中国农业科学

基于QTL定位分析策略的一般配合力遗传基础研究

胡文明, 徐扬, 张恩盈, 徐辰武

中国农业科学. 2013, 46(16): 3305-3313. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.001

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【目的】一般配合力（GCA）是评价亲本利用价值的重要指标。研究GCA的遗传基础及GCA相关QTL（QTLGCA）定位的可行性，为杂交育种提供技术参考。【方法】以双亲杂交衍生的重组自交系（RIL）为被测系、若干个随机选择的纯系为测验系的NCII交配设计以及QTL定位策略，系统研究GCA的遗传组成、影响QTLGCA定位的因素以及QTLGCA与性状本身QTL之间的关系。【结果】若性状受1对等位基因控制，RIL的GCA以及QTLGCA定位均与控制性状本身基因位点的加性效应、显性效应以及测验系等位基因的频率有关；若性状受2对加/显性的等位基因控制，则GCA估计及QTLGCA定位均与基因间是否连锁无关，其影响因素与性状受一个基因控制时相同；若性状受2对互作基因控制，GCA及QTLGCA定位均与测验系等位基因频率和性状本身QTL的主效应以及基因间互作效应有关，此外，GCA效应估计还与基因间是否连锁有关。【结论】无论是GCA效应估计还是QTLGCA定位，测验系等位基因频率和性状本身QTL效应大小都是重要的影响因素。此外，QTLGCA与性状本身QTL的差异还取决于性状的遗传结构以及QTL定位方法的选择。

植物基因组上游开放阅读框的挖掘方法及其翻译调控

王庭璋, 胡望雄, 徐建红, 薛庆中

中国农业科学. 2013, 46(16): 3314-3323. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.002

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基因组中约有20％的基因具有上游开放阅读框（upstream open reading frame，uORF），它位于成熟mRNA 5'端非编码区（5'-UTR）。本文简介了uORF同源群的挖掘方法、分类和进化，以及调控下游mORF翻译的研究进展。植物（拟南芥和水稻等）和昆虫（果蝇等）基因组中普遍存在保守肽uORFs，并且在序列多样性方面有相似之处。但它们在平均长度、基因组聚类、与甲基转移酶的关联性上有所不同。植物uORF的长度通常短于昆虫uORF。借助拟南芥和水稻全长cDNA序列比较，不同的uORF同源群对其下游如转录因子，信号转导因子、发育信号分子和翻译起始因子eIF5等编码基因的mORF具有调控功能。对于真核生物基因组中包含CHCH域的uORF进行贝叶斯系统发育分析，结果表明，同源群8-like分属5个物种（绿藻、节肢动物、线虫、无脊椎动物和真菌）。在真核生物生长、发育和生理过程中，uORF通常作为反式因子对mORF表达起调节器作用，例如，在植物蔗糖、多胺、磷脂酰胆碱，以及甲基转移酶反应中，相当大比例的uORF参与介导mORF的翻译调控。

农用生物炭研究进展与前景

陈温福, 张伟明, 孟军

中国农业科学. 2013, 46(16): 3324-3333. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.003

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生物炭以其良好的解剖结构和理化性质，广泛的材料来源和广阔的产业化发展前景，成为当今农业、能源与环境等领域的研究热点。本文综合分析、评述了生物炭在土壤、作物、农田生态系统等领域应用的主要研究进展及其未来保障中国粮食安全的重要意义，从低碳、循环、可持续视角，客观、辩证地探讨了生物炭在农业上的应用价值及其产业化发展前景。生物炭在修复土壤障碍，提升耕地生产性能和作物生产能力，促进农业可持续发展和保障国家粮食安全等方面具有重要现实意义和应用价值，本文结合中国国情，提出了进一步深入研究与开发生物炭产业的方向与建议，旨在为中国生物炭产业的健康发展提供参考。

区域气候模型数据修订方法及其在作物模拟中的应用

吕尊富, 刘小军, 汤亮, 刘蕾蕾, 曹卫星, 朱艳

中国农业科学. 2013, 46(16): 3334-3343. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.004

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【目的】建立一种修订区域气候模型所生成数据的方法，为作物模型在未来气候情景下的应用研究提供技术支持。【方法】选取徐州、淮安、郑州、潍坊、石家庄5个生态点，利用各地点1960—1993年的历史气象数据，对区域气候模型RegCM3所生成的1994—2010年降雨频率、逐日降雨量、太阳辐射、最高气温、最低气温等气象要素进行修订。【结果】与修订前的RegCM3数据相比，修订后的RegCM3月平均降雨量、温度、太阳辐射等气象要素与实际观测数据更加一致；修订后5个生态点1994—2010年的逐月降雨量、温度、太阳辐射等气象要素参数以及逐日降雨量、温度、太阳辐射等数据的概率分布，与实际观测数据更加吻合，尤其是RegCM3生成数据中的极端高温和高频率降水得到了较好的修正，反映降雨频率的连续干旱天数与实测数据也更趋一致。基于修订后RegCM3逐日气象数据在5个生态点的WheatGrow模型模拟产量与实测产量之间的决定系数和标准根均方差分别达0.72和10.5%，比修订前分别增加了0.35、降低8.2%左右。【结论】采用本研究所构建的方法来修订RegCM3生成的未来气象数据，并将修订后的气象数据输入作物模型，可以提高未来情景下作物模型预测的可靠性。

稻曲病菌突变体B-726生物学性状分析及其T-DNA插入位点侧翼序列的克隆

黄磊, 俞咪娜, 胡建坤, 于俊杰, 尹小乐, 聂亚锋, 陈志谊, 刘永锋

中国农业科学. 2013, 46(16): 3344-3353. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.005

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【目的】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B-726的生物学性状，分析其T-DNA插入位点的侧翼序列，克隆因外源基因插入被破坏正常表达的基因，为明确该基因在稻曲病菌致病过程中的作用奠定基础，并为稻曲病防治新途径的制定提供理论依据。【方法】通过测定突变菌株B-726生长速率、产孢能力及致病力检测，分析其生物学性状；Southern杂交分析B-726外源基因插入的拷贝数；利用HiTail-PCR 获得T-DNA插入位点的侧翼序列；运用RACE-PCR技术，克隆与插入位点毗邻的基因全长；用半定量RT-PCR分析该基因表达情况。【结果】突变菌株B-726与野生菌株P1相比致病力极显著下降，产孢能力、生长速率显著下降。Southern杂交结果显示T-DNA在菌株B-726中以单拷贝形式插入。经过序列分析发现，T-DNA插入在1个命名为Uvt-726上游344 bp处，半定量PCR结果表明，Uvt-726在B-726表达量较P1显著下降。【结论】克隆了1个可能与稻曲病菌致病力相关的基因，推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要的作用。

68个主推小麦品种的白粉病抗性分析及基因推导

杨立军, 曾凡松, 龚双军, 史文琦, 张学江, 汪华, 向礼波, 喻大昭

中国农业科学. 2013, 46(16): 3354-3368. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.006

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【目的】对中国68个主推小麦品种进行抗白粉病分析和基因推导，为白粉病流行预警和防治提供依据。【方法】2011年春季在西南、西北、长江中下游、华北、黄淮和新疆麦区等12个省（自治区）采集1 094个单孢子堆白粉病菌株，并用每个菌株分别接种68个品种离体叶段进行抗感性测定；应用NTSYSpc2.10e软件对表型抗感性数据进行UPGAMA（unweighted pair group arithmetic mean analysis）聚类分析；用实验室长期收集保存的31个毒谱不同的菌株作为鉴别菌株对30个含已知抗白粉病基因材料和68个主推品种的离体叶段进行接种，比较68个品种和单基因材料对31个鉴别菌株的抗性谱，从而推导68个主推品种所含的抗白粉病基因。【结果】抗性测定结果表明，品种间抗谱存在明显差异。内麦8号、内麦9号和绵麦37抗谱宽，对各省菌群的抗性频率均大于99%；济麦22、扬麦11、扬麦12、扬麦13和轮选987等5个品种抗性频率在70%—90%；有54个品种的抗性频率小于40%，占供试品种总数的79.4%，表明大部分主推品种的抗性已被克服。某品种对该品种推广种植区域菌群的抗性频率低于对其它非种植区域菌群的抗性频率。聚类分析可将68个品种分成4大类，第I类包括6个品种，其中5个品种抗性频率在40%—70%；第II类包括7个品种，抗性频率均大于70%；第III类包括54个品种，抗性频率均小于40%；第IV类包括1个品种，抗性频率为46.1%；聚类显示来自于同一省的品种、抗性频率相近的品种具有相似或相近的抗性遗传背景。基因推导表明，内麦8号、内麦9号含有Pm21，偃展4110、新麦208和扬麦11均含有Pm4b；济麦22含有Pm2+ta；其余品种含有其它未知抗白粉病因子。【结论】当前中国主推小麦品种中近80%的品种对全国白粉病菌群的抗性频率不高，特别是就单个品种而言，对该品种种植区的白粉菌群抗性频率更低，存在小麦白粉病在条件适合时暴发流行的风险，必须加强病害预警。同省品种的抗性频率聚类大多聚到同一组，说明同省品种的抗源异质性不高，中国小麦白粉病育种应该引进更丰富抗源。

单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶编码基因Tri101的原核表达及多克隆抗体制备

董飞, 祭芳, 吴季荣, 殷宪超, 徐剑宏, 史建荣

中国农业科学. 2013, 46(16): 3369-3376. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.007

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【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白，通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体，为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料，PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+），将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明，Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达，重组蛋白大小为50 kD左右，以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白，最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签，酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔，制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000，检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达，获得了纯化的融合蛋白，通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体，可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。

河北邢台和江苏南京地区棉蚜对丁硫克百威和吡虫啉的抗性

王娜, 郎志飞, 贺康, 李飞

中国农业科学. 2013, 46(16): 3377-3383. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.008

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【目的】对河北邢台和江苏南京地区棉蚜（Aphis gossypii Glover）进行抗性监测，了解棉蚜对丁硫克百威和吡虫啉的抗性发展情况，为抗性治理提供理论依据。【方法】以用药水平最低的新疆南疆种群作为相对敏感种群，通过室内毒力测定、离体酶活力测定、相对表达量分析，研究新疆南疆、河北邢台及江苏南京3个地区棉蚜对丁硫克百威和吡虫啉潜在的代谢抗性机制。【结果】河北邢台和江苏南京地区的棉蚜对丁硫克百威仍处于敏感阶段；但对吡虫啉的抗性已有所发展，抗性水平分别为4.87和8.72倍，为低水平抗性阶段。解毒代谢酶活力对比研究发现，3个地区田间种群之间多功能氧化酶、酯酶及谷胱甘肽转移酶的活力均存在显著差异，江苏南京种群的酯酶活力显著高于新疆南疆种群。定量PCR分析表明，河北邢台地区棉蚜的羧酸酯酶表达量较高，是新疆种群棉蚜的3.28倍。【结论】田间棉蚜已对吡虫啉产生了低水平的抗性，酯酶活力升高在棉蚜对吡虫啉低水平抗性形成中发挥作用。

南方根结线虫乳酸脱氢酶基因克隆及其沉默效应分析

梅眉, 黄永红, 茆振川, 刘志敏, 谢丙炎

中国农业科学. 2013, 46(16): 3384-3391. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.009

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【目的】对南方根结线虫乳酸脱氢酶基因（mildh）进行克隆分析，并探索mildh沉默对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）病害的抑制作用。【方法】在前期研究中，利用生物信息学方法在线虫全基因组中预测了一些线虫RNA干扰（RNAi）表型基因。本研究以预测的线虫ldh设计特异引物克隆南方根结线虫中mildh。对克隆到的mildh序列进行了特征分析后，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，将其导入番茄植株，并接种南方根结线虫，研究mildh基因沉默对根结线虫根结数量影响。【结果】克隆到的mildh包含1个完整的编码框序列，编码315个氨基酸。该基因与预测到的mildh核苷酸序列一致性高达94.9%，所编码的氨基酸一致性高达95.5%。构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介导的沉默载体pTV-mildhi，并用该沉默载体对番茄植株进行处理后，接种南方根结线虫。60 d后统计发现，pTV-mildhi处理的番茄植株上根结数分别比空载体对照减少48.6%，比清水对照降低48.4%。【结论】mildh基因沉默对南方根结线虫具有显著的抑制作用，也说明mildh可能参与根结线虫的致病性,该研究对线虫的病理学研究及线虫病害防控研究提供了新的理论基础。

长期施肥对中性紫色水稻土氮素矿化和硝化作用的影响

秦子娴12, 张宇亭12, 周志峰12, 石孝均12, 郭涛12

中国农业科学. 2013, 46(16): 3392-3400. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.010

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【目的】揭示长期施肥对中性紫色水稻土生态系统氮素内循环矿化及硝化特征的影响，探索维持紫色水稻土长期供氮潜力的途径。【方法】利用重庆市北碚区21年的中性紫色水稻土长期定位试验，通过淹水密闭培养-间歇淋洗法研究长期施肥对土壤氮素矿化特性的影响，并测定了不同施肥措施下土壤硝化细菌数量、氨氧化潜势及硝化强度的变化。【结果】与长期不施肥对照相比，单施化肥（除单施氮肥）、有机肥或有机无机配施显著提高了土壤累积矿化氮量和氮素矿化势（N0），氮磷钾肥配施有机肥处理累积矿化氮量最高达164.43 mg•kg-1，氮素矿化势相比CK处理增加了59.29%，而含氯氮磷钾肥配施有机肥增加累积矿化氮量和氮素矿化势幅度显著低于氮磷钾肥配施有机肥处理；不同施肥（除氮磷钾肥与单施有机肥）显著提高了氮素矿化速率常数（k）。施用氮肥处理显著提高了土壤硝化细菌数量，尤其是氮磷钾肥配施有机肥处理最高为CK处理的74.25倍；土壤氨氧化潜势和硝化强度表现出一致的趋势，均是氮磷钾肥配施有机肥处理最高而含氯氮磷钾肥配施有机肥显著低于不施肥对照处理。相关分析表明，土壤氨氧化潜势和硝化强度与土壤pH呈显著正相关关系（P<0.05）。【结论】氮磷钾肥配施有机肥是提高紫色水稻土供氮潜力及改善有机氮品质的有效手段，含氯化肥抑制了硝化过程，可充当硝化抑制剂使用。

深旋松耕作法对华北缺水区壤质黏潮土物理性状及作物生长的影响

杨雪1, 逄焕成1, 李轶冰1, 任天志1, 董国豪2, 郭智慧2, 王湘峻2

中国农业科学. 2013, 46(16): 3401-3412. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.011

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【目的】针对华北高产农区连年旋耕导致耕层变浅、犁底层变厚变硬、耕层生产能力下降的问题，探讨深旋松耕作法在华北地区作物生产上的可行性。【方法】在河北吴桥地区设置了4种耕作处理，即传统旋耕15 cm、间隔深松耕30 cm、深旋松耕30 cm、深旋松耕50 cm，研究大田条件下不同耕作方法对土壤性质与作物产量的影响。【结果】（1）不同耕作处理对土壤蓄水量的影响较大，深旋松耕处理表现出利于降水入渗、储蓄更多水分的优势，并且越是干旱的时段，表现越突出。在冬小麦返青期深旋松耕处理土壤蓄水量均极显著高于旋耕处理和间隔深松处理，其中深旋松耕50 cm处理的0—50 cm土层土壤蓄水量分别比旋耕处理和间隔深松处理增加11.69 mm和10.56 mm，提高12.21%和10.90%。（2）不同耕作方法对土壤容重影响很大，耕作一年半之后，深旋松耕两个处理在0—30 cm土层容重显著低于深松和旋耕两个处理，其中深旋松耕30 cm在20—30 cm土层容重分别比深松和旋耕低了13.67%和13.99%，深旋松耕50 cm在20—30 cm土层分别比深松和旋耕低了14.20%和14.51%，30—50 cm土层深旋松耕50 cm土层依然显著低于其他处理，其中，40—50 cm土层分别比深松和旋耕低了22.66%和22.80%，深松处理在冬小麦播前略低于旋耕处理，之后的时期则与旋耕处理间几乎没有差异。（3）耕作方式的不同对土壤性质有影响，并进而影响作物群体LAI、干物质积累和灌浆速率以及产量的形成，对冬小麦季影响最为显著，其中冬小麦花期深旋松耕50 cm处理的群体LAI分别比旋耕处理和间隔深松处理提高51.98%和39.22%，干物质积累量分别比旋耕和间隔深松处理提高26.78%和16.92%，冬小麦灌浆30 d时深旋松耕50 cm分别比深松和旋耕的籽粒干重提高10.37%和11.40%。（4）所有耕作处理中，深旋松耕土壤耕作处理的作物产量显著高于深松耕作和旋耕耕作，其中耕作一年半后夏玉米季深旋松耕50 cm处理产量达到了13 822.68 kg•hm-2，深旋松耕30 cm处理产量也达到了13 127.87 kg•hm-2，均显著高于旋耕处理，对比旋耕处理分别增产38.19%、31.24%。【结论】考虑生态经济等因素的综合考虑，深旋松耕30 cm处理为最适合华北缺水区的耕作方法。

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

程春振12, 曾继吾2, 贝学军12, 吴波12, 阳佳位3, 张永艳12, 姜波2, 朱世平1, 闫树堂1, 钟云2, 钟广炎2

中国农业科学. 2013, 46(16): 3413-3423. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.012

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【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus，CTV）品种锦橙CTV应答分子机理，筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方（Tester），用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方（Driver），构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序，其中742条测序成功，去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物，共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明，受CTV侵染的影响，锦橙能量代谢相关基因上调明显，与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外，与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染，CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显，须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。

壳聚糖处理对‘早红考密斯’梨虎皮病抑制和贮藏品质的影响

王宝刚, 侯玉茹, 李文生, 杨军军, 石磊, 杨媛, 冯晓元

中国农业科学. 2013, 46(16): 3424-3431. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.013

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【目的】探索西洋梨贮藏过程中虎皮病的控制方法及发病规律。【方法】以‘早红考密斯’梨为试材，研究水溶性和酸溶性壳聚糖处理对‘早红考密斯’梨低温（0±0.5）℃贮藏期间虎皮病的抑制效果以及品质的影响。【结果】虎皮病的发生会导致‘早红考密斯’梨果皮细胞质壁分离、死亡，形成褐色或黑色病斑。在贮藏第120天时，1.0% 酸溶性壳聚糖和1.0% 水溶性壳聚糖处理的果实虎皮病发生率分别比对照低63.89%和44.44%。酸溶性和水溶性壳聚糖处理均降低了梨果皮中α-法尼烯的生成及氧化产物共轭三烯的积累，降低了膜脂过氧化作用。同时，还降低了梨果实呼吸强度水平，促进了还原糖的积累，抑制了贮藏前期可滴定酸的下降。【结论】采后壳聚糖处理能够有效地抑制贮藏期间‘早红考密斯’梨虎皮病的发生，并且酸溶性壳聚糖处理抑制虎皮病效果优于水溶性壳聚糖。壳聚糖处理可以作为一种有效而方便的方法用于生产上‘早红考密斯’梨虎皮病的防治。

固体进样元素分析技术在农产品质量安全中的应用

毛雪飞1, 刘霁欣2, 王敏1, 钱永忠1

中国农业科学. 2013, 46(16): 3432-3443. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.014

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固体进样分析技术无需消解处理，可有效降低方法检出限（直接固体进样）、简化前处理、避免痕量元素损失，更加环保和安全，是农产品元素检测技术的重要分支，在现场、快速检测领域具有广阔的发展前景。本文简要概述了固体进样分析技术配套的样品制备和进样方式、样品导入和分析技术的研究现状，对样品均匀性和基体干扰等瓶颈问题进行了探讨；重点对直接固体进样和悬浮液进样方式，以及电热蒸发、激光烧蚀、样品直接插入、中子活化、X荧光等技术在农产品重金属和其它元素检测中的应用进行了综述。

42—62日龄康贝尔麻鸭蛋氨酸和赖氨酸的需要量

叶慧, 邬爱姬, 邓远帆, 王文策, 杨琳

中国农业科学. 2013, 46(16): 3444-3451. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.015

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【目的】研究饲粮蛋氨酸和赖氨酸添加水平对康贝尔麻鸭生产性能、屠宰性能、抗氧化功能等的影响，探讨42—62日龄康贝尔麻鸭的蛋氨酸与赖氨酸需要量。【方法】选用42日龄健康的康贝尔麻鸭936只，根据体重随机分成9组，每组4个重复，每个重复26只鸭。试验为蛋氨酸与赖氨酸3×3处理设计，蛋氨酸水平分别为0.28%、0.38%、0.48%，赖氨酸水平分别为0.58%、0.73%、0.88%。试验周期为21 d。【结果】饲粮蛋氨酸与赖氨酸交叉作用对麻鸭生产性能无显著影响（P＞0.05）；饲粮蛋氨酸与赖氨酸交叉作用对麻鸭屠宰率影响显著（P＜0.05）；饲粮中蛋氨酸与赖氨酸水平的变化对麻鸭肝脏SOD活力和GSH-Px活力有显著影响（P＜0.05），其中以蛋氨酸水平为0.38%，赖氨酸水平为0.88%组效果最好，但对MDA含量无显著影响（P＞0.05）。【结论】在饲粮蛋氨酸水平为0.28%—0.48%、赖氨酸水平为0.58%—0.88%范围内42—62日龄康贝尔麻鸭生产性能不受该两种限制性氨基酸影响，但饲粮中适宜蛋氨酸和赖氨酸的比例可改善肉鸭屠宰性能，提高机体抗氧化功能；在饲粮代谢能水平为11.49 MJ•kg-1且粗蛋白质水平为16.44%时，42—62日龄康贝尔麻鸭饲粮蛋氨酸推荐总量为0.38%，赖氨酸推荐总量为0.73%。

黑色素细胞中过量表达miR-137对TYRP-1和TYRP-2的影响

马淑慧, 薛霖莉, 徐刚, 侯亚琴, 耿建军, 曹靖, 赫晓燕, 王海东, 董常生

中国农业科学. 2013, 46(16): 3452-3459. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.016

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【目的】证明miR-137通过调控MITF而间接影响小鼠黑色素细胞TYRP-1和TYRP-2的表达，从而影响黑色素的生成。【方法】通过细胞转染技术在细胞水平过量表达miR-137，对黑色素细胞中黑色素含量进行了测定，经RT-PCR以及western blot检测转染后细胞TYRP-1和TYRP-2在mRNA和蛋白水平的变化。【结果】黑色素含量明显减少，在mRNA水平，TYRP1显著降低至0.4倍，TYRP-2显著降低至0.6倍。在蛋白水平，TYRP-1显著降低至0.61倍，TYRP-2显著降低至0.73倍。【结论】过量表达miR-137会通过调控MITF而使黑色素细胞TYRP-1和TYRP-2的表达量降低，从而揭示了miR-137通过调节TYRP-1和TYRP-2的表达间接调控了黑色素的生成。

牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用

张剑, 马卫明, 张亮, 何洪彬, 丁家波, 杨宏军

中国农业科学. 2013, 46(16): 3460-3469. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.017

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【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子，本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体，利用纯化蛋白作为包被抗原，建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法（iELISA）。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列，设计一对引物，以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因，将目的基因克隆入PEASY-T3，经测序正确后，与载体pET-32a(+)连接，构建重组表达质粒pET-32a-Virb8，转化E.coli BL21(DE3)，诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8，经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后，采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白，利用所建立的iELISA方法对235个临床奶牛血清样本进行检测，并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8的表达载体，经多次对表达条件的优化，大量表达了目的蛋白，建立的iELISA方法具有稳定、灵敏的特点，与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所建立的iELISA方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法，为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。

诺氟沙星ELISA试剂盒研制与性能鉴定

邢广旭12, 王国栋3, 胡骁飞2, 王方雨2, 邓瑞广2, 张改平2

中国农业科学. 2013, 46(16): 3470-3477. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.018

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【目的】建立诺氟沙星（norfloxacin，Nor）免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体，通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度，建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒（Nor-kit），并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50 为5.18 μg•L-1，灵敏度为0.31 μg•L-1，检测限为1.00 μg•L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外，还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%，变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中，批内变异系数小于10%，且批间变异系数也小于10%；在4℃保存条件下，试剂盒可以保存6个月而质量不变。奶样添加回收试验，试剂盒与LC-MS/MS测定结果没有显著差异（P≥0.05）；而且检测实际生产中鲜奶样时，试剂盒与LC-MS/MS测定结果也无显著差异（P≥0.05）。【结论】本研究成功研制出灵敏、特异、简便的诺氟沙星残留检测ELISA试剂盒。

芸薹属物种（B. napus, B. oleracea, B. rapa） MAPK1家族的克隆、进化和表达特征

陆俊杏, 卢坤, 朱斌, 彭茜, 陆奇丰, 曲存民, 殷家明, 李加纳, 梁颖, 柴友荣

中国农业科学. 2013, 46(16): 3478-3487. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.019

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【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族，分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1，它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp，均有3个外显子和2个内含子，最长标准mRNA为1 599—1 620 bp，ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明，甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和，其中，BnMAPK1-1对应于BoMAPK1，BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达，但器官特异性在种间差异显著，暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列，支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说，芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守，但转录表达的器官特异性上进化极快，近缘种间差异显著。

高效液相体积排阻色谱法测定稻米支链淀粉链长的相对分子质量分布

杨小雨12, 刘正辉1, 李刚华1, 王强盛1, 王绍华1, 丁艳锋1

中国农业科学. 2013, 46(16): 3488-3495. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.020

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【目的】建立稻米支链淀粉链长相对分子质量分布的高效液相体积排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography, HPSEC）的测定方法。【方法】先采用丁醇沉降法分离提纯稻米支链淀粉，纯化后的支链淀粉经异淀粉酶酶解切开分支糖苷键，然后运用HPSEC测定其相对分子质量分布。建立了稻米支链淀粉链长相对分子质量分布的HPSEC分析方法：Shodex SB-G、Shodex SB-803（1 000—100 000）、Shodex SB-802.5（300—10 000）3根凝胶色谱柱串连，柱温40℃；流动相为0.1 mol•L-1 Tris+0.1 mol•L-1 NaCl，pH=7.40，流速0.5 mL•min-1；采用示差折光检测器（Differential refractive index detector, RI），检测器温度为37℃；待测样品浓度为5 mg•mL-1，进样量20 μL。【结果】本法提纯的稻米支链淀粉：淀粉含量为99.4%、蛋白残余为0.02%、支链淀粉碘复合物最大吸收峰为517 nm，为高纯度支链淀粉。供试大米样品脱分支支链淀粉的平均聚合度（DP）分布在2—120，无杂峰干扰。【结论】试验结果和方法验证表明本方法数据可靠、重复性好、简单易行。

陕西省小麦禾谷孢囊线虫病的新发生地区与田间侵染规律

赵杰, 张管曲, 康振生

中国农业科学. 2013, 46(16): 3496-3503. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.021

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【目的】明确陕西省渭北旱塬区和陕北地区小麦孢囊线虫病（cereal cyst nematode，CCN）发生状况及其田间侵染规律，为陕西省CCN的综合防控提供决策依据。【方法】在小麦孕穗期至灌浆期，采用五点法随机取样、芬萘维克漂浮法（Fenwick）分离孢囊、利用形态学方法鉴定孢囊线虫种类；定点定期取样，利用次氯酸钠-酸性品红法对根系染色，显微镜检查根内线虫虫态与数量。【结果】陕西省渭北旱塬区和陕北地区等24个县（市）小麦的禾谷孢囊线虫病的致病线虫种类为禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae Wollenweber）。麟游县的平均孢囊量最高，为32.0个/100 g土，永寿县的平均孢囊量最低，为5.5个/100 g土。调查的陕北地区县市没有发现CCN。冬小麦秋播后，土壤中CCN孢囊孵化后的2龄幼虫（J2）即可侵入根系内。翌年小麦返青，J2幼虫开始侵染，高峰期为3月下旬至4月上旬，4月中旬开始出现3龄幼虫（J3），4月下旬J3开始膨大，5月初在小麦根表可见白色孢囊。【结论】麟游县、永寿县、礼泉县和武功县为CCN 新发生地区；CCN在陕西省存在秋播后与返青后2个侵染阶段，1年发生1个世代。

基于高光谱的苹果盛果期冠层叶绿素含量监测研究

房贤一, 朱西存, 王凌, 赵庚星

中国农业科学. 2013, 46(16): 3504-3513. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.022

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【目的】建立苹果冠层叶绿素含量及冠层光谱特征参量间的定量关系模型，以促进高光谱技术在苹果树精准施肥以及快速、无损长势监测中的应用。【方法】以蒙阴县果园的苹果树为试验材料，连续2年分别测定了苹果冠层光谱反射率和冠层叶绿素（Chl(a+b)）含量，分析了冠层叶绿素含量与光谱反射率之间的相关关系，并计算了400—1 000 nm任意两波段组合而成的RVI、DVI、NDVI和RDVI，分析了它们与冠层叶绿素含量的关系，以逐步回归分析做比较，建立了苹果冠层叶绿素含量监测模型。【结果】结果表明，以单变量估算叶绿素含量的最佳光谱指数为NDVI(975,742)，相关系数为0.5093。利用多元逐步回归建立的苹果冠层叶绿素含量最佳监测模型为Y=-0.56(log1/R)771-0.48(log1/R)1978 +0.20(log1/R)2407 -0.10(log1/R)2440+4.749。【结论】用多元逐步回归方法建立的模型来监测苹果冠层叶绿素含量效果较好，为利用高光谱技术监测苹果生长状况提供了理论依据。

叶用莴苣热激蛋白90（LsHsp90）基因的克隆及其在热激下的表达

任月, 韩莹琰, 李婷, 郝敬虹, 范双喜

中国农业科学. 2013, 46(16): 3514-3522. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.023

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【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制，为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE 技术相结合，从叶用莴苣叶片总RNA 中克隆LsHsp90 cDNA 序列。通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp，开放阅读框2 097 bp，编码698个氨基酸，推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明，LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域，并与拟南芥（AY081302.1）、紫茎泽兰（EU269070.1）等多种物种的热激蛋白90高度同源；进化树分析表明，LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因（EU269070.1）聚为一类。qRT-PCR分析表明，37℃热胁迫下，该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达；42℃高温胁迫下，热敏品种S106 中下调表达，而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90，该基因具有已知物种Hsp90基因的特征，该基因在热胁迫下有不同的表达特征，预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。

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