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2021年 第54卷 第14期 刊出日期：2021-07-16

  

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中国农业科学. 2021, 54(14):  0.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021-54-14-0

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相关文章 | 多维度评价

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

基于基因编辑技术创制高亚油酸水稻材料

陈晓军,吴凯伸,惠建,白海波,马斯霜,李靖宇

中国农业科学. 2021, 54(14):  2931-2940.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.001

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【目的】亚油酸是一种人体必需的脂肪酸,能加快体内脂肪代谢与分解、减少胆固醇在血管壁上形成积存、有效预防动脉硬化的发生、提高人体免疫力、促进骨骼发育、提高记忆力、预防脑部功能退化等功能。利用基因编辑技术对控制脂肪酸合成途径的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因进行精准编辑,关闭下游产物的合成途径,以便提高水稻上游亚油酸的含量,为创制富集亚油酸水稻材料提供依据。【方法】水稻脂肪酸合成途径中的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因（OsFAD3）存在2个拷贝,分别分布在第11和第12染色体,且两者cDNA同源性达97.32%。根据基因编辑原理（编辑的特异性取决于引导RNA（gRNA）的特性）,在2个同源基因序列高度一致的外显子区域,分别设计合成2个gRNA,并分别构建植物基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化本地受体材料（富源4号）。通过对基因编辑植株进行靶位点测序鉴定,分析2个位点的编辑效率和基因型。同时,对OsFAD3双突变体进行粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状分析。采用气质联用检测法测量OsFAD3双突变体籽粒的37种脂肪酸含量。【结果】获得2个位点的纯合编辑材料,同时也获得了其他不同基因型组合的编辑材料;与对照材料相比,OsFAD3双突变体的粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状均没有发生显著变化,但稻谷中亚油酸的相对含量提高了3.36个百分点。【结论】在不改变籽粒主要农艺性状的前提下,实现了利用基因编辑技术通过转化一个载体同时精准敲除2个ω-3脂肪酸去饱和酶基因,提高了籽粒中亚油酸的相对含量。

小麦单位面积穗数和粒长主效QTL紧密连锁KASP标记的开发及其效应评价

范涛,李治,蒋庆,陈姝霖,欧霞,陈永艳,任天恒

中国农业科学. 2021, 54(14):  2941-2951.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.002

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【目的】小麦单位面积穗数和籽粒粒长是小麦产量相关的重要农艺性状,对其进行遗传改良有利于提高小麦的产量。通过对前期QTL定位鉴定到的提高单位面积穗数的主效QTL位点QSn.sau-2D.2和提高籽粒粒长的主效QTL位点QKl.sau-3D.2开发相应的KASP分子标记,并在川农18和T1208构建的RILs群体中进行验证及评价,为更好地利用这两个QTL以及分子标记辅助育种奠定基础。【方法】利用前期在川农18和T1208构建的高代自交群体中鉴定到的控制小麦单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2和控制籽粒粒长主效QTL位点QKl.sau-3D.2,结合在这两个QTL区间内的55K SNP分子标记序列,开发设计KASP分子标记,并在亲本间筛选具有多态性的KASP分子标记。将筛选到的KASP分子标记在川农18×T1208的RILs群体中分别进行基因分型和鉴定相应表型性状的高低,并分析这两个主效QTL对于其他农艺性状的影响。【结果】KASP-AX-111151907和KASP-AX-109962767在亲本中具有多态性,KASP-AX-111151907和KASP-AX-109962767在群体中的验证表明这两个分子标记分别与QSn.sau-2D.2和QKl.sau-3D.2连锁。KASP-AX-111151907和KASP-AX-10996276能将群体材料的基因型分为2类,按照表型划分,在3年试验中,KASP-AX-111151907对多穗材料的平均选择率均达到72.58%,对少穗材料的平均选择率达到71.68%;KASP-AX-10996276对长粒材料的平均选择率达到69.86%,对短粒基因型的平均选择率可达61.52%,表明这两个标记的可靠性。基于KASP分子标记的基因分型结果表明,这两个QTL对于株高、千粒重、粒长、粒宽、粒径比、单位面积穗数、穗粒重均具有显著性影响。在川农17×川农11的RILs群体中进行验证也表明这两个分子标记对相应性状的选择具有一定的作用。【结论】针对单位面积穗数主效QTL位点QSn.sau-2D.2和籽粒粒长主效QTL位点QKl.sau-3D.2分别开发了1对与之连锁的KASP分子标记,可用于相应性状的选择,与KASP标记连锁的QTL分别能显著提高单位面积穗数和籽粒粒长。QSn.sau-2D.2对株高、千粒重、粒长、粒宽、粒径比、穗粒重是负向影响,QKl.sau-3D.2对株高、千粒重、粒宽、粒径比和穗粒重是正向影响,但对单位面积穗数是负向影响,这两个QTL及开发的KASP标记可应用于小麦高产育种中。

谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性分析及基因定位

张硕,智慧,唐婵娟,罗明昭,汤沙,贾冠清,贾彦超,刁现民

中国农业科学. 2021, 54(14):  2952-2964.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.003

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【目的】谷子是C₄模式植物,其叶色突变体是研究C₄光合途径的良好材料。通过研究谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性并对突变基因进行定位,为克隆突变基因、解析谷子叶绿体合成及发育机理、进一步理解C₄光合调控机制奠定基础。【方法】谷子条纹叶突变体A36-S是由育种创制的中间材料A36自然变异而来。对比A36-S及其正常表型等基因系A36-N的表型特征,调查二者的株高、叶宽、叶长、穗重、千粒重、结实率等农艺性状指标;测定A36-S和A36-N的叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度、气孔导度、蒸腾速率等光合指标,分析A36-S的光合特性;观察A36-S和对照品种豫谷1号的叶片半薄横截切片和超薄切片,分析A36-S叶片解剖结构特征,分别统计叶肉细胞和维管束鞘细胞中叶绿体的数量和面积,从而分析叶绿体合成及发育情况;构建A36-S×SSR41的F₂分离群体,统计群体中正常表型单株与条纹叶单株的数量,进行遗传分析;分别构建F₂分离群体正常单株与条纹叶单株的DNA混池,采用集团分离分析法（BSA法）进行突变基因的定位;筛选、开发多个SSR标记及In-Del标记,扫描F₂群体中条纹叶单株,进行进一步基因定位。【结果】谷子条纹叶突变体A36-S在全生育期表现出叶片不规则白色条纹的表型。农艺性状分析表明,相比其近等基因系A36-N,A36-S在株高、叶宽、穗重、千粒重、结实率等表型上均显著下降。光合指标测定表明A36-S叶片中叶绿素含量明显降低,尤其是叶绿素b含量下降更为严重,同时净光合速率也明显下降。叶片解剖结构观察发现,与对照豫谷1号相比,A36-S的Kranz结构变化并不明显,但叶绿体数量和大小都显著低于对照。观察叶绿体超微结构,发现A36-S的不同细胞间叶绿体发育状况差异较大,依据叶绿体发育情况可将叶片细胞可分为3类：Ⅰ类细胞具有正常发育的叶绿体;Ⅱ类细胞叶绿体基粒及片层结构减少;Ⅲ类细胞则叶绿体结构严重异常甚至不含有叶绿体。遗传分析表明A36-S表型受隐性单基因控制,利用F₂分离群体将突变基因定位在第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。【结论】谷子A36-S条纹叶突变体表现为农艺性状及光合能力下降,叶片细胞叶绿体的数量、大小及结构均表现出显著异常。条纹叶性状受隐性单基因控制,利用分子标记将候选基因定位于第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

基于高光谱和激光雷达遥感的水稻产量监测研究

李朋磊, 张骁, 王文辉, 郑恒彪, 姚霞, 朱艳, 曹卫星, 程涛

中国农业科学. 2021, 54(14):  2965-2976.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.004

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【背景】快速、准确地估算水稻产量对于肥水精确管理及国家粮食政策的制定至关重要。高光谱与激光雷达遥感作为2种不同的主被动监测技术,为水稻长势信息获取提供了多样化手段。【目的】对比2种遥感监测手段在不同生态点的独立数据集中的验证精度,寻求可移植性强的产量估算模型,对水稻长势监测提供理论与技术支撑,及为精确农业提供科学指导具有重要意义。【方法】本研究通过实施3年（2016—2018年）包含不同地点、不同品种与不同氮素水平的水稻田间试验,在抽穗后各时期同步获取点云数据和光谱数据,结合线性回归与随机森林回归来估算产量,探究抽穗后点云数据与光谱数据估算水稻产量的差异;同时评估产量模型在不同数据集的时空可移植性,寻求可移植性强的产量估算模型。【结果】利用点云数据估算产量的精度（R² = 0.64—0.69）优于光谱数据的估算精度（R² = 0.20—0.58）;基于线性回归的产量估算模型,其验证精度明显优于基于随机森林回归的产量模型;产量模型在同一生态点的可移植性更强（不同生态点：RRMSE 16.69%—17.85%;同一生态点：RRMSE 11.37%—12.41%）。【结论】本研究为抽穗后水稻产量监测提供了新的方法和不同遥感手段的性能比较,为收获前作物产量的实时估算提供重要支撑。激光雷达技术凭借其全天候工作的特点,在长江中下游水稻产量实时监测中有着较好的应用前景。

耕作对渭北旱塬小麦-玉米轮作田土壤水分和产量的影响

郭星宇, 王浩, 于琦, 王瑞, 王小利, 李军

中国农业科学. 2021, 54(14):  2977-2990.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.005

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【目的】探讨不同降水年型下,耕作方式对冬小麦-休闲-春玉米轮作田土壤水分和作物产量的影响,为旱区粮田降雨高效利用与耕作制度创新提供理论支撑。【方法】于2007—2019年在渭北旱塬进行长期定位保护性耕作试验,以传统翻耕（CT）为对照,设置免耕（NT）和深松（ST）2种少耕耕作方式,分析不同降水年型下耕作方式对小麦-玉米轮作田休闲期土壤蓄墒、作物产量和水分利用效率的影响。【结果】（1）降水年型、耕作方式及其互作均显著影响休闲期末期土壤贮水量和休闲期蓄墒率,其中降水年型是休闲末期土壤贮水量和休闲期蓄墒率变化的主导因素。休闲末期0—200 cm土层土壤贮水量（mm）表现为丰水年型（430.6）>欠水年型（405.9）>平水年型（381.5）;NT（417.4）>ST（402.3）>CT（398.2）;丰水年型NT处理休闲末期0—200 cm土层土壤贮水量最高（438.5）,平水年型ST处理最低（370.2）;休闲期蓄墒率（%）表现为丰水年型（27.1）>欠水年型（26.6）>平水年型（25.1）;NT（27.6）>ST（26.4）>CT（25.8）;欠水年型NT处理土壤蓄墒率最高（29.1）,平水年型CT处理土壤蓄墒率最低（25.0）。（2）降水年型、耕作方式及其互作均显著影响冬小麦产量和水分利用效率（WUE）,其中耕作方式是冬小麦产量（kg∙hm^-2）和WUE（kg∙hm^-2∙mm^-1）变化的主导因素。冬小麦产量表现为丰水年型（4985）>欠水年型（3984）;NT（4522）>ST（4468）>CT（4465）;丰水年型NT处理产量最高（5033）,欠水年型ST处理最低（3957）;冬小麦WUE表现为丰水年型（15.4）>欠水年型（14.9）;NT（16.2）>ST（15.4）>CT（14.0）;丰水年型NT处理WUE最高（16.5）,欠水年型CT处理最低（13.9）。（3）降水年型、耕作方式及其互作均显著影响春玉米产量和水分利用效率（WUE）,其中降水年型是春玉米产量（kg∙hm^-2）和WUE（kg∙hm^-2∙mm^-1）变化的主导因素。春玉米产量表现为丰水年型（7677）>欠水年型（6999）>平水年型（5887）;NT（6900）>ST（6879）>CT（6785）;丰水年型ST处理产量最高（8003）,平水年型ST处理最低（5723）;春玉米WUE表现为丰水年型（18.7）>欠水年型（17.5）>平水年型（14.8）;NT（17.8）>ST（17.0）>CT（16.2）;丰水年型ST处理WUE最高（19.3）,平水年型CT处理最低（13.9）。（4）在冬小麦-休闲-春玉米轮作周期中,耕作方式显著影响作物产量和WUE。其中NT处理多年平均产量和WUE分别较CT处理提高1.6%和9.5%,ST处理多年平均产量和WUE分别较CT处理提高1.2%和3.9%。【结论】综合各降水年型下土壤水分与作物产量得出,保护性耕作可以相对高效地实现保水增产目的,其中以免耕处理蓄水与增产效应最佳。从旱作农田高产高效及长期可持续发展的角度综合考虑,推荐免耕作为黄土高原地区实现蓄水保墒及增产增收目的的耕作方式。

机械收获方式对油菜籽粒关键性状的影响

白晨阳, 何菡子, 贾才华, 李晓华, 任奕林, 叶俊, 汪波, 蒯婕, 周广生

中国农业科学. 2021, 54(14):  2991-3003.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.006

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【目的】收获是油菜生产的关键环节之一,影响油菜籽粒产量、品质及效益。通过人工模拟联合收获和分段收获方式,分析不同收获方式对油菜籽粒关键性状的影响,以期为机械收获方式选用及配套参数确定提供依据。【方法】选用含油量不同的2个中熟油菜品种,在湖北黄冈和襄阳设置联合收获不同收获时期（终花后20—44 d（黄冈）和终花后23—47 d（襄阳）,每隔3 d收获1次）以及分段收获不同割倒时间（终花后20、26和32 d（黄冈）和终花后23、29和35 d（襄阳））和后熟时长（3、6、9和12 d）试验,测定千粒重、含水量、品质等关键指标。【结果】联合收获两试点、两品种均在终花后38 d左右达籽粒生理成熟期,所需积温约1 100℃,千粒重和含油量最大。终花后46 d左右,籽粒含水量和叶绿素含量可快速降至最适点,为机械化联合收获适宜时期。籽粒含水量降幅与日均温及大气压极显著正相关;叶绿素含量降幅与日均温极显著正相关,与降雨量显著负相关。与D1、D2相比,分段收获在D3条件下（终花后33 d左右）割倒后熟,籽粒千粒重、含油量、出油率、整齐度及油酸含量均值最高,叶绿素含量、亚油酸含量及含水量均值最低;后熟天数对籽粒含油量、出油率、千粒重、整齐度、油酸、亚油酸含量影响不显著,后熟6—9 d时籽粒叶绿素与含水量可快速降至最适点,为适宜捡拾脱粒时期。籽粒含水量降幅与太阳辐射量极显著正相关,与降雨量极显著负相关。【结论】终花至收获期间,平均日均温19—22℃、降雨量1.0—3.5 mm,大气压1.45—1.75 kPa条件下联合收获在终花后46 d左右（生理成熟后8 d左右）收获,分段收获在终花后33 d左右（即生理成熟前5 d左右）割倒;平均相对湿度64%—80%、降雨量0.7—3.1 mm、太阳辐射量10—13 MJ·m^-2条件下分段收获后熟6—9 d捡拾脱粒最为适宜。此条件下,籽粒含水量均可降至15%左右、叶绿素含量均可降至10 mg·kg^-1以下。且2种收获方式在籽粒千粒重、含油量、出油率及整齐度等方面均无显著差异;但与联合收获相比,分段收获籽粒油酸、亚油酸含量更高,籽粒和油脂品质更佳。

植物保护

新疆马铃薯甲虫对噻虫嗪的抗性监测及其细胞色素P450基因表达分析

石鑫,李莎,王志敏,付开赟,付文君,姜卫华

中国农业科学. 2021, 54(14):  3004-3016.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.007

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【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD₅₀处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和酯酶（EST）的活性变化。利用Illumina HiSeq^TM 2500 高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因（DEG）,运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证3个P450基因并分析6个P450基因（CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc）在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数（RR）分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍,为低至中水平抗性。解毒酶活性测定结果表明,2个敏感种群URMQ2、URMQ3以及2个抗性种群YN2、JMS成虫分别经噻虫嗪LD₅₀处理72 h后其P450活性均显著增加,分别为对照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外,URMQ3种群的GST（CDNB和DCNB为底物）及URMQ2、YN2种群的EST活性显著升高,分别为对照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。转录组分析表明,通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据,过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G,碱基错误率均为0.03%。抗性种群中差异表达的P450基因13个,其中2个基因显著上调。3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1的qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致,qRT-PCR分析还发现CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP305a1和CYP9Z25在抗性种群成虫中表达量显著增加,噻虫嗪LD₅₀处理均可引起URMQ2种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya、CYP9Yc表达量显著上调。相关性分析发现成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya表达量呈显著正相关。【结论】CYP9Ya可能在马铃薯甲虫中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,其他基因的作用也不能排除。

铜绿丽金龟气味结合蛋白AcorOBP11的表达纯化及功能分析

秦健辉,李金桥,赵旭,李克斌,曹雅忠,尹姣

中国农业科学. 2021, 54(14):  3017-3028.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.008

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【目的】通过研究铜绿丽金龟（Anomala corpulenta）气味结合蛋白11（odorant binding protein 11,OBP11）与寄主植物挥发物的结合特性,探讨AcorOBP11的功能,为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础。【方法】设计特异性引物,通过RT-PCR克隆AcorOBP11,分析其序列特征并与相似序列进行对比;将目的基因OBP11连入原核表达载体pET28a后,重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白的表达,超声破碎菌体,取上清液过镍柱,利用重组肠激酶切除His标签后再次过镍柱纯化获得目的蛋白;纯化后的蛋白以1-NPN为荧光探针开展荧光竞争结合试验,测定AcorOBP11蛋白与37种寄主植物挥发物的结合特性;利用Modeller对AcorOBP11进行同源建模,以冈比亚按蚊气味结合蛋白AgamOBP48（PDB ID：4ij7）作为模板,获得其三维结构;利用Autodock半柔性对接将蛋白与化合物对接,模拟AcorOBP11与6种候选寄主植物挥发物的结合情况。【结果】克隆获得了AcorOBP11全长基因,开放阅读框共639 bp,N末端有17个氨基酸组成的信号肽,具有8个保守的半胱氨酸位点,属于Plus-C OBP亚家族,进化树结果表明其与HparOBP9进化关系最近。AcorOBP11成功连入pET28a表达载体,在0.25 mmol·L^-1 IPTG、37℃条件下诱导表达,并通过两次镍柱纯化得到目的蛋白。竞争结合试验结果表明,AcorOBP11结合谱较广,对α-紫罗兰酮、异戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龙脑酯、柠檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、异戊酸等13种寄主植物挥发物有较好的结合能力。其中,与寄主植物挥发物α-紫罗兰酮结合能力最好,竞争解离常数为22.78 μmol·L^-1。构建了AcorOBP11三维结构图并进行蛋白构象评估后,与6种化合物进行分子对接,结果表明AcorOBP11与α-紫罗兰酮结合自由能最低,为-24.74 kJ·mol^-1,表明其与α-紫罗兰酮的结合能力最强,与荧光竞争结合结果一致;从对接图还可以看出,α-紫罗兰酮不仅与AcorOBP11在Cys163处形成氢键,而且其疏水端进入了蛋白的疏水腔,两个甲基与蛋白表面高度契合,因此,α-紫罗兰酮与蛋白间结合能力最强。【结论】AcorOBP11能够识别多种寄主植物挥发物,推测其在铜绿丽金龟成虫定位寄主植物中发挥重要作用,此研究结果为生态防控铜绿丽金龟提供了新思路。

fl(2)d单等位基因的敲除显著降低小菜蛾的生殖力和育性

李飞飞,王贝贝,赖颖芳,杨菲颖,尤民生,何玮毅

中国农业科学. 2021, 54(14):  3029-3042.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.009

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【目的】RNA甲基化是基因转录后水平表观修饰的主要形式,参与了众多重要的细胞学过程。小菜蛾（Plutella xylostella）是危害十字花科蔬菜的重要寡食性害虫,与RNA甲基化相关基因的功能尚未见报道。本研究通过克隆小菜蛾的RNA甲基化蛋白同源基因fl(2)d,鉴定其表达模式,并敲除该基因以探究其生物学功能。【方法】通过小菜蛾基因组网站查找fl(2)d基因序列,PCR扩增其蛋白质编码序列（CDS）;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术,检测小菜蛾不同发育阶段个体以及成虫生殖腺中fl(2)d的相对表达量;运用CRISPR/Cas9结合卵的显微注射技术,对小菜蛾fl(2)d进行编辑;将fl(2)d被编辑过的成虫与野生型成虫杂交,并对其产生的后代进行近交,筛选fl(2)d突变品系;观测并比较突变体与野生型个体遗传特性、生物学参数和表型的差异,明确fl(2)d的功能。【结果】克隆得到长度为912 bp的fl(2)d CDS,fl(2)d在雌蛹、雌成虫和卵中的表达量较高,雄成虫和雄蛹的表达量较低,幼虫期的表达量最低,成虫卵巢中表达量显著高于精巢。通过向小菜蛾的卵注射靶向fl(2)d的向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白的混合物,对所产生的阳性后代进行10代的单对近交筛选,获得3种杂合的移码突变品系,分别缺失了4个（Δfl(2)d213-4）、5个（Δfl(2)d213-5）和7个（Δfl(2)d214-7）碱基。在上述品系的筛选过程中,发现了6只缺失4个碱基的纯合突变个体,2只缺失5个碱基的纯合突变个体;缺失4个碱基的纯合个体成功配成了两对,近交未产卵;剩余的2只缺失4个碱基的雄性纯合个体和2只缺失5个碱基的雄性纯合个体分别与同世代的雌性杂合突变个体近交后仍未产卵。说明fl(2)d纯合突变的个体存活率极低,且可能无法产生后代。通过分析后代基因型的分离比,发现杂合突变个体近交以及杂合突变个体与野生型个体杂交产生的后代中,杂合突变个体与野生型个体的比例分别略小于2和1,说明fl(2)d杂合突变会影响小菜蛾正常的生长发育,并导致部分个体死亡。杂合突变体后代中含有突变的雌雄个体比例接近1﹕1（P<0.05）,推测小菜蛾fl(2)d可能与性别决定无关。只要是有突变品系小菜蛾所参与的交配,雌成虫产卵量和卵的孵化率均显著低于野生型（P<0.01）,所产的卵多数发育异常,表现为失水皱缩、不能正常孵化。通过对成虫的生殖腺进行解剖,发现在野生型雌成虫与突变体雄成虫交配后,卵巢内卵的附着量较未交配的个体明显减少;未交配的突变体雌成虫卵巢内卵的附着量亦少于野生型,而突变体雄成虫的精巢未见明显异常。部分能够孵化的杂合突变个体在整个发育过程会发生不同程度的畸变,导致不能正常完成整个世代;另外一些杂合突变个体未见异常,可以将突变类型遗传给后代。根据上述发现,提出了基于fl(2)d的小菜蛾遗传防控模型。【结论】fl(2)d参与小菜蛾的生殖过程和胚胎发育,突变后显著影响后代种群数量,是开展小菜蛾遗传控制的理想靶标。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

土壤质量评价指标体系的构建及评价方法

李鑫,张文菊,邬磊,任意,张骏达,徐明岗

中国农业科学. 2021, 54(14):  3043-3056.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.010

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【目的】探究国内外土壤质量评价方法与指标体系,梳理土壤质量评价中的研究热点与发展前沿,为我国土壤质量评估研究及方法应用提供科学参考。【方法】基于Web of Science 和CNKI数据库,利用文献计量检索方法,收集有关土壤质量评价指标、最小数据集筛选、土壤质量评价方法等方面的文献415篇、最小数据集155个。基于土壤质量评价指标选取频率、评价方法和最小数据集等信息,分析近30年来全球土壤质量评价的发展态势、前沿领域以及评价中存在的问题。【结果】国内外土壤质量评价指标体系涉及25个物理指标、36个化学指标、35个生物指标和19个环境指标。土壤有机质作为土壤质量的核心指标,其选取频率最高,为96.6%;其次是土壤酸碱度、全氮、速效磷、速效钾和容重,选取频率均在50%以上;微生物生物量、土壤酶活性等生物指标选取频率较低,均小于25%,但呈逐年增加的趋势。最小数据集构建方法中,主成分分析能最大限度地减少指标冗余,体现原始变量的绝大部分信息,应用最为广泛。被筛选进入最小数据集的指标中,有机质、速效磷、容重和土壤酸碱度在表征土壤质量时应用广泛,频率分别为67.7%、43.2%、34.8%和34.2%。目前土壤质量评价研究主要采用主成分分析方法筛选土壤质量指标,运用土壤质量指数法进行综合评价,能较准确地评估管理措施对土壤质量的影响,适用于土壤可持续管理。【结论】土壤有机质、速效磷、酸碱度、容重和含水量是表征土壤质量的重要评价指标。构建能够客观、全面、真实地反映土壤质量变化的指标体系及其与信息技术的融合是未来土壤质量评价研究的重点,应用指标体系在大空间尺度评估土壤质量是未来发展的趋势。

碳氮同位素结合稳定同位素模型解析沉积土壤碳源

李娜,孙占祥,张燕卿,刘恩科,李凤鸣,李纯乾,李菲

中国农业科学. 2021, 54(14):  3057-3064.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.011

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【目的】研究辽西褐土丘陵区典型小流域不同土地利用方式下经侵蚀沉积过程沉积土壤碳来源,为合理调控小流域土壤侵蚀造成的土壤碳流失提供科学参考。【方法】通过对辽西丘陵沟壑区小流域野外取样,研究小流域沉积土壤碳的来源并量化其贡献。通过GIS结合GPS技术对小流域4种不同土地利用类型（耕地、林地、草地、沟渠）表层土壤及小流域拦沙坝3个位点（S1坝前、S2坝中、S3坝后）0-100 cm土壤剖面进行取样,结合碳、氮同位素混合模型对沉积土壤碳源进行解析。【结果】利用¹³C和¹⁵N同位素特征及其元素组成（土壤有机碳和全氮）对辽西丘陵沟壑区侵蚀沉积物土壤有机碳进行了定性和定量鉴定。辽西丘陵沟壑区小流域沉积物中有机碳主要来源为耕地,其次是沟渠、草地和林地。耕地贡献平均为58.75%,沟渠25.49%,草地6.49%,林地9.2%。【结论】碳氮稳定性同位素模型作为一种重要的“指纹”工具可以成功应用于辽西丘陵沟壑区小流域沉积土壤碳来源定性及定量的分析。研究成果可以为受水力侵蚀的小流域的土壤保护和养分流失控制以及维持生态系统的可持续性提供理论参考。

不同降雨年型旱地冬小麦水分利用及产量对施氮量的响应

刘朋召,周栋,郭星宇,于琦,张元红,李昊昱,张琦,王旭敏,王小利,王瑞,李军

中国农业科学. 2021, 54(14):  3065-3076.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.012

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【目的】降雨和施氮是影响渭北旱塬冬小麦生产的主要因素,降雨年际变幅大对其影响更大,因此小麦增产效应受降雨年型显著影响。分析不同降雨年型下施氮量对旱地麦田水分利用、籽粒产量和蛋白质含量的影响,能够为实现渭北旱地冬小麦 “因雨施氮”和稳产优质提供理论依据。【方法】于2017—2020年连续3年在陕西合阳县开展田间定位施氮试验,以晋麦47为试验材料,设置5个施氮量处理0、60、120、180、240 kg·hm^-2（分别以N₀、N₆₀、N₁₂₀、N₁₈₀、N₂₄₀表示）,研究不同降雨年型施氮量对冬小麦生育期0—200 cm土层水分变化动态、水分利用效率、产量构成及蛋白质含量的影响。【结果】降雨年型和施氮对冬小麦播前底墒及生育期土壤含水量、耗水量、水分利用效率、籽粒产量和蛋白质含量影响显著。（1）休闲期降雨与播前底墒呈线性相关,每增加1 mm夏季降雨,底墒增加0.9 mm。在丰水年和平水年休闲期降雨充足,前季小麦增加施氮量对下季小麦播前底墒无显著影响;在欠水年休闲期降雨较少,前季小麦每增施氮100 kg·hm^-2,下季小麦播前底墒减少15.4 mm。丰水年较欠水年和平水年均能提高冬小麦生育期0—200 cm土层土壤含水量,因而分别增加生育期耗水量35.7%和6.6%。全生育期0—120 cm土层土壤含水量受降雨和冬小麦生长发育影响波动较大,但160—200 cm 深层土壤含水量相对稳定。丰水年的水分利用效率较欠水年和平水年分别提高55.7%和26.5%,籽粒产量分别提高112.3%和39.1%,蛋白质含量分别降低8.3%和5.2%。（2）与N₀处理相比,丰水年、欠水年和平水年施氮均降低各生育时期0—200 cm土层土壤含水量,分别提高生育期耗水量4.6%—14.6%、6.0%—8.6%、2.2%—9.5%,分别增加水分利用效率20.7%—39.8%、4.7%—33.3%、13.1%—35.4%,分别增产7.1%—28.1%、1.5%—34.1%、8.5%—28.9%,分别提高蛋白质含量5.6%—10.4%、10.1%—17.7%、8.5%—15.6%。（3）施氮量和籽粒产量、蛋白质产量均符合二次曲线关系,拟合方程表明,丰水年、欠水年和平水年满足旱地冬小麦稳产优质的最适施氮量范围分别为189—202、116—124和161—174 kg·hm^-2。【结论】综合来看,丰水年、欠水年和平水年的最佳施氮量分别为189—202、116—124和161—174 kg·hm^-2,并可采取“播前底墒确定基施氮肥量+播种至拔节期降雨确定追施氮肥量”的“因雨施氮”管理模式,既能满足旱地冬小麦稳产优质,也可保证水分高效利用。

园艺

两种微生物菌剂对有机基质袋培秋黄瓜产量、品质及根际环境的影响

王君正,张琪,高子星,马雪强,屈锋,胡晓辉

中国农业科学. 2021, 54(14):  3077-3087.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.013

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【目的】探究甲基营养型芽孢杆菌和植物乳杆菌两种微生物菌剂对有机基质培黄瓜产量、品质及根际环境的影响,开发新型功能型微生物制剂,指导黄瓜优质高效生产。【方法】以‘博耐526’黄瓜品种为材料,采用有机基质袋培方式,在浇灌清水（N）和营养液（F）2种养分水平下,以不添加菌剂为对照（分别记为CK1和CK2）,于定植后第20、35和50天按2.5×10¹⁰CFU/株的菌剂用量分别灌根添加‘VL-10’型甲基营养型芽孢杆菌（NT1、FT1）和‘LYS-1’型植物乳杆菌（NT2、FT2）两种菌剂,共6个处理。【结果】两种养分水平下,与CK1和CK2处理相比,甲基营养型芽孢杆菌处理植株的干物质积累量增幅分别为13.51%和15.02%,产量增幅分别为20.83%和15.63%;植物乳杆菌处理植株干物质积累量增幅分别为11.43%和8.42%,产量增幅分别为17.42%和14.96%,甲基营养型芽孢杆菌对植株干物质积累和产量形成的促进效果优于植物乳杆菌。以FT1处理的果实品质最优,其游离氨基酸、有机酸、可溶性糖、还原糖和维C含量分别较CK2处理显著提高了10.61%、28.93%、22.92%和39.88%（P<0.05）,FT2处理的果实品质次之;NT1和NT2处理较CK1处理显著提高了植株P（7.43%和13.50%）、K（10.60%和8.19%）元素积累量（P<0.05）,FT1和FT2处理的植株N（19.57%和24.18%）、P（17.16%和12.50%）、K（16.48%和26.25%）元素积累量均较CK2处理显著提高（P<0.05）;FT1处理的N、P、K肥料利用率较CK2处理分别显著提高了82.85%、483.90%和75.60%（P<0.05）,FT2处理分别显著提高了102.42%、367.98%和120.46%（P<0.05）。NT1和NT2处理较CK1处理提高了盛果期的基质蔗糖酶（100.66%、116.60%）、过氧化氢酶（3.39%、4.10%）和碱性磷酸酶（6.99%、95.08%）活性,其中过氧化氢酶和碱性磷酸酶活性在拉秧期依然高于CK1处理;而FT1和FT2处理均较CK2处理显著提高了盛果期和拉秧期的基质脲酶（3.75%、4.95%和13.13%、6.12%）、蔗糖酶（68.62%、24.93%和31.68%、63.35%）和碱性磷酸酶活性（18.00%、26.99%和109.64%、84.01%）（P<0.05）,且甲基营养型芽孢杆菌对脲酶和碱性磷酸酶的影响优于植物乳杆菌;两种养分水平下,甲基营养型芽孢杆菌处理的基质有效态氮含量在盛果期分别较CK1和CK2显著提高了63.33%和72.70%（P<0.05）,在拉秧期增幅为25.48%和86.46%,同时期增幅均大于植物乳杆菌,有利于保持更高的基质有效态氮含量。【结论】灌根添加7.5×10¹⁰CFU/株的甲基营养型芽孢杆菌和植物乳杆菌均可改善有机基质袋培黄瓜的根际环境,促进植株对元素的吸收、同化和积累,有效提高黄瓜产量和果实品质,以甲基营养型芽孢杆菌的增产提质效果更优。

苹果果实大小相关的ARF-Aux/IAA互作组合筛选

周喆,卞书迅,张恒涛,张瑞萍,高启明,刘珍珍,阎振立

中国农业科学. 2021, 54(14):  3088-3096.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.014

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【目的】通过转录组学和生物信息学,在苹果全基因组中对可能互作的MdARF和MdIAA进行鉴定,为明确相关基因功能和解析生长素调控苹果果实大小的分子机理奠定基础。【方法】对野生大果型‘皇家嘎啦’和miRNA172p过表达的转基因小果型‘皇家嘎啦’进行不同发育时期和不同组织材料的转录组测序,对测序结果进行基因的功能注释及差异表达分析。利用转基因小果和野生型大果的转录组数据,筛选在果实发育中表达的苹果MdARFs和MdIAAs基因家族成员,通过逐一在两个家族间计算基因时空表达的相关系数,筛选可能互作的MdARF-MdIAA组合,将从拟南芥基因组中下载的23个ARFs和34个Aux/IAAs、番茄基因组中下载的21个ARFs和25个Aux/IAAs,分别与互作候选MdARFs和MdIAAs进行比对,并进一步构建系统发育树。使用MEME和TBtools对苹果候选互作对中的MdARFs和MdIAAs蛋白进行Motif分析。利用STRING蛋白互作预测数据库进行同源映射,构建苹果中的蛋白-蛋白互作网络,进一步的确认候选互作对,最终得到苹果中通过互作参与果实发育可能性最高的MdARF-MdIAA组合。【结果】分别对野生型‘皇家嘎啦’和miR172OX转基因‘皇家嘎啦’盛花期后两周的全果和盛花期后4周的果皮、果肉和果核进行转录组测序,共生成178.19 Gb的数据量,各项指标均表明,3个生物学重复在所有组织类型上均具有高度一致性。在转录组数据中,共鉴定到38个MdARFs和27个MdIAAs在至少一个文库中的FPKM值大于2,在苹果果实发育时期表达。通过计算Pearson相关系数对表达的MdARFs和MdIAAs两两进行相关性分析,其中8对MdARF-MdIAA的相关系数大于0.9或小于-0.9,作为初步筛选的候选互作组合。将8对组合中的MdARFs和MdIAAs分别与拟南芥和番茄中的ARFs和IAAs进行序列比对并构建系统进化树后发现,MdARF6和MdARF19与起转录激活作用的AtARFs同属一个分支。而MdARF2、MdARF4和MdARF9则与起转录抑制作用的AtARFs具有较近的亲缘关系。Motif分析结果显示,候选MdARF、MdIAA蛋白中均包含Motif 2和Motif 5。Motif 2和Motif 5分别对应IAA蛋白中的保守结构域Motif IV和Motif III。互作蛋白在拟南芥中进行同源映射校验后,最终得到两对MdARF-MdIAA组合可用于进一步的功能验证。【结论】苹果MdARF和MdIAA家族成员,在果实发育时期,有8对组合在表达量上存在显著的相关性,进一步同源映射确认互作后,最终确定MdARF4-MdIAA17和MdARF4-MdIAA19两对互作组合,极有可能通过互作传递生长素信号参与调控苹果果实发育。

苹果LRR-RLK基因家族鉴定和表达分析

黄金凤,吕天星,王寻,王颖达,王冬梅,闫忠业,刘志

中国农业科学. 2021, 54(14):  3097-3112.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.015

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【目的】从苹果全基因组中鉴定LRR-RLK家族蛋白成员,并进行生物信息学和表达模式分析,为研究苹果LRR-RLK的潜在功能提供理论基础。【方法】利用BLASTp基于GDR数据库鉴定苹果LRR-RLK家族成员,通过ExPASy Proteomics Server、Cell-PLoc、CD-Search Tool、MEGAX、MG2C等软件分析LRR-RLK蛋白序列基本信息、亚细胞定位情况、结构域组成、系统进化关系以及染色体定位情况。利用实时荧光定量PCR技术检测苹果12个LRR-RLK的组织表达和诱导表达特性。【结果】苹果LRR-RLK基因家族包含378个成员,这些LRR-RLK蛋白包括318—1 827个不等的氨基酸残基,等电点分布在5.16—9.75。亚细胞定位结果显示LRR-RLK蛋白均定位在细胞膜。系统进化分析可将其分为15类,各亚家族基因数量分布在1—111。染色体定位结果显示,LRR-RLK在苹果17条染色体上均有分布,其中第7条染色体数量最多,为40个。LRR-RLK家族基因具有2个特定的保守结构域,分别是LRR结构和蛋白激酶结构。蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋,β-转角所占比例最小。通过定量检测发现筛选的12个家族成员在各组织中均有表达（除MD00G1105400外）,且多数基因在茎中表达水平相对较高。低温条件下,7个基因上调表达,其中MD09G1153800上调最明显,最高为对照的6.8倍,而MD06G1170200和MD05G1061600均下调表达;在干旱条件下,8个基因上调表达,其中MD00G1105400上调最明显,最高为对照的9.6倍;在盐胁迫条件下,MD04G1150400、MD13G1108000和MD02G1071800始终处于上调表达状态,其中MD02G1071800上调最明显,最高为对照的14.9倍。苹果新梢接种轮纹病菌后,12个LRR-RLK家族基因表达基本上呈先上升后下降的趋势。并且在‘望山红’中,1 d时表达水平较高,而在‘鸡冠’中,3 d时表达水平较高。MD09G1153800和 MD05G1065800在‘鸡冠’响应轮纹病菌侵染过程中显著上调表达,而在‘望山红’中无响应,可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。【结论】苹果LRR-RLK基因家族包含378个成员,进化上可分为15组,在17条染色体上均有分布,多数基因具有在茎中高表达的组织表达特征,多数基因受逆境和轮纹病菌调控。

畜牧·兽医·资源昆虫

小尾寒羊泌乳性状重要lncRNAs的筛选、鉴定及功能分析

王继卿,郝志云,沈继源,柯娜,黄兆春,梁维炜,罗玉柱,胡江,刘秀,李少斌

中国农业科学. 2021, 54(14):  3113-3123.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.016

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【目的】长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类长度大于200 nt的非编码RNA分子,它对奶牛和奶山羊的乳腺发育和泌乳过程发挥了重要调控作用,然而在绵羊上研究甚少。为此开展lncRNAs对绵羊泌乳性能的调控作用研究,为解析绵羊泌乳性能的分子机理提供理论基础。【方法】选取高泌乳性能（高泌乳量、高乳脂率）和低泌乳性能（低泌乳量、低乳脂率）小尾寒羊各3只,采集泌乳期乳腺组织,用RNA-Seq构建lncRNAs表达谱,研究差异表达lncRNAs靶基因的GO和KEGG富集通路,最后用实时荧光定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）对16个差异表达lncRNAs进行验证。【结果】在小尾寒羊乳腺组织中共鉴定出7 239个表达的lncRNAs,包括2 262个已知lncRNAs和4 977个新的lncRNAs,大部分lncRNAs呈低丰度表达。在两组小尾寒羊中发现120个差异表达lncRNAs,其中68个lncRNAs在高泌乳性能小尾寒羊中上调表达,52个lncRNAs下调表达。差异表达lncRNAs的靶基因显著富集在硫化物代谢过程、硫酯生物合成过程、酰基辅酶A生物合成过程、Rap1信号通路、粘附连接等通路上。LncRNA-miRNA网络分析发现,MSTRG.125242.6、MSTRG.59580.8等6个最显著差异表达lncRNAs的靶向miRNAs海绵体在家畜乳腺发育和泌乳过程中发挥了重要作用。RT-qPCR结果表明,16个lncRNAs的表达趋势与RNA-Seq结果完全吻合,证实了RNA-Seq测序结果的准确性和真实性。【结论】筛选的差异表达lncRNAs参与了绵羊乳腺发育及泌乳性能的调控,该结果将为解析绵羊泌乳性状的分子遗传机制提供理论参考。

茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎的作用及其机制

陈志,张逸,路钦越,郭佳禾,梁艳,张明怡星,杨章平

中国农业科学. 2021, 54(14):  3124-3133.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.017

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【目的】奶牛乳腺炎一直是奶牛养殖业和奶制品行业最大的挑战之一,制约着奶业的健康发展。有效进行奶牛乳腺炎的防治,可以为奶牛的健康、生产优质乳制品提供良好保障。探究茶树油对LPS诱导的奶牛乳腺炎作用效果,探索茶树油替代抗生素治疗奶牛乳腺炎的可行性,为茶树油治疗奶牛乳腺炎提供参考。【方法】在牛乳腺上皮细胞的培养中分别添加50、100、200、500、1 000μg·mL^-1的LPS进行相关指标的检测。通过CCK-8法检测细胞增殖活性、流式细胞仪检测细胞凋亡、实时荧光定量检测细胞因子表达量以及ELISA检测相关蛋白的表达量等方法检测乳腺上皮细胞的相关指标。研究构建了LPS诱导的奶牛乳腺炎模型。在200μg·mL^-1 LPS诱导12h的奶牛乳腺炎细胞模型中分别添加0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%的茶树油进行相关指标的检测。【结果】CCK-8法检测细胞增殖活性,结果显示100μg·mL^-1的LPS攻毒情况下,细胞已开始出现不同程度的活性下降情况。进一步使用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示在诱导12h的情况下,100μg·mL^-1的LPS并未出现大量的细胞凋亡,而200μg·mL^-1的LPS诱导情况下约有46%左右的细胞出现了早期凋亡和晚期凋亡。以上结果表明：试验中,200μg·mL^-1 LPS诱导12h为构建奶牛乳腺炎模型的最佳条件。添加茶树油浓度为0.0004%、0.0006%、0.0008%时细胞的凋亡比例会有所下降,其中添加茶树油浓度为0.0006%的这一组保护效果最为明显,其活细胞比例71.95％,早期凋亡细胞比例22.15％,晚期凋亡细胞比例5.11％,与未添加茶树油的乳腺炎模型组活细胞相比提高了约22%。之后对有保护效果的3组进行qPCR检测细胞因子与凋亡因子表达量,结果显示随着加入茶树油的浓度上升,TNF-α表达量下调的较多,IL-6的表达量下调的较少（P<0．01）,STAT1的表达量在加入0.0004%浓度茶树油时有轻微的上调,在0.0006%和0.0008%浓度时表达量略微下调,其中添加0.0006%浓度茶树油表达量最低（P<0.05）。进一步使用ELISA法检测炎症蛋白和凋亡蛋白表达量,结果显示3组浓度的茶树油添加组均极显著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表达量,其中,0.0006%浓度茶树油组较其余浓度组的炎症反应蛋白的表达量最低,约为空白对照组的50%（P<0.05）,而这3组的凋亡反应相关蛋白表达量则几乎持平,约为空白对照组的55%（P<0.05）。【结论】茶树油对于奶牛乳腺炎有一定的拮抗作用,可以降低细胞凋亡比例,提高正常细胞的存活比例,并下调炎症因子与凋亡因子以及相应蛋白的表达量。

研究简报

巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

张伟,王世银,高莉,杨力伟,邓双义,刘晓娜,石国庆,甘尚权

中国农业科学. 2021, 54(14):  3134-3148.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.018

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【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。