理均值高12.3%;籽粒磷累积量表现为2种混合菌剂>4种混合菌剂>3种混合菌剂>单一菌剂,其中2种混合菌剂处理籽粒磷累积量比单一菌剂高23.2%;但AMF菌剂多样性处理之间玉米籽粒钾累积量差异不显著。【结论】在酸性土壤条件下玉米接种不同类型丛枝菌根真菌均能显著增加籽粒产量及其磷、钾累积量,其中Funneliformis mosseae改善玉米籽粒产量及其磷钾累积量的作用最佳。丛枝菌根真菌菌剂多样性增加能显著提高玉米籽粒产量和磷累积量,其中4种混合菌剂处理的增产效果较好,而2种混合菌剂处理的养分吸收积累量较高。生产上应根据高产优质不同目的,选择接种合适的丛枝菌根真菌类型并进行菌剂之间合理的搭配。

中耕时间和深度对大豆光合特性及产量形成的影响

原程, 张玉先, 王孟雪, 黄炳林, 辛明强, 尹小刚, 胡国华, 张明聪

中国农业科学. 2022, 55(15): 2911-2926. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.004

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【目的】针对东北北部地区大豆主产区早春低温、保墒能力差,导致单产水平较低等问题,探究玉米大豆轮作模式下不同中耕时间和深度对大豆田土壤温湿度、大豆光合特性指标和产量的影响,为大豆产量稳定提升提供有力支撑。【方法】试验于2019—2020年在黑龙江省鹤山农场进行,采用田间小区试验方法,以当地主栽品种黑河43为试验材料,设置4种不同的中耕处理：常规培土（T1）、提前培土（T2）、常规深松（T3）和提前深松（T4）,研究中耕时间和深度对土壤温湿度、大豆叶面积指数、株高、气体交换参数、光合产物积累与分配和产量的影响。【结果】（1）在相同中耕深度的基础上,提前培土处理（T2）较常规培土处理（T1）,盛花期（R2期）土壤温度和湿度分别提高5.88%—6.54%、3.57%—4.03%（P<0.05）,鼓粒期（R6期）叶面积指数、株高和SPAD值分别提高9.48%—16.86%、5.40%—10.57%、2.39%—6.81%（P<0.05）;与常规深松处理（T3）相比,提前深松处理（T4）显著提高R6期叶面积指数、株高、净光合速率（P_n）籽粒干物质积累量及大豆产量。（2）在相同中耕时间的条件下,与T1处理相比,T3处理R2期土壤温度、湿度和R6期株高分别提高4.14%—6.42%、10.08%—13.19%和7.43%—8.29%（P<0.05）,R5期后干物质积累量和同化贡献率分别提高49.75%和32.95%（P<0.05）;与T2处理相比,T4处理各时期土壤温度、R6期叶面积指数、净光合速率（P_n）、结荚期（R5期）后干物质积累量、同化贡献率和产量均显著增加,其中产量增幅度达5.03%—6.02%（P<0.05）。（3）比较不同中耕措施,与T1处理相比,T4处理R2期土壤温度和湿度分别提高11.68%—17.15%和4.70%—8.66%（P<0.05）,R6期叶面积指数、株高、SPAD分别提高12.64%—27.42%、11.67%—13.50%、5.43%—6.87%（P<0.05）;T2、T3、T4处理提高R6期气体交换参数和大豆产量,其中T4处理净光合速率（Pn）提高14.25%—29.68%（P<0.05）、产量增幅达10.69%—18.71%（P<0.05）。【结论】提前深松处理（T4）能够改善土壤温度和湿度,提高气体交换参数,促进植株净光合产物积累,延缓叶片衰老,提高大豆产量,适宜于东北北部旱作农业区推广应用。

基于花生//高粱间作模式的花生盐胁迫耐受性效应研究

史晓龙, 郭佩, 任婧瑶, 张鹤, 董奇琦, 赵新华, 周宇飞, 张正, 万书波, 于海秋

中国农业科学. 2022, 55(15): 2927-2937. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.005

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【目的】研究旨在探究花生//高粱间作下花生对盐胁迫的响应,以期为逆境栽培提供新的视角。【方法】本试验以耐盐花生品种（花育25）和耐盐高粱品种（辽杂15）为试验材料,在正常（N）和0.25%盐胁迫（S）条件下设置花生单作（SP）和花生//高粱间作（IP）,分别为正常土壤条件下单作花生（N-SP）;正常土壤条件下间作花生（N-IP）;盐胁迫条件下花生单作（S-SP）和盐胁迫条件下花生间作（S-IP）,共4个处理组合。通过连续2年进行田间种植箱模拟试验,测定花生盐耐受指数（STI）、邻体效应指数（RII）、Na⁺/K⁺和根际养分等指标,研究不同种植模式下花生对盐胁迫的响应。【结果】花生//高粱间作模式下,花生RII均为负值,但在盐胁迫条件下,特别是连续种植2年后,S-IP处理组的负RII明显减弱,STI明显提高。在2019年,S-IP处理负RII较2018年降低了66.78%,相较N-IP处理降低了88.76%。2018和2019年S-IP处理STI相较S-SP处理均提高了27%左右。此外,花生//高粱间作有利于不同类型根系的发育,从而改变整体根系分布与结构并影响花生根际养分。其中N-IP处理根际土壤养分含量相较N-SP处理平均升高6.19%,S-IP处理根际土壤养分含量相较S-SP处理平均升高3.73%。盐胁迫条件下土壤钾素含量相较正常土壤条件显著增加,这可能是植物维持根际土壤Na⁺/K⁺稳态的初始防御响应,从而通过影响Na⁺、K⁺的选择性吸收与运输调控了花生体内Na⁺/K⁺稳态。相较S-SP处理,S-IP处理叶片Na⁺/K⁺降低了20.63%,叶片盐害系数（LSHC）减少了53.95%,光合潜力和光能转化效率得到明显改善,干物质积累能力和产量潜力也得到提高。其中S-IP增产潜力最为明显,相较2018年,2019年S-IP处理产量增加了17.95%。【结论】盐胁迫下连续花生//高粱间作能有效缓解花生的负相互作用,显著提高了花生盐耐受指数,并通过改善土壤养分状况和调控花生Na⁺/K⁺稳态缓解盐胁迫,维持了干物质积累能力和提高了产量潜力。

螺虫乙酯抑制西花蓟马卵孵化的蛋白质组学分析

周桂盈,杨晓敏,滕子文,孙丽娟,郑长英

中国农业科学. 2022, 55(15): 2938-2948. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.006

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【目的】前期研究发现,螺虫乙酯处理西花蓟马（Frankliniella occidentalis）0 h卵24 h后,造成卵壳破裂从而抑制卵孵化出若虫。本研究旨在探究螺虫乙酯处理西花蓟马0 h卵24 h后引起卵形态结构发生变化的原因,寻找螺虫乙酯抑制西花蓟马0 h卵孵化的关键蛋白,揭示螺虫乙酯抑制西花蓟马卵孵化的分子机制。【方法】以西花蓟马0 h卵为研究对象,使用浓度为14.42 mg·L^-1的螺虫乙酯处理24 h后,采用无标记定量（Label-free）蛋白质组学技术分析螺虫乙酯处理组与对照组之间的差异表达蛋白。利用Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG通路分析对筛选出的差异表达蛋白进行功能注释和通路分析等生物信息学分析,并通过平行反应监测（PRM）技术验证差异蛋白的表达量。【结果】螺虫乙酯处理后共有204个蛋白差异表达,其中124个蛋白表达量上调,80个蛋白表达量下调。生物信息学分析表明,上调的差异表达蛋白主要参与物质合成和代谢通路,下调的差异表达蛋白主要参与对外界刺激的防御反应通路。此外,利用PRM技术对差异表达蛋白进行鉴定,结果表明螺虫乙酯处理西花蓟马0 h卵24 h后,三磷酸鸟苷环水解酶1-1、三磷酸鸟苷环水解酶1-2、类谷胱甘肽硫-转移酶、脂酰辅酶A还原酶蛋白表达量显著上调,西花蓟马卵的类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2、类铜/锌-超氧化物歧化酶、O-乙酰基转移酶蛋白表达量显著下调,且类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2表达量下调最为明显。PRM技术验证结果与蛋白质组学的结果一致。【结论】上述蛋白可能在西花蓟马卵孵化过程中发挥多种功能,其中类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2与昆虫表皮分化等生命活动相关,推测螺虫乙酯抑制了类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2的表达,从而造成西花蓟马0 h卵出现卵壳破裂的现象,类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2可能在西花蓟马0 h卵孵化的过程中发挥重要作用。

RNA生物农药的商业化现状及存在问题

关若冰,李海超,苗雪霞

中国农业科学. 2022, 55(15): 2949-2960. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.007

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RNA生物农药是利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）原理,通过抑制生物体重要功能基因的表达,造成有害生物发育停滞或死亡,进而达到病虫害防控的目的。该技术不会改变有害生物的基因组,也不会对生态系统造成不良影响。由于RNA生物农药具有精准、高效、绿色无污染等优势,受到了植物保护专家的重视,将其称为“农药史上的第三次革命”。近年来,随着拜耳公司表达昆虫dsRNA的抗虫玉米MON87411获得多个国家的安全证书,引起各大传统农化公司投入大量人力物力进行布局和产品开发。此外,还吸引了资本市场的关注,涌现了一大批基于RNAi技术进行病虫害防控的新兴公司,极大地加速了RNA生物农药的产业化步伐。随着RNA生物农药的快速发展,必将改变全球农药市场格局,这无疑是一种新的挑战。尽管我国在该领域的研发起步较早,起点也很高,但是,大多数研究主要集中在基础理论,而应用开发相对薄弱,已经远远落后于国际同行。与传统农药相比,RNA生物农药无论是作用机理还是应用开发,均有其独特之处,亟需监管部门建立匹配的研发、应用、生产等技术标准。完善相应的法律法规,对生产进行监督指导,促进我国RNA生物农药的快速发展,降低国际农药巨头在该领域形成技术垄断的风险。基于此,本文系统总结了目前RNA生物农药的国内外研发现状、商业化概况、未来发展趋势及欧美国家针对RNA生物农药相关的法规政策。此外,本文也指出了RNA生物农药在研发以及产业化过程中一些亟需解决的问题,期望为国内RNA生物农药开发与监管提供有益的参考。

基于机器学习方法的宁夏南部土壤质地空间分布研究

申哲,张认连,龙怀玉,徐爱国

中国农业科学. 2022, 55(15): 2961-2972. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.008

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【目的】基于历史数据,利用机器学习方法分析宁夏南部土壤质地空间变异规律及其与环境因素之间的关系。【方法】基于宁夏回族自治区南部428 个20世纪80年代第二次土壤普查土壤剖面点数据,采用分类回归树（CART）和随机森林（RF）两种机器学习方法,结合地形因子、土壤类型、归一化植被指数,探究与宁夏南部地区土壤质地分布相关性较强的环境因素,并用两种机器学习预测该区土壤质地类型的空间分布,用剖面点验证集数据以及宁夏回族自治区海原县实测样点数据验证模型精度。【结果】（1）RF和CART对剖面点验证集土壤质地类型的预测正确率分别为 62.36%、55.29%,接收者操作特性（receiver operating characteristic,ROC）曲线下面积（area under roc curve,AUC）分别为0.7515、0.6933,对海原县122个实测样点的预测正确率分别为54.10%、48.36%,AUC分别为0.6599、0.5981,RF的预测精度高于CART。（2）该区土壤类型（ST）是与土壤质地空间分布相关性最强的环境因素,其次是高程（Ele）,高程越高,土壤质地越黏重。风力作用指数（WEI）和坡度（Slo）对土壤质地的影响较小。（3）研究区土壤质地类型以轻壤土为主,空间分布格局基本呈现为南部土壤质地黏重,北部土壤质地较轻。【结论】RF更适合预测宁夏南部地区土壤质地的空间分布,且充分利用历史数据,结合新的野外采样,可以达到预测制图的精度要求;土壤类型（ST）和高程（Ele）是与土壤质地空间分布相关性较强的环境因素。

有效积温与不同供氮水平夏玉米干物质和氮素积累定量化研究

陈杨,徐孟泽,王玉红,白由路,卢艳丽,王磊

中国农业科学. 2022, 55(15): 2973-2987. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.009

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【目的】探究基于有效积温的不同供氮水平夏玉米干物质和氮素积累动态预测模型及其特征参数,以期为利用有效积温预测夏玉米干物质和氮素积累提供理论依据。【方法】在河北廊坊进行两年大田试验（2019—2020年）,以郑单958为试验材料,利用归一化法,通过模型筛选拟合不同供氮水平夏玉米干物质和氮素积累基于播种后有效积温的归一化Gompertz模型,并利用增长速率曲线及其特征参数定量分析夏玉米干物质和氮素积累特征。【结果】（1）在本试验条件下,当磷钾肥适量时,随施氮量的增加夏玉米最大干物质和氮素积累量持续增加。（2）以有效积温为自变量建立的夏玉米干物质和氮素积累量的归一化Gompertz模型具有较好的生物学意义,方程的决定系数分别为0.9962—0.9988和0.9887—0.9922。利用第2年数据进行模型验证,模拟值和实测值的相关系数分别0.9933—0.9959和0.9830—0.9923,标准化的均方根误差分别为6.64%—16.86%和7.31%—12.68%,预测效果达到良好水平。（3）不同供氮水平夏玉米干物质和氮素积累的增长速率均表现为“单峰曲线”,其变化与供氮水平关系密切,在处理间表现为：适量施肥条件下,增长速率曲线呈现上升快下降也快的特点,减肥处理增长速率曲线呈现上升慢下降也慢的特点。（4）夏玉米播种后干物质和氮素积累快增期有效积温范围分别为709.35—1 722.54 ℃·d和482.50—1 507.61 ℃·d,氮素积累达最大速率所需有效积温为995.05 ℃·d,小于干物质积累达最大速率对积温的需求（1 215.94 ℃·d）。供氮水平明显影响夏玉米干物质和氮素积累进入快增期、缓增期、达到最大增长速率所需积温,同时还影响最大增长速率和快增期平均增长速率;与不施氮肥处理相比,适量氮肥处理夏玉米进入各关键期所需有效积温明显减少,关键期增长速率明显增加。【结论】归一化Gompertz模型不仅能够很好地模拟和预测不同供氮水平夏玉米干物质和氮素积累随有效积温的动态变化,还明确了有效积温与干物质和氮素积累的定量化关系。基于有效积温的Gompertz模型可以用来预测作物长势和最佳施肥时期,具有较强的应用价值。

有机肥替代部分化肥对椪柑生长、品质及土壤特性的影响

万连杰,何满,李俊杰,田洋,张绩,郑永强,吕强,谢让金,马岩岩,邓烈,易时来

中国农业科学. 2022, 55(15): 2988-3001. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.010

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【目的】通过有机肥替代等养分化肥对椪柑生长、产量、品质及土壤特性的影响研究,提出适宜的有机肥替代量,为柑橘化肥减量与提质增效技术提供理论依据。【方法】以15年生枳砧台湾椪柑为试验材料,设置不施肥（CK）、单施化肥（FP）、有机肥替代氮、磷、钾肥的比例分别为10%、25%、18%（T1）、有机肥替代氮、磷、钾肥的比例分别为15%、38%、27%（T2）、有机肥替代氮、磷、钾肥的比例分别为20%、51%、36%（T3）、有机肥替代氮、磷、钾肥的比例分别为30%、76%、54%（T4）,共6个处理,除CK外,各施肥处理的氮、磷、钾养分一致,2019—2020年连续两年系统研究等养分有机肥替代化肥对椪柑当年生叶片、花、果等的干物质量积累、产量与品质、土壤理化性质、土壤碳排放与硝态氮淋失的影响。【结果】（1）两年试验施肥处理的椪柑春、秋梢叶片,花和果实的干物质量变化趋势类似,即随有机肥替代比的增加呈先升后降的趋势,且总体上T1和T2处理更有利于叶片、花和果干物质量的积累。2019和2020年各有机肥替代处理的产量分别较FP处理增加了7.2%—26.4%和2.0%—36.9%;（2）与FP相比,2020年各有机肥替代处理的可溶性固形物显著增长了7.4%—9.8%,其他品质指标也有提升,且以T2和T3处理的效果较好;（3）2020年各有机肥替代处理的土壤pH和有机质含量较FP分别显著提高了4.6%—12.6%和16.4%—25.1%;（4）与FP相比,有机含量替代处理的土壤碳排放通量平均提高了20.1%、土层硝态氮含量减少了13.9%,且随有机肥替代比的增加,硝态氮向深层土壤的迁移量越小;（5）通过主成分分析及对主要指标进行综合评分,各处理得分从高到低顺序为T3、T2、T4、T1、FP、CK。【结论】本试验条件下以T3处理效果最佳,兼顾树体生长发育、土壤良好理化特性和果实优质丰产,并能一定程度减轻土层硝态氮淋失的风险。

基于SSR荧光标记的79份桃种质遗传多样性分析

王璐伟,沈志军,李贺欢,潘磊,牛良,崔国朝,曾文芳,王志强,鲁振华

中国农业科学. 2022, 55(15): 3002-3017. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.011

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【目的】利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对取自国家果树种质南京桃资源圃的79份种质进行基因分型和遗传多样性分析,筛选出多态性高的引物可用于桃品种间鉴定、亲缘关系分析,并用于分子标记辅助选种体系建立。【方法】对母本‘中油4号’进行从头测序,以物理距离1 Mb为单位在全基因组范围内开发SSR标记。以79个桃品种为材料进行PCR扩增,扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后筛选目标条带清晰且多态性丰富的标记。对筛选出的标记进行5′端荧光修饰,PCR产物在ABI3730XL测序仪测序,实现对标记的复筛。利用Genemapper 4.0软件对测序结果进行统计,Data Formater 2.1软件将统计得到的bp数据转换成Power Marker v3.25软件所需要的数据格式。对筛选出的引物进行多态性分析,选择多态信息含量（PIC）大于0.45的荧光SSR引物作为79份种质材料的核心引物。以Nei’s为参数,利用NTSYSpc 2.1软件中的UPDM聚类方法分析品种间的遗传多样性。利用基于贝叶斯模型的Structure v2.3.4软件解析79份种质的居群遗传结构。【结果】基于79份种质,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对覆盖全基因的SSR标记进行初筛,共筛选出207对多态性良好的引物;利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对207对引物进行复筛,最终筛选出26对核心引物,利用其中5对核心引物可将79份品种完全区分开。26对SSR核心引物在79份桃种质中共扩增出174种多态性基因型,每对引物扩增出的基因型为4—13种,平均每对引物扩增出6.69个基因型,每对引物的多态信息含量PIC在0.45以上。基于207对SSR引物在79份种质中扩增出的位点信息,构建了79份种质的遗传关系图谱和居群遗传结构图。207对引物从遗传距离上将79份种质划分为7组,从居群结构上分为2组。79份品种遗传多样性较高,部分品种聚类结果与系谱图相符。【结论】构建了79份材料的聚类分析图和居群遗传结构图,在一定程度上揭示了79份材料的亲缘关系。由于桃复杂的遗传背景,不能依据单一特性对品种间亲缘关系进行判定。本研究筛选出的26对核心引物可用于全基因组范围内连锁性状的鉴定、桃种质资源鉴定、新品种鉴定及保护、分子标记辅助育种体系构建。

基于国家果树种质南京桃资源圃的桃褐腐病抗性评价

沈志军, 田雨, 蔡志翔, 徐子媛, 严娟, 孙朦, 马瑞娟, 俞明亮

中国农业科学. 2022, 55(15): 3018-3028. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.012

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【目的】褐腐病是危害桃果实的最严重病害之一,在采收前后造成大量果实损失,开展桃褐腐病抗性的系统鉴定评价,筛选抗性资源,为褐腐病抗性育种的亲本选配提供遗传资源,是解决栽培品种褐腐病抗性不强的长久之策。【方法】2018—2021年,以国家果树种质南京桃资源圃的种质资源为试材,采收8.0—8.5成熟度的果实,无损接种616份,有损接种505份,观测无损接种的病果率每天增加百分比（%）和有损接种的病斑直径扩展速率（cm·d^-1）,以平均值和0.5标准差建立9级抗性评价体系,比较不同种质类型、果实类型、来源地的褐腐病抗性,并分析抗性指标与其他果实性状的相关性。【结果】无损接种病果率每天增加百分比为（11.22±5.96）%,变异系数为35.48,基于此指标建立的9级抗性评价体系中,抗性1级（<0.80%）的种质资源缺失,2级（0.80—3.78%）中含有10份抗性较强的种质资源,3级（3.78%—6.76%）134份,4级（6.76%—9.73%）157份,5级（9.73%—12.71%）122份,6级（12.71%—15.68%）73份,7级（15.68%—18.66%）60份,8级（18.66%—21.64%）21份,9级（>21.64%）39份。无损接种病斑直径扩展速率为（1.71±0.21）cm·d^-1,变异系数为0.18,基于此指标的9级评价体系中,1级（<0.98 cm·d^-1）含11份种质资源,2级（0.98—1.19 cm·d^-1）28份,3级（1.19—1.40 cm·d^-1）72份,4级（1.40—1.61 cm·d^-1）109份,5级（1.61—1.83 cm·d^-1）103份,6级（1.83—2.04 cm·d^-1）82份,7级（2.04—2.25 cm·d^-1）45份,8级（2.25—2.46 cm·d^-1）29份,9级（>2.46 cm·d^-1）26份。无损接种病果率每天增加百分比（y）与有损接种病斑扩展速率（x）的回归为关系为y=6.2073x（R²=0.1839）,线性程度较低。分组均值比较发现中国桃野生资源相对具有较强的褐腐病抗性,是抗性资源挖掘的重点。无损接种病果率每天增加百分比与有损接种病斑扩展速率2个指标均与果实带皮硬度（r=-0.234）和去皮硬度（r=-0.240）呈极显著负相关,与单果重（r=0.427）和着色程度（r=0.319）呈极显著正相关,但相关系数较低。【结论】分别建立了基于无损接种病果率每天增加百分比（%）和有损接种病斑直径扩展速率（cm∙d^-1）的褐腐病抗性9级评价体系;筛选出抗侵染能力较强的种质资源10份,抗扩展能力较强的种质资源11份。

超快速冷却对冷鲜羊肉风味品质的影响

颜统晶,张德权,李欣,刘欢,方菲,刘珊珊,王素,侯成立

中国农业科学. 2022, 55(15): 3029-3041. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.013

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【目的】明确超快速冷却对冷鲜羊肉风味物质的影响,为超快速冷却技术在产业中应用提供理论依据与数据支撑。【方法】对宰后1 h分割的羊米龙肉分别进行常规冷却（冷却速率为1.94℃·h^-1）和超快速冷却（冷却速率为15.10℃·h^-1）处理,测定其贮藏过程核苷酸、游离氨基酸与挥发性风味物质含量的变化规律,并计算其滋味活性值、气味活性值,确定冷鲜羊肉中关键的风味物质。【结果】通过滋味活性值分析确定5'-鸟苷酸、丙氨酸、谷氨酸为冷鲜羊肉的关键滋味物质。通过气味活性值分析确定13种化合物为冷鲜羊肉的关键挥发性风味物质,其中包括8种醛、4种醇与1种呋喃类物质。醛类物质包括戊醛、反-2-辛烯醛、壬醛、庚醛、反,反-2, 4-壬二烯醛、反-2-壬醛、辛醛、己醛;醇类物质包括己醇、反-2-辛烯-1-醇、辛醇、1-辛烯-3-醇;呋喃物质为2-戊基-呋喃。随着贮藏时间的延长,常规冷却处理组羊肉中呈味核苷酸5'-腺苷酸、5'-肌苷酸和5'-鸟苷酸逐渐降解成次黄嘌呤与肌苷,甜味氨基酸丝氨酸与苦味氨基酸缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸显著增加,1-辛烯-3-醇、己醛、辛醛等挥发性风味物质逐渐积累,使冷鲜羊肉风味品质发生变化。超快速冷却处理延缓了羊肉中呈味核苷酸5'-腺苷酸和5'-鸟苷酸的降解,延缓了羊肉中谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸等游离氨基酸与1-辛烯-3-醇、己醛、辛醛、壬醛、庚醛、己醇、2-戊基-呋喃等挥发性风味物质的形成,在保持羊肉鲜味的同时降低了苦味氨基酸、醛类、醇类物质对羊肉风味品质产生的不利影响。聚类分析结果表明,超快速冷却处理组宰后72 h的冷鲜羊肉与常规冷却处理组宰后6 h的冷鲜羊肉风味品质接近。【结论】超快速冷却处理延缓了冷鲜羊肉中风味物质与滋味物质的变化,使冷鲜羊肉的风味品质保持在接近僵直前期的状态。

猪群体一步法基因组选择应用效果评估

周隽,林清,邵宝全,任端阳,李加琪,张哲,张豪

中国农业科学. 2022, 55(15): 3042-3049. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.014

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【背景】在提高畜牧生产效率中,遗传育种的贡献率占比最高。通过育种可使畜牧企业提高生产效率,获得最大的经济效益。目前,基因组选择已经成为动植物育种中广泛应用的技术手段。基因组选择能够利用覆盖全基因组的高密度标记对育种值进行估计,与系谱信息相比,利用这些标记得到的个体间平均亲缘关系更加准确,从而能更准确地估计育种值（Estimate breeding values, EBV）,对个体进行选育。在实际育种中,对所有个体进行基因分型是不现实的,尤其是猪这种个体经济价值较小的物种,这限制了基因组选择在猪育种中的应用。一步法（single-step genomic best linear unbiased prediction,ssGBLUP）能够同时利用系谱和基因型信息,允许只测定部分个体的基因型,在保持较高预测准确性的同时,大大降低基因分型成本。目前,已经有很多研究表明,在猪育种中使用基因组选择方法能够提高预测准确性,但在实际育种中,育种成本也是畜牧企业考虑的一个重要问题。因此,如何经济有效地实施育种方案,具有重大的研究价值。【目的】通过对一步法基因组选择在杜洛克猪群体评估效果的研究,为基因组选择育种方案提供依据。【方法】以福建某猪场2009—2018年出生的杜洛克猪群体的3个重要经济性状为研究对象,比较了BLUP、GBLUP和一步法等方法在杜洛克猪生长性状上的基因组预测准确性与估计育种值预测可靠性,探究了当参考群中具有不同比例的基因型个体时,一步法预测准确性的变化规律。【结果】（1）达100 kg日龄、背膘厚和眼肌面积的遗传力分别为0.257±0.038、0.250±0.039和0.399±0.040;（2）ssGBLUP相比于BLUP准确性提升14.7%—51.1%;相比于GBLUP准确性提升13.4%—45.7%;（3）10%—30%的个体有基因型时,ssGBLUP预测的准确性超过BLUP;在40%—60%的个体有基因型时,准确性提升速度降低,趋于平缓。【结论】（1）与BLUP相比,一步法能提高各性状估计育种值的准确性和可靠性;与GBLUP方法相比,只有无基因型个体的系谱信息时一步法略低于GBLUP,但在加入无基因型个体的表型信息后,一步法表现优于GBLUP。（2）随着参考群中测定基因型个体的比例逐渐提高,不管使用哪种筛选测定基因型个体的方式（随机选取和筛选关键个体）,一步法预测效果都逐渐提高。表明,在企业育种预算有限时,即使只测定部分个体基因型,一步法可提高基因组选择的预测效果。

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

李丽莹,何颖婷,钟玉宜,周小枫,张豪,袁晓龙,李加琪,陈赞谋

中国农业科学. 2022, 55(15): 3050-3061. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.015

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【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

魏天,王成宇,王凤杰,李忠鹏,张芳毓,张守峰,扈荣良,吕礼良,王永志

中国农业科学. 2022, 55(15): 3062-3070. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.15.016

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【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。

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