中国农业科学

植物miRNA的生物学特性及在环境胁迫中的作用

曾幼玲，杨瑞瑞

中国农业科学. 2016, 49(19): 3671-3682. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.001

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MicroRNA（miRNA）是一类在生物体内普遍存在的非编码、长度约为21 nt的小RNA分子，一般由内源基因编码，RNA聚合酶Ⅱ转录后，经过Dicer-Like酶等一系列的蛋白复合物将pre-miRNA（precursor miRNA）剪切成成熟miRNA，在转录及转录后水平介导靶mRNA转录沉默、降解或翻译抑制来调控基因的表达，是真核细胞基因表达的重要调控因子。第一个miRNA是在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中发现的lin-4，与lin-14 mRNA 3′ UTR的碱基序列部分互补，降解lin-14，从而抑制lin-14的表达。lin-4对靶基因lin-14的调控与线虫的生长发育密切相关。而第一个发现的植物miRNA是拟南芥miR171，它靶向剪切编码基因Scarecrow-Like（SCL）家族的mRNA，调控其基因的表达，进而影响植物的生长发育。植物部分miRNA，如miR156—miR408在各植物物种中相对保守，而miR408以后的miRNA具有物种特异性。植物在生长过程中会遭遇诸多不可预知（如同盐碱、干旱、重金属以及害虫和病原菌的侵扰等）的环境胁迫。固着生长的特性使得植物不能像动物那样通过移动来避免不利环境的影响，因此，需要自身特殊机制来应对这些环境胁迫。植物在长期逆境中已进化出极为精细复杂的生理和分子机制。miRNA与它作用的靶基因是响应环境胁迫的主要调控因子。miRNA参与了植物的生长发育、信号转导、蛋白质降解、营养胁迫、抗病原菌的入侵以及适应高盐和干旱等逆境胁迫过程，对于调节内源抗性基因表达具有一定意义。目前通过高通量测序、实时定量PCR检测和转基因等技术已经发现了很多与环境胁迫相关的miRNA，它们在逆境胁迫下的表达呈现显著差异性；miRNA的过表达植株经逆境胁迫处理可能表现出一定的抗逆或敏感性。同一家族的miRNA不同成员在响应环境胁迫时具有物种特异性。新疆地区是典型的大陆性干旱气候，降水量少，盐碱荒漠化地区多。在这样严酷的环境中顽强生存着许多盐生旱生类植物，这些植物的miRNA如何在逆境中发挥调控作用，依然需要更深入的探索。本文主要综述了现阶段植物miRNA生物合成、与靶基因作用方式、生物功能以及不同环境胁迫下对miRNA和作用的靶基因影响等方面的研究进展，以便更好地利用miRNA依据的生物技术开展研究和应用转化。

偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用

姚涵，汤才国，赵静，郑琪，李滨，郝晨阳，李振声，张学勇

中国农业科学. 2016, 49(19): 3683-3693. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.002

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【目的】偃麦草（Thinopyrum）是小麦（Triticum aestivum L.）的多年生野生近缘植物，具有许多可用于小麦品种改良的优异基因。利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系、绘制染色体指纹图谱及检测外源染色质。克隆十倍体长穗偃麦草（Th. ponticum (Host) Liu and Wang）基因组特异重复序列，可用于鉴定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质。【方法】通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库，并对文库进行高密度点杂交（Dot-blot hybridization）筛选，结合荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术，获得偃麦草基因组特异的重复序列，分析其在不同基因组及染色体上的分布特点。利用Repeat Masker在小麦族重复序列数据库（Triticeae repeat sequence database，TREP）及NCBI GenBank对特异重复序列进行比对分析，并设计偃麦草基因组特异重复序列的PCR引物。通过FISH分析和特异PCR引物扩增，对小麦-偃麦草衍生后代进行鉴定和选择。【结果】获得7条偃麦草基因组特异的重复序列。FISH分析表明，其在十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布，且在不加小麦封阻DNA的情况下，能明确区分八倍体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体。将其应用到小麦-偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中，特异重复序列同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段，而且信号相比基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，GISH）更加特异和清晰。基于偃麦草基因组特异重复序列开发了90对引物，通过在中国春、十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析，筛选出36对（40%）偃麦草基因组特异PCR标记；利用这些特异引物对109份小麦-偃麦草衍生材料进行扫描，发现10对扩增效果较好的特异引物，其检测效率为73.3%—95%。【结论】获得偃麦草基因组特异的重复序列，开发了特异PCR扩增引物，可应用于小麦背景下偃麦草遗传物质的高效检测和跟踪。

陆地棉核心种质表型性状遗传多样性分析及综合评价

代攀虹，孙君灵，何守朴，王立如，贾银华，潘兆娥，庞保印，杜雄明，王谧

中国农业科学. 2016, 49(19): 3694-3708. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.003

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【目的】分析陆地棉核心种质的遗传多样性和表型性状遗传变异规律，并探讨核心种质的综合评价方法。【方法】利用17个表型性状数据分析419份陆地棉核心种质的遗传多样性。用Shannon-weaver信息多样性指数计算表型性状的遗传多样性，用Nei’s 1973法计算表型性状遗传距离，并使用NTSYS-pc 2.20q软件对核心种质进行聚类分析；用SAS9.2对表型性状数据进行最佳线性无偏估计（BLUE），然后根据最佳线性无偏估计值计算出表型性状的最佳值。同时，结合主成分、回归和相关分析，研究核心种质的综合评价指标和方法。【结果】核心种质表型性状分析发现，单株铃数、单铃重、衣分、子指等性状的变异系数均较大，变异系数超过10%。而断裂比强度、马克隆值以及上半部平均长度的变异程度较小，变异系数均在10%以下。方差分析发现，各表型性状地点间、年份间、地点和年份间、品种间均有极显著差异；不同地理来源的种质表型性状差异较大，长江流域地理来源的种质生育期、伸长率、上半部平均长度、衣分等性状均高于其他的地理来源，西北内陆地理来源的种质纤维强度，单铃重、整齐度指数、株高、纺纱均匀性指数等综合性状最好，美国种质的产量和纤维品质的性状优于其他国家的总和。表型性状的遗传多样性指数范围为0.351—3.796，平均为1.715。分析不同地理来源种质的遗传多样性，发现黄河流域的遗传多样性和遗传丰富度最高，中国南部区域最低。类群聚类结果发现陆地棉整体分散，没有比较明显的类群关系，部分具有相似特点的种质聚类13个组群。核心种质综合评价表明在累计贡献百分比高于85%时，共发现7个主成分，陆地棉核心种质的表型性状综合值（F值）平均为1.740，来自澳大利亚的N74-250F值最高（2.302），辽阳绿绒棉的F值最低（0.624）。对17个表型性状与F值的相关分析，发现除马克隆值、子指和黄度外，单铃重、衣分、断裂比强度、上半部纤维长度等14个表型性状与F值间的相关性具有极显著差异，最后构建了以吐絮期、单铃重、伸长率、花期、马克隆值、株高、果枝数、纺纱均匀性指数8个表型性状为自变量的回归方程，综合评价核心种质资源。【结论】中国保存的陆地棉核心种质具有较为丰富的遗传多样性，不同地理来源遗传变异有较大的差异，不同生态区的核心种质具有独特的性状特性。

叶绿素含量降低对水稻叶片光抑制与光合电子传递的影响

周振翔，李志康，陈颖，王志琴，杨建昌，顾骏飞

中国农业科学. 2016, 49(19): 3709-3720. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.004

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【目的】水稻突变体叶片叶绿素含量显著低于其野生型，但其光合电子传递效率与净光合值显著高于对照，文章旨在阐明其生理学机理并探讨其在高光效育种中的潜在应用价值。【方法】通过人工气候室的盆栽试验设置高光强（光照强度为700—800 µmol·m^-2·s^-1）与低光强（光照强度约为100—200 µmol·m^-2·s^-1）2个处理，并结合大田试验，观测突变体与野生型的叶绿素荧光、超氧阴离子含量、丙二醛含量、SOD酶活性、叶绿体超微结构、叶片荧光显微结构与冠层温度。【结果】突变体材料叶绿素含量显著低于其野生型，并且光照强度对其叶绿素含量的效应也不相同。随着光照强度的增强，突变体叶片叶绿素含量增加60%，而野生型品种叶片叶绿素含量却降低20%以上。光反应曲线表明，突变体光合值显著高于野生型，尤其在1 000 µmol·m^-2·s^-1光照下，低光强与高光强处理中低叶绿素含量突变体光合值分别比野生型高9.4%和46.5%。叶绿素荧光数据也表明，水稻突变体的电子传递速率（ETR）、光系统Ⅱ的量子产量（Φ_PSⅡ）、光化学淬灭（qP）、光下最大光化学效率（F′v/F′m）显著高于其野生型。在高光强处理下，野生型材料中的应激活性氧超氧阴离子与丙二醛（MDA）含量受到光抑制。叶绿体超微结构与荧光显微结构表明，野生型材料叶绿体受到一定程度的损伤，且其维管束间距离显著大于突变体，其维管束面积小于突变体，不利于水分在叶片中的传输。田间冠层热力学图像表明中午高温、高光照条件下，突变体冠层温度显著低于其野生型。综合以上结果，野生型叶片叶绿素含量高，在高光强下会导致过量光吸收，光系统Ⅱ电子传递效率下降，超氧阴离子与丙二醛累计，导致叶绿素结构与功能的破坏，因此，其光合值显著低于突变体材料。同时过量光吸收会导致叶片与冠层温度上升，不利于冠层群体光合。【结论】在未来高光效育种中选育叶绿素含量适当降低的品种，有助于避免高光强下叶片的过量光吸收，从而缓解活性氧的产生与光抑制，并有利于降低冠层温度从而缓解水稻群体光合“午休”现象。

旱作地膜玉米密植增产用水效应及土壤水分时空变化

樊廷录，李永平，李尚中，刘世新，王淑英，马明生

中国农业科学. 2016, 49(19): 3721-3732. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.005

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【目的】干旱缺水是黄土高原旱作农业最大的限制因素，研究覆膜、增密和品种对旱作玉米增产和水分利用的影响，有助于揭示未来旱作粮食持续增产与水环境的关系。【方法】试验于2012—2015年在黄土高原丘陵沟壑区的宁夏彭阳进行，在全膜双垄沟（FPRF）和半膜平铺盖（HPFC）2种种植方式下，选择耐密中晚熟先玉335和吉祥1号及不耐密早熟酒单4号3个杂交种，低密度（4.5万株/hm2）、中密度（6.75万株/hm²）和高密度（9.0万株/hm²）3个水平，随机区组设计，玉米连作定位观测。采用烘干法监测不同降水年型玉米生育时期0—200 cm土层土壤水分，通过Surfer软件绘制土壤水分等值线图，研究旱作覆膜连作玉米产量、水分利用效率（WUE）及土壤水分时空变化。【结果】在地膜覆盖条件下各因素对旱作玉米产量和水分利用的影响达到极显著或显著水平，对籽粒产量和WUE的影响顺序依次为降水年型＞密度＞覆膜方式＞品种，降水年型从干旱、正常、丰水年的变化，玉米产量由7.72和8.79 t·hm^-2增加到11.86和11.15 t·hm^-2，但WUE最高值并不在降水较多的年份，而在正常年型。密度由4.5 万株/hm²增加到6.67万株/hm²，耗水量、产量、WUE增加10.6 mm、20.0%和3.45 kg·mm^-1·hm^-2，但密度从6.67万株/hm²增加到9.0万株/hm²时，耗水量不再增加，而产量和WUE提高12.0%和2.97 kg·mm^-1·hm^-2；FPRF处理较HPFC处理平均增产15.72%，WUE提高21.09%；耐密中晚熟品种吉祥1号和先玉335较耐密性弱早熟品种酒单4号增产15.46%—24.45%，WUE提高13.35%—15.55%。在全膜双垄沟种植条件下，玉米生育期内土壤剖面水分含量始终高于半膜平覆盖种植，尤其是玉米灌浆期0—200 cm土层多蓄积了50—90 mm的土壤水分，在严重伏旱年份发挥了明显的抗旱增产作用。不论降雨年型如何，4年期间全膜双垄沟播玉米产量增加和WUE提高并没有多消耗土壤水分，土壤深层未形成低湿层，也未观察到增密增产对土壤剖面水分循环的负效应，而干旱年份半膜平铺盖形成了一个土壤水分＜8%的明显干土层，并且随着玉米生长时间的推后干土层厚度增加、范围扩大。【结论】在目前地膜覆盖和生产平均密度5.3万株/hm²基础上，“全膜双垄沟播+耐密品种+增密1.5万株/hm²”是年降雨450 mm以上旱作区玉米持续增产和水分高效利用的技术关键，增密增产不会导致土壤深层形成干土层。

马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺抗性突变体的获得及其生物学性状

罗彦涛，孟润杰，赵建江，韩秀英，马志强，王文桥，张小风

中国农业科学. 2016, 49(19): 3733-3745. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.006

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【目的】研究抗氟吡菌胺突变体对不同杀菌剂的交互抗性并评估马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险。【方法】通过紫外线照射菌丝体、紫外线照射孢子囊和药剂驯化的方法获得抗氟吡菌胺的马铃薯晚疫病菌突变体，计算突变体的突变频率，测定抗性突变体的抗性水平，研究突变体在无药条件下继代培养10代后抗性能否稳定遗传，测定突变体在RSA培养基和离体叶片上的适合度（菌丝生长速率、产孢子囊能力及复合适合度指数），比较抗性菌株与其亲本敏感菌株的竞争力，分析对氟吡菌胺表现不同敏感性的菌株对不同药剂的交互抗性，并通过笔者实验室建立的抗性风险量化标准评定马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险。【结果】共获得21个抗性菌株，抗性水平介于61—3 157倍，紫外线诱导孢子囊的突变率为2.78×10^-7；大多数抗性突变体的适合度与其亲本菌株无显著性差异；竞争力测定试验中，2株突变体的第1、3、7代的共18次抗药频率测定中，有3次测定的抗药频率显著低于初始频率，有4次测定的抗药频率显著高于初始频率，其余11次测定的抗药频率与初始频率均无显著性差异；所有突变菌株的抗药性均能稳定遗传；抗氟吡菌胺菌株及其亲本菌株对氟吡菌胺的lgEC₅₀与这些菌株对嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰吗啉、双炔酰菌胺、甲霜灵、氟醚菌酰胺的lgEC₅₀之间的相关系数(r)分别为0.104(p =0.654)、0.311(p =0.170)、0.228(p =0.081)、0.376(p =0.093)、0.214(p =0.351)、0.122(p =0.599)、0.963(p =0.000)；致病疫霉对氟吡菌胺基本抗性风险值为15。【结论】氟吡菌胺与氟醚菌酰胺之间存在交互抗性，与嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰吗啉、双炔酰菌胺、甲霜灵之间无交互抗性，马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的固有抗性风险为高度,应加强马铃薯晚疫病菌对氟吡菌胺的抗性风险管理，建议生产上将氟吡菌胺与其他类药剂交替或混合使用。

中国粗榧生物碱的除草活性

马树杰，刘琳，芦小鹏，马志卿，张兴

中国农业科学. 2016, 49(19): 3746-3753. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.007

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【目的】明确中国粗榧(Cephalotaxus sinensis)的除草活性成分，为进一步深入研究中国粗榧的除草作用打下基础。【方法】采用种子萌发法评价中国粗榧乙醇提取物、中国粗榧总生物碱及从中分离得到的8种生物碱（桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、贡山三尖杉碱A、异三尖杉碱、cephalotaxine β-N-oxide、4-羟基三尖杉碱、台湾三尖杉碱和三尖杉碱）对红三叶（Trifolium pratense）、反枝苋（Amaranthus retroflexus）、黑麦草（Lolium perenne）及高丹草（Sorghum sudanense）4种杂草种子幼根和幼芽的生长抑制作用；采用盆栽法测定中国粗榧乙醇提取物、中国粗榧总生物碱及各生物碱的鲜重抑制率。【结果】种子萌发试验表明，中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱和cephalotaxine β-N-oxide对红三叶种子具有较强的抑制作用，对幼根的有效中浓度（EC₅₀）分别为634.35、690.47、69.47、71.21、174.11和243.12 mg·L^-1，对幼芽的EC₅₀分别为411.79、413.11、68.52、139.25、237.72和413.62 mg·L^-1；中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱和cephalotaxine β-N-oxide对反枝苋种子具有较强的抑制作用，对幼根的EC₅₀分别为176.32、29.69、21.01、48.08、199.57和90.74 mg·L^-1，对幼芽的EC₅₀分别为257.69、46.20、25.51、47.85、65.08和66.34 mg·L^-1；仅中国粗榧提取物、中国粗榧总生物碱及桥氧三尖杉碱对高丹草种子具有抑制作用，对幼根的EC₅₀分别为349.54、254.27和84.71 mg·L^-1，对幼芽的EC₅₀分别为556.50、168.66和154.34 mg·L^-1；仅中国粗榧提取物、cephalotaxine β-N-oxide及桥氧三尖杉碱对黑麦草种子具有抑制作用，对幼根的EC₅₀分别为214.40、187.89和26.52 mg·L^-1，对幼芽的EC₅₀分别为695.58、290.15和122.26 mg·L^-1；盆栽试验表明，中国粗榧提取物、总生物碱及3种生物碱（桥氧三尖杉碱、11-羟基三尖杉碱、三尖杉碱）对双子叶杂草红三叶和反枝苋表现出了一定的苗前除草作用，其中桥氧三尖杉碱的活性最高，以1 000 mg·L^-1浓度进行土壤处理后，14 d的鲜重抑制率分别为78.89%和81.11%，但对禾本科的高丹草和黑麦草的鲜重抑制率较低，均在25%以下；茎叶喷雾处理显示，5种药剂对双子叶杂草红三叶和反枝苋的生长表现出一定的抑制作用，但抑制率均在30%以下，而对2种单子叶杂草基本无效果。【结论】中国粗榧生物碱对双子叶杂草具有较好的除草活性，其主要活性成分为桥氧三尖杉碱，且主要作用方式为抑制幼芽（根）的生长，具有进一步研究及开发潜力。

水稻内生固氮菌分离鉴定、生物特性及其对稻苗镉吸收的影响

袁梅，谭适娟，孙建光

中国农业科学. 2016, 49(19): 3754-3768. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.008

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【目的】分离鉴定湖南水稻内生固氮菌，研究水稻内生固氮菌的系统发育，分析测定分离菌株的生物学特性，探讨接种水稻内生固氮菌对稻苗镉（Cd）吸收的影响。【方法】表面灭菌水稻植株样品后采用低氮培养法分离水稻内生细菌，采用PCR扩增、测序检测菌株nifH基因确认分离物是固氮菌，通过16S rRNA基因序列测定、比对初步鉴定菌株，分析菌株系统发育，通过温室盆栽试验探讨接种水稻内生固氮菌对稻苗Cd吸收的影响。【结果】从8个湖南水稻植株样品中分离到19株内生固氮菌，这些菌株在系统发育地位上属于Bacillus aryabhattai、B. cereus、B. idriensis、B. indicus、B. licheniformis、B. megaterium、B. methylotrophicus、B. subtilis、B. tequilensis、Brevibacterium halotolerans、Fictibacillus phosphorivorans、Paenibacillus barcinonensis、P. lautus 4属13种。分离到的19株内生固氮菌中有大约1/3的菌株产生蛋白酶和纤维素酶的能力较强，在48℃生长良好，在产孢液体培养基上生长良好(OD＞1.0)，在固体产孢培养基上产孢率高(60%—90%)，产碱能力也相对较强(pH 8.5—9.0)。有1/6的内生固氮菌（3个菌株）分别对立枯丝核菌、禾谷镰孢、拟枝孢镰孢具有拮抗性，抑菌率为42%—55%。有大约2/3的菌株对抗生素相对比较敏感，对杀菌剂耐性强。测定的4个代表菌株对检测过的78种碳源中的7种利用较好，它们是乳酸钠、蔗糖、葡萄糖、甘油、苹果酸、丙氨酸、葡萄糖醛酰胺。试验的19株内生固氮菌中有6个菌株促进水稻苗期Cd吸收，与对照相比植株Cd含量增加6.41%—38.45%；其他13个菌株抑制水稻苗期Cd吸收，与对照相比植株Cd含量减少2.06%—34.46%。【结论】从湖南水稻分离到19株内生固氮菌，系统发育地位属于 Bacillus、Brevibacterium、Fictibacillus、Paenibacillus 4属13种。部分菌株产碱能力强，产孢率高，可在48℃高温下生长，产蛋白酶、纤维素酶，拮抗立枯丝核菌、禾谷镰孢、拟枝孢镰孢，具有良好应用前景。接种水稻内生固氮菌可以显著影响水稻苗期Cd吸收，提示采用微生物方法阻控稻田Cd污染是一个非常值得研究、探讨的途径。

中国主要农作物秸秆可新型能源化生态经济总量分析

朱开伟，刘贞，贺良萍，林金钗

中国农业科学. 2016, 49(19): 3769-3785. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.009

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【目的】如何在保护生态环境和考虑秸秆资源开发成本的基础上，实现秸秆资源的合理开发，对中国农业生物质能发展规划有着重要的意义。因此，从保护生态环境和开发成本角度，对可新型能源化利用秸秆资源的生态经济总量进行评估，为生物质能产业布局、优先发展区域、优先发展技术以及政策制定提供参考。【方法】采用文献调研法对研究秸秆还田量与水土流失、土壤有机质和农作物单产关系的文献进行梳理，在此基础上提出土壤生态保留量的概念，并归纳出不同农作物的基础土壤生态保留量；根据基准年农作物单产、种植结构和草谷比系数，考虑土壤生态保留量和秸秆用途，对区域秸秆生态总量和资源密度进行计算；对政府政策和相关项目成本进行分析，设计发展情景和项目成本参数，并以项目投资回报率为变量，计算不同回报率下项目的经济收集半径；根据秸秆资源密度和经济收集半径，计算项目的经济收集量，并与项目理论需求量进行比较，整理出不同项目可用秸秆生态经济总量。【结果】中国主要农作物可新型能源化利用秸秆生态总量约8 661.31万t，主要分布在广西、四川、山东和河南，主要由薯类、甘蔗和油菜秸秆构成。当投资回报率（ROI）为0时，现有技术水平和政策下，6 MW、25 MW直燃发电项目，12 MW气化发电项目，年产5 000 t和10 000 t燃料成型项目可用秸秆生态经济总量分别为8 658.24×10⁴、8 655.29×10⁴、8 658.24×10⁴、3 314.69×10⁴和8 661.31×10⁴ t。当ROI为5%时，6 MW、25 MW直燃发电项目，12 MW气化发电项目，年产5 000 t和10 000 t燃料成型项目可用秸秆生态经济总量分别为7 943.15×10⁴、8 347.38×10⁴、8 347.38×10⁴、260.45×10⁴和8 661.31×10⁴ t。当ROI为10%时，6 MW、25 MW直燃发电项目，12 MW气化发电项目，年产5 000 t和10 000 t燃料成型项目可用秸秆生态经济总量分别为1 853.29×10⁴、7 023.24×10⁴、7 068.07×10⁴、0和8 661.31×10⁴ t。在现有技术水平和政策下，不同ROI下纤维素乙醇项目的可用秸秆生态经济总量均为0。【结论】（1）现有政策对发电类项目有显著的激励作用，可适当降低对年产10 000 t燃料成型项目的补贴力度，提高发电类项目的补贴力度；（2）在生物质能产业布局方面，现阶段可优先发展年产10 000 t秸秆燃料成型项目，可优先在广西、湖北、广东、安徽、河南等地规划建设12 MW秸秆气化发电项目，其次可考虑在广西、湖北、广东和安徽规划建设25 MW秸秆直燃发电项目，最后可考虑在广西规划建设6 MW秸秆直燃发电项目。

葡萄OVATE基因家族生物信息学及表达

袁月，张亚光，高世敏，陶建敏

中国农业科学. 2016, 49(19): 3786-3797. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.010

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【目的】OVATE是一类调控植物生长发育的转录抑制因子，对葡萄OVATE基因家族（VvOFPs）进行生物信息学和组织特异性表达分析，为该类基因的功能研究奠定基础。【方法】根据OVATE保守域蛋白序列（PF04844）对葡萄OVATE基因家族进行鉴定，利用生物信息学方法对葡萄OVATE基因家族染色体定位、基因结构、保守结构域、亚细胞定位等方面进行预测和分析，并分析葡萄和拟南芥OVATE基因家族的进化关系。采用实时荧光定量PCR技术检测VvOFPs组织表达特性。【结果】葡萄OVATE基因家族包含17个成员，不均匀地分布在11条染色体上，均没有内含子结构，编码115—444个氨基酸，等电点4.55—9.69，均为亲水蛋白；所有蛋白均包含完整的OVATE保守结构域，亚细胞定位主要在细胞核中。根据进化树拓扑结构，将葡萄和拟南芥OVATE蛋白家族聚为六类(I—VI)，其中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ类仅包含两个基因，Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ类中VvOFPs和AtOFPs相互交错地聚类在一起；VvOFPs和AtOFPs共包含10个未知基序，保守元件1和2位于OVATE结构域区域，此外，在OVATE结构域外每个类别均包含特有基序。VvOFPs具有组织表达特异性，12个基因在根、茎、叶、花和果实中均可以检测到表达，其余5个基因仅在特定组织中表达。多数VvOFPs在根、嫩茎和花中表达量较高，在嫩叶和果实中仅检测到少数基因表达；VvOFPs在不同发育期表达量存在差异，通常在开花前1周和开花期表达量较高，而花后4周果实中表达量较低。1对旁系同源基因表达模式相似，3对旁系同源基因产生了新的表达模式。【结论】葡萄OVATE结构域序列比较保守，其在不同组织中呈现出多种表达模式，推测其可能参与了葡萄生长发育的调控。

葡萄类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶VvCIPK10的特性与表达

余义和，李秀珍，郭大龙，张会灵，杨英军，李学强，张国海

中国农业科学. 2016, 49(19): 3798-3806. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.011

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【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶VvCIPK10，分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式，为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能，探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得VvCIPK10序列，设计特异引物进行RT-PCR反应，对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析；构建原核表达载体，转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达，收集菌体后裂解细胞，制备蛋白上样液，SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析，同时对融合蛋白进行可溶性分析；IPTG大量诱导表达融合蛋白，收集菌体后进行超声破碎细胞，用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-VvCIPK10融合蛋白，SDS-PAGE电泳进行分析；纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应，反应后SDS-PAGE电泳，压磷屏检测体外自磷酸化反应；构建重组瞬时表达载体pBI221-GFP/VvCIPK10；分离拟南芥原生质体，通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体pBI221-GFP/ VvCIPK10转化至原生质体；通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体pBI221-GFP/VvCIPK10转化至洋葱表皮细胞，培养16 h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测；选择生长相对一致且健壮的葡萄植株，于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样，同时在田间取葡萄不同组织样品，实时荧光定量PCR检测VvCIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式。【结果】PCR克隆获得葡萄VvCIPK10全长为1 357 bp，5′端非编码区为30 bp，3′端非编码区为156 bp，开放阅读框为1 171 bp，编码436个氨基酸，理论等电点为8.59，分子量为48.7 kDa。保守结构域预测分析显示该蛋白5′端具有一个激酶结构域，3′末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域。BLSATP分析表明葡萄VvCIPK10与桃树CIPK（XP_007205151）一致性最高（74%）。重组表达载体pMAL-C5X/VvCIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量（43 kDa+48.7 kDa）相一致的融合蛋白。MBP-VvCIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带，VvCIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn²⁺，不依赖于Mg²⁺和Ca²⁺，EDTA可以抑制VvCIPK10的自磷酸化活性。亚细胞定位结果显示，VvCIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质。VvCIPK10在葡萄各个组织中均有表达，主要在葡萄根和叶片中大量表达，葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低。在干旱、低温和盐胁迫处理后，VvCIPK10呈现受诱导表达模式。VvCIPK10的表达在低温胁迫后6 h达到峰值，干旱和盐胁迫后2 h即达到峰值。【结论】葡萄VvCIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫，推测VvCIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用。

茶树3类渗透调节物质与冬春低温相关性及其品种间的差异评价

薄晓培，王梦馨，崔林，王金和，韩宝瑜

中国农业科学. 2016, 49(19): 3807-3817. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.012

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【目的】探讨2个茶树品种可溶性糖、脯氨酸和游离氨基酸等3类渗透调节物质含量变化及其与冬春期间气温的相关性，评价其对低温的响应程度及其品种间的差别。【方法】选早芽品种‘平阳特早’和‘中茶102’，连续2年于10月21日至翌年4月5日逐日记载茶梢间气温，每天8：00、14：00、20：00记录干湿球温度计的温度，每日3次测得的每块茶园3支干球温度计的平均值即为当日茶梢生境气温；测温期间每月5日、15日、25日采摘成叶，以蒽酮比色法测定茶鲜叶可溶性糖含量，将剩余擦拭干净的鲜叶蒸青、烘干制成蒸青茶样，用SDE-HPLC方法测定茶干叶脯氨酸和游离氨基酸含量。【结果】根据茶树的发育起点温度和休眠温度，将试验阶段分为越冬期（2013/10/21—2014/3/5，2014/10/21—2015/3/5）和早春期（2014/3/6—2014/4/5，2015/3/6—2015/4/5）2个阶段。①连续2年试验的越冬期间（2013/10/21—2014/3/5，2014/10/21—2015/3/5），气温先逐渐下降，再持续低温；2个品种成叶的可溶性糖含量相应地升高、再升高，与旬平均气温显著负相关；脯氨酸含量升高、保持，与旬平均气温显著负相关；游离氨基酸含量则为下降、保持，与旬平均气温显著正相关；当温度出现最低值时，可溶性糖含量和脯氨酸含量相应出现最高值，游离氨基酸含量也跟随着出现最低值，而当温度出现最高值时，可溶性糖含量和脯氨酸含量随后也就相应地出现最低值，游离氨基酸含量随之也相应地出现最高值。②2年试验的早春期间（2014/3/6—2014/4/5，2015/3/6—2015/4/5）气温渐升，可溶性糖含量趋于减少，脯氨酸、游离氨基酸含量趋于增加；③茶树抗冻性与温度密切相关，茶鲜叶可溶性糖、脯氨酸和游离氨基酸含量与茶树的抗冻性密切相关，2年越冬期间，与‘中茶102’相比，在遭受冬季低温胁迫时，‘平阳特早’3类渗透调节物质对低温的响应性、响应幅度分别更灵敏、更大，‘平阳特早’3类渗透调节物质含量稍多。【结论】深秋至清明期间茶树易受冻害和倒春寒，其中越冬期间可溶性糖、脯氨酸和游离氨基酸皆能敏感地响应低温变化，三者含量分别与旬平均气温显著相关，是茶树的重要抗冻指标；‘平阳特早’品种对于低温响应程度大于‘中茶102’。

米糠酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺

童鑫，张瑞芬，邓媛元，肖娟，刘磊，张雁，魏振承，张名位

中国农业科学. 2016, 49(19): 3818-3830. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.013

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【目的】建立米糠中酚类物质的大孔树脂分离纯化工艺，比较米糠提取物纯化前后总酚、总黄酮含量及抗氧化能力，为米糠的深加工利用提供参考。【方法】比较9种不同类型大孔吸附树脂（HPD-100、HPD-200A、HPD-300、HPD-700、D101、HPD-722、AB-8、ADS17和HPD-826）对米糠提取物中总酚的静态吸附和解吸性能，筛选出对脱脂米糠酚类物质纯化效果最佳的大孔吸附树脂类型；通过考察其静态吸附动力学曲线，比较不同上样液浓度、上样流速和上样体积下的动态吸附曲线以及采用不同浓度乙醇洗脱的解吸效果，建立米糠多酚的大孔吸附树脂吸附和解吸工艺条件；比较HPD-300型大孔吸附树脂纯化前后总酚、总黄酮含量，采用高效液相色谱法结合应用酚类标准品分析米糠提取物经大孔吸附树脂纯化前后其各单体酚类物质种类与含量，并通过氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）和细胞抗氧化分析法（cellular antioxidant activity，CAA）比较其纯化前后的抗氧化活性。【结果】9种类型大孔吸附树脂对脱脂米糠提取物酚类物质均有一定的吸附能力，其中HPD-300型大孔吸附树脂对脱脂米糠总酚静态吸附和解吸效果明显优于其他类型树脂，其饱和吸附量为9.04 mg GAE·g^-1，解吸率为82.62%，同时米糠总酚静态吸附在6 h时达到饱和值。HPD-300型大孔吸附树脂最佳吸附和解吸工艺条件为：米糠酚类提取液上样浓度为1.0 mg GAE·mL^-1，上样流速为3.0 BV·h^-1，上样体积为3.5 BV，洗脱剂为70%乙醇溶液，洗脱流速为3.0 BV·h^-1。经HPD-300型大孔吸附树脂纯化后，米糠酚类提取物的总酚和总黄酮含量分别从纯化前的88.07 µg GAE·mg^-1和30.04 µg CE·mg^-1提高到320.72 µg GAE·mg^-1和133.67 µg CE·mg^-1，分别提高了2.6和3.4倍。经高效液相色谱分析，米糠酚类提取物经HPD-300型大孔吸附树脂纯化后，其中的没食子酸、原儿茶酸、香草酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香草醛、对香豆酸和阿魏酸等10种酚类单体组成未见明显变化和损失，且上述酚类单体在提取物中的含量较纯化前分别提高0.4—2.4倍。纯化后提取物的ORAC和CAA值分别为3 248.21 µmol TE·g^-1和95.24 µmol QE·g^-1，较纯化前的1 327.51 µmol TE·g^-1和29.19 µmol QE·g^-1，分别提高了1.4和2.2倍。【结论】HPD-300型大孔吸附树脂适合米糠酚类物质的分离纯化，经其纯化后的米糠提取物中总酚、总黄酮含量及抗氧化活性提高1—3倍，且不会造成单体酚的明显损失。

发酵对苹果渣多糖加工特性的影响

贾丰，郭玉蓉，刘冬，杨曦，邓红，孟永宏

中国农业科学. 2016, 49(19): 3831-3844. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.014

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【目的】中国苹果年均产量占世界总产量的50%以上，其中约有20%用于工业化深加工。因此，每年将产生数以万吨的苹果渣，这些苹果渣一般作为廉价饲料出售或作为废料丢弃，造成资源极大浪费。比较苹果渣发酵前后多糖的物理特性、流变特性、黏均分子量及基本结构等加工特性，为苹果渣多糖的开发利用提供新的思路和依据。【方法】以苹果原渣多糖（apple pomace polysaccharides，AP）、苹果酒渣多糖（wine fermented apple pomace polysaccharides，WFP）、苹果醋渣多糖（vinegar fermented apple pomace polysaccharides，VFP）为原料，通过对苹果渣多糖提取率、溶解性、乳化性及其稳定性、起泡性及其稳定性、吸湿性与保湿性等物理指标进行全面测定、利用流变仪测定多糖溶液流变学特性、利用台式扫描电镜（DSEM）对多糖微观结构进行观察，同时利用乌氏粘度计对多糖进行黏均分子量测定，从而对加工特性进行全方位的对比研究。【结果】AP提取率为5.68%，发酵苹果渣多糖提取率为6%—7%，与AP差异显著（P＜0.05）。VFP、WFP在水中溶解度分别为0.1405 g·mL^-1、0.0771 g·mL^-1，均与AP（0.0283 g·mL^-1）存在显著差异（P。＜0.05）。与AP相比，发酵苹果渣多糖起泡稳定性有所增加，吸湿性、保湿性明显升高（P＜0.05），但吸油性、乳化性及乳化稳定性均显著降低（P＜0.05）。此外，在流变学方面，AP、VFP、WFP均为典型的非牛顿流体，其表观黏度存在明显的浓度依赖特征；WFP、VFP 具有良好的温度抗逆性。黏均分子量和微观结构分析表明，AP、WFP、VFP黏均分子量在15—130 kDa，黏均分子量的大小顺序依次为：AP＞WFP＞VFP。台式扫描电镜微观结构图像显示，AP主要由条带、棒状、片状组成，结构间相互交联，形成网状结构；WFP主要由齿状、棒状和片状组成，有一定交联性，但交联程度相对较低；VFP主要由较大的片状组成，弯曲折叠在一起，交联程度相对最低。【结论】发酵苹果渣多糖在物理特性、流变学特性、基本结构、黏均分子量等方面均有所提升，苹果酒渣多糖、醋渣多糖加工特性优于原渣多糖。

基于F₂群体的豁眼鹅豁眼性状遗传分析

于金成，李喆，于宁，赵辉

中国农业科学. 2016, 49(19): 3845-3851. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.015

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【目的】豁眼鹅产蛋性能优良，是中国宝贵的地方家禽资源。作为豁眼鹅的品种标志，豁眼性状的遗传规律有待揭示。文章通过构建鹅豁眼性状F₂资源群，结合表型分析，验证决定豁眼性状基因为隐性遗传的假设，从而了解豁眼性状的遗传机制，为豁眼鹅遗传资源利用提供理论依据。【方法】选用20只豁眼公鹅和100只豁眼母鹅为亲本，组建随机交配群产生豁眼鹅纯系F₁代，观察F₁代中眼睑的表现和分离比例；资源群采用远交群体F₂设计，选用豁眼鹅（3只♂，15只♀）和四川白鹅（3只♂，15只♀）为亲本建立资源群，正反交交配产生F₁代，F₁代在避开近交的前提下互交产生F₂代，观察资源群F₁和F₂代中眼睑的表现和分离比例。【结果】豁眼鹅纯系随机交配下一代的豁眼表型比例为89%(n=444)，11%(n=444)的个体为正常眼睑表型，其中，豁眼与正常表型公鹅的实际比值为7﹕1(n=238)，与理论值差异不显著（χ²=2.09＜χ²_0.05(1)=3.84），母鹅的实际比值为10﹕1(n=206)，与理论值差异不显著（χ²=0.06＜χ²_0.05(1)=3.84），表明决定豁眼性状的基因为隐性遗传的假设为正确的；同时，提示豁眼性状可能由两个基因座决定的，其中一个基因座影响眼睑形成，另一个起修饰作用的基因座影响豁眼表型的外显率。②豁眼鹅与四川白鹅的反交F₁代群体中公鹅和母鹅全部为正常眼睑，表明豁眼性状相对正常眼睑为隐性遗传。③正交F₁代中公鹅100%(n=71)为正常眼睑，母鹅中83%(n=76)的个体表现豁眼，17%(n=76)的个体表现正常，其中，豁眼母鹅与正常表型母鹅的实际比值为5﹕1(n=76)，与理论值差异不显著（χ²=3.51＜χ²_0.05(1)=3.84），表明豁眼性状呈伴性遗传。④正交F₂群体中豁眼公、母鹅与正常眼睑实际比值分别为5﹕8(n=102)和2﹕3(n=94)，与理论比值差异不显著（χ²=0.36, 0.02＜χ²_0.05(1)=3.84）；同时，反交F₂群体中豁眼公、母鹅与正常眼睑的实际比值分别为0﹕1(n=61)和5﹕7(n=60)，与相应的理论比值差异不显著（χ²=0.02＜χ²_0.05(1)=3.84），正反交F₂群体中公母鹅的豁眼表型分离情况进一步证实了豁眼性状呈伴性隐性遗传的遗传规律。【结论】豁眼性状相对正常眼睑为隐性遗传，且呈伴性遗传；豁眼性状的形成主要受两个基因座的影响，一个起主要作用的基因座位于Z染色体上，另一个修饰作用的基因座位于常染色体上。

中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的克隆及时空表达

杜亚丽，张中印，潘建芳，王树杰，杨爽，赵慧婷，姜玉锁

中国农业科学. 2016, 49(19): 3852-3862. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.016

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【目的】克隆获得中华蜜蜂（Apis cerana cerana）AcerOBP14基因序列，并对其蛋白结构进行预测，分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异，为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织cDNA为模板利用RT-PCR技术扩增和克隆获得AcerOBP14 cDNA全长序列，并提交至GenBank数据库；利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征；采用MEGA5.2软件中的邻位相连法（neighbor-joining，NJ）构建AcerOBP14及其同源膜翅目昆虫OBPs的系统发育树；通过实时荧光定量PCR技术分析AcerOBP14在1、5、10、15、20、25和30日龄中华蜜蜂不同组织（触角、头、胸、腹、足和翅）中mRNA的表达情况。【结果】克隆获得了中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP14的cDNA序列（GenBank登录号为KT24648）。AcerOBP14的开放阅读框（ORF）长度为408 bp，编码135个氨基酸，预测其蛋白分子量为15.08 kD，理论等电点为5.44，有信号肽，无跨膜结构，且第18—127位氨基酸之间存在一个昆虫气味结合蛋白家族PBP-GOBP superfamily保守结构域；存在多个比较明显的疏水区域，可能是脂溶性气味分子的结合位点；含有4个保守的半胱氨酸位点，属于Minus-C OBP亚家族。亚细胞定位分析表明，AcerOBP14属于分泌型蛋白，主要集中在内质网-高尔基体-质膜分泌途径上。AcerOBP14蛋白具有7个α螺旋，α1—α6属于典型OBPs核心螺旋，α7位于C端且暴露在蛋白表面。氨基酸同源序列比对结果显示，AcerOBP14与西方蜜蜂AmelOBP14的氨基酸序列一致性最高，达到86%；其次是大蜜蜂AdorGOBP56a-like，一致性为55%。系统进化树分析表明，同为蜜蜂属的中华蜜蜂AcerOBP14、西方蜜蜂AmelOBP14、大蜜蜂AdorGOBP56a-like、中华蜜蜂AcerOBP21和小蜜蜂AfloGOBP56d-like聚为一个分支，切叶蜂属的苜蓿切叶蜂MrotGOBP56a-like、侧沟茧蜂属的毁侧沟茧蜂MdemGOBP83a-like、壁蜂属的角额壁蜂OcorOBP3和熊蜂属的BterGOBP56d-like和BimpGOBP56d-like聚为另一大分支。荧光定量PCR结果显示，AcerOBP14在成蜂不同发育期的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达，其表达程度有差异。1日龄工蜂的胸部表达量最高，触角次之，且两者均极显著高于头、腹、足和翅（P＜0.01）；其他日龄工蜂触角表达量均极显著高于其他组织（P＜0.01），其中20日龄工蜂的触角表达量最高。从各组织在不同发育阶段的表达量来看，触角的表达量在1日龄最低，极显著地低于其他日龄（P＜0.01）；5、10日龄逐渐增加，15日龄突然下降，20日龄达到最高，极显著高于其他日龄（P＜0.01）；之后又呈逐渐下降趋势。头、胸、腹、足和翅膀表达量总体上随日龄增加而呈下降趋势，5日龄之后大幅下降，之后趋于平稳且呈低丰度表达。【结论】AcerOBP14属于Minus-C OBP亚家族，具有PBP-GOBP家族的典型结构；组织表达谱结果暗示，AcerOBP14属普通气味结合蛋白GOBP，在中华蜜蜂中除嗅觉识别之外还参与其他生理功能。

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