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2018年 第51卷 第17期 刊出日期：2018-09-01

  

《中国农业科学》2018年第51卷第17期目次

中国农业科学. 2018, 51(17):  0-0. 

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作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

小麦新品种淮麦33的遗传构成分析

杨子博，王安邦，冷苏凤，顾正中，周羊梅

中国农业科学. 2018, 51(17):  3237-3248.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.001

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【目的】解析高产广适小麦新品种淮麦33的遗传构成，探讨双亲烟农19和郑麦991对其产量相关性状的遗传贡献，为小麦品种改良及亲本选配提供依据。【方法】利用部分农艺及品质性状、高分子量谷蛋白亚基组成及覆盖小麦21条染色体的625个SSR分子标记分析淮麦33及其双亲的遗传构成；比对已知的产量性状相关QTL，分析双亲的产量相关区段对淮麦33的遗传贡献。【结果】淮麦33的每平方米穗数和千粒重均介于两亲本之间，穗粒数和小区产量均显著高于两亲本；与烟农19相比,其株高显著降低。淮麦33的高分子量谷蛋白亚基组成为（1、17+18和2+12），其中1和17+18亚基均来自于母本烟农19，2+12亚基来自于父本郑麦991。SSR分子标记分析表明，双亲对淮麦33的遗传贡献和理论值相比出现了较大偏离，淮麦33分别继承了烟农19和郑麦991两亲本73.9%和26.1%的遗传物质。淮麦33与烟农19具有较大的遗传相似度，遗传相似系数为0.78。在不同基因组和染色体水平上，双亲对淮麦33的遗传贡献率差异较大，其中，烟农19在A、B和D基因组水平的遗传贡献率均较高，分别为75.1%、69.4%和68.7%；除6A染色体外，烟农19在其他20条染色体上的遗传贡献率均高于郑麦991，其中在2A染色体上达到100%，在1A、3A、2B、3B和4B等5条染色体上均超过90%。在遗传距离大于5 cM的染色体区段中，淮麦33来源于烟农19和郑麦991的染色体区段分别有34个和7个，其中在2D染色体上来源于烟农19的染色体区段最多，在5A染色体上来源于郑麦991的区段最多。淮麦33有38个不同于双亲的特异位点，主要分布在1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、5A、5B、6B、6D和7A等15条染色体上。比对已知产量性状相关QTL，共发现10个产量相关区段，有6个来源于烟农19，分别位于1A、2D、3B、4B、4D和7A染色体上；3个来源于郑麦991，分别位于4A和5A染色体上；1个为淮麦33特异区段，位于6D染色体上。【结论】明确了小麦新品种淮麦33的遗传构成，其更多地继承了母本烟农19的遗传物质；发现淮麦33中来源于不同亲本的产量相关区段。

二倍体栽培马铃薯高效遗传转化体系的建立

叶明旺，张春芝，黄三文

中国农业科学. 2018, 51(17):  3249-3257.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.002

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【背景】马铃薯是最重要的块茎类粮食作物。栽培马铃薯以四倍体为主，但四倍体遗传和薯块繁殖增加了马铃薯改良的难度。因此越来越多的科学家呼吁在二倍体水平进行马铃薯的再驯化，将马铃薯驯化成种子繁殖作物。自然界中存在4个二倍体马铃薯原始栽培种，这些二倍体栽培种中蕴含着丰富的遗传变异，但是它们的遗传转化体系尚未成熟。【目的】建立高效的二倍体栽培马铃薯遗传转化体系，为二倍体马铃薯优良等位基因和分子育种提供工具。【方法】以二倍体栽培种马铃薯（Solanum phureja）CIP 703541为试验材料，利用绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）作为报告基因，对遗传转化体系进行摸索，主要包括：预处理培养时间、诱导再生的激素比例、抗生素浓度以及转化效率。另外，利用同样的激素组合对17份不同基因型的二倍体马铃薯原始栽培种进行了测试，比较各个材料在不同激素浓度条件下的再生效率，筛选出再生效率较高的激素组合进行大量遗传转化；对再生苗进行生根筛选、荧光观察和PCR鉴定，统计阳性植株的概率。用流式细胞仪检测阳性植株的倍性，以分析再生植株发生染色体加倍的频率。【结果】预处理培养时间为2 d的外植体浸染效率最高。二倍体材料CIP 703541最适合再生出芽的激素配方为2.0 mg·L^-1玉米素（zeatin，ZT）﹕0.01 mg·L^-1奈乙酸（naphthaleneacetic acid，NAA）。再生阶段抗生素卡那霉素（kanamycin，Kan）的最适筛选浓度为100 mg·L^-1，生根阶段的最适筛选浓度为50 mg·L^-1。通过对不同基因型进行筛选，获得3份再生能力较强的二倍体马铃薯材料（CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541）。它们响应的激素配方各不相同，在添加了100 mg·L^-1卡那霉素的再生培养基中，3份材料的再生效率分别为45%、40%和52%。通过大规模遗传转化证明，3份材料的转化率分别为2.8%、4.2%和5.3%。经流式细胞仪检测，所获得的马铃薯阳性植株中四倍体的比例较高，CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541的阳性转化植株中二倍体的比例分别为5.26%、10.53%和38.46%。【结论】建立了高效的二倍体马铃薯遗传转化体系，获得了3份再生能力较强的二倍体材料。另外，发现二倍体马铃薯在经过遗传转化之后再生植株中染色体加倍的比例较高。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

气候变化背景下华北平原夏玉米适宜播期分析

张镇涛，杨晓光，高继卿，王晓煜，白帆，孙爽，刘志娟，明博，谢瑞芝，王克如，李少昆

中国农业科学. 2018, 51(17):  3258-3274.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.003

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【目的】随人口增加、饮食结构变化和能源需求的增加，中国粮食安全问题日益严峻，在耕地资源有限的背景下，高产稳产仍是保证粮食安全的主要途径。华北平原是我国夏玉米主产区，明确气候变化背景下该区域夏玉米的适宜播期，对于稳定和提升该地区夏玉米单产，保障我国粮食安全具有重要意义。【方法】依据夏玉米生长季积温和降水将华北夏玉米区分为8个气候亚区，在每个气候亚区内基于1981—2015年气候资料、农业气象观测站夏玉米种植资料和土壤资料，对农业生产系统模型（APSIM-Maize）进行调参验证，选用决定系数（R2）、D指标、均方根误差（RMSE）和归一化均方根误差（NRMSE）等指标来评价模型调参验证结果。在此基础上设置不同播期，利用调参验证后模型模拟各气候亚区不同播期夏玉米产量，采用高稳系数并综合考虑下茬作物冬小麦的播期，明确各气候亚区冬小麦-夏玉米两熟系统下充分灌溉和雨养条件夏玉米适宜播期，并分析与实际播期相比适宜播期下的夏玉米增产幅度。【结果】（1）模型适应性评价指标中决定系数（R2）均在0.75以上，D指标均在0.80以上，归一化均方根误差（NRMSE）均在7%以下，表明调参后的APSIM-Maize模型在华北平原夏玉米生育期和产量模拟方面具有较好的模拟效果，可用于华北平原夏玉米生育期和产量模拟研究。（2）充分灌溉条件下，第一气候亚区夏玉米推荐适宜播期主要在6月下旬，第二气候亚区到第七气候亚区，主要在6月中下旬，第八气候亚区主要在6月中上旬。雨养条件下，第一气候亚区主要在6月下旬和7月上旬，第二、三A、四、五、六气候亚区主要在6月中下旬，第三B、七气候亚区适宜播期范围较广，6月均可播种，第八气候亚区在6月上中旬。（3）在充分灌溉和雨养条件下，与实际播期相比，适宜播期在各气候亚区的增产幅度为第一气候亚区到第五气候亚区增产幅度最大，平均在4%—10%；第六气候亚区到第七气候亚区次之，平均在2%—5%；第八气候亚区增产幅度最小，平均在3%以下。【结论】华北平原夏玉米适宜播期随着纬度的升高而提前。充分灌溉和雨养条件下，随着年代的推移，夏玉米适宜播期呈现推迟趋势，自20世纪80年代到21世纪00年代，每10年推迟3 d左右。第一和第二气候亚区雨养条件下的适宜播期晚于充分灌溉条件下适宜播期，其他气候亚区无显著差异。与实际播期相比，各气候亚区适宜播期下产量有2%—10%的提升，但雨养和充分灌溉条件下增产幅度没有明显差异，增产幅度由南到北呈现减小的趋势，第一到第五气候亚区，增产幅度较其他气候亚区大。

施氮和木薯-花生间作对木薯养分积累和系统养分利用的影响

林洪鑫，潘晓华，袁展汽，肖运萍，刘仁根，汪瑞清，吕丰娟

中国农业科学. 2018, 51(17):  3275-3290.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.004

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【目的】木薯-花生间作是一种生态高效的种植模式，研究分析施氮和木薯-花生间作对木薯氮磷钾素积累和系统氮磷钾素利用的影响规律，以期为木薯-花生合理间作和养分高效利用提供理论依据。【方法】试验于2015和2016年，以木薯品种华南205和花生品种粤油200为材料，设计不施氮、施氮2个水平和木薯单作、花生单作、木薯间作1行花生、木薯间作2行花生及木薯间作3行花生共5种种植模式，研究不同木薯-花生间作系统的木薯养分积累和系统养分利用特征。【结果】随着木薯生育时期的推进，块根氮磷钾素的积累量和分配率增加；茎秆氮磷钾素积累量和氮素分配率增加，磷钾素分配率先增加后降低；叶片氮磷钾素积累量先增加后降低，分配率下降。不同生育时期、不同施氮水平和不同种植模式间块根、茎秆、叶片和植株的氮磷钾素积累量变化规律存在差异。同一种植模式，施氮处理生产100 kg荚果所需氮钾量、生产100 kg鲜薯所需氮磷钾量、木薯氮素收获指数、木薯磷钾肥偏生产力、钾素间作优势、系统氮钾素积累总量和系统内木薯氮磷钾素比例较不施氮处理提高或显著提高，而花生氮钾素利用效率、花生磷素积累总量、木薯氮钾素利用效率、木薯钾素收获指数、系统内花生氮磷钾素比例、氮素间作优势和氮磷钾素的土地当量比较不施氮处理降低或显著降低。同一施氮水平，间作花生的氮磷素积累总量、氮磷钾肥偏生产力显著低于单作花生，间作木薯的氮磷钾肥偏生产力、钾素利用效率和磷素收获指数低于单作木薯。随着间作花生行数的增加，氮磷钾素的土地当量比和间作优势、系统内花生氮磷钾素比例、花生的氮磷钾素积累总量和氮磷钾肥偏生产力提高或显著提高，系统内木薯氮磷钾素比例下降。【结论】与单作模式相比，木薯间作2行和3行花生模式虽降低了系统内单一作物的产量、氮磷钾肥偏生产力和氮磷钾素积累总量，但提高了系统氮磷钾素积累总量，表现出明显的间作优势，氮磷钾素间作优势分别为63.91—112.11、19.37—42.67和68.29—105.62 kg·hm^-2。

植物保护

环境因子对腐烂病菌在苹果枝条木质部内生长扩展的影响

王晓焕，潘彤彤，练森，王彩霞，李保华

中国农业科学. 2018, 51(17):  3291-3301.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.005

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【目的】腐烂病菌（Valsa mali）在苹果树枝干木质部内生长扩展是导致剪锯口发病和旧病斑复发的重要原因，本研究旨在明确环境因子对腐烂病菌在枝干木质部内生长扩展的影响，为苹果腐烂病的流行预测和防控提供依据和参考。【方法】采用菌饼接种离体富士苹果枝条剪口后，用活体皮层检测病菌在枝条木质部内生长扩展距离的方法，研究温度、枝条相对含水量、枝条龄期、高温处理与浸水等因子对腐烂病菌在木质部内生长扩展的影响；采用菌饼接种离体、活体富士枝条剪口，系统监测腐烂病菌在枝条木质部内的周年生长扩展动态；通过离体培养，测试病菌在枝条不同组织配制培养基内的生长速度。【结果】腐烂病菌能够利用木质部内的水溶性养分生长扩展，病菌在木质部内的生长扩展速度显著快于在皮层内的生长速度；在5—35℃的范围内，腐烂病菌在苹果枝条木质部和皮层内都能生长扩展，最适温度为30℃；在浸水枝条木质部内，腐烂病菌的扩展距离显著短于未浸水枝条；当枝条的相对含水量大于90%时，腐烂病菌在木质部内的生长扩展速度较快，当枝条的含水量低于90%时，病菌的生长扩展受到明显的抑制；病菌在当年生枝条木质部内的生长扩展速度显著快于在2—3年生枝条木质部内的扩展速度；在经高温处理枝条木质部内，腐烂病菌的扩展速度显著快于未处理枝条；在用木质部粉末、韧皮部粉末、木质部浸出液、韧皮部浸出液制作的培养基中，腐烂病菌都能正常生长，其生长速度和生长量都不低于在PDA中的生长；腐烂病菌在韧皮部培养基中，气生菌丝多，在木质部培养基中气生菌丝少；自然条件下，接种到枝条剪锯口上病菌的生长扩展速度主要受温度的影响，12月至次年3月份，腐烂病菌在活体的富士枝条内扩展速度很慢，3—11月份扩展较快。【结论】腐烂病菌在木质部内可利用可溶性养分生长，其扩展速度显著快于在皮层内的扩展速度；腐烂病菌在木质部内的生长扩展速度受温度、枝条含水量、木质部的致密程度等因素的影响。

大豆孢囊线虫扩展蛋白新基因（Hg-exp-1、Hg-exp-2）的鉴定及功能分析

张瀛东，孔详超，黄文坤，孔令安，李红梅，彭焕，彭德良

中国农业科学. 2018, 51(17):  3302-3314.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.006

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【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一，由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白（expansin）在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因，并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究，为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术，根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物，从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段，根据EST片段序列设计RACE特异性引物，通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接，得到大豆孢囊线虫expansin基因cDNA全长；采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对；使用EBI在线软件SignalP 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测，GSDS在线软件进行基因组结构分析；使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建；采用southern杂交技术分析Hg-exp-1。在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数；通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位；提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的cDNA作为模板，通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性；根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA，对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株，分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列，命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2，长度分别为1 047和1 037 bp，分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽，2个预测蛋白N端均含有信号肽，无跨膜结构域，表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫（Globodera rostochiensis）GR-EXPB1（CAC83611）和GR-EXPB2（CAC84564）以及非洲茎线虫（Ditylenchus africanus）DA-EXPB1（ADJ57307）等具有高度一致性。Southern杂交分析表明，expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后，2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h，靶基因的转录水平下调，接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因，同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

长期施用氮肥和磷肥对东北黑土丛枝菌根真菌群落组成的影响

王庆峰，姜昕，马鸣超，关大伟，赵百锁，魏丹，曹凤明，李力，李俊

中国农业科学. 2018, 51(17):  3315-3324.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.007

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【目的】丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizae, AM）真菌在促进作物养分吸收、提高作物抗病和抗逆性等方面具有重要意义，探讨长期施用化学氮肥和磷肥对东北黑土AM真菌的影响及其主效环境因子，为进一步揭示AM真菌对化肥的响应机制，指导农田施肥以及利用AM真菌提高土壤养分有效性提供依据。【方法】以长期定位试验为平台，选取5种不同处理：不施肥（CK），单施常量氮肥（N₁），混施常量氮肥和磷肥（N₁P₁），单施2倍常量氮肥（N₂），混施2倍常量氮肥和磷肥（N₂P₂）。采用Illumina Miseq高通量测序技术研究连续施用37年氮肥和磷肥的AM真菌群落组成差异，并对AM真菌群落组成与环境因子进行相关性分析。【结果】随着氮、磷施用量的增加，黑土pH和速效钾含量显著降低，而全氮、硝态氮、铵态氮和有机质含量显著提高。单施氮肥（N₁和N₂）对黑土中AM真菌多样性影响不显著（P＞0.05）；然而氮、磷混施（N₁P₁和N₂P₂）显著降低黑土中AM真菌多样性（P＜0.05）。土壤中AM真菌以Glomeraceae科为主，占AM真菌45.5%。在属水平上，施肥降低Funneliformis和Septoglomus丰度，而提高Paraglomus丰度；在N₁和N₂基础上施磷显著提高Glomus和Funneliformis丰度，而降低Gigaspora和Paraglomus的丰度。非度量多维度分析表明，长期施用氮、磷肥改变了土壤中AM真菌群落组成。不施肥处理、单施氮肥处理和氮、磷混施处理AM真菌群落差异显著，且磷肥影响较为显著。冗余分析表明，土壤pH，有效磷含量是影响黑土中AM真菌群落组成的主效环境因子（P＜0.05）。【结论】长期施用氮肥以及氮、磷肥混施改变了黑土中AM真菌群落组成，单施氮肥对黑土中AM真菌多样性影响不大，而氮、磷肥混施降低其多样性，施肥导致的土壤pH和有效磷含量变化是主要因素。

不同施肥处理红壤性水稻土团聚体有机碳矿化特征

陈晓芬，刘明，江春玉，吴萌，李忠佩

中国农业科学. 2018, 51(17):  3325-3334.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.008

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【目的】在已有团聚体碳氮分布研究的基础上，进一步研究不同施肥处理红壤性水稻土团聚体有机碳矿化特征，并分析有机碳矿化的影响因素，为揭示施肥对土壤肥力的影响及土壤有机碳矿化作用机制提供理论依据。【方法】以长期定位施肥红壤性水稻土为研究对象，包括9个处理：不施肥（CK）、有机质循环（C）、氮肥（N）、氮肥+有机质循环（NC）、氮磷肥（NP）、氮磷钾肥（NPK）、氮磷钾肥+有机质循环（NPKC）、氮钾肥（NK）和氮磷钾肥+1/2秸秆回田（NPKS）。运用湿筛法得到＞2 mm、1—2 mm、0.25—1 mm、0.053—0.25 mm和＜0.053 mm 5个粒级团聚体，观测团聚体和全土有机碳矿化动态变化，测定团聚体中微生物生物量碳含量和转化酶活性。【结果】全土和＞1 mm团聚体有机碳矿化速率在培养前期快速下降，之后逐渐降低至稳定状态，而＜1 mm粒级尤其是0.053—0.25 mm 团聚体，有机碳矿化速率在培养前期降低幅度减小并更早达到稳定状态。有机碳累积矿化量在＞2 mm和1—2 mm团聚体中最高，在0.053—0.25 mm团聚体中最低。与对照相比，施磷肥处理（NP和NPK）各粒级团聚体有机碳累积矿化量平均提高17.0%—62.1%，施有机肥处理（C、NC和NPKC）则平均提高25.0%—80.5%。＞2 mm和0.25—1 mm团聚体对全土有机碳矿化的贡献最大，分别为21.0%—42.5%和20.6%—32.7%。＞0.25 mm大团聚体微生物生物量碳含量和转化酶活性均高于＜0.25 mm微团聚体。施磷肥处理各粒级团聚体微生物生物量碳含量较对照平均高73.4%—92.0%，施有机肥处理平均高60.8%—99.6%。磷肥和有机肥的施用显著提高＞0.25 mm大团聚体转化酶活性，其中NC处理大团聚体转化酶活性最高，较对照提高46.0%—135.0%。团聚体有机碳累积矿化量与有机碳、全氮、微生物生物量碳含量及转化酶活性均呈极显著正相关，但与有机碳的相关性最大。【结论】大团聚体在土壤有机碳矿化中发挥主导作用；有机碳含量是影响团聚体有机碳矿化的最主要因素；磷肥和有机肥的施用促进了土壤团聚体有机碳的矿化，是提高红壤性水稻土供肥能力的有效措施。

畜禽粪便中兽用抗生素削减方法的研究进展

成登苗，李兆君，张雪莲，冯瑶，张树清

中国农业科学. 2018, 51(17):  3335-3352.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.009

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兽用抗生素具有显著的促动物生长、预防动物疾病的作用。随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的不断发展，抗生素作为饲料添加剂在全球范围内已被广泛应用。我国畜禽养殖业对抗生素的依赖甚是严重，每年用于畜禽养殖的兽药抗生素超过了8吨，占抗生素总产量的一半以上。这些兽用抗生素并不能完全被动物体所吸收，绝大部分以原药或者代谢产物的形式随畜禽粪便和尿液排出体外，导致畜禽粪污中多种抗生素残留，最高浓度达到了183.50 mg·kg-1。残留抗生素可能经各种途径进入土壤和水体环境中，一方面影响土著微生物的活性，另一方面引起抗性菌和抗性基因的产生和传播，给生态系统安全和人类身体健康带来巨大的负面效应。因此，充分、有效消减畜禽粪污中兽药抗生素十分重要而迫切。论文作者在总结大量文献的基础上，对国内外畜禽粪便抗生素的污染特点和赋存规律进行了系统介绍，并着重阐述了国内外畜禽粪便中兽用抗生素削减方法的最新研究进展，描述了畜禽粪便好氧堆肥和厌氧发酵的分类及工艺流程。在此基础上重点对好氧堆肥和厌氧发酵两种处理方式下畜禽粪便中兽用抗生素的去除程度进行了详尽、深入分析，同时对抗生素消减效果的影响因素进行了充分讨论。主要结论：好氧堆肥对土霉素、四环素、金霉素、磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、环丙沙星、恩诺沙星和泰乐菌素等主要类别抗生素的最高去除率可达65.5%—100%，去除效果受抗生素种类、初始浓度、添加方式、堆肥温度、供养方式、底物组成影响；厌氧发酵对氨苄青霉素、四环素、磺胺甲氧二嗪的去除可达100%，但几乎无法去除磺胺噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、泰乐菌素，去除效果受抗生素种类、浓度、发酵温度、污泥性质、混合速率和发酵时间影响。最后，对需要进一步开展的研究进行了展望，建议加强兽用抗生素的监管，制定相关的法规和标准，加速兽用抗生素替代物品的研发，减少源头污染；深入开展畜禽废弃物好氧堆肥或者厌氧发酵过程中抗生素降解产物及机理研究；筛选具有强降解能力的微生物作为菌剂，强化其对畜禽养殖废弃物中兽用抗生素的消减；深入研究好氧堆肥和厌氧发酵过程中抗生素和ARGs之间的相互关系，去除兽用抗生素的同时也加速ARGs的削减。

园艺

基于枝条和叶片表型性状的梨种质资源多样性

张莹，曹玉芬，霍宏亮，徐家玉，田路明，董星光，齐丹，张小双，刘超，王立东

中国农业科学. 2018, 51(17):  3353-3369.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.010

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【目的】通过对梨种质资源叶片和枝条表型多样性和变异特点的研究，为梨种质资源描述的规范化和标准化、梨资源的保存及核心种质的构建提供数据基础和理论依据，促进梨种质资源的高效利用。【方法】采用“梨种质资源描述规范和数据标准”中提供的方法对“国家果树种质兴城梨、苹果圃”内保存的梨13个种548份资源的叶片和枝条23个表型性状进行数据采集及整理。使用SPSS19.0软件分析梨叶片和枝条表型性状的分布频率、变异系数、Simpson指数、Shannon-weaver指数、相关性和主成分，分析比较梨种群内和种群间多样性；采用Origin 8.0软件绘制梨各数值型性状分布直方图，进行分级评价并选取参照品种；采用MEGA 5.0软件对脆肉梨和软肉梨进行聚类分析。【结果】字符型的15个性状分析表明，梨叶片以卵圆形、叶基宽楔形、叶尖急尖、锐锯齿带刺芒、叶片伸展状态抱合、叶姿斜向下和绿微显红色幼叶等类型居多，分别占相对应描述符分布频率的90.51%、58.03%、66.97%、81.93%、87.23%、59.27%、86.68%和35.04%；枝条以黄褐色一年生枝、皮孔数量多、叶芽姿态斜生、顶端钝、芽托中和花芽无茸毛等类型居多，分别占相对应描述符分布频率的87.23%、78.28%、87.96%、83.76%、73.91%和99.27%；其中幼叶颜色和叶基形状的Shannon-weaver指数较高，分别为2.197和1.597。数值型的8个性状分析表明，叶片长度、叶片宽度、叶柄长度、一年生枝长度、一年生枝粗度、节间长度、花芽长度和花芽粗度的平均变异系数分别为17.25%、19.04%、20.06%、23.70%、15.08%、19.33%、20.62%和16.66%；根据分布统计分析，对每个性状分别提出了5级数值分级指标与参照品种；综合相关性分析和主成分分析，8个数值型性状可简化为一年生枝长度、花芽长度、叶片宽度和叶柄长度4个主要性状；梨叶片和枝条8个数值型性状在种群内和种群间差异均达到极显著水平，种群内和种群间表型分化系数VST分别为41.10%和58.90%。聚类分析233个脆肉梨地方品种可划分为12类，87个软肉型秋子梨可划分为6类，西南地区的梨资源在多个类群中均有分布。【结论】梨种质资源叶片和枝条表型性状多样性丰富，字符型性状中幼叶颜色和叶基形状的多样性指数较高，数值型性状中一年生枝长度和花芽长度的变异系数较高，更能体现梨品种间的差异。梨叶片和枝条种群间变异高于种群内变异，种群间的变异是其主要变异来源。筛选出5个数值型性状可作为梨枝条和叶片的综合评价指标。

枳NLP转录因子响应干旱胁迫并与NRE顺式作用元件互作

曹雄军，卢晓鹏，熊江，李静，谢深喜

中国农业科学. 2018, 51(17):  3370-3378.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.011

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【目的】探讨枳氮素含量在干旱条件下的变化，以及氮代谢途径枳亚硝酸还原酶基因（NiR）和NLP转录因子的响应表达，分析确定枳NLP转录因子与NiR启动子区域硝酸盐响应顺式作用元件（nitrate-responsive cis-element，NRE）位点绑定互作。【方法】以一年生的砧木枳为试验材料，进行干旱处理直至植株叶片开始萎蔫，并设置对照。利用凯氏定氮仪检测干旱条件下枳叶片和侧根的全氮含量，并同步利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和2^-ΔΔCT法分析PtNiR、PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8在枳叶片和侧根的表达情况。通过基因克隆并检索与比对分析，获取PtNiR启动子区域的硝酸盐响应顺式作用元件序列，之后利用同源克隆方法构建用于酵母单杂交的pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec-NLP载体，将构建的pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec-NLP载体质粒共同转化到酵母菌株Y187中，在氨基酸缺失培养基（SD/-Trp/-Leu，以及SD/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L^-1 3-氨基三唑）上30℃恒温培养3—5 d，观察酵母的生长情况，以确定枳NLP转录因子（PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8）与NRE的互作关系。【结果】受干旱的影响，枳叶片全氮含量表现出先升高再下降的趋势，而侧根中全氮含量则显著下降；在对照中，枳叶片和侧根全氮含量均显著上升。RT-qPCR分析表明，PtNiR的表达水平在叶片中先上调然后再显著下调，而在侧根中则随着干旱程度的增加显著下调；ptNLP2、ptNLP4及ptNLP7在枳叶片和侧根中的表达也均呈现不同程度的先上调然后再受到抑制的规律，而ptNLP8在枳叶片和侧根中的表达则在一定程度上受到干旱抑制。通过克隆测序分析，在枳NiR启动子区域-196至-154的位置发现了疑似NRE。酵母单杂交分析表明，转化pHIS2-4×NRE-HIS3载体和pGADT7-Rec-NLP载体的Y187酵母在对照培养基（-Trp/-Leu）和含有120 mmol·L^-1 3-氨基三唑的三缺培养基（-His/-Trp/-Leu）上均能正常生长。【结论】枳侧根中的全氮含量受干旱的影响而显著下降，以对照为参比，枳侧根和叶片中的全氮含量均随着干旱时间的延长而相对减少。氮代谢途径的枳NiR和NLP转录因子在叶片和侧根中的表达对干旱有不同程度的响应。PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8转录因子均能与PtNiR启动子中的硝酸盐响应顺式作用元件（NRE）位点绑定互作，从而激活下游基因的表达。

畜牧·兽医·资源昆虫

PB2蛋白E627V突变可增强H7N9病毒对小鼠的致病力

尹馨，马树杰，李梅，邓国华，侯玉杰，崔鹏飞，施建忠，陈化兰

中国农业科学. 2018, 51(17):  3379-3388.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.012

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【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来，研究发现其对家禽均呈现低致病力，对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是，2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒（简称HuN/S40726），却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制，提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警，展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株（简称SH/S1053）和上述湖南HuN/S40726病毒，开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株，利用反向遗传学技术，成功建立了病毒的反向遗传操作系统；利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸，救获了重组病毒rHuN/S40726、rHuN/S40726-PB2/627E和rHuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力，分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统，以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照，使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性，进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析，推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示，PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力，使得病毒MLD₅₀由≥6.5 log₁₀EID₅₀变化为3.5 log₁₀EID₅₀，病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明，无论是在33℃还是37℃下，PB2蛋白E627V的改变，显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性，与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸（V）决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性，是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。

流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用

赵青青，李俊平，梁立滨，黄山雨，周陈陈，赵玉辉，王倩，周圆，姜丽，陈化兰，李呈军

中国农业科学. 2018, 51(17):  3389-3396.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.013

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【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分，在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术（Y2H）筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白，获得多聚胞嘧啶结合蛋白1（poly（rC）-binding protein 1，PCBP1）。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响，为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒pGADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞，并涂布在3种营养缺陷型培养基上，30℃倒置培养5—7 d，观察酵母菌落生长情况和菌落颜色，回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列，分别设计特异性扩增引物，构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1，将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞，于转染48 h后裂解细胞，收获上清，留取少部分作对照，余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀（Co-IP），经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-ZsGreen1在HEK293T细胞中包装假病毒，将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系，Western blot检测PCBP1过表达情况，然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系，于感染后24和48 h收获上清，对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的siRNA，转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达，干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况，并以MOI=0.01感染流感病毒WSN，收获感染后24和48 h的上清，进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒pGADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A 等3种营养缺陷型平板上正常生长，并且能分解底物X-α-Gal，使菌落呈现蓝色，与阳性对照组一致，表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来，说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中，PCBP1蛋白表达水平显著提高，流感病毒的复制滴度下降; 而通过siRNA干扰后，PCBP1表达水平显著下降，流感病毒的复制滴度升高，表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用，且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。

重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的质量分析及发展方向

杨劲松，吴涛，李金祥

中国农业科学. 2018, 51(17):  3397-3404.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.014

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对主要用于我国高致病性禽流感防控的重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的种类和使用情况，以及国内高致病禽流感流行株的主要分支情况作一介绍。随着病毒抗原性的不断变异，疫苗毒株也需随之进行更换，因此必须使用匹配相应分支的疫苗才能取得理想的防控效果。目前国内重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的生产现状是共有10家生产企业，其中2个厂家采用悬浮细胞工艺生产，其余8个厂家均采用鸡胚工艺进行疫苗生产。笔者根据企业上报的产品批签发报告情况，以2016年至2017年农业部规定的高致病性禽流感强制免疫疫苗重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)为例，着重从疫苗的安全性和效力两方面对4家重组禽流感灭活疫苗生产企业共计488批次产品的批签发检验数据进行了质量分析。从Re-6株、Re-7株、Re-8株不同组分效价的比较可以看出，所有批次疫苗抗体效价几何平均滴度（GMT）至少高于国家标准1个滴度以上，而Re-6株和Re-8株组分抗体效价（GMT）高于国家标准2个滴度以上。虽然产品的效价都超过了国家标准，但抗体水平还是参差不齐，较高产品的3个组分抗体效价（GMT）比较低的要高出1.5个滴度以上。各生产企业产品批间差异较大，这虽有生产工艺不断成熟和优化的因素，但对于相近批次产品批间差异出现较大差异，则说明企业生产工艺并不十分稳定。4个企业在2017年生产的疫苗各组分抗体效价GMT整体水平均比2016年有所提高，说明生产工艺的不断成熟和优化，企业对产品质量的进一步严格把关。我国禽流感病毒灭活疫苗含有的甲醛和细菌内毒素是造成疫苗副反应的直接原因，因此通过生产工艺改进，降低疫苗中甲醛和细菌内毒素的含量，可以降低疫苗的副反应。核酸疫苗是当前禽流感疫苗研究发展的前沿技术，是现阶段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗,也是禽流感疫苗研究的一大热点。另外，具有交叉保护性的广谱免疫原性的通用疫苗可以有效的解决抗原漂移这一难题，是现阶段流感疫苗研究的一个重要研究方向。

悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养

陈宏，杨柳，宋海岩，石莹，孟令伟，付春杰，张丹，赵海源，李金祥，蒋晓梅，张天舒

中国农业科学. 2018, 51(17):  3405-3414.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.015

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【目的】为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持。【方法】选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞，通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方，将其驯化为悬浮MDCK细胞，并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株；比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异。分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒（H5亚型）三价灭活疫苗，免疫商品蛋鸡和商品鸭，通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。海兰褐商品蛋鸡：6 050只，分为3组，2组为免疫组，每组3 000只，28日龄免疫0.5 mL/只，80日龄免疫0.5 mL/只；不免疫对照组1组，50只，同等条件下隔离饲养。分别于蛋鸡日龄49、110、210 d（即首免后21 d、82 d、6个月）时采血分离血清，测定禽流感H5亚型 Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价，监测抗体消长。长白飞鸭：220只，分为3组，2组为免疫组，每组100只，10日龄免疫0.5 mL/只，24日龄免疫1.0 mL/只，不免疫对照组20只，同等条件下隔离饲养。分别于鸭日龄24、38、52 d（即首免后14、28、42 d）时采血分离血清，测定禽流感H5亚型 Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价，监测抗体消长。【结果】获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞，摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示，该细胞株适合放大生产。此悬浮MDCK细胞培养48 h细胞密度可由1.5×10⁶ cells/mL左右增殖到1.0×10⁷ cells/mL左右，状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中。以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒，H5N1 Re-6株的HA效价达1﹕512，TCID₅₀ 10^7.67/mL，EID₅₀ 10^7.83/0.1 mL；H5N1 Re-7株的HA效价达1﹕256，TCID₅₀达10^7.33/mL，EID₅₀ 10^7.17/0.1 mL；H5N1 Re-8株的HA效价达1﹕1024，TCID₅₀ 10^8.5/mL，EID₅₀ 10^8.38/0.1 mL，与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当。细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡，首免后21 d时，禽流感H5亚型 Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值（GMT）分别为1﹕446、1﹕111、1﹕416，二免后30 d时三者HI抗体效价几何平均值（GMT）分别为1﹕588、1﹕362、1﹕776，6个月时分别为1﹕239、1﹕128、1﹕223，维持了较高的抗体水平；免疫长白飞鸭，首免后14 d时，禽流感H5亚型 Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值（GMT）分别为1﹕30、1﹕17、1﹕64，28 d时三者HI抗体效价几何平均值（GMT）分别为1﹕194、1﹕91、1﹕137，42 d时分别为1﹕416、1﹕128、1﹕239；以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当。【结论】经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强，且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体。为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持。

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化

李莉，杜鑫，张丽娜，杨柳，高晓庆，唐东雪，赵海源，蒋晓梅，张天舒，李金祥

中国农业科学. 2018, 51(17):  3415-3426.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.016

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【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏，现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一，需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗，不仅可以大幅度提高单位产量，实现高密度细胞和高病毒产率，同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L，高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原，开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验，确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h，最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10^-4，最佳TPCK-胰酶浓度为2 μg·mL^-1，根据确定的最佳培养条件连续传代，并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时，HA可达1﹕256，每1 mL病毒含量达到10^8.5TCID50，每0.1 mL病毒含量达到10^8.5EID50，均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次，可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验，确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h，最佳接毒剂量MOI为10^-2，最佳TPCK-胰酶浓度为4—8 μg·mL^-1。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。

研究简报

黄瓜白粉病抗性基因定位及候选基因分析

郝俊杰，李磊，王波，秦玉红，崔健，王瑛，王佩圣，江志训，孙吉禄，王珍青，岳欢，张守才

中国农业科学. 2018, 51(17):  3427-3434.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.17.017

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【目的】通过对黄瓜白粉病抗性基因的精细定位，明确抗性基因的候选区段，为进一步克隆基因及解析基因功能奠定基础。【方法】本研究选用高抗白粉病资源（自交系‘74’）和感白粉病资源（自交系‘80’）配制杂交组合，构建F₁、F₂群体，利用单囊壳白粉菌鉴定亲本及群体白粉病抗性并进行遗传分析；采用BSA-seq的方法对黄瓜白粉病抗性基因进行初步定位，在此基础上在候选区段开发分子标记，进一步精细定位白粉病抗性基因。【结果】分离群体单株表型鉴定结果表明，自交系74的抗性是由不完全隐性基因控制的。BSA-seq技术初步将抗性基因定位于5号染色体15—25 Mb位置，命名为PM⁷⁴。最终，利用分子标记将抗性基因定位于SSR15321和SSR07531之间，遗传距离为3.06 cM，物理距离为238 444 bp，可解释41.95%的表型变异。生物信息学分析表明在候选区段内包含有17个候选基因，其中Cucsa.275630为TIR-NBS-LRR类基因。【结论】本研究将黄瓜白粉病抗性基因精细定位到约238 kb的候选区段内，区段内包含有一个TIR-NBS-LRR基因，该基因将是今后研究的重点候选基因。