中国农业科学 ›› 2023, Vol. 56 ›› Issue (18): 3642-3654.doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.012
收稿日期:
2023-02-14
接受日期:
2023-05-04
出版日期:
2023-09-16
发布日期:
2023-09-21
通信作者:
联系方式:
杨胜男,E-mail:y_sn@qq.com。
基金资助:
YANG ShengNan(), CHENG Li, TAN YueXia, ZHU YanSong, JIANG Dong()
Received:
2023-02-14
Accepted:
2023-05-04
Published:
2023-09-16
Online:
2023-09-21
摘要:
【目的】挖掘宽皮柑橘褐斑病抗性基因及抗病资源中的相关基因型,为柑橘品种抗褐斑病改良提供依据。【方法】在夏秋两季对136份宽皮柑橘离体叶片进行褐斑病病菌接种试验,将两次试验结果取交集,得到121份宽皮柑橘的褐斑病感抗结果。用121份宽皮柑橘表型对前人开发的CAPS进行验证,再对这121份宽皮柑橘的表型结果与利用简化基因组获得的SNP基因型结果进行主成分分析、GWAS分析和Fst分析,获得宽皮柑橘褐斑病抗性相关SNP位点。对通过GWAS获得的SNP进行基因型分析,在所有候选SNP的上下游25 kb范围内选取候选基因,根据phytozome注释对候选基因进行筛选。在感病资源‘秤砣红橘’和抗病资源‘新克里曼丁’接种褐斑病病菌24、48和72 h后,利用实时荧光定量PCR对筛选出的基因进行表达量分析。【结果】发现在121份宽皮柑橘中,温州蜜柑和克里曼丁类等67份资源表现抗褐斑病,大部分红橘和椪柑等54份资源感褐斑病。本研究发现前人开发的CAPS准确率为76.86%,其相关性为中等程度相关。以-log10(P)>4.5为标准,GWAS筛选出6个强关联SNP;以Fst>0.38为标准,Fst筛选出8个SNP。GWAS筛选出的6个SNP的基因型与宽皮柑橘抗褐斑病表现为强相关,其中位于3号染色体上24 838 146 bp位置处Ciclev10021676的SNP1基因型对宽皮柑橘抗褐斑病区分能力最强。从14个SNP中筛选出Ciclev10018604、Ciclev10023485、Ciclev10023486、Ciclev10024586和Ciclev10019874等5个基因。这5个基因在‘秤砣红橘’接种病原菌后表达量上调,且都在48 h后表达量达到最高,上调倍数高达90倍。【结论】通过GWAS挖掘出3号染色体上24 838 146 bp位置的SNP与宽皮柑橘褐斑病抗病性相关性最显著,相关系数为0.641。并且该位置的基因型能比较有效地将抗性资源和感病资源进行区分。挖掘到Ciclev10019874、Ciclev10018604、Ciclev10023485、Ciclev10024586、Ciclev10023486等5个调控宽皮柑橘抗褐斑病的候选基因。
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表2
候选基因荧光定量引物"
基因名称 Gene name | 引物名称 Primer name | 序列 Primer sequence | ||
---|---|---|---|---|
β-Actin | F | CCCCATCGTTACCGTCCAG | ||
R | CGCCTTGCCAGTTGAATATCC | |||
Ciclev10018604 | F | GGGAGCTTGTGGCACTGTAT | ||
R | TCCTTCACCACGCAACTTGA | |||
Ciclev10019874 | F | GAATCCCTTCTCTCCGGCTG | ||
R | GTGGTGGAGTGATGAGGTGG | |||
Ciclev10023485 | F | GAGTCACCTGACAAGAGAATGC | ||
R | ACTTGCAGCAACATCATCCAAG | |||
Ciclev10024586 | F | GCATAGGCCTTGCCAATGTT | ||
R | CGATAATCAACGACACGGGC | |||
Ciclev10023486 | F | AAACAGCATTCCAAGCGTGC | ||
R | AATCCCATCCGCATAGGTCG |
表3
GWAS和Fst分析获得的14个SNP的基本信息"
来源 Source | 编号 Code | 染色体 Chromosome | 位置 Location (bp) | P值/Fst值 P value/ Fst value |
---|---|---|---|---|
GWAS筛选 Screening of GWAS | SNP1 | 3 | 24838146 | 7.742227 |
GWAS筛选 Screening of GWAS | SNP2 | 3 | 29033460 | 6.01147 |
GWAS筛选 Screening of GWAS | SNP3 | 2 | 9623685 | 5.404526 |
GWAS筛选 Screening of GWAS | SNP4 | 3 | 10912656 | 4.899702 |
GWAS筛选 Screening of GWAS | SNP5 | 3 | 29379604 | 4.524974 |
GWAS筛选 Screening of GWAS | SNP6 | 3 | 29379461 | 4.504927 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP7 | 5 | 9384031 | 0.427099 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP8 | 3 | 21846432 | 0.407686 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP9 | 3 | 30824581 | 0.402405 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP10 | 2 | 32716438 | 0.400017 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP11 | 3 | 11889486 | 0.395677 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP12 | 3 | 30230610 | 0.391282 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP13 | 3 | 30132014 | 0.381140 |
Fst筛选 Screening of Fst | SNP14 | 3 | 33601151 | 0.380600 |
表4
GWAS 分析获得的6个SNP基因型的基本信息"
SNP编号 SNP code | 基因型 genotype | 感病资源数量 Number of susceptible varieties | 抗病资源数量 Number of resistant varieties | 感病资源占比 The proportion of susceptible varieties (%) | 抗病资源占比 The proportion of resistant varieties (%) |
---|---|---|---|---|---|
SNP1 | G/G | 13 | 0 | 100 | 0 |
G/A | 45 | 14 | 76 | 24 | |
A/A | 7 | 39 | 15 | 85 | |
SNP2 | C/C | 13 | 0 | 100 | 0 |
C/T | 37 | 11 | 77 | 23 | |
T/T | 14 | 42 | 25 | 75 | |
SNP3 | C/C | 33 | 4 | 89 | 11 |
C/A | 28 | 16 | 64 | 36 | |
A/A | 5 | 33 | 13 | 87 | |
SNP4 | G/G | 13 | 0 | 100 | 0 |
G/T | 36 | 10 | 78 | 22 | |
T/T | 16 | 43 | 27 | 73 | |
SNP5 | A/A | 19 | 1 | 5 | 95 |
A/T | 24 | 21 | 47 | 53 | |
T/T | 37 | 13 | 74 | 26 | |
SNP6 | C/C | 12 | 0 | 100 | 0 |
C/T | 35 | 11 | 76 | 24 | |
T/T | 15 | 42 | 26 | 74 |
表5
5个候选基因的功能注释"
基因 Gene | 注释 Annotation | 连锁SNP编号 Chain SNP code |
---|---|---|
Ciclev10019874 | 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶wag1 Serine/threonine-protein kinase wag1 | SNP2 |
Ciclev10023485 | 非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶;苏氨酸特异性蛋白激酶 Non-specific serine/threonine protein kinase; Threonine-specific protein kinase | SNP14 |
Ciclev10018604 | 蛋白激酶结构域;富含亮氨酸重复序列N端结构域(LRRNT_2);富含亮氨酸重复序列(LRR_8) Protein kinase domain; Leucine rich repeat N-terminal domain (LRRNT_2); Leucine rich repeat (LRR_8) | SNP2 |
Ciclev10024586 | 富含亮氨酸重复序列(LRR_1);富含亮氨酸重复序列N端结构域(LRRNT_2) Leucine Rich Repeat (LRR_1); Leucine rich repeat N-terminal domain (LRRNT_2) | SNP14 |
Ciclev10023486 | 富含亮氨酸重复序列的蛋白 Leucine-rich repeat-containing protein | SNP8 |
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