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2019年 第52卷 第9期 刊出日期：2019-05-01

  

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中国农业科学. 2019, 52(9):  0. 

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相关文章 | 多维度评价

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

利用荧光SSR分析中国糜子的遗传多样性和群体遗传结构

寇淑君, 霍阿红, 付国庆, 纪军建, 王瑶, 左振兴, 刘敏轩, 陆平

中国农业科学. 2019, 52(9):  1475-1477.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.001

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【目的】利用荧光SSR研究中国糜子的遗传多样性与群体遗传结构,为糜子品种改良、种质创新和资源利用提供依据。【方法】用不同地理来源且表型差异较大的6份糜子材料对SSR引物进行筛选,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳获得条带清晰、稳定性好、多态性高的糜子SSR引物,对筛选出的引物5′末端进行6-FAM、HEX、ROX和TAMRA荧光标记,利用基因分析仪检测不同等位变异的扩增片段大小,并以此来分析131份糜子材料的遗传多样性和群体结构。【结果】从202对SSR引物中共筛选出22对扩增稳定、多态性好的SSR引物,能同时适用于传统变性PAGE胶电泳和荧光SSR标记-全自动分析检测技术。22对SSR引物共检测出128个主要等位变异,平均每个位点5.82个;基因多样性指数变化范围为0.3572—0.8132,平均0.6284;多态性信息含量为0.2934—0.8150,平均0.5874;Shannon多样性指数为0.5427—1.7681,平均1.2062。不同生态区糜子种质间遗传距离的变化范围为0.0764—0.7251,平均0.3121,遗传一致度的变化范围为0.4843—0.9265,平均0.7465。其中,北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区的遗传距离最小,遗传一致度最高,亲缘关系较近。UPGMA聚类分析显示,北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区的材料聚为一类,个体间聚类,东北春糜子区的育成品种和农家种聚类结果一致,黄土高原春夏糜子区的育成品种在多个组群中都有出现。通过绘制K与△K的关系图,K=4时,△K最大,据此将131份糜子材料划分为4个类群,类群Ⅰ代表北方春糜子区;类群Ⅱ主要来自东北春糜子区;类群Ⅲ主要是北方春糜子区,群组Ⅳ主要是黄土高原春夏糜子区。各群体中大部分品种亲缘关系单一,少数品种含有其他组群的遗传成分。基于遗传距离的聚类分析与群体遗传结构分析结果基本一致,表明糜子的遗传差异与地理来源相关。【结论】北方春糜子区和黄土高原春夏糜子区的遗传多样性比较丰富,东北春糜子区的育成品种主要以农家种为遗传背景选育而来,黄土高原春夏糜子区在育种过程中引种资源广泛,与其他生态区存在基因交流。

陆地棉亲本间遗传距离与杂种优势的相关性研究

曲玉杰, 孙君灵, 耿晓丽, 王骁, ZareenSarfraz, 贾银华, 潘兆娥, 何守朴, 龚文芳, 王立如, 庞保印, 杜雄明

中国农业科学. 2019, 52(9):  1488-1501.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.002

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【目的】通过1 500个陆地棉杂交组合分析杂种优势与其亲本间数量性状遗传距离的相关性,探讨能否利用大规模杂交组合亲本间遗传距离提高陆地棉杂种优势预测效果,以期为棉花杂交育种和杂种优势利用提供理论指导。【方法】选择来自15个国家和中国23个省（市）的305份陆地棉核心种质为亲本,采用L×T（Line×Tester）杂交设计配制1 500个杂交组合。2012—2013年,在中国南北方13个生态环境下考察其株高、单铃重、衣分、纤维长度等10个产量和纤维品质相关性状,分析F₁杂种优势、亲本间遗传距离和群体结构,并采用4种方式（Cor1—Cor4）计算遗传距离与杂种优势的相关性。【结果】10个性状中亲优势（MPH）均值的变幅为1.70%—7.40%,平均为4.36%,按父本不同将F₁分成5组（A,E）,其MPH均值A>E>B>C>D;超亲优势（HB）均值的变幅为-4.17%—1.87%,平均为-0.17%,A、B和E组的HB均值皆为正。10个性状在5组中除D、E组的马克隆值之外,其他性状普遍具有明显的中亲优势,其中,单铃重和纤维长度的中亲优势在5组中均以正优势为主（达80%以上）,最大值分别为34.01%和9.83%,对应的超亲优势分别为24.25%和5.80%。F₁和亲本差异显著性分析表明单铃重、株高、纤维长度、伸长率和整齐度指数整体表现出一定的超亲优势。父本（测试种）与300个母本之间的遗传距离介于2.280—61.430,平均为21.550,5个测试种与母本间的平均遗传距离D>C>E>A>B,其中,最近值为11.721,最远值为33.271。按最小方差聚类,将305个陆地棉亲本划分为2个主群,包括5个亚群。4种遗传距离与杂种优势的相关性分析结果显示,因样本量、遗传距离变幅和父本不同其结果有所差异,相关性随样本量的增大而有所增强。其中,Cor1是Cor2结果的整体体现;Cor3与Cor1和Cor2相比,部分性状的中亲优势与遗传距离的相关性有所不同;Cor4的相关性最弱。综合来看,遗传距离与衣分、断裂比强度、整齐度指数和纺纱均匀性指数的中亲优势呈显著正相关,遗传距离与其他性状的中亲优势的相关性因采用的分析方案不同,结果有所不同;在4种方案中,除整齐度指数外,遗传距离与超亲优势的相关性整体表现负相关。其中,遗传距离与马克隆值、纤维长度和衣分的超亲优势相关性较强。【结论】陆地棉亲本间数量性状遗传距离与杂种优势有一定的线性关系,不同性状的杂种优势与遗传距离的相关性存在正负和强弱差异,且样本量越大相关性越强。说明基于大规模杂交组合研究陆地棉亲本间遗传距离与杂种优势的关系效果显著。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

播/收期对冬小麦-夏玉米一年两熟模式周年 气候资源分配与利用特征的影响

周宝元, 马玮, 孙雪芳, 高卓晗, 丁在松, 李从锋, 赵明

中国农业科学. 2019, 52(9):  1501-1517.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.003

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【目的】优化冬小麦-夏玉米一年两熟模式周年气候资源配置,探索两季最佳的资源搭配模式,进一步挖掘当前气候和生产条件下黄淮海地区周年产量潜力和资源利用效率。【方法】本研究通过10月上旬至12月上旬设置冬小麦不同播期和夏玉米不同收获期,建立了5种冬小麦-夏玉米一年两熟模式周年气候资源分配方式,于2015—2017年在中国农业科学院河南新乡试验站进行田间试验,对其产量、光温水等气候资源分配及利用特征进行研究。【结果】随冬小麦播期及夏玉米收获期推迟,两作物生长季光温水资源分配比例分别由处理Ⅰ的46%﹕54%、60%﹕40%、42%﹕58%调整至处理V的34%﹕66%、49%﹕51%、34%﹕66%范围内,小麦季生长天数及其分配的光温水资源量逐渐减少,将更多的资源分配到玉米季,从而导致小麦产量降低,但由于处理V的ZM66小麦品种维持了较高的穗数和穗粒数,因此与处理Ⅰ比产量降低不显著。然而,处理V玉米季生理生长时间较处理Ⅰ延长约15 d,2016和2017年光温水资源分配量分别增加143.8和120.7 MJ·m^-2、290.5和281.6℃、12.4和25.7 mm,粒重分别增加13.1%和15.5%,周年产量两年分别提高7.9%和6.7%;籽粒脱水时间增加约45d,光温水资源分配量两年分别增加322.5和336.3 MJ·m^-2、509.6和497.8℃、56.7和14.1mm,籽粒含水量降至14.4%—17.3%,达到机械直接收获标准。同时,由于处理V小麦季光温水资源分配量显著降低,特别是减少底墒水和越冬水灌溉约150mm,2016和2017年其光能、温度和水分生产效率较处理Ⅰ分别提高12.5%和15.8%、10.9%和7.7%、39.6%和59.3%,玉米季虽然光能、温度生产效率有所降低,但水分生产效率显著提高,因此周年光能、温度和水分生产效率两年分别提高7.3%和9.1%、5.6%和5.1%、17.3%和29.3%。【结论】在不增加任何投入的前提下通过播/收期的调整（小麦12月上旬播种,玉米11月中旬收获）优化冬小麦-夏玉米一年两熟模式周年气候资源配置,可进一步提升其周年产量和光温水资源利用效率,对于促进黄淮海冬小麦-夏玉米种植模式可持续发展具有重要意义。

倒伏胁迫下玉米抽雄期叶面积密度光谱诊断

周龙飞, 顾晓鹤, 成枢, 杨贵军, 孙乾, 束美艳

中国农业科学. 2019, 52(9):  1518-1528.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.004

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【目的】叶面积密度（leaf area density,LAD）反映作物在垂直方向上体积内叶面积总量的差异,体现作物冠层内叶面积随着高度变化的分布状况。本文旨在探索玉米叶面积密度对于倒伏胁迫强度的表征能力及其光谱响应规律。【方法】以抽雄期倒伏夏玉米为研究对象,获取倒伏后玉米多期LAD及冠层光谱数据,对倒伏玉米冠层光谱进行一阶微分和小波变换处理,根据LAD与冠层光谱一阶微分及小波分解系数的相关性分析,筛选LAD敏感波段和最佳小波分解尺度,采用偏最小二乘法构建倒伏玉米LAD光谱诊断模型,并利用实测样本验证模型精度。【结果】玉米LAD随着倒伏胁迫程度的增强而增大,LAD可有效表征玉米倒伏胁迫强度及其自身恢复能力;玉米倒伏后冠层结构发生较大变化,倒伏玉米冠层光谱反射率较正常玉米整体增高,近红外波段的增幅相比可见光波段更高,倒伏强度越强则光谱反射率越高;LAD敏感波段主要分布在蓝光波段354—442、472—495 nm和红光波段649—829 nm以及近红外波段903—1 195 nm和1 564—1 581nm;同一阶微分处理相比,基于连续小波变换的玉米倒伏LAD诊断模型的验证R²提高6.08%—9.11%,RMSE降低23.08%—31.63%;小波分解尺度对LAD诊断精度有一定的影响,中低尺度模型精度优于高尺度模型,其中第5尺度构建的模型对LAD的拟合效果最优（R²=0.898,RMSE=1.016）。【结论】利用连续小波变换技术对玉米冠层高光谱解析,可有效诊断倒伏胁迫下的玉米叶面积密度,可以为玉米倒伏胁迫灾情遥感监测提供必要的先验知识。

植物保护

葡萄霜霉病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

李文学, 肖瑞刚, 吕苗苗, 丁宁, 石华荣, 顾沛雯

中国农业科学. 2019, 52(9):  1529-1540.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.005

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【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物（F-cox-Pv/R-Pv）,建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄白粉病菌（Uncinula necator）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌（C. capsica）、甘草根腐病菌（Fusarium solani）、西葫芦白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、番茄菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、马铃薯干腐病菌（F. equiseti）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL ^-1,real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL ^-1,是常规PCR检测灵敏度的100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值（Ct）与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R ²=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10 ³—2.4×10 ⁹ copies/μL呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×10 ⁴·e ^{0.084 x},相关系数R ²=0.936。该real-time PCR检测体系在接种6 h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×10 ⁴ copies/μL病原菌DNA。 【结论】构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量。

不同Bt蛋白对捕食性天敌大草蛉的生态安全性评价

赵曼, 汤金荣, 牛琳琳, 陈琳, 梁革梅

中国农业科学. 2019, 52(9):  1541-1552.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.006

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【目的】明确转基因棉花中表达Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab蛋白对我国Bt棉田中主要捕食性天敌大草蛉（Chrysopa pallens）的潜在影响。【方法】通过在大草蛉人工饲料中添加高剂量Bt蛋白的方法,评价Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab蛋白对大草蛉重要生命表参数（4龄幼虫体重、幼虫发育历期、化蛹率、蛹重、蛹发育历期、羽化率、成虫体重和产卵量）的影响,以不添加杀虫物质的大草蛉纯人工饲料作为阴性对照,以添加PA（砷酸二氢钾,KH₂AsO₄）的大草蛉人工饲料作为阳性对照;同时,利用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）测定取食Bt蛋白处理饲料后,大草蛉幼虫、蛹以及成虫体内的Bt蛋白浓度;利用ELISA法和敏感昆虫生物测定法,检测新鲜饲料和在试验环境条件下暴露2 d的处理饲料中Bt蛋白的稳定性和生物活性;此外,利用酶活性测定的方法,比较取食空白对照饲料、Bt蛋白处理饲料或PA处理饲料后大草蛉体内主要消化酶（总蛋白酶、类胰蛋白酶、类凝乳蛋白酶和氨肽酶）、解毒酶（α-乙酸萘酯酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、乙酰胆碱酯酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶）和保护酶（超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶）的活性。【结果】生命表评价结果表明,在大草蛉人工饲料中添加高浓度单独Bt蛋白或Bt蛋白混合物,对大草蛉4龄幼虫体重、幼虫发育历期、化蛹率、蛹重、蛹发育历期、羽化率、成虫体重和产卵量无显著性不利影响,但饲料中添加PA却能够使大草蛉幼虫和蛹发育历期极显著延长,4龄幼虫体重、化蛹率、蛹重、羽化率、成虫体重和产卵量极显著降低;大草蛉体内Bt蛋白浓度测定结果显示,大草蛉取食Bt蛋白处理饲料后,其幼虫、蛹及成虫体内均含有一定量的Bt蛋白;ELISA和敏感昆虫生物测定结果表明,新鲜准备和在试验环境条件下暴露2 d的Bt蛋白处理饲料,均含有高剂量且具有生物活性的Bt蛋白,因此,大草蛉在整个生物测定过程中接触到的均为高浓度的、具有生物活性的Bt蛋白;此外,取食Bt蛋白处理饲料,对大草蛉幼虫和成虫体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性无显著性影响,但取食PA处理饲料能使大草蛉幼虫和成虫体内氨肽酶活性极显著降低,其他所测消化酶、解毒酶和保护酶活性显著升高。【结论】大草蛉对3种供试Bt蛋白（Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab）不敏感,取食这3种Bt蛋白对大草蛉生长发育及其体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性没有显著不良影响,本研究所建立的生物评价体系还可用于评价其他新型转基因抗虫植物中表达杀虫蛋白对大草蛉的生态安全性。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

添加玉米秸秆对旱作土壤团聚体及其有机碳含量的影响

王碧胜,于维水,武雪萍,高丽丽,李景,李生平,宋霄君,刘彩彩,李倩,梁国鹏,蔡典雄,张继宗

中国农业科学. 2019, 52(9):  1553-1563.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.007

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【目的】研究玉米秸秆还田对不同耕作处理下旱地土壤团聚体及其有机碳的影响,旨在探究长期传统耕作土壤添加秸秆后团聚体及其有机碳的变化规律,并确定添加秸秆提高土壤有机碳的主要原因,为旱地农田固碳技术提供理论依据。【方法】采集大田长期试验地的传统耕作和免耕小区土样进行室内培养试验,设置4个处理,分别为传统耕作土壤不加秸秆（CT）、免耕土壤不加秸秆（NT）、传统耕作土壤加秸秆（CTS）和免耕土壤加秸秆（NTS）,15次重复;秸秆为传统耕作玉米植株地上部分,用量为5%烘干土质量,在25℃恒温培养箱中通气培养180 d,定期取样进行团聚体组成和有机碳含量的测定。【结果】（1）不加秸秆处理团聚体以250—53 μm为主,占全部团聚体的52%—66%;添加秸秆处理以2 000—250 μm团聚体为主,占全部团聚体的41%—50%,CTS较CT提高230%—302%,NTS较NT提高92%—134%。（2）添加秸秆处理平均重量直径（MWD）、几何平均直径（GMD）以及>0.25 mm团聚体百分比（R_0.25）显著提高,培养到180 d时,CTS较CT分别提高133%、130%和235%,NTS较NT分别提高53%、75%和87%。（3）培养至180 d时,CTS较CT分别提高250—53 μm和<53 μm团聚体有机碳70%和54%;NTS较NT分别提高250—53 μm和<53 μm团聚体有机碳30%和25%。（4）添加秸秆显著提高2 000—250 μm团聚体有机碳对土壤有机碳的贡献率,CTS和NTS分别为49%—61%和50%—60%,且受团聚体组成影响较大。【结论】添加秸秆能够有效提高旱作土壤大团聚体（>250 μm）形成并增强其稳定性,提高大团聚体有机碳对土壤有机碳的贡献率,且对传统耕作处理土壤的促进效果更明显。

我国典型农田土壤中有机物料腐解特征及驱动因子

马想, 徐明岗, 赵惠丽, 段英华

中国农业科学. 2019, 52(9):  1564-1573.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.008

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【目的】研究不同有机物料在我国典型农田土壤中的腐解残留率变化。结合气候、土壤等环境因素,阐明秸秆和粪肥在我国农田土壤中的腐解特征及其主控因素,为因地制宜的合理利用有机资源和培肥土壤提供科学依据。【方法】在“国家土壤肥力肥效监测基地”中的黑土、潮土和红壤实验站,开展大田填埋试验。有机物料烘干后过2 mm筛,置于48 μm孔径尼龙网袋后填埋在土壤中。共4种供试有机物料：小麦秸秆（WS）、玉米秸秆（MS）、猪粪（PM）和牛粪（CM）。根据各地温度差异,分别在填埋后49—360 d内采样6次。通过分析腐解过程中有机碳含量的变化,整合土壤积温与腐解残留率的相关关系,采用VPA（方差分解分析）定量化气候因子,有机物料性质及土壤养分对不同有机物料腐解的相对贡献率。【结果】秸秆的腐殖化系数为11%—39%,粪肥的为50%—57%,秸秆腐解速率显著高于粪肥,且南方红壤上腐解速率高于北方黑土。地积温方程可拟合有机物料腐解残留率变化,由该方程可知,秸秆和粪肥易分解碳库占比分别为76%和43%,稳定碳库分别为17%和53%。但秸秆和粪肥易分解碳库的分解速率常数（k）无显著差异,其周转积温（1/k）约为1 400—2 000℃。物料性质是有机物料腐解的最主要影响因子,贡献率为28%;其次是气候,贡献率为20%。秸秆腐解过程中主要影响因子为气候因子、有机物料性质和土壤因子三者的交互作用,贡献率达42.3%。粪肥腐解过程中主要影响因子为气候因子,贡献率为38.3%。【结论】秸秆腐解速率和其有机碳库中易分解碳库比例明显高于粪肥,秸秆腐解受到气候、土壤和物料性质协同作用影响,而粪肥则受气候因子影响最大。在田间秸秆还田时需结合当地水热条件确定还田时间和还田量,粪肥则建议在还田前进行堆腐,且注意施用时间。

吡咯伯克霍尔德菌WY6-5的溶磷、抑菌与 促玉米生长作用研究

宫安东, 朱梓钰, 路亚南, 万海燕, 吴楠楠, CheeloDimuna, 龚双军, 文淑婷, 侯晓

中国农业科学. 2019, 52(9):  1574-1586.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.009

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【目的】筛选兼具高效溶磷和抑菌作用的微生物,检测其溶磷效果和抑菌活性,鉴定抑菌代谢产物,并分析筛选微生物对植物生长的作用,为新型多功能抑菌微生物菌肥的研发提供材料。【方法】采集信阳毛尖茶车云山茶厂百年龄茶树根际土壤,稀释后涂布难溶性无机磷或难溶性有机磷培养基表面,培养后检测溶磷活性,测定溶磷圈直径,筛选具有高效溶磷作用的微生物,进行后续溶磷效果分析。高效溶磷菌WY6-5接种于培养液和土壤中,检测不同培养时间下,可溶性磷含量的变化规律,分析菌株WY6-5的溶磷活性;玉米盆栽土壤中接种菌株WY6-5菌液,种植27 d后分析玉米植株长势,检测溶磷菌WY6-5对苗期玉米生长的影响;采用双皿对扣培养法,验证菌株WY6-5产挥发性物质的抑菌作用,检测其对不同病原真菌的广谱抑菌效果,气相色谱串接质谱（GC-MS/MS）分析挥发性代谢物质,鉴定主效抑菌成分。【结果】筛选到3个兼具有降解难溶性无机磷和有机磷作用的微生物菌株,尤以菌株WY6-5溶磷效果最优。培养基培养条件下,对难溶性无机磷的溶解直径达2.3 cm,溶磷圈直径与菌落直径比为4.6;对难溶性有机磷溶解直径3.6 cm,溶磷圈直径与菌落直径比达7.2。表型观察、生理生化鉴定和系统发育树分析表明,菌株WY6-5为乳白色细菌,16S rRNA序列与Burkholderia pyrrocinia CIP 105874和Burkholderia stabilis CIP 106845两个菌株的同源性最高,进化树中聚成独立一支。另外,WY6-5与Burkholderia pyrrocinia具有高度相同的生理生化反应结果。因此,本研究将WY6-5鉴定为吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）。WY6-5在液体培养和土壤中均具有较好的溶磷活性,20 d培养时间内,液体培养液中磷含量最高达520.4 mg·L ^-1,为对照组176倍;土壤试验3—20 d期间,WY6-5处理组可溶性磷含量均高于对照组,且在盆栽试验中,能高效促进苗期玉米植株的生长,处理组叶长、叶宽、叶片数、茎粗、株高、鲜重等指标显著优于对照组;同时,菌株WY6-5还可产生挥发性抑菌物质,高效广谱抑制8种重要病原真菌的生长,抑菌率最高达100%,经GC-MS/MS检测发现,挥发性物质含有一种主效抑菌物,相对丰度达97%以上,鉴定为二甲基二硫。 【结论】吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）WY6-5分离自茶树根际土壤,在培养基、培养液和土壤环境下,均具有高效的溶磷效果,将难溶性的无机磷转化为植物可吸收的可溶性磷,并促进苗期玉米植株的生长;同时该菌还可产生挥发性抑菌物质二甲基二硫,高效抑制8种重要植物病原真菌的生长,抑制率最高达100%。菌株WY6-5兼具有提升土壤磷肥力、促进植物生长和和抑制真菌病害等多种重要作用,具有较好的生物学功能。

园艺

西瓜果实表皮蜡粉的化学成分与基因定位

龚成胜, 赵胜杰, 路绪强, 何楠, 朱红菊, 豆峻岭, 袁平丽, 李兵兵, 刘文革

中国农业科学. 2019, 52(9):  1587-1600.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.010

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【目的】蜡粉是植物抵御外界胁迫的第一层保护性屏障,对西瓜果实表皮蜡粉的结构、化学成分、遗传规律进行研究,并预测控制该性状的基因,以便全面了解性状的生理生化作用,发掘候选基因。【方法】试验选用无蜡粉的西瓜自交系‘美佳选黑’（P₁）和有蜡粉的西瓜自交系‘FH’（P₂）为双亲配制杂交组合,构建六世代群体（P₁、P₂、F₁、F₂、BC₁P₁、BC₁P₂）,利用扫描电子显微镜（SEM）对双亲成熟期果实表皮结构进行观察,通过气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对蜡粉的化学成分进行测定,以峰面积为指标,定量计算蜡粉化学成分的含量,采用BSA-seq对西瓜表皮蜡粉进行基因初定位,应用BLAST软件将定位区间内的编码基因与多个数据库比对完成基因信息注释,并通过详细的基因注释信息及突变位点分析,快速筛选候选基因。【结果】西瓜果实表皮蜡粉为灰白色,呈致密的板状结构,长度约为5 μm;无蜡粉材料表皮较为光滑,无蜡粉层附着。GC-MS分析显示,蜡粉中共检测到24种脂肪族化学成分,分别属于烃类、醇类、酯类、酸类、酚类和醛类。包括烃类物质10种,含量占表皮蜡粉有效化学提取物总含量的77.72%,链长变化范围为C17—36,主要为C27、C28、C29、C32、C33、C34、C36的饱和正链烷烃;醇类物质5种,占12.60%;酯类物质5种,占0.43%;酸类物质2种,占0.53%;酚类1种,占0.80%;醛类1种,占3.99%;含量最高的5种化学成分依次为：正三十四烷、正二十九烷、1,30-三十烷二醇、正三十三烷、正二十八烷。在后代群体中,F₁、BC₁P₂群体西瓜果实表皮全部有蜡粉,F₂群体有蜡粉和无蜡粉西瓜果实的分离比符合3﹕1的孟德尔分离比例,BC₁P₁回交群体有蜡粉和无蜡粉分离比符合1﹕1的理论比,说明蜡粉的有无符合单基因显性遗传模式,有蜡粉对无蜡粉为显性。对BSA-seq数据进行SNP和InDel关联分析,关联结果取交集得到1号染色体3.16—4.84 Mb的候选区域,该区域共含有144个基因。数据库比对结果显示,在关联区域中,共138个基因有功能注释,包括10个非同义突变,1个移码突变。结合已有文献报道,其中5个非同义突变基因可能与西瓜表皮蜡粉的生成有关：Cla002367为烯酰ACP-还原酶（ECR）类基因,该类基因是特长链脂肪酸合成所必须;Cla011514、Cla002337和Cla002342为细胞色素P450（CYP）家族基因,该家族部分编码蛋白能够通过烃基羟化等反应催化脂肪族化合物的生成;Cla002353的基因注释信息为ABC转运体,ABC转运体与蜡质分子的转运息息相关。【结论】西瓜果实表皮蜡粉为板状结构,主要由特长链脂肪酸衍生成的脂肪族化合物组成。该性状是单基因遗传,有蜡粉为显性性状。BSA关联分析得到1号染色体1.68 Mb的关联区域,并预测关联区域中Cla002367、Cla011514、Cla002337、Cla002342、Cla002353这5个非同义突变基因为调控西瓜果实表皮蜡粉性状的候选基因。

基于CAPS标记的甜瓜单果重相关性状QTL分析

刘相玉, 张裕舒, 刘柳, 刘识, 高鹏, 王迪, 王学征

中国农业科学. 2019, 52(9):  1601-1613.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.011

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【目的】基于甜瓜全基因组重测序技术,挖掘SNP位点并开发CAPS标记,构建遗传连锁图谱。初步为甜瓜单果重相关性状进行QTL定位,为甜瓜单果重相关基因挖掘奠定理论基础。【方法】选取栽培甜瓜品系M4-130为母本,野生甜瓜品系X207为父本,构建F_2:3群体材料。对甜瓜果实单果重、果实长宽、果肉厚度、果形指数及可溶性固形物含量等性状进行相关性分析。对亲本材料进行20×深度重测序,利用BWA、SAMTools、VCFTools等软件在全基因组范围内挖掘双亲SNP位点,利用SNP2CAPS软件结合甜瓜基因组上的限制性内切酶酶切位点开发CAPS标记,建立遗传连锁图谱。最后采用复合区间作图法对甜瓜果实单果重、果实长宽、果肉厚度、果形指数及可溶性固形物含量进行QTL分析。【结果】单果重与果实长度、果实宽度及果肉厚度呈显著相关。开发得到可利用CAPS标记185个,构建一张包含12个连锁群的遗传连锁图谱,覆盖总长度为1 600.45 cM,标记间的平均遗传距离8.65 cM。定位发现与单果重相关QTL位点7个（FW3.1、FW4.1、FW5.1、FW6.1、FW8.1、FW8.2、FW11.1）,与果实长度相关QTL位点7个（FL2.1、FL3.1、FL4.1、FL5.1、FL6.1、FL8.1、FL11.1）,与果实宽度相关QTL位点5个（FWID3.1、FWID4.1、FWID8.1、FWID10.1、FWID11.1）,与果肉厚度相关QTL位点2个（FT6.1、FT11.1）,与果形指数相关QTL位点1个（FS2.1）,与可溶性固形含量相关QTL位点2个（SS6.1、SS12.1）。【结论】获得了24个QTL位点。确定了一个主效QTL位点FW8.1,贡献率高达25.8774%,LOD值为16.8746。发现单果重与果实长度、果实宽度及果肉厚度密切相关,定位区间相同或相邻,紧密集中在3、4、5、6、8、11染色体上。

食品科学与工程

酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌的致死效应

蔡林林, 胡海静, 衣晓坤, 王虎虎, 徐幸莲, 彭斌

中国农业科学. 2019, 52(9):  1614-1623.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.012

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【目的】研究酸性电解水（AEW）能否有效控制肉源性荧光假单胞菌,探究处理后菌体变化,为新型杀菌剂的开发提供思路。【方法】使用不同有效氯浓度酸性电解水（20、40和60 mg?L ^-1）将肉源性荧光假单胞菌分别处理5、10、15、20、25和30 min后,通过平板计数检测酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌的致死效果;收集未处理及20、40和60 mg?L ^-1酸性电解水各处理5 min后菌液,利用扫描电子显微镜观测酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌细胞形态的影响;利用多种荧光探针检测酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌细胞膜完整性、胞内pH、胞内ATP浓度、膜电位的影响;提取胞外聚合物（EPS）探究酸性电解水与EPS的相互作用。 【结果】20、40和60 mg?L ^-1的酸性电解水均可在5 min内杀死10 ⁷CFU/mL肉源性荧光假单胞菌,酸性电解水浓度大于40 mg·L ^-1时对肉源性荧光假单胞菌的杀菌效果没有显著影响（P>0.05）,10 min处理后均已无活菌检出。扫描电子显微镜结果表明3种浓度酸性电解水的处理均可使肉源性荧光假单胞菌菌体干瘪皱缩,失去原本饱满的细胞形态,60 mg·L ^-1电解水处理下破损程度最大。酸性电解水可显著降低肉源性荧光假单胞菌的膜完整性、胞内pH、膜电位、胞内ATP浓度和EPS含量（P<0.05）。20、40和60 mg·L ^-1酸性电解水处理后菌体膜完整性分别降低到2.26%、1.87%和1.20%,膜电位分别消散40%、50%和50%,胞内pH由7.50分别降低到6.53、5.90和5.83,3种浓度处理后胞内ATP浓度已降至最低。杀菌效果显著依赖于酸性电解水浓度的升高,当处理浓度高于40 mg?L ^-1时,胞内pH、膜电位和胞内ATP浓度的降低无显著差异。酸性电解水处理下EPS中蛋白、总糖含量显著降低,松散胞外聚合物 （L-EPS）中蛋白和总糖分别降低71.08%和62.23%,而紧密胞外聚合物（B-EPS）中蛋白和总糖分别降低99.32%和40.62%。当EPS反向添加到酸性电解水中时则可显著降低酸性电解水氧化还原电位（ORP）（P<0.05）,但对有效氯浓度（ACC）和pH没有显著影响（P>0.05）。 【结论】酸性电解水对肉源性荧光假单胞菌具有良好的杀菌效果,可破坏肉源性荧光假单胞菌细胞膜,同时EPS对酸性电解水杀菌效果具有一定的阻碍作用。

畜牧·兽医·资源昆虫

转录因子CEBPα和p53在猪卵巢颗粒细胞中 对Kiss1基因表达的调控

辛晓萍, 王家迎, 张爱玲, 钟玉宜, 何颖婷, 陈赞谋, 张哲, 张豪, 李加琪, 袁晓龙

中国农业科学. 2019, 52(9):  1624-1634.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.013

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【目的】预测母猪Kiss1（GenBank Gene ID: 100145896）上游区域潜在的转录因子结合位点,并验证部分转录因子在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因的调控作用,为研究Kiss1基因在母猪卵巢颗粒细胞中的分子调控机制提供理论基础。【方法】参考NCBI数据库中Kiss1基因上游区域的序列,通过生物信息学网站预测的Kiss1基因上游区域潜在转录因子结合的位点,结合文献阅读与资料查询,在转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域潜在结合位点附近设计引物,利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术,验证转录因子CEBPα和p53与Kiss1基因上游区域的结合情况;参照NCBI数据库相关转录因子CEBPα和p53的mRNA序列,使用软件Primer Premier 5设计引物,PCR分别扩增转录因子CEBPα（带有Kpn I和Xho I限制性内切酶的酶切位点）和p53（带有Kpn I和Hind III限制性内切酶的酶切位点）的CDS区序列,并进行测序鉴定,连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建含有潜在转录因子CEBPα和p53 CDS区序列的真核表达载体,并获得无内毒素质粒,分别命名为pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53;化学合成目标转录因子CEBPα和p53的干扰siRNA片段。屠宰场采集猪的卵巢,快速分离并培养原代猪的卵巢颗粒细胞,阳离子脂质体转染法分别将转录因子CEBPα和p53真核表达载体(pcDNA3.1-CEBPα和pcDNA3.1-p53)或siRNA片段(CEBPα-siRNA和p53-siRNA)转染进母猪卵巢颗粒细胞,使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别验证预测的转录因子CEBPα和p53对Kiss1基因mRNA水平和蛋白水平的影响。【结果】生物信息学预测结果表明,Kiss1基因上游区域（-850—+221）存在p53（肿瘤抑制蛋白,tumor protein p53,p53）、CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein, CEBP）、信号传导及转录活化家族Stat4（signal transducer and activator of transcription 4, Stat4）等转录因子的潜在结合位点,其中转录因子p53（GenBank Gene ID：397276,NM_213824.3）可能结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp处,转录因子CEBPα（GenBank Gene ID：397307,XM_003127015.4）可能结合在Kiss1基因上游区域-744—-733 bp处;ChIP结果表明,转录因子p53和CEBPα可以特异性的结合在Kiss1基因上游区域-533—-523 bp和-744—-733 bp处;在母猪卵巢颗粒细胞中超表达转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著下降（P<0.05）,蛋白水平显著下降（P<0.05）;在母猪卵巢颗粒细胞中,干扰转录因子p53或CEBPα后,Kiss1基因的mRNA的表达水平显著升高（P<0.05）,蛋白水平显著升高（P<0.05）。【结论】在猪卵巢颗粒细胞里,转录因子p53和CEBPα能结合到Kiss1基因的上游区域降低其启动子转录活性,进而降低其mRNA和蛋白表达水平。

生命周期评价在畜牧生产中的应用研究现状及展望

姜明红, 刘欣超, 唐华俊, 辛晓平, 陈吉泉, 董刚, 吴汝群, 邵长亮

中国农业科学. 2019, 52(9):  1635-1645.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.014

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生命周期评价（life cycle assessment,LCA）作为一种全程评价产品总体环境影响和生产效率的方法,被广泛应用于企业优化生产经营结构和政府政策制定等方面。近年来,出于粮食安全保障和生态环境保护的考虑,LCA在农牧生产中的应用越来越受到重视。但我国相关方面的研究和应用并不多见,特别是作为畜牧业重要产区的北方草原牧区,尚没有开展针对当地畜牧生产体系的LCA研究。在这一背景下,本文围绕主要环节和流程对国内外畜牧生产LCA方法框架和研究现状进行了综述,主要从LCA研究目的与范围的确定、生命周期清单分析和影响评价三个方面展开。国内外文献综述表明,国外畜牧产业中LCA的应用已相当普遍,无论从方法上还是技术上都已经相当成熟和完备,对我国畜牧产业LCA科学研究和实际应用均有较强的借鉴意义。然而,由于国内外畜牧产业的具体情况差异,国外LCA经验难以直接应用到国内。首先,在我国北方牧区,家庭牧场是当地畜牧生产的主要经营方式,具有季节性放牧与圈养舍饲结合、不同牲畜混养、牧民生活和生产经营界限不明确等特点,难以直接套用国外方法。此外,在我国开展畜牧生产LCA研究所需的数据收集非常困难,这是制约我国畜牧生产LCA应用的最大短板。最后,由于畜牧生产技术及经营方式的差距,相比于欧美澳等畜牧业发展成熟国家,我国北方牧区畜牧生产受降水等自然因素及市场供求价格因素影响年际间差异更大,这也是我国开展畜牧生产LCA研究必须考虑的问题。为了使 LCA 能够精准且广泛地应用于我国畜牧产业,应从以下几个方面进行改进：首先,开展我国北方牧区不同规模畜牧生产经营系统物料投入和产出的调查和研究,为畜牧产业LCA研究收集必要数据;其次,根据我国畜牧产业的特征建立并完善适合国情的畜牧业LCA标准方法和数据库,提升我国LCA结论的准确性;第三,在我国畜牧LCA研究中还应加大学科交叉力度,理清畜牧产业发展中的自然和社会驱动因素,为我国北方牧区畜牧产业的可持续发展提供数据参考和科技支撑。

食品动物源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLS_B类 抗生素耐药性调查

李淑敏, 方亮星, 李亮, 赵孟, 陆肖, 古伟琪, 廖晓萍, 孙坚, 熊雁琼, 刘雅红

中国农业科学. 2019, 52(9):  1646-1656.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.015

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【目的】调查中国6个省食品动物源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（livestock-associated methicillin- resistant staphylococcus aureus,LA-MRSA）对大环内酯类-林可酰胺类-链阳菌素B类（macrolides, lincosamides and type B streptogramin, MLS_B）抗生素的耐药情况及MLS_B耐药基因的流行情况。【方法】从广东、河南、河北、福建、山东以及湖南等6省采集的食品动物源（猪、鸡以及鸭）样品约6 500份,分离金黄色葡萄球菌,通过苯唑西林药物敏感性测定和mecA,mecC基因检测鉴定MRSA菌株。采用二倍琼脂稀释法和微量肉汤稀释法测定LA-MRSA菌株对MLS_B以及其他常见的10种抗菌药物的敏感性,采用PCR方法检测MLS_B耐药基因（ermA-C和ereA-B）以及其他16种常见耐药基因。【结果】6 500份动物源样品中分离出480株金黄色葡萄球菌,其中101株为LA-MRSA,LA-MRSA分离率为1.54%（101/6500）,金黄色葡萄萄球菌中LA-MRSA检出率达21.04%（101/480）。LA-MRSA菌株对MLS_B类抗生素呈现高度耐药的情况,耐药率高达99.00%以上,对其他常见的抗菌药物氟苯尼考、四环素、头孢噻肟以及庆大霉素等抗菌药物也均呈现高度耐药,耐药率为94.00%—99.00%。MLS_B耐药基因检测结果显示,ermC的检出率最高,为100.00%;其次是ereB,为79.20%,接着是ermA和ereA,检出率分别为45.54%和40.59%,而ermB的检出率最低,为11.88%。其他耐药基因的检测结果显示fexA、tetL、aadA1、aph(4’)-Ia的检出率较高,分别是92.10%、97.02%、97.29%和83.17%;其次是tet(M),检出率为71.29%;而aac(6’)-Ib、aac(3’)-Ic、 aph(3’)-II、aph(3’)-IV、optrA、tet(A)、tet(C)的检出率相对较低,分别是49.50%、46.53%、39.60%、37.62%、33.67%、29.70%和20.79%;接着检出率更低的是cfr、tet(K)、lnuA以及lnuF,分别为17.82%、14.85%、5.94%和3.96%。进一步分析LA-MRSA菌株中MLS_B耐药基因检出个数与对受试抗菌药物的耐药数目之间的关系,发现随着动物源MRSA菌株对受试抗菌药物的耐药数目增加时,菌株中MLS_B耐药基因检出个数也在增加。【结论】动物源MRSA菌株对MLS_B高度耐药,其与菌株中ermC基因的高检出率一致,并且LA-MRSA菌株多重耐药情况严重,这与MLS_B耐药基因检出个数以及其他耐药基因的高检出率密切相关。因此,养殖场中MLS_B类药物使用应规范使用,以减少动物源MRSA菌株的多重耐药性。

研究简报

紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因PfJMT的克隆及表达分析

白辉扬, 鲁庚, 陆俊杏, 管丽, 唐鑫, 张涛

中国农业科学. 2019, 52(9):  1657-1666.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.016

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【目的】茉莉酸羟基甲基转移酶（jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT）是植物茉莉酸甲酯生物合成的关键酶,通过克隆紫苏JMT,并研究其在不同胁迫下和种子不同发育时期的表达模式,为研究JMT在植物防御和种子发育中的作用提供理论依据。【方法】根据紫苏种子转录组测序结果设计引物,从紫苏中克隆得到紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因的DNA和cDNA序列,命名为PfJMT,通过生物信息学分析该基因的结构、稳定性、亲水性、亚细胞定位及保守结构域等,利用系统进化树分析PfJMT和其他物种JMT蛋白的进化关系。取开花期的紫苏根、茎、叶、花等组织用于组织特异性表达分析。取开花后5、10、15、20、25和30 d的种子用于JMT在种子不同发育时期表达模式的研究。用25 μmol·L ^-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和1 mmol·L ^-1水杨酸（salicylic acid,SA）喷洒处理具有4片真叶的紫苏幼苗并浇灌根部,分别于处理0、2、4、8、16、24和48 h后取样,研究JMT在不同胁迫下的表达模式。 【结果】PfJMT的ORF长1 050 bp,编码349个氨基酸。生物信息学分析表明,PfJMT为不稳定的亲水蛋白,亚细胞定位于细胞质,含有一个甲基转移酶-7（Methyltransf-7）保守结构域。通过与其他物种的JMT蛋白多序列比对发现,紫苏JMT和丹参JMT的序列一致度最高,为80.5%,和水稻的序列一致度最低,为36.8%。在对多种不同植物基于JMT蛋白构建系统进化树的分析中发现紫苏和拟南芥、丹参等双子叶植物亲缘关系较近,而与建兰、水稻等单子叶植物亲缘关系较远,说明JMT在单子叶和双子叶植物的进化过程中可能存在较大的差异。荧光定量PCR结果表明,PfJMT在紫苏根和茎中的相对表达量最低,叶和花中的相对表达量比根和茎中略高,在开花后5d的种子中的表达量最高,并且随着种子的发育表达逐渐下调,说明JMT在种子发育中起着重要作用。在使用外源MeJA和SA处理的紫苏根、叶组织中,PfJMT表达均显著下调,这一结果支持JMT可能不直接参与防御反应,而是通过调节JA水平间接参与植物防御的理论。【结论】成功克隆获得PfJMT,随着种子的发育PfJMT表达量逐渐下调,并在外源MeJA、SA胁迫下表达量显著下调。