中国农业科学

水稻颖花开放前浆片转录组变化

付永琦，向妙莲，蒋海燕，何永明，曾晓春

中国农业科学. 2016, 49(6): 1017-1033. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.001

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【目的】水稻颖花开放是由其基部的一对浆片吸水膨大所启动。测序技术的发展为从细胞整体水平研究浆片对颖花开放的分子响应，从而对掌握浆片调控颖花开放的内在分子机制提供更为快速、有效的方法。【方法】以常规籼稻品种中早25为材料，应用Illumina测序技术对水稻颖花开放前12 h和临开放前1 h 2个时间点的浆片转录组进行测序，将所得高质量的序列（clean reads）与籼稻9311参考序列比对，获得唯一比对上某一参考基因匹配的reads（unique reads），采用RPKM法计算基因表达量，并在此基础上以FDR≤0.001和|log₂Ratio|≥1为条件筛选出两样本间差异表达的基因，通过与Gene Ontology（GO）数据库、KEGG pathway数据库以及联合蛋白质数据库中的UniProtKB等数据库比对注释差异表达基因的功能和可能参与的分子调控途径。【结果】从水稻颖花开放前12 h和临开放前1 h 2个时间点的浆片转录组中分别检测到有26 369和26 157个表达基因，2个时间点的转录组之间存在3 924个差异表达基因，其中2 623个基因呈现下调表达和1 301个基因呈现上调表达，有105个基因表达差异倍数高达100倍以上（即|log₂Ratio|≥6.7）。GO分析结果表明被注释分子功能的差异基因有1 624个，其中21.7%基因具有离子结合活性、10.3%具有氧化还原酶活性、5.4%具有转运活性。富集于生物学过程的差异基因有1 313个，其中15.0%的差异基因参与定位、12.4%参与运输、4.7%参与碳水化合物代谢、4.5%参与脂类代谢。Pathway显著性富集分析发现有2 229个差异基因参与了123条代谢途径，其中，富集基因数目较多的途径主要包括次生物质生物合成（399个）、植物激素信号转导（152个）、核苷酸代谢（146个）以及淀粉和糖代谢（64个）等路径。花前1 h浆片中特异表达且唯一比对上基因的reads数（Uniq-reads_ num）超过30的基因的功能主要涉及细胞壁重塑、质膜的稳定性、能量代谢、基因转录调节以及信号转导等生命活动。茉莉酸及其类似物对水稻颖花开放有强烈的诱导效应，差异表达基因中有16个基因参与了茉莉酸生物合成途径以及11个基因参与了茉莉酸的信号转导过程，且随着颖花开放时间的临近，多数基因表达水平显著提高。【结论】获得颖花开放前12 h和临开放前1 h浆片中差异表达基因的表达变化模式及其功能信息，发现参与调控碳水化合物代谢与运输、细胞能量代谢、细胞壁结构修饰以及茉莉酸等激素代谢与信号转导等生理过程的基因在颖花临开前被强烈诱导或抑制表达，提示这些基因与浆片细胞吸水膨大调控水稻颖花开放密切相关。

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

曹新文，王秀珍，李永梅，赵李婧，马海霞，闫洁

中国农业科学. 2016, 49(6): 1034-1046. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.002

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【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶，获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草，为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列，并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA，对FPS基因进行组织特异性表达分析，并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较，分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达，对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析，比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶，测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列，命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框，编码342个氨基酸，编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD，理论等电点（pI）为5.41，平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明，橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域，系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支，其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知，TKFPS 蛋白无跨膜区域，可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达，其中，在叶中表达量最高，根次之，在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘，得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现，与野生型相比，转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高，6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS，并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系，FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。

胡麻两系杂交亲本的配合力及杂种优势分析

王利民，张建平，党照，裴新梧，党占海

中国农业科学. 2016, 49(6): 1047-1059. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.003

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【目的】研究胡麻两系杂种优势的亲本配合力遗传基础，为胡麻两系杂交种亲本选配提供理论依据。【方法】选用7份温敏型雄性不育系和11份国内外主栽油用及纤用亚麻优良品种为亲本材料，按照遗传交配设计NCⅡ不完全双列杂交设计配置77（7×11）份杂交组合，利用DPS软件分析两系胡麻杂交亲本14个主要农艺性状和品质性状的遗传效应、亲本一般配合力（GCA）和特殊配合力（SCA）效应及与杂种优势的关系。【结果】胡麻两系杂交组合主要农艺性状和品质性状存在显著的遗传差异，其主要表现为加性基因效应遗传的性状有：株高、工艺长度、分茎数、分枝数、每果粒数、千粒重和含油率、油酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸；同时受加性和非加性基因效应共同影响的性状有：单株果数、单株产量和亚麻酸组分。主要农艺性状与品质性状的狭义遗传力大小顺序分别为：工艺长度>千粒重>株高>每果粒数>分枝数>单株产量>分茎数>单株果数；含油率>亚麻酸>硬脂酸>棕榈酸>亚油酸>油酸。亲本一般配合力（GCA）和特殊配合力（SCA）在同一亲本（组合）的不同性状间和同一性状的不同亲本（组合）间存在较大差异，且亲本的GCA效应与SCA效应没有直接的关系。在供试的18份亲本材料中，不育系113S、16-1-1-2、24-1-1-1、T-11和1S，恢复系陇亚10号、天亚9号、轮选3号、Macbeth和AC Watson在某些农艺和品质性状上具有较突出的一般配合力（GCA）效应，是较优的亲本材料。所组配的77份杂交组合14个主要农艺性状和品质性状存在广泛的超亲优势和竞争优势，优势大小因性状而异，其竞争优势与亲本一般配合力（GCA）和特殊配合力（SCA）呈极显著正相关，且与亲本GCA的相关性多高于SCA，与恢复系的GCA相关性多高于不育系，强优势组合的特点是双亲或亲本之一具有较高的GCA效应，或具有较高的SCA效应。此外，亲本GCA效应，特别是恢复系的GCA效应对杂种优势的贡献要明显高于不育系。【结论】胡麻两系杂种优势表现与亲本一般配合力（GCA）和特殊配合力（SCA）紧密相关，其亲本一般配合力（GCA），特别是亲本一般配合力（GCA）高的恢复系的选配，是组配强优势胡麻两系杂交育种的关键。

外源6-BA和不同用量氮肥配合对小麦花后叶片功能与荧光特性的调控效应

骆永丽，杨东清，尹燕枰，崔正勇，李艳霞，陈金，郑孟静，王玉竹，庞党伟，李勇，王振林

中国农业科学. 2016, 49(6): 1060-1083. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.004

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【目的】探讨外源细胞分裂素（6-BA）和不同用量氮肥对小麦花后光合特性的调控效应，为激素与氮肥配合施用提高小麦光合生产力提供理论依据。【方法】试验选用持绿型品种汶农6号和非持绿型品种济麦20，设置N0（0）、N1（240 kg·hm-2）、N2（360 kg·hm^-2）3个氮肥用量，同时，花后连续3 d叶面喷施25 mg·L^-1 6-苄基腺嘌呤（6-BA）及300 mg·L^-1洛伐他汀（Lovastatin），用量100 mL·m^-2。开花后每隔7 d取旗叶，测定叶绿素含量、MDA含量、抗氧化酶活性等生理指标，用高效液相色谱法测定4种内源激素含量，利用脉冲调制式荧光仪测定不同处理下旗叶叶绿素荧光诱导的动力学参数。【结果】喷施外源6-BA显著提高两品种小麦旗叶花后不同时期最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSII）、光合电子传递速率（ETR）以及光化学猝灭系数（qP），而喷施外源洛伐他汀对上述指标产生显著降低作用。喷施外源6-BA使N0、N1、N2处理下济麦20旗叶ΦPSII分别提高12.08%、14.21%、9.43%，汶农6号旗叶ΦPSII分别提高12.44%、14.84%、11.58%；喷施外源6-BA使N0、N1、N2处理下济麦20旗叶ETR分别提高16.57%、25.81%、18.83%，汶农6号旗叶ETR分别提高13.88%、23.58%、22.80%。两品种其他荧光参数指标表现出以下规律，即6-BA与N1配合对小麦旗叶Fv/Fm、ΦPSII、ETR以及qP的提高效应均高于单一喷施6-BA或6-BA与N2配合。同时，品种、氮肥、激素单一效应及激素与氮肥配合对ΦPSII、ETR、qP影响显著，品种、激素单一效应对Fv/Fm影响显著，而激素与不同用量氮肥配合对Fv/Fm无显著影响。叶面喷施细胞分裂素抑制剂洛伐他汀使N0、N1、N2处理下济麦20旗叶ETR分别降低22.71%、12.06%、11.92%，两品种其他荧光参数指标Fv/Fm、ΦPSII、qP均表现出下降趋势，而增施氮肥能够缓解因细胞分裂素合成减少导致的小麦荧光参数的降低。外源喷施6-BA对两品种小麦内源激素含量影响显著。喷施外源6-BA显著提高旗叶玉米素核苷（ZR）含量，生长素（IAA）含量以及N0、N1处理下21—28 d赤霉素（GA3）含量，显著降低脱落酸（ABA）含量，而喷施外源洛伐他汀后，4种内源激素含量变化与以上结果相反。随着施氮量增加，ZR含量、14—28 d IAA含量随之增加，ABA含量总体呈下降趋势，而7—14 d GA3含量在N1处理下最高。同时，品种、氮肥、激素单一效应、激素与氮肥配合对ZR含量影响显著。另外，6-BA与N1配合对小麦叶绿素含量和抗氧化酶活性的提高效应高于单一喷施6-BA或6-BA与N2配合，激素与氮肥配合施用显著影响叶绿素含量和抗氧化酶活性。与不施氮相比，N1与N2处理下，外源洛伐他汀对叶绿素含量和抗氧化酶系活性的降低幅度减小，即增施氮肥能够缓解因细胞分裂素合成减少引起的两品种小麦光合结构的衰老。花后喷施外源6-BA显著影响千粒重和产量（P＜0.01），对穗数、穗粒数无显著影响，6-BA与氮肥配合显著影响穗数、穗粒数、千粒重以及产量，6-BA与N1配合显著提高产量及其构成因素。【结论】细胞分裂素与氮肥配合能够明显改善小麦的光合性能，6-BA与适量氮肥配合施用对小麦光合性能的提高效应显著高于单一喷施6-BA或6-BA与过量氮肥相配合，光合性能的改善显著提高两品种的产量。

旱区集雨种植方式对土壤水分、温度的时空变化及春玉米产量的影响

李玉玲，张鹏，张艳，贾倩民，刘东华，董昭芸，贾志宽，韩清芳，任小龙

中国农业科学. 2016, 49(6): 1084-1096. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.005

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【目的】探索不同集雨种植方式春玉米旱作田土壤水分转运、分配、土壤温度的时空变化特征及其对玉米产量和水分利用效率的影响，为试区玉米高产、水分高效持续利用型种植模式提供理论依据。【方法】2013—2014年在宁夏彭阳区设置传统露地平作（CK）为对照，分析4种不同集雨覆膜种植方式下春玉米各生育期的土壤水分、土壤温度、水分利用效率及产量变化。4种集雨覆膜种植方式分别为双垄沟全覆膜种植（D）、半膜平铺种植（F）、沟播垄膜双行种植（R1）、沟播垄膜单行种植（R2）。沟播垄膜双行处理和半膜平铺处理覆膜宽度均为60 cm，沟播垄膜单行处理垄宽50 cm、沟宽10 cm，双垄沟全覆膜大垄宽70 cm，垄高15 cm、小垄宽50 cm，垄高10 cm。播种密度均为75 000株/hm²。播前基施化肥102 kg N·hm^-2和90 kg P₂O₅·hm^-2，拔节期追施153 kg N·hm^-2，试验为随机区组设计，3次重复。【结果】各覆膜处理较CK可明显改善土壤水温条件，在玉米苗期（0—30 d），D、F、R1、R2处理0—200 cm土层的贮水量比CK分别增加了10%、8.9%、10.9%和14.4%。在玉米生长中后期（90—120 d），受降雨量与不同覆膜种植方式下玉米耗水量不同，各覆膜处理0—200 cm土层贮水量表现出差异，2013年（前期降水为309.4 mm）各覆膜处理显著低于CK，覆膜处理间无显著差异，2014年（前期降水为104.9 mm）R1、R2处理贮水量均显著高于其他覆膜处理。2年试验中，R1处理0—40 cm土层贮水量显著高于其他处理，平均增加了5%；D、F、R1、R2 处理0—25 cm土层土壤温度在玉米苗期较CK分别增加了3.5、2.3、0.9和1.1 ℃；玉米全生育期总干物质积累量呈“S”型曲线，在0—60 d，积累量较小，各处理仅占整个生育期的4.3%-15.4%，各处理大小顺序为：D＞R2＞F＞R1＞CK；在60—120 d（大喇叭口期至灌浆期），积累了玉米干物质的74.5%，此期D、R2的干物质积累速率达309.3和324.1 kg·hm^-2·d^-1；2013年（玉米全生育期降雨量为594.1 mm）D、F、R2的水分利用效率和玉米产量较CK分别提高13.4%、21.2%、13.3%和18.0%、11.2%、20.3%；2014年D、R1、R2（玉米全生育期降雨量为341.9 mm）的水分利用效率和玉米产量比CK分别显著提高了31.1%、33.8%、35.1%和42.5%、39.9%、40.8%，D、R1、R2处理间产量无明显差异。各覆膜处理在降水较少的年份水分利用效率和产量增加幅度较大，且R1效果明显。【结论】沟垄集雨种植方式可明显改善宁南半干旱地区土壤浅层水分状况，提高土壤温度，增加物质积累量；沟播垄膜种植在降水较少的年份集雨优势明显，双垄沟全覆膜、沟播垄膜单行种植的水分利用效率和产量最佳。该项研究丰富了宁南半干旱地区旱作集水种植模式，对进一步完善和筛选适合半干旱地区玉米高产稳产的可持续发展种植模式提供了理论依据。

葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2互作蛋白筛选与鉴定

余义和，李秀珍，郭大龙，杨英军，李学强，张国海

中国农业科学. 2016, 49(6): 1097-1105. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.006

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【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子VvRR2，获得VvRR2的互作蛋白，为阐明VvRR2在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌，提取总RNA后反转录，利用实时荧光定量PCR检测VvRR2转录本对白粉病菌的响应；构建瞬时表达载体pBI221-VvRR2-GFP，转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析；构建酵母表达载体pGBKT7-VvRR2，转化酵母菌株AH109，检测VvRR2的转录激活活性；构建酵母表达cDNA文库，以VvRR2为诱饵，通过Mating法筛选互作蛋白，对获得候选序列进行Blast分析；将候选蛋白VvTGA的全长序列克隆至pGADT7载体形成重组载体pGADT7-VvTGA，与重组诱饵载体pGBKT7-VvRR2共转化酵母，进行双杂交验证VvRR2与VvTGA的相互作用；将VvTGA的全长序列克隆至pSPYNE（R）173载体，形成重组载体pSPYNE-VvTGA，将VvRR2的全长序列克隆至pSPYCE（M）载体，形成重组载体pSPYCE-VvRR2，然后将两个重组载体共转化拟南芥原生质体，利用双分子荧光互补技术验证VvRR2与VvTGA的相互作用。【结果】葡萄接种白粉病菌后，细胞分裂素响应调节因子VvRR2呈现受白粉病菌诱导表达模式。VvRR2定位在拟南芥原生质体的细胞核，转录激活试验结果表明VvRR2在酵母体内具有转录激活活性。在含有60 mmol·L^-1的3-AT培养基上可以抑制VvRR2诱饵载体的自激活活性，VvRR2诱饵载体对宿主酵母菌没有毒性。以VvRR2为诱饵，初步筛选到287个单克隆，在高严谨条件下进一步筛选获得23个有效序列，Blast分析显示这些基因参与蛋白质合成与降解、细胞分裂素信号传导、光反应和生物钟节律、生长发育和逆境响应。酵母回复双杂交试验结果显示含有空载体（pGADT7或pGBKT7）酵母在四缺培养基（含3-AT）上不能生长，含有两种重组质粒的酵母在四缺培养基（含3-AT）上能够生长，并在含有X-α-Gal的四缺培养基上能够显色。双分子荧光互补试验结果显示共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE（R）173、pSPYNE-VvTGA与pSPYCE（M）的原生质体没有黄色荧光，而共转化pSPYCE-VvRR2与pSPYNE-VvTGA的原生质体显示黄色荧光。VvTGA的表达类似于VvRR2，呈现受白粉病菌诱导表达模式。【结论】葡萄细胞分裂素响应调节因子VvRR2是一个受白粉病菌诱导表达的转录因子，能够与VvTGA相互作用，并且VvTGA受白粉病菌诱导表达。

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

张治科，吴圣勇，雷仲仁

中国农业科学. 2016, 49(6): 1106-1116. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.007

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【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白（odorant binding protein，OBP）并对其序列特征及分布情况进行研究，为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因，用DNAMAN软件进行序列分析，用BLAST进行同源性比较，并用MEGA6.0的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树，应用服务器Chou & Fasman预测蛋白的二级结构，通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因，命名为FoccOBP1（GenBank登录号：KM527948）；该基因cDNA序列全长660 bp，其中开放阅读框450 bp，编码149个氨基酸，3′端非编码区长172 bp，具有真核生物polyA加尾结构，5′末端非编码区长38 bp，预测成熟蛋白分子量为16.39 kD，等电点为7.46，N端有22个氨基酸组成的信号肽序列，具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征，其排列方式为C1-X₂₆-C2-X₃-C3-X₄₀-C4-X₉-C5-X₈-C6，符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域，第74—83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显，可能是脂溶性气味分子的结合位点；FoccOBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支，其中与绿盲蝽（Apolygus lucorum）的AlucOBP8（GenBank登录号为AFJ54049.1）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）的AlinOBP5（GenBank登录号为ACZ58031.1）、牧草盲蝽（Lygus lineolaris）的LlinOBP2（GenBank登录号为AHF71029.1）同源相似性最高，其次是棉蚜（Aphis gossypii）的AgosOBP7（GenBank登录号为AGE97637.1）、大豆蚜（Aphis glycines）的AglyOBP7（GenBank登录号为AHJ80893.1）、禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）的RpadOBP7（GenBank登录号为AHL30243.1）等昆虫的OBP，表明FoccOBP1与这些基因的亲缘关系也较近；经FoccOBP1蛋白的二级结构预测，FoccOBP1以α-螺旋为主，其次是β-折叠，转角含量较少；经不同发育阶段检测发现，FoccOBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高，且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低，在雌雄成虫间的表达量也有差异；在初羽化成虫的不同组织检测发现，FoccOBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达；构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1。【结论】明确了FoccOBP1的核苷酸、氨基酸序列特征，分析了该蛋白的二级结构特征，根据FoccOBP1在西花蓟马中的时空表达情况，推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色；成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1，为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下基础。

中国耕地资源与粮食增产潜力分析

陈印军，易小燕，方琳娜，杨瑞珍

中国农业科学. 2016, 49(6): 1117-1131. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.008

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【目的】分析未来中国耕地数量和粮食增产潜力，为国家粮食安全决策提供参考。【方法】以1980/1996—2013年耕地面积和粮食生产系列数据为样本，应用时间序列预测方法，基于中国第二次全国土地调查结果，预测2020年全国耕地面积、耕地复种指数、粮食作物与非粮食作物面积比、粮食作物种植结构，并从“高产示范区单产水平”、“品种区试单产水平”、趋势单产等多视角分析未来全国粮食增产潜力。【结果】到2020年，全国耕地面积为1.32×10⁸ hm²，粮食作物与非粮食作物面积占比为66﹕34，粮食作物播种面积为1.12×10⁸ hm²；从“高产示范区单产水平”看全国粮食总产有68.9%的增产潜力，从“品种区试单产水平”看全国粮食总产有35.5%的增产潜力，从趋势单产看2020年全国粮食总产潜力为6.34×10⁸—6.53×10⁸ t，与2013年相比增产5.3%—8.5%。【结论】未来中国耕地面积和粮食作物播种面积呈小幅减少之势，但在粮食作物单产不断提高的拉动下，未来中国粮食总生产能力继续呈上升之势。

长期施肥下红壤性水稻土有效磷的演变特征及对磷平衡的响应

黄晶，张杨珠，徐明岗，高菊生

中国农业科学. 2016, 49(6): 1132-1141. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.009

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【目的】分析长期不同施肥下土壤有效磷含量、全磷含量、土壤磷素盈亏和磷素活化效率（PAC）的动态变化，探讨不同施肥下水稻土磷素演变特征及与磷平衡的响应关系。【方法】基于1982年开始的红壤性水稻土长期不同施肥定位试验，试验包括不施肥（CK）、有机肥（牛粪，M）、氮磷钾肥（NPK）、氮磷钾肥＋有机肥（NPKM）、氮磷肥＋有机肥（NPM）、氮钾肥＋有机肥（NKM）和磷钾肥＋有机肥（PKM）共7个处理。【结果】经过30年不同施肥，土壤有效磷含量均呈上升趋势。M、NKM、NPK、NPM、NPKM和PKM处理土壤有效磷含量变化速率分别为0.18、0.20、0.83、1.35、1.46和1.62 mg·kg^-1·a^-1。M、NPK、PKM、NPM和NPKM处理土壤全磷增加速率分别约为4.3、15.4、16.0、18.3和22.9 mg·kg^-1·a^-1。所有施肥处理，土壤中磷素均有盈余，磷素盈余量与土壤有效磷增加量呈显著正相关关系（P＜0.05），土壤中每盈余100 kg P·hm^-2，M、NKM、NPM、NPKM、PKM和NPK6个处理的土壤有效磷含量分别增加0.4、0.7、1.9、2.1、2.2和3.2 mg·kg^-1。在土壤中磷素盈余量接近的情况下，单施化肥（NPK）的PAC显著高于单施有机肥（M）处理（P＜0.05）。【结论】化学磷肥和有机肥配施相比单施化肥或有机肥能够显著提高红壤性水稻土土壤有效磷、全磷含量和磷素活化效率。

施用生物炭对土微生物量碳、氮及酶活性的影响

尚杰，耿增超，王月玲，陈心想，赵军

中国农业科学. 2016, 49(6): 1142-1151. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.010

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【目的】研究不同用量生物炭对土微生物量碳（SMBC）、微生物量氮（SMBN）及酶活性的影响，为生物炭提升土壤质量提供科学依据。【方法】采用大田试验，将果树树干、枝条生物炭（450℃、限氧条件下裂解）以不同用量（0、20、40、60、80 t·hm^-2分别记作B0、B20、B40、B60、B80）施入土，与耕层（0—20 cm）混匀。经过2年的夏玉米和冬小麦轮作后，分3层测定0—30 cm土层的土壤生物活性及理化性质，采用主成分分析研究施用生物炭后土酶活性及微生物量碳、氮的变化特征。【结果】（1）在0—20 cm土层，SMBC和SMBN均是在生物炭用量为40或60 t·hm^-2时达到最大，而在20—30 cm土层，SMBC和SMBN均在生物炭用量为80 t·hm^-2时达到最大，且在整个测试土层，施炭处理均比对照（B0）含量高。（2）随生物炭施用量的增加，6种土壤酶活性总体上表现为先增加后降低的趋势。施用生物炭显著增加了土壤酶指数（SEI），在0—10 cm土层，施炭处理较B0显著增加1.6—2.7倍；在10—20 cm和20—30 cm土层，施炭处理较B0分别显著增加26.6%—39.5%和18.7%—21.7%，但用量达到80 t·hm^-2时，SEI则又显著下降。（3）通过主成分分析可以将本研究的8个指标归纳为土壤活性因子和土壤强度因子，其综合得分在不同土层总体上表现为0—10 cm土层＞10—20 cm土层＞20—30 cm土层；在0—10 cm和10—20 cm土层，不同处理综合得分为B60＞B40＞B20＞B80＞B0，在20—30 cm土层，综合得分为B60＞B80＞B40＞B20＞B0。【结论】生物炭的施用增加了土土壤微生物量，提高了土壤酶活性，改善了土壤生物环境。总体而言，60 t·hm^-2的生物炭施用量综合表现最优。

不同配比的硝态氮和铵态氮对枇杷实生苗氮素吸收动力学及生长的影响

马检，樊卫国

中国农业科学. 2016, 49(6): 1152-1162. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.011

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【目的】探究硝态氮和铵态氮及其配比条件对枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）实生苗的氮素吸收动力学参数和生长发育的影响，确定枇杷可吸收利用的氮素形态，为枇杷的氮肥管理提供科学依据。【方法】以枇杷实生苗为材料，采用离子耗竭法，测定枇杷实生苗根系对不同硝态氮和铵态氮的吸收动力学参数；以pH为7.35的石灰性黄壤为栽培介质，设置5个不同硝铵比的施氮处理，研究不同硝态氮和铵态氮配比对枇杷实生苗生长及根系形态特征的影响。【结果】在不同的NH₄⁺及NO₃^-离子浓度及其不同配比的营养液中，枇杷实生苗根系吸收铵态氮、硝态氮及总氮的规律均符合Michaelis-Menten酶动力学方程。无论NH₄⁺和NO₃^-离子浓度如何变化，枇杷实生苗根系对NH₄⁺吸收的内在潜力及亲和力和其在根中的流速均比NO₃^-的大。在单纯供给硝态氮的条件下，枇杷对NO₃^-的吸收并没有得到促进。在供给不同硝铵配比的处理中，随铵态氮比例的增加，枇杷实生苗根系中总氮的最大吸收速率（I_max）和根系中流速（α）明显增大，而米氏常数值（K_m）明显减小；随硝态氮比例的增加，根系中总氮的I_max和离子流动速率（α）明显降低，K_m值明显增大。增加铵态氮的比例能够促进枇杷实生苗根系对氮素的吸收，而增大硝态氮的比例对枇杷根系吸收氮素营养有不利影响，铵态氮是枇杷优先选择吸收的氮素形态。在土培条件下，施不同配比的硝态氮肥和铵态氮肥，枇杷实生苗的植株高度、基径、干重生物量、根冠比、根系形态指标和总叶面积的差异显著。增大铵态氮的施肥比例能够显著增大植株高度、基径、干重生物量、根冠比、总叶面积，根的总长度、总表面积、总体积、平均直径，总根尖数及根系分形维数。100%的铵态氮处理的上述指标最大，100%的硝态氮处理的上述指标最小。【结论】铵态氮能够明显促进枇杷实生苗的生长发育，增强枇杷实生苗对氮素的吸收利用，而硝态氮则抑制枇杷实生苗的生长。在混合供应铵态氮和硝态氮的条件下，增加铵态氮比例能够促进枇杷实生苗的生长发育。

干燥方式对银耳加工与贮藏过程中品质的影响

李亚欢，田平平，王杰，杜冰，姚松君，孙恬，马务迢，刘伟贤

中国农业科学. 2016, 49(6): 1163-1172. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.012

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【目的】研究不同干燥方式对银耳加工与贮藏过程中品质变化的影响，为高品质银耳的生产提供理论依据。【方法】以收缩率，复水比，色泽，蛋白质、还原糖、总糖和多糖含量，多糖对超氧阴离子和羟自由基的清除能力，水分含量，微生物含量，过氧化氢、SO₂、米酵菌酸和亚硝酸盐含量为评价指标，研究热风干燥、真空干燥和真空冷冻干燥3种干燥方式对银耳在加工与贮藏过程中质构品质和相关理化指标的影响。【结果】不同干燥方式对银耳品质影响的结果表明，热风干燥的银耳收缩率和褐变程度最高，复水比增幅低；冷冻干燥的银耳褐变程度低，具有最大的复水比增幅和最小的收缩率。干燥方式对银耳营养成分影响方面，冷冻干燥的银耳中水溶性蛋白、总糖和多糖含量最高；真空干燥的银耳中水溶性蛋白和多糖含量最低，但其还原糖含量最高；热风干燥的银耳中还原糖含量最低；从冷冻干燥的银耳中提取的多糖具有最高的超氧阴离子和羟自由基清除率，从真空干燥的银耳中提取的多糖具有最低的超氧阴离子和羟自由基清除率。采用3种方式干制的银耳贮藏期间营养成分理化指标变化结果表明，随着贮藏时间的增加，各样品中水分和还原糖含量均呈上升趋势，蛋白质、总糖、多糖含量呈下降趋势。贮藏90 d后，热风干燥的银耳水分含量和还原糖的增幅最大，多糖含量降幅最小；冷冻干燥的银耳蛋白质和多糖含量降幅最大，还原糖含量增幅最小；真空干燥的银耳水分和蛋白质含量变化幅度最小。在贮藏期间微生物与代谢产物方面，3种方式干制的银耳中细菌和真菌个数，过氧化氢、SO₂和米酵菌酸含量均呈上升趋势。贮藏90 d后，冷冻干燥的银耳中微生物数量和米酵菌酸含量增幅最大；热风干燥的银耳中过氧化氢含量增幅最大；真空干燥的银耳中微生物数量和过氧化氢含量增幅最小；3种方式干制的银耳之间SO₂含量增幅无显著差异。【结论】综合分析，冷冻干燥的银耳质构品质和营养成分最佳，其次是真空干燥，热风干燥的银耳品质最差。但冷冻干燥的银耳在贮藏过程中易受微生物的影响，营养物质下降幅度最大。

复合保鲜剂涂膜对石榴果实采后生理、贮藏品质及贮期病害的影响

张润光，田呈瑞，张有林

中国农业科学. 2016, 49(6): 1173-1186. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.013

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【目的】石榴采后易出现果皮褐变、籽粒劣变、软化腐烂等问题，导致贮期短，贮后质量差，商品价值降低。优选石榴复合保鲜剂的最佳配方，研究保鲜剂对石榴采后生理、贮藏品质及贮期病害的影响，为石榴贮藏保鲜提供理论依据和技术参考。【方法】以‘净皮甜’石榴为试材，采用正交试验优化复合保鲜剂组分比例，通过生理变化和感官鉴评确定最佳配方。用复合保鲜剂涂膜处理石榴，于温度（1.0±0.5）℃、相对湿度90%—95%条件下贮藏，以未经保鲜剂处理的石榴作对照。贮期测定各处理果实呼吸速率、相对电导率、果实硬度，果皮多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和籽粒可溶性固形物含量、总糖含量、可滴定酸含量，计算贮藏不同时期各处理褐变指数、腐烂指数、失重率和商品果率，贮藏160 d时对石榴果实的口感、色泽、气味等感官性状进行综合评定。对引起石榴贮期病害的病原菌进行科赫氏验证、形态学分析和ITS序列鉴定，测定复合保鲜剂对石榴贮期病原菌的抑制率、半致死浓度（EC₅₀）和最小抑菌浓度（MIC）。【结果】复合保鲜剂由壳寡糖、那他霉素、葡萄糖酸-δ-内酯、柠檬酸、抗坏血酸、六偏磷酸钠和酪蛋白酸钠7种组分配制而成。各项指标测定结果表明，复合保鲜剂涂膜处理能够降低石榴果实呼吸速率，减缓果皮褐变指数和相对电导率升高，抑制果皮PPO、POD活性，保持果皮CAT、SOD较高活性，有效地维持籽粒的可溶性固形物含量、可滴定酸含量、总糖含量和果实硬度，降低果实腐烂指数和失重率，提高商品果率，保持良好的感官品质。引起石榴贮期主要病害的病原菌为葡萄核盘菌属的富氏葡萄核盘菌（Botryotinia fuckeliana）和青霉属的小刺青霉（Penicillium spinulosum）；复合保鲜剂抑制病原菌生长作用明显。贮藏期可达160 d，褐变指数0.21，腐烂指数0.16，商品果率90.2%，贮后果皮色泽鲜艳，籽粒晶莹饱满，感官品质优良，保鲜效果好。【结论】复合保鲜剂的最佳配方为：壳寡糖0.2 g、那他霉素0.02 g、葡萄糖酸-δ-内酯0.08 g、柠檬酸3 g、抗坏血酸2 g、六偏磷酸钠0.1 g、酪蛋白酸钠0.6 g，各组分混合后加蒸馏水配制成浓度为160 mg·L^-1的保鲜剂。石榴果实采后在温度（5.0±0.5）℃下预冷3 d，然后放入上述保鲜剂中浸渍10—20 s，取出自然晾干，单果套塑料袋包装，置于温度（1.0±0.5）℃、相对湿度90%—95%条件下贮藏。

鸡粪中氨氮降解菌的分离鉴定及除氨适宜条件研究

刘志云，刘国华，蔡辉益，张姝，常文环，谢庆，司彦培

中国农业科学. 2016, 49(6): 1187-1195. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.014

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【目的】氨气是畜禽养殖业中最常见、危害最大的有害气体之一。为了获得用于治理畜禽粪便氨气污染的微生物，从发酵3 d的鸡粪中分离筛选高效氨氮降解菌，研究其对鸡粪的除氨效果。【方法】以硫酸铵为唯一氮源，对鸡粪中具有氨氮降解能力的微生物进行连续10代的富集培养，将获得的富集培养液按10^-1梯度稀释后进行分离纯化。分离得到的单菌落接种至富集培养基中，培养24h后，测定培养基中剩余的氨氮含量，比较各菌株之间的氨氮降解率，筛选出具有高效氨氮降解能力的菌株。通过形态观察、分子生物学以及生物化学的方法进行菌株鉴定。研究不同温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）和pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）对菌株生长的影响，探索不同碳源（淀粉、甘露醇、柠檬酸钠、葡萄糖、乙酸钠、碳酸氢钠）、C/N（5、10、20、40）以及初始氨氮浓度（100、300、600、1 200mg·L^-1）对菌株氨氮降解性能的影响。最后将得到的目标菌株制成菌悬液，按10%的接种量接种到鸡粪中，同时以等量无菌生理盐水作为对照组，分别培养24 h、48 h、72 h和96 h，测定鸡粪的氨气散发量以及不同形态氮素的变化情况，评价目标菌株对鸡粪的除氨效果。【结果】通过富集培养，从鸡粪中共分离出15株能够降解氨氮的菌株，进一步筛选得到1株氨氮高效降解菌LSA，经鉴定为克柔假丝酵母（Candida krusei），与Candida krusei isolate EM12（JF274497.1）的相似性达到99%，GenBank中的登录号为KT025851。该菌株的对数生长期为6-12h，可在pH 3-7，20-40℃条件下生长，能够分别利用葡萄糖、乙酸钠、淀粉、柠檬酸钠、甘露醇作为碳源，不能利用无机碳，当培养基的C/N为20时氨氮去除效果最佳。随着培养基中初始氨氮浓度的升高，菌株LSA对氨氮的降解率呈现下降趋势；与之相反，氨氮降解速率则随着初始浓度的升高呈现升高趋势。当氨氮初始浓度为327.20mg·L^-1时，60h内菌株LSA对氨氮的去除率达到71.88%，菌体含量为OD₆₀₀ 2.45；当氨氮初始浓度为1 105.26mg·L^-1时，96h内菌株LSA对氨氮的去除率达到57.44%，菌体含量达到OD₆₀₀ 2.96。将其接种到鸡粪中可以显著降低鸡粪中氨氮的含量，最高可降低22.30%；减少粪中氨气的挥发量，最高可降低15.92%；增加粪便总氮含量；降低粪便氨氮占总氮的比重。【结论】克柔假丝酵母（Candida krusei）LSA菌株具有高效氨氮降解能力和较强的环境适应性，可有效减少鸡粪中的氨氮含量，降低氨气的挥发量。

关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响

张雯，许厚强，陈伟，陈祥，赵佳福，桓聪聪，夏丹，周迪

中国农业科学. 2016, 49(6): 1196-1206. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.015

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【目的】生肌决定因子(myogenic determination gene，MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族。该家族包括MyoD1，Myf5，MyoG和Myf6，只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中；在其他的非肌细胞中， MyoD基因家族会被抑制。该家族中，MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等方面的调节，以维持个体骨骼肌的相对稳定，是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素，具有尤为重要的作用，已成为研究热点。目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多，表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理；在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达情况，但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确。文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响，为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础。【方法】通过设计特异性引物克隆关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2；同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1（+）和pGL3-Basic基本骨架，构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体pGL3-P1、pGL3-P2。重组质粒经酶切和测序鉴定后，利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞，30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性。最后根据荧光素酶的相对活性来分析 MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响。【结果】克隆得到的关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确，载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pGL3-P1和pGL3-P2经酶切和测序鉴定，证实载体构建成功；与相应剂量的对照组相比，转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD后，pGL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强，其中，在转染量为200 ng时增强作用最强，差异显著(P＜0.05)；转染pcDNA3.1（+）-MyoG后，虽然对pGL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用，但差异不显著(P＞0.05)；而转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG后，pGL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显 (P＞0.05)。【结论】在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P＜0.05)；而外源过表达转录因子 MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性。说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。

家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

刘华伟，李游山，唐新，张晓璐，赵萍

中国农业科学. 2016, 49(6): 1207-1218. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.016

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【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息，明确其时空表达模式，结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响，探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆，得到其编码区核苷酸序列；应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析；利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析；构建原核表达载体p28-BmSP141，并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达，利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术，分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化；通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况；利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白，其中第1—17位氨基酸为信号肽，其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD，等电点为7.8。同源序列比对表明，BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高，分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体，与活性相关的基序也很保守，但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比，BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后，重组蛋白均以包涵体形式表达，经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白，并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明，该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加，但眠期表达下降，蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明，BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达，且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明，BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中，进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平，BmSP141饥饿处理后表达量显著下调，而重新喂食后其表达量上调，表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达，在幼虫期食桑期高表达，蛹期和成虫期表达水平较低，受消化道食物的诱导而上调表达，推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。

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