中国农业科学

CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展

解莉楠，宋凤艳，张旸

中国农业科学. 2015, 48(9): 1669-1677. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.01

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当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后，会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中，进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合，从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组；当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响，而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况，使得研究者无法得到精确控制的突变结果；而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变，通过加入同源重组的供体DNA，可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产生自发同源重组的概率很低，对植物基因组进行精确修饰和改造非常困难，位点特异性核酸酶的出现和应用，大大提升了同源重组的效率，使基因组编辑变得更加高效和精确，从而使得对包括植物在内的任何物种进行基因组编辑都将成为可能。锌指核酸酶（ZFN）和TALE核酸酶（TALENs）是能够使DNA的靶位点产生DNA双链断裂进而实现基因组定点编辑的常用系统，但在具体应用中发现这两种系统存在着许多缺陷和不足，如脱靶效应、与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等，另外技术难度大、构建组装时间长也限制了其应用。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经过密码子优化等改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术，具有突变效率高、制作简单、易操作及成本低的特点。目前，该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑，编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的indel突变等。目前，CRISPR/Cas系统在植物中的应用还比较有限，但该技术为植物基因工程的发展呈现了美好的前景。文中首先简要介绍了CRISPR/Cas系统的组成和基本原理，进而详细综述了该技术在植物内源基因和外源基因定点编辑中的应用，主要列举了自CRISPR/Cas系统改造成功以来利用该系统对单子叶和双子叶植物进行基因组定点编辑的案例，最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望，希望能够为开展该领域研究的科研工作者提供参考。

黄萎病菌毒素联合法鉴定棉花对黄萎病的抗性

王铭，臧丽丽，范凯，李凤，袁淑娜，申浩，王学德

中国农业科学. 2015, 48(9): 1678-1688. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.02

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【目的】黄萎病菌是危害棉花最严重的病菌，又属于被检疫的病菌，田间接菌鉴定棉花抗病性受到检疫的限制，通过比较多种鉴定棉花抗黄萎病的方法，提出一种使用黄萎病菌毒素进行联合鉴定的方法，以替代传统病圃鉴定法。【方法】将待测棉花品系种植于人工气候室内，以常规管理模式培养棉苗，在21 d后将所种植棉苗的根部放入黄萎病菌毒素中浸泡，浸泡72 h时统计病情指数；在待测棉花品系的盛花期取棉株倒数第三片叶片，用打孔器在叶片上取10—20个直径约1.5 cm的叶圆盘，将所取叶圆盘浸泡于黄萎病菌的毒素当中，经过24 h后观察所浸泡的叶圆盘黄化程度，并进行统计分析；综合上述两种方法的鉴定结果，对待测棉花品系的黄萎病抗性作出评价。【结果】通过对多种鉴定方法的比较，毒素蘸根法、无底塑钵菌液浇根法和菌液蘸根法所需的鉴定时间较长，而毒素浸根法和毒素浸泡叶圆盘法所需鉴定时间较短；在应用毒素浸根法进行鉴定时，最适毒素浓度为15 μg·mL^-1，在此浓度下，毒素浸根法的鉴定结果与田间病圃法鉴定结果的相关系数为0.94（P＜0.01）；在使用毒素浸泡叶圆盘法进行鉴定时，浸泡叶圆盘的最适毒素浓度为18 μg·mL^-1；在应用毒素浸泡叶圆盘法鉴定时，应于盛花期选取待测棉花的倒三叶的叶圆盘进行鉴定，其鉴定结果与常规病圃法鉴定结果的相关系数为0.92（P＜0.01）；2013年和2014年两年的试验结果证明联用毒素浸根法和毒素浸泡叶圆盘法的鉴定结果与常规病圃法的鉴定结果相关系数较高。2013年其与常规病圃法的鉴定结果相关系数为0.94（P＜0.01），2014年为0.95（P＜0.01）。【结论】通过联用毒素浸根法和毒素浸泡叶圆盘法可以准确、环保、便捷地鉴定棉花抗黄萎病性，可以在一定程度上代替传统的病圃鉴定法，其结果比用单一鉴定方法更为准确可靠。

越冬紫花苜蓿根系性状与秋眠性的关系及其抗寒效应

刘志英，李西良，李峰，陶雅，刘磊，王宗礼，孙启忠

中国农业科学. 2015, 48(9): 1689-1701. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.03

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【目的】秋眠是紫花苜蓿（Medicago sativa）对晚秋生长环境变化的一种适应性反应，根系是紫花苜蓿越冬的主要功能器官，秋眠性与其越冬具重要关联，但对于如何通过根系性状的越冬特征来实现抗寒效应，仍不清楚。文章中从根系性状越冬反应的角度，探究秋眠性对紫花苜蓿抗寒性的作用过程。【方法】采用11个标准秋眠级紫花苜蓿品种为材料，以紫花苜蓿在中国适宜分布区中较为寒冷的中温带地区为例，通过标准主轴分析（standardized major axis，SMA）等方法，研究不同秋眠级紫花苜蓿各根系性状在越冬过程的差异化响应及其异速生长关系，进一步采用偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）等方法，研究不同秋眠型紫花苜蓿通过根系策略来实现其抗寒效应的关键作用因子。【结果】（1）随着秋眠性的减弱（即秋眠级提高），越冬紫花苜蓿根颈直径和侧根数显著减小（P＜0.05），秋眠性较强的紫花苜蓿具有增强储藏的表型特征，而主根直径、侧根直径等则随着秋眠性的减弱而显著趋于增大（P＜0.05），侧根数量与侧根的其他特性表现一定的权衡关系（P＜0.05）；（2）受秋眠级的影响，根系性状之间表现显著的异速生长关系，主要表现在根颈入土深度、侧根位置、侧根数等性状之间，其异速生长斜率与1存在显著差异（P＜0.05），不同根系性状在越冬期间对秋眠级具有不同的响应策略；（3）紫花苜蓿越冬率与秋眠级具有显著的负相关关系，但并非线性响应，而是呈现逻辑斯蒂曲线变化特征，1—5秋眠级趋于稳定在高越冬率水平（＞95%），中间级别5—8级的越冬率逐渐急剧减小（50%—70%），9—11级在中高纬度难以越冬（＜5%）；（4）影响紫花苜蓿越冬率的正向贡献因子是根颈直径、侧根数（P＜0.05），而主根直径、侧根直径等因子的提高反而降低了紫花苜蓿的抗寒性（P＜0.05），根系直径等性状并非决定抗寒能力的主导因子。【结论】不同秋眠级紫花苜蓿的根系性状表现出对越冬低温胁迫的差异化响应特征，不同性状具有异速生长关系；紫花苜蓿主要通过增加根颈直径和侧根数来提高其抗寒性，并不取决于根系其他表型性状的绝对大小；越冬期间，不同秋眠型紫花苜蓿根系策略的适应性变化，是实现其抗寒效应的重要途径。

再生稻产量形成特点与关键调控技术研究进展

徐富贤，熊洪，张林，朱永川，蒋鹏，郭晓艺，刘茂

中国农业科学. 2015, 48(9): 1702-1717. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.04

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发展再生稻是充分利用秋季光热资源,提高稻田产出效益的一条重要途经。根据已报道资料，结合笔者20余年的研究结果，综述了再生稻产量形成特点及关键调控技术研究进展。主要内容包括:（1）头季稻中上部节的再生穗抽穗期比下部抽穗早、着生叶片数少、出叶速度快、生育期短、穗子小、成穗率和结实率较高。头季稻抽穗后光合物质主要供给穗部籽粒灌浆结实，分配给再生芽生长利用的光合物质极少，是齐穗后大量再生芽开始死亡的机理所在；改善头季稻抽穗期间植株行间的光照条件对再生芽生长的促进作用，必须在一定光合物质供给基础上才能显现。头季稻齐穗后品种间再生力取决于头季稻的叶粒比，强再生力品种头季稻单位颖花的绿叶面积占有量较大，其光合产物满足头季稻高产之后剩余量较多，对再生稻高产提供了重要的物质基础，杂交组合间再生力与穗粒数呈极显著负相关关系。（2）水稻品种再生力可分为4级，头季稻及再生稻两季高产品种的库源特征：穗粒数160—190粒、叶粒重比0.0737—0.0827 cm²·mg^-1、有效穗232.12—249.40万/hm²、结实率81.54%—85.74%、千粒重28.58—30.07 g、单穗重4.13—4.43 g。（3）促芽肥提高再生力的作用，是通过施氮延缓了头季稻生长后期绿叶衰老速度，提高母茎叶片全氮含量及其净光合速率，增加叶片当时的光合产物向头季稻穗部输入比例，减少先期贮藏于母茎鞘中光合产物向穗部输入量，相对地提高了母茎鞘干物重而增强再生力。促芽肥对再生稻的作用效果在品种间的表现不尽相同，头季稻穗粒数较多的大穗型品种要提早施用促芽肥并增加施用量，才能获得较高的再生稻产量。利用杂交中稻齐穗期剑叶叶绿素计读数（SPAD值）可预测再生稻促芽肥高效施用量；通过防治纹枯病保护头季稻基部叶片和适度烤田提高根系活力，是再生稻高产的重要保证；头季稻收获期的成熟度与再生力呈极显著正相关，以头季稻完熟期再生芽开始破鞘现青时收割头季稻为宜，留桩高度以保留倒2节并高出5—7 cm处割苗即可。（4）针对目前再生稻生产上存在的主要制约因素，即再生稻开花期的低温危害、再生稻大面积产量不平衡和机械收获头季稻对再生稻生产的不利影响，提出了相应的对策与解决途经。（5）提出再生稻理论与技术的研究重点，包括“生态与农艺措施对头季稻后期冠层性状与再生芽生长的多因素互作机制”、“头季稻收割后再生芽停滞于母茎鞘中的原因及其调控途径”、“提高再生稻氮肥利用效率的技术途径”和“适应机械插秧与机械收割的杂交水稻-再生稻配套技术”4个方面。

超高效液相色谱法分析稻米酚酸化合物组分及其含量

张娜，王国祥，Abacar Jose Daniel，刘正辉，丁承强，唐设，李刚华，王绍华，丁艳锋

中国农业科学. 2015, 48(9): 1718-1726. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.05

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【目的】稻米酚酸化合物是天然抗氧化物的重要来源，本研究建立糙米和精米中酚酸化合物的超高效液相色谱的定性定量方法，并分析其在籽粒中的分布特征。【方法】以没食子酸、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、异阿魏酸、2-羟基肉桂酸和反式肉桂酸14种酚酸化合物标准品，对糙米和精米中酚酸进行定性和定量分析。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm-Micron），流动相为0.1%乙酸水溶液（A）/乙腈（B），柱温30℃，流速为0.5 mL·min^-1，采用梯度洗脱，洗脱程序为0—1 min，8%—10%B；1—2.5 min，10%—13%B；2.5—5.5 min，13%B；5.5—6 min，13%—21%B ；6—6.5 min，21%—27%B；6.5—7.5 min，27%—50%B；7.5—9 min，50%—100%B；9—12 min，100%B；12—12.5 min，100%—8%B。检测波长为280和325 nm。【结果】14种酚酸在8 min内完全分离，经质谱鉴定，精米及糙米中检测出的物质共有11种，分别是没食子酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、异阿魏酸和反式肉桂酸。可进行定量分析的酚酸共8种，分别是对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、异阿魏酸和反式肉桂酸，线性范围为5—220 μg·mL^-1 (R²=0.9994—0.9999)，检出限为0.002—0.03 μg·mL^-1，定量限为0.004—0.08 μg·mL^-1，回收率为84.11%—114.43%。对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、异阿魏酸和反式肉桂酸在精米和糙米中的含量差异显著，其中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸和反式肉桂酸集中存在于胚乳外层中，精米/糙米含量百分比变幅为4.52%—16.73%。而异阿魏酸在稻米籽粒中分布较均匀，其精米/糙米含量百分比达到45.86%。【结论】该方法简便、快速、准确、可靠，不仅适合稻米中酚酸化合物的含量测定，而且对于其他谷物中酚酸化合物含量的测定也具有一定参考价值。

氮素对灌浆期夏玉米叶片蛋白质表达的调控

王祥宇，魏珊珊，董树亭，刘鹏，张吉旺，赵斌

中国农业科学. 2015, 48(9): 1727-1736. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.06

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【目的】在大田生产条件下研究氮素对灌浆期玉米叶片蛋白质表达的调控。【方法】在大田生产条件下，以紧凑耐密型玉米杂交种登海618为试验材料，研究施氮对玉米穗位叶花后净光合速率、硝酸还原酶（NR）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量和可溶性蛋白含量的影响。采用TCA-丙酮沉淀法提取灌浆期（花后20 d）两个施氮处理下玉米穗位叶总蛋白质，并用双向凝胶电泳技术（2-DE）分离获得蛋白质图谱。采用ImageMaster-2D Elite 7.0图像分析软件对蛋白质图谱进行比较，确定玉米叶片应答灌浆期施氮处理的差异蛋白点。通过MALDI-TOF/TOF MS质谱分析及NCBInr数据库搜索，对差异表达蛋白质进行鉴定并分析其涉及的生物学功能。【结果】开花后，随生育进程的推进，玉米穗位叶净光合速率、叶绿素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均呈下降趋势，而MDA含量则呈上升趋势。相对于不施氮处理，施氮处理下叶片叶绿素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均显著提高，而MDA含量则显著下降。对灌浆期玉米叶片进行双向电泳及图谱分析，分别在施氮和不施氮条件下检测出1 086和1 170个蛋白点。通过图像分析软件进行成对匹配分析，共得到29个显著差异蛋白点。经质谱鉴定分析，29个显著差异蛋白点中有25个被成功鉴定，鉴定成功的蛋白中除未知蛋白（蛋白点55）和30s核糖体蛋白（蛋白点1089）外，其余蛋白表达量均在施氮条件下上调。通过搜索NCBInr数据库，差异表达的蛋白主要分为8类，包括13个能量相关蛋白，2个防御相关蛋白，2个蛋白合成相关蛋白，2个蛋白目的和储存相关蛋白，1个细胞生长相关蛋白，1个次级代谢相关蛋白，1个转运相关蛋白和3个未知蛋白。【结论】施氮对灌浆期玉米叶片光合能力、碳代谢能力、防御能力、蛋白合成能力、蛋白目的和储存能力、以及次级代谢能力等均有显著提升作用。

苦豆子生物碱对番茄生长及果实品质的影响

熊鑫，郭树奇，李琳，马志卿，张兴

中国农业科学. 2015, 48(9): 1737-1746. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.07

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【目的】通过测定植物源农药苦豆子生物碱对番茄生长发育及果实品质的影响，探讨苦豆子生物碱对番茄形态及发育的调控效应，全面了解苦豆子生物碱的生物学效应，为其科学合理使用提供依据。【方法】以番茄为供试植物，阿维菌素为对照药剂，测定苦豆子生物碱不同浓度（333.0、166.5和111.0 mg·L^-1）处理对番茄植株形态、果实产量及品质指标的影响。采用盆栽试验测定苦豆子生物碱对番茄幼苗株高、茎粗、叶片总数、最大叶长和宽及叶绿素含量的影响；采用田间小区试验测定苦豆子生物碱对番茄产量、可溶性糖含量、可滴定酸含量、维生素C含量和硝酸盐含量的影响。【结果】苦豆子生物碱对番茄植株生长及果实品质具有明显的调控作用。盆栽试验结果表明，166.5 mg·L^-1处理对番茄幼苗的刺激生长作用最为明显，与空白对照（清水处理）相比，每次施药后第7天，番茄的株高相对生长速率分别增加55.07%、103.03%和60.60%，茎粗净增长量分别增加31.54%、225.80%和185.45%，但叶片形态无明显变化；在333.0和166.5 mg·L^-1浓度下，与空白对照相比，苦豆子生物碱处理后可使叶片叶绿素含量分别升高6.16%—13.79%和6.89%—17.12%，而111.0 mg·L^-1浓度处理的番茄叶绿素含量较空白对照却下降0.60%—9.40%。田间小区产量测定结果表明，333.0、166.5和111.0 mg·L^-1的苦豆子生物碱处理后，与空白对照相比，番茄第一穗果实平均单果重分别增加13.07%、20.92%和9.15%，第二穗果实平均单果重与空白对照均无显著差异，第三穗果实平均单果重分别增加12.23%、20.86%和17.27%；且166.5 mg?L^-1浓度下，番茄前期产量较对照增加16.48%，而333.0和111.0 mg·L^-1处理下，产量无显著增加。田间小区试验果实品质测定结果表明，在浓度为333.0和111.0 mg·L^-1的苦豆子生物碱处理下，与空白对照相比，可溶性糖含量平均值明显下降，而166.5 mg·L^-1处理下可溶性糖含量与对照无显著差异；在333.0、166.5和111.0 mg·L^-1浓度下，可滴定酸含量平均值分别较空白对照增加37.01%、23.88%和27.16%；333.0、166.5 mg·L^-1浓度的苦豆子生物碱处理后，与空白对照相比，番茄第一穗果实的维生素C含量分别下降28.06%和21.91%，第二穗分别下降27.37%和26.34%，而第三穗分别增加7.28%和7.69%，呈先降低后升高的趋势，而111.0 mg·L^-1浓度下，第一、二穗果实维生素C含量较空白对照显著下降，第三穗果实维生素C含量与空白对照无显著差异；苦豆子生物碱处理后番茄果实中硝酸盐的含量与空白对照相比显著增加，且浓度越高，硝酸盐积累越多，但仍远远低于中国蔬菜硝酸盐允许量。【结论】在田间常用浓度(166.5 mg·L^-1) 下，苦豆子生物碱能够在番茄营养期促进生长，生殖期促进果实增产，对果实品质无不利影响，作为一类新型、安全的植物源农药，具有较好的开发应用前景。

短时高温暴露对褐飞虱存活和生殖特性的影响

李干金，徐显浩，张海亮，朱敏，崔旭红

中国农业科学. 2015, 48(9): 1747-1755. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.08

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【目的】明确短时高温暴露对褐飞虱成虫存活和生殖特性的影响，为褐飞虱种群发生预测及防治提供理论依据。【方法】采集初羽化24 h内的褐飞虱成虫，辨别雌、雄后放入平底玻璃管内，每管5对，置于水浴循环仪中进行高温暴露处理，设置6个靶标温度，分别为33、35、37、39、39.5和40℃，误差范围0.02℃。高温处理时以25℃为起点温度，然后以0.1℃/min的速度上升至靶标温度，待靶标温度恒定后，在靶标温度下处理2 h。处理结束后，将褐飞虱转移到25℃的人工培养箱中，1 h后观察记录其存活情况，以未经过高温处理的褐飞虱成虫为对照。随后研究其存活率、产卵量及后代存活能力是否发生变化。【结果】33—37℃对褐飞虱雌、雄虫的存活率均无显著影响；而39—40℃下暴露2 h，雌、雄虫的存活率显著下降，其中39.5℃下暴露2 h，雌、雄虫存活率均低于50%，40℃下暴露2 h，雌、雄虫存活率仅为4.5%—6.7%，且成虫存活时间不足24 h；不同高温暴露2 h后，褐飞虱雄成虫逐日存活率曲线坡度较雌成虫陡；在35—39.5℃范围内暴露2 h，褐飞虱的产卵前期有所延长，尤其在39.5℃下暴露2 h，每头褐飞虱雌虫的平均产卵前期达6.3 d，与对照（25℃）的产卵前期3.5 d达到极显著差异水平（P＜0.01）；在35和39℃暴露2 h，产卵前期显著延长，分别达到4.4和4.4 d（P＜0.05）；高温暴露对褐飞虱雌成虫产卵量也有明显的影响，33、35、37、39及39.5℃分别暴露2 h，每雌产卵量显著从25℃的365.5粒下降至165.4、194.6、146.7、301.6和234.7粒（P＜0.05）；高温暴露对褐飞虱后代孵化率和性比均无显著影响，但对其后代总存活率有着显著的影响，随着温度上升，F₁代若虫总存活率由对照（25℃）的80.4%下降至61.8%—75.5%；褐飞虱成虫在33—39.5℃高温下暴露2 h，其F₁代若虫总存活率比对照均下降，而除35℃（75.5%）外，其他温度暴露后，均与对照存在显著差异（P＜0.05），40℃下褐飞虱停止产卵活动。此外，高温暴露还能使褐飞虱的产卵节律和孵化节律发生变化，经39.5℃高温暴露2 h后，较33、35、37和39℃高温处理及对照的产卵高峰期和后代的孵化高峰期推迟。【结论】在39—40℃高温暴露下，褐飞虱成虫存活及产卵量和后代总存活能力显著下降，39℃及以上高温对褐飞虱存活与生殖具有一定的威胁。

呋虫胺在有机溶剂和水中的手性稳定性

陈增龙，陈秀，董丰收，刘新刚，徐军，郑永权

中国农业科学. 2015, 48(9): 1756-1763. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.09

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【目的】在人工氙灯光照、室内自然光照和避光培养条件下，探究呋虫胺外消旋体（Rac-呋虫胺）及其对映体（S-呋虫胺和R-呋虫胺）在甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、超纯水以及β-环糊精水溶液中的手性稳定性，为大宗用量的手性新烟碱类杀虫剂呋虫胺的准确检测分析、药效和环境安全的正确评价提供依据。【方法】培养周期内分段取样，以直链淀粉-三（3, 5-二甲基苯基氨基甲酸酯）为手性固定相，正己烷/甲醇/乙醇（85/10/5, v/v/v）为流动相，柱温为30℃，流速为1.0 mL?min^-1，紫外检测波长为270 nm，进样量为20 µL，高效液相色谱/二极管阵列检测器（HPLC/DAD）进行分离分析，S-呋虫胺和R-呋虫胺的保留时间分别为8.3和9.7 min。外标法定量。【结果】人工氙灯光照、室内自然光照和避光培养条件下，S-呋虫胺和R-呋虫胺在甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、超纯水以及β-环糊精水溶液中均不存在相互转化现象；配对样品t-test分析Rac-呋虫胺在每种溶剂中两个对映体的降解残留量，证实无对映体选择性降解。对映体浓度比值（EF值）为0.4746—0.5116。但在人工氙灯光照下，Rac-呋虫胺、S-呋虫胺和R-呋虫胺迅速降解，顺序为二氯甲烷＞乙腈＞乙酸乙酯≈异丙醇≈乙醇＞甲醇＞超纯水＞β-环糊精水溶液。相比水溶液，呋虫胺在有机溶剂中更容易降解，半衰期分别为3.3—3.6 h和1.2—2.3 h。光解动态符合一级动力学模型，相关系数为0.9550—0.9959。室内自然光照与避光培养条件下，Rac-呋虫胺、S-呋虫胺和R-呋虫胺在二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇、乙醇、甲醇、超纯水和β-环糊精水溶液中无明显降解，实测浓度和相对标准偏差分别为9.5—10.4 mg?L^-1，1.0%—3.2%和9.5—10.5 mg?L^-1，1.4%—2.8%。【结论】在（25±2）℃人工氙灯光照、室内自然光照和避光条件下，呋虫胺在甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、超纯水以及β-环糊精水溶液中手性构型稳定，在此条件下进行定性定量分析、药效和环境安全评价是准确的。

耕作措施对东北黑土微生物呼吸的影响

贾淑霞，孙冰洁，梁爱珍，陈学文，张士秀，魏守才，刘四义，陈升龙，张晓平

中国农业科学. 2015, 48(9): 1764-1773. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.10

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【目的】利用东北黑土13年保护性耕作定位试验，研究耕作措施（免耕和秋翻处理）对土壤微生物的影响，从土壤微生物角度分析免耕是否有利于土壤有机碳（SOC）的固定，为合理评价农田黑土碳“源”与“汇”功能提供科学依据。【方法】以连作玉米为研究对象，采用单因素随机区组设计，耕作处理包括免耕和秋翻。免耕除播种外不扰动土壤，秸秆覆盖地表。秋翻处理的田间管理包括人工除草、中耕起垄和秋翻，秋翻时将秸秆翻于地表之下。土壤微生物呼吸速率通过PVC环在野外采用动态气室法（Li-Cor8100）直接测定（去除植物根系），定期监测土壤微生物呼吸速率的季节变化，并在土壤微生物呼吸速率最高的季节取样分析不同处理土壤微生物量碳和数量特征。【结果】生长季节内免耕和秋翻处理下土壤微生物呼吸速率分别为0.42—3.35和0.48—3.24 μmolCO₂·m^-2·s^-1，两处理平均值差异不显著（8.8%），但土壤累积CO₂-C释放量免耕比秋翻高10.0%（2012）和4.3%（2013）（P＜0.05）。免耕显著地增加0—5 cm表层土壤细菌、真菌和放线菌的数量，分别比秋翻高125.7%、112.4%和53.3%；还显著地增加了其他土层的真菌数量，分别为105.3%（5—10 cm），159.4%（10—20 cm）和114.7%（20—30 cm）。耕作处理影响土壤温度，主要体现在春季，秋翻（0—5 cm，5—10 cm）春季（6月）土壤温度比免耕分别高2.8%和5.8%。土壤微生物呼吸速率表现出显著的季节变化规律，与土壤温度具有相似的动态变化，夏季（7、8月份）最高，秋季较低。尽管耕作处理没有明显地影响土壤微生物呼吸速率的季节动态格局，但秋翻的土壤微生物呼吸最高值比免耕晚半个月。土壤微生物呼吸速率随土壤温度（5 cm和10 cm）呈指数型增长，10 cm处的回归模型明显好于5 cm。耕作处理只改变了5 cm的Q₁₀值，免耕比秋翻高10.8%。土壤微生物呼吸速率与土壤温度、水分混合回归模型能更好地反应其变化规律，解释土壤微生物呼吸速率变异的65%（秋翻）和81%（免耕）。【结论】免耕增加了表层（0—5 cm）的SOC含量，从而使得该土层的土壤微生物量碳和活性增加，但是由于免耕处理增加0—30 cm 土层SOC含量的加权平均值，因此相对于传统的耕作措施（秋翻），免耕有利于SOC含量的增加。

填闲种植对棚室菜田累积氮素消减及黄瓜生长的影响

彭亚静，郝晓然，吉艳芝，王琳，任翠莲，巨晓棠，张丽娟

中国农业科学. 2015, 48(9): 1774-1784. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.11

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【目的】在中国集约化蔬菜种植区，传统的高水肥投入导致土壤氮素大量累积，致使氮素淋洗到土壤深层或进入地下水，造成地下水硝酸盐污染。种植填闲作物可控制和减少土壤深层硝态氮的累积，因此，本研究探讨不同填闲作物种类对消减土壤剖面累积硝态氮及下季作物生长的影响，筛选出适宜的填闲作物种类。【方法】以华北平原传统棚室黄瓜菜田为对象，在蔬菜休闲期通过种植深根型填闲作物，利用其根系发达、生长迅速、吸氮量大的特点，促使土层中硝态氮大量消耗，以消减土壤剖面根层NO₃^--N累积和降低土壤剖面NO₃^--N淋失。以此为目标，设置甜玉米、苋菜、甜高粱及休闲田间小区试验，采集测定土壤、植株及根系样品，分析不同填闲作物的消减效果。【结果】在这3种填闲作物中，甜玉米的生物量和吸氮量最大，整体根长密度大于其它填闲种类。从对土壤剖面NO₃^--N的消减能力来说，甜玉米的消减能力最高。2008、2009及2010年，甜玉米对0—200 cm土层土壤NO₃^--N的消减量分别为153.8、605.7和56.3 kg·hm^-²。3年休闲期后，第一季前茬休闲处理的黄瓜产量、生物量及吸氮量均最高，在产量、吸氮量上与其他处理差异显著；第二季、第三季，前茬休闲的产量、生物量和吸氮量与其他处理差异不显著；填闲作物的种植并没有对黄瓜产量造成影响，并且黄瓜收获后土壤NO₃^--N含量明显降低。氮素表观平衡中0—200 cm土层，甜玉米-黄瓜的氮素亏缺量较大，说明甜玉米能显著降低土壤NO₃^--N的残留。种植填闲作物能够达到经济效益和生态效益的双赢，甜玉米、苋菜与甜高粱可分别为农民带来39 467、497和16 522元/hm²的净收入。【结论】棚室菜田夏季种植填闲作物不仅可以消减土壤剖面根层NO₃^--N累积，而且对下茬黄瓜产量未造成显著影响，黄瓜收获后土壤NO₃^--N含量也会明显降低；在设施蔬菜轮作体系中引入填闲作物具有可行性，甜玉米为较佳的填闲作物。

中国主栽葡萄柚果肉酚类物质组成及其抗氧化活性

张桂伟，张秋云，江东，席万鹏，周志钦

中国农业科学. 2015, 48(9): 1785-1794. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.12

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【目的】对不同品种葡萄柚（Citrus paradis Macfad.）的酚类物质组成及其抗氧化能力进行比较研究，为柑橘育种及葡萄柚资源的利用提供科学依据。【方法】以中国主栽的9个葡萄柚品种为材料，使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）法检测分析各品种果肉酚类物质的组成、含量与分布情况，用自由基清除（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals, DPPH）、铁离子还原（ferricreducing antioxidant power, FRAP）和自由基抗氧化（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid, ABTS）3种方法对各品种果肉提取物的总抗氧化活性进行评价，并使用相关系数法分析抗氧化能力与多酚含量的相关性。【结果】结果表明，供试葡萄柚总酚含量变异范围为6.93—21.18 mg·g^-1 DW，‘四倍体马叙’葡萄柚的总酚含量最高；总黄酮含量变异范围为5.56—23.24 mg·g^-1 DW，‘四倍体马叙’的总黄酮含量最高。葡萄柚中的黄烷酮以柚皮苷和新橙皮苷为主，柚皮苷含量变异范围为1 180.58—3 065.33 μg·g^-1 DW，‘火焰’葡萄柚的柚皮苷含量最高，新橙皮苷含量变异范围为94.05—637.24 μg·g^-1 DW，‘鸡尾’葡萄柚的新橙皮苷含量最高。多甲氧基黄酮以橘皮素为主，其变异范围在0.56—4.66 μg·g^-1 DW之间，‘奥罗勃朗卡’的橘皮素含量最高。酚酸以没食子酸为主，其变异范围为60.42—385.53 μg·g^-1 DW，‘四倍体马叙’没食子酸含量最高。‘鸡尾’含有丰富的圣草次苷（111.23 μg·g^-1 DW），‘马叙’含有丰富的橙皮苷（130.90 μg·g^-1 DW），‘火焰’‘瑞红’‘四倍体马叙’和‘红马叙’含有丰富的没食子酸（＞300 μg·g^-1 DW），‘鸡尾’含有丰富的绿原酸、咖啡酸和阿魏酸。供试葡萄柚的综合抗氧化指数（an overall antioxidant potency composite index, APCI）变异范围大，在36.70—97.50之间，除‘奥罗勃朗卡’和‘鸡尾’外，其他葡萄柚的APCI都比较高（＞80）。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素、橘皮素和绿原酸与果实抗氧化能力呈显著的正相关关系。【结论】中国主栽的9个葡萄柚品种多酚含量丰富，变异范围大，具有明显的组成和含量特点。柚皮苷、橘皮素和没食子酸是中国主栽葡萄柚的主要多酚类物质，各品种间多酚类物质的含量差异较大，抗氧化能力也有明显差异。‘火焰’‘瑞红’‘四倍体马叙’和‘红马叙’是没食子酸的良好来源，而‘鸡尾’是绿原酸、咖啡酸和阿魏酸的良好来源。总体上，在这些供试葡萄柚品种中，‘粉红汤姆逊’‘马叙’‘火焰’‘瑞红’‘四倍体马叙’和‘红马叙’不仅多酚含量极其丰富，而且抗氧化能力也高，是具有良好开发前景的天然抗氧化剂和保健食品及生物药品基料。

基于SRAP标记的国兰种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建

唐源江，曹雯静，吴坤林

中国农业科学. 2015, 48(9): 1795-1806. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.13

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【目的】探究国兰种质资源遗传多样性水平，并构建分子指纹图谱及分子身份证，为在分子水平上鉴定国兰种质提供技术支撑，也为国兰种质资源开发、保存利用及种质创新奠定基础。【方法】以收集于华南及邻近地区的139份国兰栽培品种和野生种质为材料，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，由13条正向引物和16条反向引物随机组成208对SRAP引物，每对引物用品种‘宋梅’和‘大勋’扩增产物进行筛选；PCR扩增产物应用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳胶图进行人工读带，并计算多态性引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态性条带比率。按照Botstein公式计算多态信息含量；用POPGENE32软件计算观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数、Shannon’s信息指数，并进行遗传多样性分析。用NTSYS-pc2.10e软件UPGMA方法进行聚类分析，并计算遗传相似性系数。采用引物对组合的方法，构建139份国兰种质资源数字指纹图谱。【结果】从208对SRAP引物中共筛选出17对多态性好且重复性高的引物，对供试材料进行PCR扩增，共扩增出DNA条带489条，其中多态性谱带484条，多态性比率(PPB)为98.89%，观测等位基因数平均值为2.00，多态性信息含量平均值为0.94，每个位点的有效等位基因数平均值为1.49，Nei’s基因多样多样性指数平均值为0.30，Shannon信息指数平均值为0.45。UPGMA聚类分析表明，139份国兰种质资源的遗传相似系数变化范围为0.51—0.91。在相似系数为0.70时，可划分为6个类群。用SRAP多种引物组合方法可有效区分所有材料，并构建出139份国兰种质资源特异性分子身份证，置信概率达到99.99%。根据聚类结果可以将国兰种质分为４组：一为春兰组，由春兰种质单独构成；二为建墨兰组，主要由建兰和墨兰种质组成；三为寒蕙兰组，主要由寒兰、蕙兰和杂交系组成；四为剑莲兰组，由春剑和莲瓣兰种质组成。而四组之间剑莲兰组与寒蕙兰组亲缘关系最近，与建墨兰组次之，与春兰组亲缘关系较远。【结论】所试国兰种质具有较丰富的遗传多样性水平，基于17对SRAP引物组合所构建的139份国兰种质的分子身份识别体系具有唯一性和高效性，SRAP标记是在分子水平鉴定国兰种质的有效方法之一。

大米小包装储藏过程中脂类及微观结构的变化

王立峰，陈超，杨精华，陈静宜，汪海峰，鞠兴荣

中国农业科学. 2015, 48(9): 1807-1817. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.14

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【目的】由于胚乳失去保护，大米在储藏过程中易发生陈化、霉变等问题，致使其品质劣变甚至丧失食用价值。通过测定储藏过程中大米游离脂肪酸、总酸含量、脂肪酸组成和含量，观察大米横断面胚乳细胞、淀粉颗粒微观结构，探讨大米品质劣变原因，为大米储藏技术提供参考。【方法】以粳稻99号大米为对象，进行人工模拟储藏试验：采用编织袋、自然密闭缺氧、抽真空3种包装方式，置于温度为15、25和30℃（60%湿度）的人工气候箱中储藏180 d，每个月进行一次品质指标测定；测定大米储藏过程中脂肪酸值、总酸值的变化，利用气相色谱分析脂肪酸组成及含量变化，利用扫描电镜观察大米横断面胚乳细胞形态，探索脂类及横断面胚乳结构导致大米品质陈化的机理及品质劣变后淀粉颗粒微观形态的变化规律。【结果】①储藏过程中，编织袋及自然密闭缺氧包装的大米游离脂肪酸及总酸含量皆呈现急剧上升趋势，当品质劣变严重时两者含量反而下降；抽真空包装的大米游离脂肪酸及总酸含量均保持在较稳定的水平，且储藏温度对其含量影响不显著；②脂肪酸组成中含量最多的是亚油酸、油酸和棕榈酸，这3种脂肪酸含量占总脂肪90%以上。包装方式及储藏温度对各脂肪酸组成影响不同。除了花生酸（C20:0）及二十二烯酸（C22:1）外，其余脂肪酸受包装方式影响较大；而储藏温度仅与豆蔻酸（C14:0）和山嵛酸（C22:0）有显著性关系，对其余脂肪酸影响不大。脂肪酸变化规律符合：高不饱和脂肪酸含量随温度升高而降低，多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸间呈现显著负相关，具体表现为硬脂酸（C18:0）与亚油酸（C18:2）、亚麻酸（C18:3）；油酸（C18:1）与亚油酸、亚麻酸皆呈现明显的“此消彼长”现象。③新鲜大米淀粉粒以复粒形式存在，形状较大，表面有较厚的膜，排列整齐有序，两侧以片状的细胞间断面居多，放射状结构清晰可见。陈化加剧的大米胚乳细胞横断面结构松散无序，细胞内断面多于细胞间断面，横断面上可观测到“小孔”及一些分散在淀粉体周围的蛋白体和脂肪滴；细胞壁的完整性受到破坏致使复粒崩解并可见大量单粒细胞，一部分单淀粉粒形状近圆型，棱角较钝；细胞间的棱角模糊，放射状结构变得模糊甚至消失。【结论】编织袋及自然密闭缺氧包装的大米陈化劣变较为严重，储藏过程中其脂肪酸值、总酸值急剧上升后下降，胚乳表面光滑度变差、小孔数量及表面蛋白质膜的翘起变多，辐射状趋势渐渐消失。抽真空包装可以有效延缓大米品质劣变进程。

POMC在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位

马淑慧，李亚楠，赫晓燕，王海东，杨磊，董常生

中国农业科学. 2015, 48(9): 1818-1824. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.15

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【目的】对不同毛色绵羊皮肤中的阿黑皮素原（proopiomelanocortin，POMC）进行定位和表达差异分析，确定POMC与毛色形成的关系，进一步丰富有关哺乳动物毛色形成机制的理论知识。【方法】选取年龄相近的雄性黑色和白色成年绵羊各3只，用取皮器分别在臀部采集皮肤组织3块，对其中一块制作石蜡切片后采用免疫组织化学法确定POMC在不同绵羊皮肤中的定位，另两块置于液氮中冻存后分别提取皮肤总RNA和总蛋白，总RNA经反转录成cDNA后，经NCBI分析比对后设计POMC特异性PCR引物，采用QRT-PCR方法检测POMC基因在mRNA水平的表达差异；总蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，采用Western blotting方法加入POMC多克隆抗体检测POMC在蛋白水平的表达差异，得出的数据用SPSS19.0软件进行差异显著性分析，探讨POMC对毛色形成机制的调控作用。【结果】免疫组织化学结果显示POMC在黑色和白色绵羊皮肤中均有表达，且表达部位都位于毛囊根鞘周围和表皮的皮肤角质形成层细胞内；QRT-PCR结果显示POMC在黑色绵羊皮肤中mRNA的相对表达量为2.5004±0.2577^**，而在白色绵羊皮肤中POMC的mRNA的相对表达量为1.0032±0.0350，黑色绵羊皮肤中POMC的mRNA的相对表达量为白色绵羊皮肤的2.5倍，二者表达差异极显著（P＜0.01）；Western boltting结果显示黑色绵羊皮肤POMC蛋白水平相对表达量为1.5253±0.0426^*，而白色皮肤中POMC蛋白水平相对表达量为1.0005±0.0180，黑色皮肤POMC蛋白表达量是白色皮肤的1.55倍（P＜0.05），两者差异显著。【结论】试验表明POMC可在黑色和白色绵羊皮肤中正常表达，且其表达位置一致，但POMC在不同毛色绵羊皮肤组织中mRNA和蛋白的表达水平存在一定的差异，表明POMC的表达量变化会在一定程度上影响毛色的生成。

锌对5—15周龄鹅免疫、抗氧化功能、金属硫蛋白-Ⅰ基因表达量的影响及变量相关性分析

王宝维，陈苗璐，王秉翰，张名爱，葛文华，程凡升，岳斌

中国农业科学. 2015, 48(9): 1825-1835. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.16

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【目的】研究不同水平锌对5—15周龄鹅免疫抗氧化功能与金属硫蛋白-Ⅰ（MT-I ）mRNA表达量的影响及相互关系，以科学地确定鹅饲粮中锌的需要量。【方法】试验随机选用29日龄体重相近的青农灰鹅360只（P＜0.05），设计6个处理，每处理6次重复，每重复10只（公母各半）；各处理饲粮中锌水平分别为：27.46（Ⅰ组）、77.46（Ⅱ组）、127.46（Ⅲ组）、177.46（Ⅳ组）、227.46（Ⅴ组）、277.46 （Ⅵ组）mg·kg^-1（基础饲粮中含锌），试验进行11周。【结果】(1)胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数受饲粮中锌水平的影响，随锌水平的升高呈现先升高后降低趋势；当锌水平为127.46 mg·kg^-1时，胸腺指数最高（P＜0.05）；当锌水平为77.46 mg·kg^-1时，脾脏指数、法氏囊指数最高（P＜0.05）。(2)饲粮锌水平为177.46 mg·kg^-1时，鹅副黏病毒疫苗免疫后7日的抗体滴度最高（P＜0.05）；饲粮锌水平为157.41 mg·kg^-1时，鹅副黏病毒疫苗免疫后14日的抗体滴度最高（P＜0.05）。(3)当饲粮锌水平为153.84 mg·kg^-1时，鹅血清和肝脏总抗氧化能力（T-AOC）活性最高（P＜0.01）；当饲粮中含锌127.46 mg·kg^-1时，血清和肝脏过氧化氢酶（CAT）活性最高（P＜0.01）；当饲粮锌水平为148.33 mg·kg^-1时，鹅血清和肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性最高（P＜0.05）；当饲粮中含锌148.33 mg·kg^-1时，血清和肝脏铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性最高（P＜0.01）；当饲粮中锌水平为177.46 mg·kg^-1时，血清和肝脏中丙二醛（MDA）最低（P＜0.05）。(4)饲粮中锌能显著提高MT-I mRNA表达量（P＜0.05），当饲粮中锌水平为177.46 mg·kg^-1时，肝脏MT-I mRNA表达量最高（P＜0.01）。(5)肝脏中MT-I mRNA表达量与肝脏中T-AOC（r= 0.94）、CuZn-SOD（r= 0.97）活性指标呈极显著性正相关（P＜0.01），与CAT（r= 0.85）、GSH-Px（r= 0.89）活性呈显著正相关（P＜0.05），与MDA呈负相关（r= -0.70, P＞0.05）；肝脏中MT-I mRNA表达量与血清中T-AOC （r= 0.99）、CAT（r= 0.92）和CuZn-SOD（r= 0.94）活性均呈极显著正相关（P＜0.01），与GSH-Px呈正相关（r= 0.81, P＞0.05），与MDA呈负相关（r= -0.39, P＞0.05）。【结论】(1)饲粮中适宜水平锌能够促进鹅免疫器官发育，增强T-AOC、CAT、GSH-Px、CuZn-SOD抗氧化酶活性，降低MDA水平。(2)饲粮中锌能够干预肝脏MT-I mRNA表达量，从而调节机体抗氧化能力。(3)鹅饲粮中锌水平在77—150 mg·kg^-1范围内机体处于高位免疫和抗氧化状态。

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

王盛，谢芝勋，黄莉，谢丽基，邓显文，谢志勤，刘加波，罗思思，曾婷婷

中国农业科学. 2015, 48(9): 1836-1844. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.17

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【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据GenBank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列，设计特异引物扩增σ3基因，构建重组植物表达载体pBI121-σ3，热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，筛选含有重组质粒的pBI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草，卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物，PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数，以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因，通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应C_T值的标准曲线，通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】①通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确，表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体pBI121的花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子的下游，以NOS为终止子，含有卡那霉素抗性标记（NPT II）。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白，其大小约为61.6 ku；②在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L^-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染，100 mg·L^-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长；③随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp；④内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143，σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265，两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4，阴性对照没有扩增。⑤Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达，目的条带大小约为61.6 kD，与预计大小一致；σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应，表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体pBI121-σ3，筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草，σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性，为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。

蚕用益生芽孢杆菌SWL-19的筛选鉴定及其对肠道菌群多样性的影响

李冠楠，夏雪娟，SENDEGEYA Parfait，何石宝，郭东东，朱勇

中国农业科学. 2015, 48(9): 1845-1853. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.18

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【目的】筛选对家蚕（Bombyx mori）具有益生作用的芽孢杆菌，改善家蚕肠道微环境，促进蚕业生产的发展。【方法】采用高温选育法对家蚕肠道内的芽孢杆菌进行初筛；以产胞外消化酶（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶）及能在肠道定殖为基础，结合溶血试验、抗生素药敏试验和产消化酶能力大小等对芽孢杆菌进行复筛。通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种，再利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术检测其在家蚕肠道内定殖情况及其对肠道内微生物菌群多样性的影响。【结果】共从57株细菌中筛选出两株能同时产蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶且不产生溶血现象的芽孢杆菌SWL-17和SWL-19。14种抗生素药敏纸片检测结果表明，二者对绝大多数抗生素敏感，且敏感程度基本相同。除SWL-19不能利用蔗糖发酵外，两个株菌的革兰氏染色、芽孢染色、产酸产气、柠檬酸利用、葡萄糖发酵、硝酸盐还原和V-P等生理生化特性均相同。二者生长速度相同，但菌落形态特征差异较大。SWL-17的菌落形态为淡黄色，圆形隆起，表面光滑湿润，边缘整齐，而SWL-19的菌落形态为乳白色不透明，表面扁平干燥，边缘不整齐。SWL-17产蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的能力分别为（1.62±0.04）、（2.12±0.11）、（1.87±0.03）和（1.43±0.03），SWL-19的产酶能力分别为（2.91±0.05）、（2.43±0.04）、（3.24±0.12）和（3.48±0.10）。因此SWL-19具有较高的产消化酶能力，且除脂肪酶外，其产蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的能力均显著性高于SWL-17（P＜0.05）。细菌16S rDNA序列比对和系统发育分析表明SWL-17和SWL-19分别为芽孢杆菌（Bacillus sp.）和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，且SWL-19具有更清楚的遗传背景，适于进行后续试验。进一步DGGE试验结果表明，自然条件下家蚕肠道内的优势菌群为肠球菌属(Enterococcus)细菌，而外源性添加菌株SWL-19后能使家蚕肠道内的芽孢杆菌属和肠杆菌属细菌成为优势菌群，说明芽孢杆菌SWL-19能在家蚕肠道内定殖，并且能改变家蚕肠道内微生物菌群的结构和多样性。【结论】家蚕益生芽孢杆菌的筛选为研发蚕用复合微生态制剂提供菌株资源，在蚕业生产上具有重要的应用价值。

基于顺序GISH-FISH花生栽培种的染色体分析

杜培，刘华，李丽娜，秦利，张忠信，黄冰艳，董文召，汤丰收，亓增军，张新友

中国农业科学. 2015, 48(9): 1854-1863. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.19

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【目的】针对花生染色体较小，染色体细胞学标记少，细胞遗传研究相对滞后，染色体分类识别困难的问题，建立能够准确区分栽培花生（Arachis hypogaea L.，2n=4x=40，AABB）A、B染色体组的新核型，提高染色体识别准确率，以揭示栽培花生和野生供体亲本的染色体对应关系，鉴定栽培种花生染色体结构变异体。【方法】以花生栽培种（Arachis hypogaea L.，2n=4x=40，AABB）的2个可能供体亲本即花生野生种Arachis duranensis（2n=2x=20，BB）和Arachis ipaënsis（2n=2x=20，AA）全基因组DNA及5S rDNA和45S rDNA为探针，利用顺序基因组荧光原位杂交（GISH）和多色荧光原位杂交（McFISH）技术（简称顺序GISH-FISH）结合DAPI染色，在准确区分花生栽培种A、B染色体组的基础上，对花生栽培品种Z5163及其供体亲本染色体进行分析，建立花生栽培种新核型，并利用该核型对其他栽培品种的染色体进行分析，以探讨该核型的应用潜力和栽培花生染色体组成特点。【结果】以A. ipaënsis和A.duranensis全基因组DNA为探针的GISH分析表明，以A. ipaënsis为探针在花生栽培种20条B组染色体上能够产生清晰稳定的杂交信号，在A组染色体上没有信号，而以A.duranensis为探针，只在18条A组染色体能产生信号，但1对A组的小染色体“A染色体”不易被区分，因此，以A. ipaënsis为探针可以准确区分花生栽培种A、B染色体组；综合5S rDNA和45S rDNA Mc-FISH和DAPI染色分析，发现花生栽培种A、B染色体组DAPI带纹、5S rDNA和45S rDNA的分布分别与A.duranensis和A. ipaënsis一致，此结果支持A.duranensis和A.ipaënsis是花生栽培种的供体亲本。DAPI染色结果显示，A. ipaënsis及花生栽培种的B组染色体均有14条染色体显示着丝粒带纹，明显多于前人报道，表明仅利用DAPI染色来区分花生栽培种A、B组染色体的方法具有局限性。综合DAPI染色、rDNA、A.duranensis和A. ipaënsis基因组探针进行顺序GISH-FISH分析，建立了可以准确识别花生栽培种A、B染色体组新核型。然后利用该核型对3个栽培种品种的染色体组成进行了分析，首次发现一个自发的花生染色体代换系MS B1（A1），揭示了栽培花生染色体B1与A1之间存在部分同源关系。【结论】野生花生A. duranensis和A. ipaënsis分别与栽培花生A和B基因组染色体间具有很好的对应关系；研究建立的基于GISH-FISH和DAPI染色的栽培花生新核型，不但可以准确区分大部分A、B组染色体，而且还能识别栽培花生在多倍体化和人工进化过程中可能存在的自发的染色体变异，揭示A、B组染色体间的部分同源性。

不同抗倒性甜荞茎秆木质素合成关键酶基因的表达分析

胡丹，刘星贝，汪灿，杨浩，李鹤鑫，阮仁武，袁晓辉，易泽林

中国农业科学. 2015, 48(9): 1864-1872. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.09.20

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【目的】测定不同抗倒伏能力甜荞品种在不同时期的茎秆木质素含量及其相关合成酶基因表达量，探讨甜荞茎秆木质素合成积累的关键时期及其关键酶基因，为甜荞抗倒伏育种提供理论依据。【方法】用简并引物扩增得到基因CAD、CCR、F5H、COMT和CCOAOMT的部分CDS序列，在NCBI数据库中进行比对分析；用紫外分光光度法测定4个不同抗倒性甜荞品种在分枝期、盛花期和乳熟期茎秆基部第2节间木质素含量；用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析木质素合成途径中9个相关基因PAL、4CL、C4H、C3H、CAD、CCR、F5H、COMT和CCOAOMT的表达，用2^-^△△CT法计算其相对表达量。用Microsoft Excel 2003整理数据和作图，用SPSS 19软件进行方差分析和相关性分析。【结果】扩增得到CAD、CCR、F5H、COMT和CCOAOMT的CDS序列可用于设计后续荧光定量引物。甜荞茎秆木质素含量从分枝期到乳熟期逐渐增加，不同抗倒性品种间，高抗倒伏品种木质素含量在各个时期均显著高于易倒伏品种。基因PAL、4CL、C4H和CCR表达量在品种间和时期间均差异显著或极显著，CCOAOMT在品种间不显著，时期间显著，F5H在品种间差异显著，时期间不显著，C3H、CAD和COMT在品种和时期间差异均不显著。从分枝期到乳熟期，各品种的PAL、4CL、C4H、CAD、CCOAOMT、F5H和CCR表达量均先增后减，在盛花期达最大值，高抗倒伏品种表达量显著高于易倒伏品种；从分枝期到盛花期COMT表达量逐渐下降，易倒伏品种表达量显著高于高抗倒伏品种，乳熟期高抗倒伏品种显著高于易倒伏品种；从分枝期到乳熟期C3H表达量无明显变化规律。木质素含量与PAL、4CL、C4H、CCOAOMT、CAD和CCR基因表达量呈显著正相关，与C3H呈负相关，与COMT在分枝期和盛花期呈负相关，乳熟期呈正相关，与F5H呈正相关。【结论】木质素含量与甜荞茎秆倒伏密切相关，抗倒伏能力强的甜荞品种其茎秆木质素含量高；盛花期是甜荞茎秆木质素合成积累的关键时期；PAL、4CL、C4H、CAD、CCOAOMT和CCR是甜荞茎秆木质素合成的关键酶基因。

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