中国农业科学

基因组编辑技术及其安全管理

沈平，章秋艳，杨立桃，张丽，李文龙，梁晋刚，李夏莹，王颢潜，沈晓玲，宋贵文

中国农业科学. 2017, 50(8): 1361-1369. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.001

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基因组编辑技术利用核酸酶对生物体内的DNA双链进行断裂，并以非同源末端连接或同源重组的方式对基因组DNA特定位点进行突变、缺失或者基因的插入与替换。锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、成簇规律间隔短回文重复序列是目前基因组编辑技术应用中的3种关键核酸酶。基因组编辑技术已在植物基因功能、育种等领域广泛应用，特别是基于成簇规律间隔短回文重复序列的基因编辑技术CRISPR-Cas9。具有优良性状的基因组编辑大豆、玉米等产品已逐步从实验室走向田间，基因组编辑作物展现了较传统转基因作物更为优越的应用前景。本文简要概述了主要使用的3种基因组编辑技术及其原理。对这些技术的优缺点进行了分析，并依据物种分类梳理了利用上述3种技术在动物、植物中突变体建立、基因功能研究、分子育种等方面的研究进展。同时，针对基因编辑产物的产业化应用前景，讨论了基因编辑技术及其产品较传统转基因技术产品的优势，分析了基因编辑技术及其产品可能因脱靶效应而引发的生物安全风险,介绍了美国、欧盟等国家对基因编辑技术及其产品安全管理和商业化应用的政策。文章结合中国现行法规对转基因生物的定义及安全评价（实质等同、个案分析）原则，讨论了基因编辑技术及其产品的安全管理，初步提出了基于传统转基因生物安全评价框架的基因编辑产品的安全评价和管理思路。针对基因编辑产品需要按照个案原则进行评价和管理，安全评价重点开展分子特征及食用安全评价；同时需要针对基因编辑技术的特点建立更加有效、特异的检测新方法，实现对基因编辑产品的有效监测，以促进基因组编辑产品的商业化应用。

小麦TaLox-B等位变异对脂肪氧化酶活性和面粉色泽的影响

张福彦，陈锋，程仲杰，杨保安，范家霖，陈晓杰，张建伟，陈云堂，崔龙

中国农业科学. 2017, 50(8): 1370-1377. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.002

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【目的】小麦籽粒脂肪氧化酶（Lox）与面粉色泽密切相关，研究TaLox-B位点上的不同等位变异类型对Lox活性和面粉色泽的影响，为面粉色泽的改良和相关的品质育种工作提供参考依据。【方法】选用122份河南小麦品种（系）为试验材料，用紫外分光光度计和色差仪分别测定其Lox活性和面粉色泽，并利用控制脂肪氧化酶活性位于4BS上的TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位点上的功能标记Lox16、Lox18和Lox-B23对参试材料的Lox基因型进行鉴定。【结果】不同品种间Lox活性及其色泽性状差异达到极显著水平。基因型鉴定结果表明，参试材料的TaLox-B1位点存在TaLox-B1a和TaLox-B1b两种等位变异，所占比例分别为63.9%和39.1%，TaLox-B2位点存在TaLox-B2a和TaLox-B2b两种等位变异，所占比例分别为57.4%和42.6%，TaLox-B3位点也存在TaLox-B3a和TaLox-B3b两种等位变异，所占比例分别为41.8%和48.2%。分析其基因型组合发现，参试材料中共有6种基因型组合类型，依次为TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b、TaLox-B1a/TaLox-B2b/ TaLox-B3b、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b和TaLox-B1b/TaLox-B2b/ TaLox-B3b，所占比例分别为41.8%、15.6%、6.6%、28.7%、5.7%和1.6%。分析不同TaLox-B位点基因与Lox活性及红度（a*值）、黄度（b*值）、亮度（L*值）、白度（Wht值）等面粉色泽性状的关系表明，单基因等位变异对Lox活性和面粉色泽的影响不同，3个基因等位变异a*值差异均不显著，对Lox活性的效应，TaLox-B2a高于TaLox-B2b（P＜0.05），TaLox-B3a高于TaLox-B3b（P＜0.01），TaLox-B2a基因型的Wht值低于TaLox-B2b基因型（P＜0.01），TaLox-B3a基因型的Wht值也低于TaLox-B3b基因型（P＜0.05）。说明TaLox-B2和TaLox-B3对Lox活性和面粉色泽具有重要影响。进一步分析发现，拥有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型组合的小麦品种（系）的Lox活性和b*值最高，a*值和Wht值最低，而TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b基因型组合的小麦品种（系）的L*值、a*值和Wht值最高，其Lox活性和b*值最低。【结论】河南小麦中所发现的6种不同Lox基因型组合中，拥有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型组合的小麦品种（系）的Lox活性相对较高，Wht值相对较低（P＜0.05），而拥有TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b基因型组合的小麦品种（系）的Lox活性相对较低，Wht值相对较高（P＜0.05）。Lox活性的遗传控制在面粉色泽品质改良进程中发挥着关键作用。

拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型分析

董磊，董晴，张文利，胡晓龙，王洪刚，王玉海

中国农业科学. 2017, 50(8): 1378-1387. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.003

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【目的】建立拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型，分析明确不同来源拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型特点，比较不同拟斯卑尔脱山羊草及其与普通小麦的FISH核型差异。【方法】以荧光标记的寡核苷酸Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针，利用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术分析pTa535和pSc119.2在不同拟斯卑尔脱山羊草、四倍体小麦和普通小麦染色体上的杂交信号分布特点；以禾本科植物着丝粒专化寡核苷酸Oligo-CCS1为探针，明确拟斯卑尔脱山羊草的着丝粒位置，测量拟斯卑尔脱山羊草染色体相关参数；通过FISH核型比较明确不同拟斯卑尔脱山羊草及其与小麦核型的多态性差异。【结果】Oligo-pTa535主要分布在小麦的D和A组染色体上，在小麦的B组染色体上仅有零星分布，在5份拟斯卑尔脱山羊草的染色体中未显示Oligo-pTa535杂交信号。Oligo-pSc119.2杂交信号主要分布在小麦的B组染色体上，在小麦的A、D组染色体中分布较少，但在5份拟斯卑尔脱山羊草染色体上均有广泛分布。根据Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2杂交信号在小麦染色体上的分布特点，可以将小麦的不同染色体相互区分开来。Oligo-pSc119.2杂交信号在不同倍性、不同品种的小麦B组染色体上的分布特点基本相似，而不同来源拟斯卑尔脱山羊草的Oligo-pSc119.2的FISH核型差异较大，甚至在同一细胞内的2条同源染色体上Oligo-pSc119.2杂交信号的分布也具有明显差异。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草与小麦B染色体组的FISH核型存在明显差异。PI542238的7对染色体均为中间着丝粒染色体，核型公式为2n=14=14m。其余4份拟斯卑尔脱山羊草的4S染色体均为近中着丝粒染色体，其余染色体均为中间着丝粒染色体，核型公式皆为2n=14=12m+2sm。【结论】拟斯卑尔脱山羊草染色体上含有丰富的与pSc119.2高度同源的重复序列，不含有与pTa535高度同源的重复序列。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草之间以及同一来源的拟斯卑尔脱山羊草的个体间甚至同一个体内的同源染色体间在pSc119.2的分布上均具有遗传多样性。以Oligo-pSc119.2为探针建立的拟斯卑尔脱山羊草染色体FISH核型与小麦B组染色体的核型具有显著差异。利用荧光标记的Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针进行FISH分析，可以准确区分拟斯卑尔脱山羊草的不同染色体，并能将拟斯卑尔脱山羊草与小麦的染色体区分开来。

酒用糯高粱资源成株期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选

汪灿，周棱波，张国兵，徐燕，张立异，高旭，高杰，姜讷，邵明波

中国农业科学. 2017, 50(8): 1388-1402. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.004

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【目的】干旱是影响酒用糯高粱生产的主要因素之一，鉴定酒用糯高粱资源成株期的抗旱性，筛选抗旱指标，培育抗旱品种，对高粱产业的发展具有重要意义。【方法】以50份酒用糯高粱资源为材料，于2015年和2016年设置正常灌水和干旱胁迫2个处理在旱棚内进行田间试验，测定株高、穗长、茎粗、分蘖数、穗粒数、千粒重、单株粒重和产量，采用抗旱性度量值（D值）、综合抗旱系数（CDC值）、加权抗旱系数（WDC）、相关分析、频次分析、主成分分析、灰色关联度分析、隶属函数分析、聚类分析和逐步回归分析相结合的方法，对其进行成株期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选。【结果】干旱胁迫对各指标均有极显著影响。相关分析表明，产量与分蘖数、穗粒数和单株粒重呈极显著正相关，与穗长、茎粗和千粒重呈显著正相关，与株高呈不显著的正相关。频次分析表明，各指标对干旱胁迫反应的敏感程度依次为产量、穗粒数、分蘖数、单株粒重、千粒重、茎粗、穗长和株高。主成分分析表明，5个主成分可代表酒用糯高粱抗旱性84.26%的原始数据信息量。基于D值、CDC值和WDC值的供试酒用糯高粱材料抗旱性排序相近。灰色关联度分析表明，各指标DC值与D值间的关联度大小依次为产量、分蘖数、穗粒数、单株粒重、千粒重、穗长、茎粗和株高，这与各指标DC值与WDC值的密切程度基本吻合。根据D值进行聚类分析，可将供试酒用糯高粱材料划分为5个抗旱级别，其中Ⅰ级2份、Ⅱ级16份、Ⅲ级28份、Ⅳ级2份、Ⅴ级2份。除茎粗和分蘖数外，其余指标的隶属函数值、CDC值、D值和WDC值均随抗旱级别的升高而增大。逐步回归分析表明，与D值密切相关的指标有分蘖数、穗粒数和单株粒重。【结论】干旱胁迫对酒用糯高粱资源成株期各指标均有极显著影响。确定了D值为适宜的抗旱性鉴定方法。筛选出成株期抗旱性强的酒用糯高粱材料分别为粱丰141-3和粱丰247-3，可为酒用糯高粱抗旱育种、抗旱机理及干旱调控缓解机制的研究提供基础材料。分蘖数、穗粒数和单株粒重可作为酒用糯高粱资源成株期简单、直观的抗旱性评价指标。

江西双季晚稻不同纬度产量、生育期及温光资源利用的差异

陈波，周年兵，郭保卫，舒鹏，张洪程，霍中洋，程飞虎，花劲，黄大山，陈忠平，陈恒，刘云发，廖世亮

中国农业科学. 2017, 50(8): 1403-1415. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.005

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【目的】研究明确江西不同纬度不同类型双季晚稻产量、生育期及温光资源利用差异，为江西双季晚稻适宜粳稻品种的科学选用提供依据与参考。【方法】以籼粳杂交稻、杂交粳稻、常规粳稻、杂交籼稻（CK）4种类型品种为材料，在江西乐平市（29.00°N， 117.12°E）、上高县（28.27°N， 115.12°E）、赣州市（25.81°N， 114.96°E）3个试验点进行试验，比较研究双季晚稻不同类型品种在纬度上的产量、生育期及温光资源利用的差异特征。【结果】随着纬度升高，3种类型粳稻产量均增加，2013年（2014年）平均纬度每增加1°，籼粳杂交稻、杂交粳稻、常规粳稻分别增产0.36（0.32）、0.18（0.22）、0.25（0.20）t·hm-2。同一纬度下，除赣州试验点杂交粳稻与常规粳稻的产量低于杂交籼稻外，其余各点均表现为籼粳杂交稻、杂交粳稻与常规粳稻产量显著高于杂交籼稻。各试验点3种类型粳稻均能安全成熟，随着纬度升高，各类型水稻播种至拔节期显著延长，全生育期天数增加；同一试验点3种类型粳稻全生育期均极显著长于杂交籼稻，主要表现在抽穗至成熟期天数的增加。3种类型粳稻光照与积温及其利用效率表现为籼粳杂交稻＞杂交粳稻＞常规粳稻＞杂交籼稻，在安全成熟条件下，双季晚稻生育期越长，温光资源利用率越高。【结论】江西不同纬度地区实行双季晚稻“籼改粳”，可显著提高当地温光资源利用率与稻谷产量。与大面积种植的籼型杂交稻相比，在乐平与上高地区选种籼粳杂交稻、杂交粳稻与常规粳稻均具有显著的产量及温光资源利用优势；在赣州地区选种籼粳杂交稻的优势明显。双季晚稻“籼改粳”可能是提高双季稻区水稻产量的现实途径之一。

测墒补灌对2个小麦品种旗叶叶绿素荧光及衰老特性的影响

闫丽霞，于振文，石玉，赵俊晔，张永丽

中国农业科学. 2017, 50(8): 1416-1429. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.006

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【目的】探讨测墒补灌和定量灌溉对2个小麦品种旗叶叶绿素荧光、衰老特性及籽粒产量的影响，为小麦节水高产提供理论依据。【方法】于2013—2015两年度，在大田条件下，选用泰农18（T18）和济麦22（J22）2个小麦品种，设置3个水分处理：W0（全生育期不灌水）、W1（依据0—40 cm土层土壤相对含水量进行测墒补灌，拔节期和开花期目标土壤相对含水量均为65%）、W2（定量灌溉，拔节期和开花期分别灌溉60 mm），研究测墒补灌和定量灌溉对2个小麦品种旗叶叶绿素荧光特性及衰老特性的影响。【结果】W1处理通过调节拔节期和开花期灌水量，保持灌水后0—40 cm土层土壤相对含水量在65%，可防止灌水过多或过少，为小麦生长发育创造适宜的土壤水分环境。W1处理条件下，两小麦品种开花后14、21和28 d的旗叶电子传递速率、光化学猝灭系数、PSⅡ实际光化学效率及旗叶蔗糖含量均显著高于W2处理，磷酸蔗糖合成酶活性在花后14和21 d显著高于W2处理；两小麦品种开花后14、21和28 d的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性均显著高于W2，但同期旗叶丙二醛含量显著低于W2并保持较高的旗叶可溶性蛋白含量。两年度T18和J22两品种W1处理的籽粒产量、水分利用效率和灌溉效益均显著高于W2。品种间比较可知，T18两灌水处理的旗叶电子传递速率、光化学猝灭系数、PSⅡ实际光化学效率及旗叶蔗糖含量在花后21和28 d均显著高于J22，磷酸蔗糖合成酶活性在花后7、14和21 d亦显著高于J22；T18开花后21和28 d的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性、可溶性蛋白含量均显著高于J22，但同期旗叶丙二醛含量显著低于J22。同一年度同一处理条件下，T18和J20总耗水量和水分利用效率均无显著差异；在W0处理条件下，J22的籽粒产量显著高于T18；但在W1和W2处理条件下，T18的籽粒产量、灌溉效益均显著高于J22。【结论】在小麦拔节期和开花期依据0—40 cm土层土壤相对含水量进行测墒补灌至65%土壤相对含水量，是两小麦品种同步实现高产与节水的有效措施。在灌溉条件下T18的产量潜力高于J22，但在干旱条件下，其对水分敏感，致使产量低于J22。

苹果炭疽叶枯病菌GcAP1复合体β亚基基因的克隆及功能分析

张俊祥，冀志蕊，王娜，徐成楠，迟福梅，周宗山

中国农业科学. 2017, 50(8): 1430-1439. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.007

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【目的】明确衔接蛋白（adaptor protein）GcAP1复合体β亚基在苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)生长发育和致病过程中的功能，检测GcAP1β在该菌中的时空表达模式，并揭示其是否调控多聚半乳糖醛酸内切酶（endopolygalacturonase）基因CgPG1和CgPG2、果胶裂解酶（pectin lyase）基因pnl-1和pnl-2以及果胶酸酯裂解酶（pectate lyase）基因pelA和pelB的表达，为深入开展苹果炭疽叶枯病菌衔接蛋白在致病信号传导途径中的分子机制研究打下基础。【方法】通过构建GcAP1β基因敲除载体和GcAP1β-gfp融合表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化技术（ATMT）获得Δgcap1β突变体和GcAP1β恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β，并由RT-PCR和Southern杂交分析进行鉴定。以野生型菌株W16为对照，对Δgcap1β突变体和GcAP1β恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β的生长速度、产孢能力、分生孢子萌发率及附着胞形成率和致病性进行测定。利用生物信息学软件ProtComp 9.0和TMHMM对GcAP1β蛋白进行结构分析，并结合GcAP1β-GFP信号观测，进行GcAP1β的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术，检测GcAP1β在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵染阶段的表达量，并检测CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在野生型菌株和Δgcap1β突变体中的表达量。【结果】GcAP1β基因全长2 321 bp，含有3个内含子，编码720个氨基酸。与野生型菌株W16相比，Δgcap1β突变体菌落成褶皱状，菌丝生长速度明显减慢，而分生孢子产量、分生孢子萌发率、附着胞形成率无显著差异。Δgcap1β致病力明显降低，仅在苹果叶片上引起极小的点状斑。GcAP1β基因恢复菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修复了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷。荧光检测显示，融合蛋白GcAP1β-GFP分布于细胞质中。qRT-PCR检测结果表明，GcAP1β在苹果炭疽叶枯病菌各个发育阶段都有表达，且在侵染后表达量相对最高。GcAP1β的缺失导致CgPG1表达量降低至20.3%，CgPG2表达量降低至16.5%，pnl-1表达量降低至8.2%，pnl-2表达量降低至14.4%，pelA表达量降低至4.4%，pelB表达量降至0.8%。【结论】衔接蛋白GcAP1复合体分布于细胞质中，是苹果炭疽叶枯病菌生长发育所需要的；GcAP1调控CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表达，是苹果炭疽叶枯病菌一个重要的毒力因子。

氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾主要解毒酶活性与生长繁殖的影响

陈羿渠,向兴,贡常委,王学贵

中国农业科学. 2017, 50(8): 1440-1451. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.008

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【目的】甜菜夜蛾（Spodoptera exigua)是一种杂食性害虫，在不同环境、药物等选择压力下表现出不同的生长发育特点。氯虫苯甲酰胺是一种新型广谱的鱼尼丁受体杀虫剂，对鳞翅目害虫杀虫活性强。本研究旨在探究氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾幼虫3种主要解毒酶——羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFOs)活性以及对种群繁殖的影响。【方法】采用饲料混毒法测定氯虫苯甲酰胺对SE-Lab品系、SE-Sel品系的毒力，SE-Sel品系由SE-Lab品系经亚致死剂量LC25连续汰选6代得到；通过浸叶法测定磷酸三苯酯（TPP）、顺丁烯二酸二乙酯（DEM）、胡椒基丁醚（PBO）3种酶抑制剂与氯虫苯甲酰胺协同对SE-Lab和SE-Sel品系的毒力增效作用，提前12 h让试虫取食浸渍过酶抑制剂的叶片，对照组取食用0.1% TritonX-100浸渍后的叶片，再分别测定氯虫苯甲酰胺对使用酶抑制剂与未使用酶抑制剂试虫的毒力；在冰上解剖试虫的中肠和脂肪体，并通过离体酶活性测定，分析氯虫苯甲酰胺亚致死剂量与酶抑制剂对甜菜夜蛾体内的3种代谢解毒酶活力的影响；通过记录试虫各个年龄阶段的生长、死亡、产卵量等数据，参照两性生命表理论分析SE-Lab和SE-Sel品系的两性生命表参数差异。【结果】在3种酶抑制剂中PBO增效作用最强，其对甜菜夜蛾SE-Sel品系和SE-Lab品系对氯虫苯甲酰胺的毒力增效比分别为1.58和1.69。在氯虫苯甲酰胺亚致死剂量连续汰选下，甜菜夜蛾体内3种解毒酶活性均被诱导上升，其中MFOs酶活力上升最显著，SE-Sel品系中肠和脂肪体的MFOs活性相对于SE-Lab品系分别提高了2.07和2.10倍，而经氯虫苯甲酰胺亚致死剂量再次诱导的SE-Sel试虫的MFOs活性亦较SE-Lab品系上升4.02和3.44倍；在使用了酶抑制剂后3种解毒酶酶活力均有下降，其中MFOs活性下降最多，其酶比活力仅为未使用酶抑制剂处理的42.3%—44.8%。与SE-Lab品系相比，SE-Sel品系成虫的产卵前期和总产卵前期变长，而产卵量减少；SE-Sel品系的内禀增长率（r）、周限增长率(λ)和净增殖率(R₀)均显著小于SE-Lab品系，SE-Lab品系与SE-Sel品系的r分别为0.18和0.16 d^-1,λ为1.20和1.17 d^-1, R₀为358.42和203.12 d^-1。尽管SE-Sel品系的平均世代周期（T）更长，但是与SE-Lab品系无显著差异。【结论】MFOs可能为甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺解毒代谢过程中的主要解毒酶，在其后续抗性形成中起主要作用；甜菜夜蛾在氯虫苯甲酰胺亚致死剂量作用下，世代周期延长，繁殖力降低，种群增长减缓，氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾有持续控制作用。

山东省辣椒炭疽病病原菌的鉴定及高效防治药剂的筛选

高杨杨，禾丽菲，李北兴，林琎，慕卫，刘峰

中国农业科学. 2017, 50(8): 1452-1464. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.009

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【目的】明确山东省露地辣椒主产区炭疽病致病菌的种类，评价不同药剂对致病菌的毒力和活体接种防效，筛选高效防治药剂。【方法】从山东省菏泽、济宁等5个辣椒主产区采集感炭疽病的辣椒果实，经分离、纯化培养后，观察菌落及分生孢子的形态、大小和病原菌的致病性，利用真菌通用引物ITS4和ITS5对4个典型代表菌株的rDNA-ITS进行扩增，对扩增产物进行回收和测序，并利用MEGA 5.1软件进行基于病原菌的rDNA-ITS序列和GenBank中相关炭疽菌序列的系统发育树构建，确定病原菌的种类。采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定11种杀菌剂对辣椒炭疽病菌的毒力，通过活体接种试验验证药剂对辣椒炭疽病的防效。【结果】分离得到的27个菌株形态特征相同，气生菌丝较发达，初呈白色，而后逐渐变为浅灰色，分生孢子无色单胞，椭圆形，一端稍尖，大小为（7.48—14.69）μm×（2.52—5.64）μm。将所分离得到的菌株接种于刺伤果实或无伤口果实，两者均可发病，但刺伤果实上病斑发展快。病菌既侵染未成熟的辣椒果实，也侵染成熟的果实，病斑呈椭圆形凹陷，表面有橘黄色的分生孢子团。所选取的4个代表性菌株的rDNA-ITS序列的长度为562、541、557和553 bp，通过系统进化树分析，4个代表菌株与炭疽菌属尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）聚在同一分支上，亲缘关系置信度为100%。室内毒力测定试验表明，吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑对尖孢炭疽菌的菌丝生长和孢子萌发均具有较高的抑制活性。活体接种试验表明，吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑对辣椒炭疽病具有较好的预防和治疗作用，在浓度为400 μg·mL-1时，对辣椒炭疽病的预防效果和治疗效果均大于60%，高于对照药剂嘧菌酯的防效。【结论】引起山东省露地辣椒主产区辣椒炭疽病的致病菌为尖孢炭疽菌。吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑对该菌具有较高的毒力和活体防效，在辣椒炭疽病的田间防治中具有较大的应用潜力。

土壤水与有机质对高光谱的作用及交互作用规律

尚璇，李西灿，徐邮邮，刘莎莎

中国农业科学. 2017, 50(8): 1465-1475. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.010

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【目的】定量揭示土壤水分与有机质对高光谱的作用规律，为提高土壤水分、有机质的光谱估测精度提供基础。【方法】以山东省泰安市岱岳区90个棕壤土样为研究对象，进行室外光谱采集、室内土壤水分和有机质测定，运用Savitzky-Golay filter对光谱曲线进行平滑去噪预处理。根据含水量、有机质含量的高低将土壤样本分为9组，运用比较法对9组原始光谱数据进行分析，初步探究土壤水、有机质对光谱的作用规律。然后采用相关分析法，分析水、有机质与土壤原始光谱反射率（raw spectral reflectance，R）、光谱一阶微分变换（first order differential reflectance，D（R））以及分组光谱的相关性。在假定其他影响因素基本相同的条件下，利用有交互作用的双因素方差分析法，定量分析水、有机质对土壤光谱反射率、光谱一阶微分的作用程度及其交互作用。根据土壤水与有机质的交互作用规律，按相关系数较大而交互作用小的原则选取特征因子，采取偏最小二乘回归模型建立土壤有机质含量的高光谱估测模型，分析依据两者交互作用规律选取的因子对提高光谱估测模型精度的有效性。【结果】在田间持水量范围内，水对土壤光谱反射率影响起主要作用；水与有机质对土壤光谱客观存在交互作用，当土壤含水量小于10%时，600—1 800 nm的原始光谱能较好反映有机质的作用，而当土壤含水量大于15%时，有机质的作用几乎被水的作用所掩盖。水、有机质对土壤原始光谱的作用及其交互作用分别在360—1 800，410—1 800，509—1 800 nm达到显著水平，且三者均在1 951—2 450 nm达到显著水平（α=0.05）；对土壤光谱的作用程度由大到小依次为：水、有机质、交互作用；在425—1 800 nm水对土壤光谱的作用大约是有机质的5—8倍，在1 950—2 300 nm为8—12倍；在350—2 500 nm有机质对土壤光谱的作用大约是水与有机质交互作用的2倍。光谱经一阶微分变换之后，在450—530、600—790、1 019—1 027、2 000—2 020以及2 045—2 075 nm土壤水的作用增强，而在其他波段处减弱；土壤有机质的作用在471—824、851—949、967—1 140、1 172—1 340、1 379—1 428、1 450—1 770、1 953—2 122、2 174—2 199以及2 271—2 342 nm处得到增强，而在其他波段处减弱。水与有机质的交互作用也在不同波段处有所变化，但相对于土壤水与有机质的作用变化幅度而言是相对减弱的。基于土壤水与有机质的交互作用规律选取的特征因子，所建立的土壤有机质高光谱估测模型精度有所提高，其中16个检验样本的决定系数R2由不考虑交互作用的0.6764提高到0.7934。【结论】研究表明，在反演土壤含水量时，可以不考虑有机质对光谱的影响；而在反演有机质含量时，必须要剔除水对反射率的影响，还要考虑水与有机质对光谱的交互作用。考虑水与有机质对土壤光谱的交互作用，可有效提高土壤有机质的光谱估测精度。

基础地力对黄壤区粮油高产、稳产和可持续生产的影响

黄兴成，石孝均，李渝，张雅蓉，刘彦伶，张文安，蒋太明

中国农业科学. 2017, 50(8): 1476-1485. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.011

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【目的】黄壤是中国重要的地带性土壤，黄壤区粮油作物的高产、稳产和可持续生产对于地区粮食安全和经济民生至关重要。研究黄壤区主要粮油作物基础地力特征，评价地力对粮油作物高产、稳产和可持续生产的影响，为黄壤耕地地力保育和区域作物绿色生产提供依据。【方法】依托于2006—2013年测土配方施肥项目在黄壤区开展的3 515个田间试验（马铃薯434个、油菜525个、玉米1 318个、水稻1 238个），调查每个试验点无肥对照（CK）和氮磷钾肥（N2P2K2）处理作物产量；基于作物估计方法，分析了粮油基础地力产量和地力贡献率特征；采用直线拟合和边界线分析评价了基础地力对作物施肥产量及产量差的影响；采用稳定性指数和可持续性指数评估了基础地力对产量稳定性和可持续性的影响。【结果】黄壤区马铃薯、油菜、玉米和水稻平均基础地力产量分别为10.8、1.13、4.57和5.73 Mg·hm^-2，平均地力贡献率分别为50.8%、49.0%、59.0%和70.8%；基础地力产量越高，地力对作物施肥产量的贡献率越大。作物施肥产量与基础地力产量显著正相关，马铃薯、油菜、玉米和水稻施肥产量与基础地力产量的直线拟合方程决定系数分别为0.476、0.284、0.382和0.366（P＜0.001）。边界线分析结果表明，马铃薯、油菜、玉米和水稻4种作物的施肥产量潜力分别为42.8、4.07、11.8和12.4 Mg·hm^-2；随着基础地力的提升，作物施肥产量差降低，产量的稳定性和可持续性增加。【结论】提升基础地力能够提升作物施肥产量，降低产量差，有利于黄壤区粮油作物的高产、稳产和可持续生产。

叶用莴苣热激蛋白基因LsHsp70-2711的克隆及高温胁迫下的功能分析

李雅博，李婷，韩莹琰，范双喜

中国农业科学. 2017, 50(8): 1486-1494. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.012

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【目的】通过克隆Hsp70相关基因，并利用VIGS分析叶用莴苣热胁迫下Hsp70表达量和形态变化，为解析热激蛋白基因Hsp70在高温胁迫下的响应机制及分子机理奠定基础。【方法】通过同源克隆及RACE技术，获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711的cDNA全长序列，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在不同温度和不同高温时间下的叶用莴苣热敏品种‘P-S11’和耐热品种‘G-S59’的表达差异，确定基因和高温的相关性。根据VIGS技术，构建pTRV-LsHsp702711瞬时沉默载体，转化农杆菌GV1301，注射法侵染叶用莴苣叶片，三周后经PCR鉴定得到阳性植株。对照组和阳性组在基因表达和形态上进行对比，对照植株和阳性植株热胁迫和干旱处理后再次分析LsHsp70-2711的表达特性，观测形态变化。【结果】LsHsp70-2711 cDNA全长为2 226 bp，开放阅读框为2 154 bp，编码718个氨基酸，与拟南芥（NP_187864.1）、番茄（NP_001266213.1）、水母雪莲花（AAB99745.1）等物种的Hsp70同源性达到80%以上，证明此基因属于Hsp70家族。根据qRT-PCR结果，高温胁迫下该基因在两个品种中的表达均上调，在耐热品种中总体表达水平均高于热敏品种，耐热品种LsHsp70-2711的表达量最大值出现在42℃、60 min，37℃、60 min时热敏品种基因表达量达最大值，且在42℃高温下热敏品种‘P-S11’中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制，而耐热品种‘G-S59’则能长时间保持较高的表达水平，此结果和田间两品种间耐热差异表现相符合。亚细胞定位显示，LsHsp70-2711主要在细胞质中。将构建好的载体侵入叶用莴苣，鉴定后获得阳性植株。由定量PCR结果可知，未进行胁迫处理的阳性植株与对照株相比，LsHsp70-2711表达量下降，茎长明显增长。热胁迫和干旱处理后的阳性植株LsHsp70-2711表达量显著低于对照植株，高温处理对LsHsp70-2711的影响大于干旱胁迫。【结论】LsHsp70-2711属于Hsp70基因家族，其与叶用莴苣耐热性相关。研究结果为解析叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711在叶用莴苣高温抽薹方面的功能提供了理论支持。

新疆红肉苹果3个品系的风味品质与抗氧化能力评价

刘羽，刘盛雨，卢娟芳，于庆帆，席万鹏

中国农业科学. 2017, 50(8): 1495-1504. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.013

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【目的】明确新疆红肉苹果风味物质组成与含量特征，了解其营养品质状况，为开发利用提供信息。【方法】分别采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）技术，以富士苹果‘长富2号’为对照，检测分析3个新疆红肉苹果品系果皮和果肉的糖、酸和挥发性成分的组成及含量，并测定评价其提取物的总酚、总黄酮的含量以及抗氧化活性。【结果】3个供试品系的可滴定酸含量为21.01—27.71 mg·mL^-1，是对照的3.68—4.85倍，pH为3.12—3.39，显著低于对照（P<0.05）。共检测到果糖、葡萄糖、蔗糖3种可溶性糖，其中以果糖（56.71%—64.07%）为主，蔗糖的含量最低，仅仅占总糖含量的8.89%—31.12%。供试品系中可溶性糖的含量均显著低于对照；果肉中果糖的含量显著高于果皮，而葡萄糖和蔗糖的含量无显著差异（P<0.05）。共检测到5种有机酸，包括柠檬酸、酒石酸、草酸、苹果酸和奎宁酸，以苹果酸（56.53%—95.07%）的含量最高，其次为柠檬酸（2.11%—40.72%），其他酸的含量均低于0.6 mg·g^-1 FW，奎宁酸只在‘13-3’中检测到。果皮、果肉中，苹果酸含量分别是对照的6.56—8.99倍和5.58—6.61倍，柠檬酸的含量是对照的16.80—117倍和4.50—16.17倍；果肉中苹果酸的含量显著高于果皮，而柠檬酸的含量显著低于果皮（P<0.05）。共检测到85种挥发性成分，醛类、酯类和萜类的含量最为丰富，共占总香气物质的92.32%—97.84%。‘13-3’与对照相似，以酯类和萜类为主，丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸甲酯、乙酸己酯是主要酯，苏合香烯、D-柠檬烯、α-法尼烯是主要萜，而‘P3’和‘新农’以醛类和萜类为主，己醛和反-2-己醛是主要的醛。果皮中挥发性成分的含量显著高于果肉（P<0.05）。果皮中总酚、总黄酮的含量分别是对照的2.31—2.65倍和1.23—1.61倍，果肉中分别是对照的5.53—16倍和1.43—3.49倍，3种自由基清除能力也显著高于对照。果皮的总酚、总黄酮含量均高于果肉，且抗氧化活性也远高于果肉，‘13-3’的总酚、总黄酮及抗氧化能力最高。【结论】3个供评价的品系材料均属于新疆红肉苹果中的高酸类型；低可溶性糖、高苹果酸、高柠檬酸、低总糖苹果酸比，以及特征香气成分己醛、2-己烯醛、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸乙酯在其独特的风味品质决定中有重要作用，‘P3’和‘新农’属“青香型”苹果，‘13-3’属“果香型”。供试品系风味特征鲜明、营养价值高，是研究风味品质及选育功能性加工苹果的良好材料，其中‘13-3’的表现最优。

基于HRM获得与桃Tssd紧密连锁的SNP标记

鲁振华，牛良，张南南，崔国朝，潘磊，曾文芳，王志强

中国农业科学. 2017, 50(8): 1505-1513. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.014

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【目的】植物中，SNP标记具有分布广泛、分辨率高、共显性和多态性高等特点，是遗传研究的常用分子标记。桃全基因组测序完成，获得了大量SNP位点。利用现有的SNP数据进行简单、快速的SNP基因分型是基因定位、品种鉴定和图谱构建等后续研究的基础。文章拟建立采用高分辨率熔解曲线进行不同类型SNP的基因分型方法，以获得与桃温度敏感半矮生型基因紧密连锁的分子标记。【方法】以普通生长型（ST）单株97-32-46为母本，温度敏感半矮生型单株03-94-2（Tssd）为父本进行人工杂交，利用其分离群体96个后代单株为研究材料。在定位目标基因的区间内开发连锁和不同类型的SNP标记的基础上，采用高分辨率熔解曲线进行SNP的基因分型并获得与目标性状紧密连锁的SNP标记。【结果】明确了DNA模板和Mg²⁺是影响基因分型的关键因子，并确立了反应体系最佳浓度区间。在15 µL反应体系中模板DNA的量低于5.0 ng时或Mg²⁺浓度低于1.6 µmol·L^-1时则不能完成PCR扩增和基因分型；根据亲本基因型和表型一致的SNP位点设计引物，扩增片段长度在140 bp左右。高分辨率熔解曲线分析可对由单个核苷酸变异引起的4种不同类型的SNP（A/T、A/G、A/C和C/G）进行基因分型，并正确区分了温度敏感半矮生型和普通生长型，与进行Sanger测序鉴定的结果一致。采用96孔板对温度敏感半矮生型和普通生长型各48个分离后代单株进行了PCR扩增和基因分型，确定了遗传距离。分型结果表明高分辨率熔解曲线分析技术可以将96个样杂交后代单株分为温度敏感半矮生型和普通生长型2种，正确地区分了A/A基因型和A/T基因型。在96个样品中仅1个没有成功扩增，在温度敏感半矮生型和普通生长型中各存在1个重组单株。获得与温度敏感半矮生型基因紧密连锁的SNP标记，遗传距离为2.11 cM。【结论】建立了基于高分辨率熔解曲线分析的SNP基因分型。尽管高分辨率熔解曲线分析技术无法区分两种不同纯合类型的SNP变异，但仍不失为区分已知变异SNP的有效方法。在已经获得桃大量SNP的基础上，该体系可用于桃的基因定位、遗传多样性和品种鉴定等研究。

蜡质玉米淀粉凝胶的冻融稳定性

宁吉英，顾丰颖，高萍萍，曹晶晶，罗其琪，王锋

中国农业科学. 2017, 50(8): 1514-1524. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.015

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【目的】采用多次冻融循环（FTC）处理手段，研究蜡质玉米淀粉凝胶与冻融稳定性相关的物性变化，为蜡质玉米淀粉在冷冻食品中的推广应用提供科学支撑。【方法】以一个普通玉米淀粉样品（YM）为对照、两个蜡质玉米淀粉样品（WCS1、WCS2）为研究对象，采用离心过滤方法测定淀粉凝胶的析水率；差示扫描量热仪（DSC）测定淀粉凝胶的糊化焓、回生焓、冰晶熔化焓；Brabende黏度仪测定淀粉凝胶的糊化特性；物性测试仪测定蜡质玉米淀粉凝胶的质构特性；流变仪测定淀粉凝胶的凝胶动态黏弹性；扫描电子显微镜（SEM）观察淀粉凝胶截面的微观结构。【结果】析水率测定结果显示首次FTC后，WCS表现超强持水能力，其中WCS2持水能力最强，析水率为5.75%，而YM持水能力最弱，析水率超过50%。随着冻融循环次数的增加，淀粉凝胶的回生率和冰晶熔化焓均逐渐增大，且1、3、5次FTCs之间差异显著，说明多次冻融使淀粉的回生程度和可冻结水含量增加。WCS的回生率在首次FTC时达到17%—18%，而YM的在40%—50%。WCS的冰晶熔化焓在首次FTC时达到540 J·g^-1左右，而YM的在555 J·g^-1左右。5次FTCs后淀粉凝胶硬度均发生明显的增大，其中WCS凝胶硬度较小（45—100 g），远低于YM淀粉凝胶硬度（440 g左右）。凝胶动态黏弹性结果显示随着冻融次数的增加，淀粉凝胶的tanδ均逐渐降低，但WCS的tanδ值始终大于YM的，表明WSC凝胶较黏软。WCS的糊化特性也表明其在冷却过程中不易老化。5次FTCs后的淀粉凝胶结构均发生明显变化，WCS凝胶形成的网络结构较不规则，淀粉壁出现的孔道不明显且相互黏连缠绕；YM凝胶形成比较致密的网络状结构，结构较规则，淀粉壁出现的孔道完整，淀粉壁光滑。【结论】蜡质玉米淀粉凝胶经冻融处理后，其抵抗由温度波动造成的不良物理变化的能力强，比普通玉米淀粉凝胶的冻融稳定性好，本研究结果对蜡质玉米淀粉在冷冻食品中的应用具有重要参考价值。

轮牧方式对荒漠草原滩羊牧食特征、体重及繁殖性能的影响

周静静，马红彬，周瑶，王丽，牛佳伟，沈艳，许冬梅

中国农业科学. 2017, 50(8): 1525-1534. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.016

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【目的】合理的放牧方式对维持草地生态系统平衡具有重要意义。研究轮牧方式对滩羊牧食特性、体重及繁殖性能的影响可为草地放牧管理提供依据。【方法】以宁夏面积最大的荒漠草原为对象，在载畜率为0.75 只/hm²水平下，设置连续放牧（CG）、二区轮牧（TG）、四区轮牧（FG）、六区轮牧（SG）4个处理。采用跟群全天观察法测定滩羊的牧食习性，利用差额法测定采食量，采用常规方法测定草群和滩羊摄入牧草营养成分，每个轮牧周期结束观测滩羊的体重，统计放牧期间繁殖性能等。【结果】放牧全天，滩羊采食时间占据了主体，比例达64%以上。随轮牧分区增加，滩羊采食、游走站立时间下降（P＜0.05），反刍卧息时间增加（P＜0.05）；排泄、争斗、瘙痒、啃食异物等其他行为受个体行为影响更大，所占时间比例不到1.4%。草地牧草采食量表现为四区与六区轮牧无明显差异（P＞0.05），但均高于连续放牧和二区轮牧，连续放牧采食量最低（P＜0.05）；草地采食率呈现连续轮牧＞二区轮牧＞四区轮牧＞六区轮牧的趋势，连续放牧达到39.06%，六区轮牧仅为27.9%；滩羊日采食量在二区、四区、六区轮牧方式下差异不大（P＞0.05），在连续放牧区最低（P＜0.05）。滩羊摄入的牧草的粗蛋白、粗脂肪、磷的含量总体高于草群相应养分含量，而粗纤维和钙低于草群养分含量，粗灰分和无氮浸出物比较接近，说明滩羊具有选食蛋白质含量高, 粗纤维含量低牧草的能力；随轮牧分区增加，滩羊摄入的牧草粗蛋白含量呈下降趋势、粗纤维呈上升变化，但滩羊摄入干物质、粗蛋白和磷的总量增加；各处理下滩羊营养摄入量均超出了美国NRC绵羊饲养标准，说明暖季滩羊放牧不需要补饲。放牧期间，滩羊体重和日增重以连续放牧最低（P＜0.05），二区、四区及六区轮牧间无显著差异（P＞0.05）；各处理下滩羊产羔率、羔羊平均初生重等繁殖性能接近，说明在适宜载畜率水平下，轮牧方式对滩羊繁殖性能影响不大。【结论】轮牧方式对滩羊牧食特征和增重产生了影响，相对于连续放牧，随轮牧分区增加，草地牧草采食率、滩羊采食时间和摄入的牧草粗蛋白含量下降，但草地采食量，滩羊日采食量及摄入的干物质、粗蛋白等营养物质总量增加。划区轮牧没有提高滩羊繁殖性能，但更有利于滩羊体重增加。若仅考虑滩羊牧食特征、增重性能以及生产中放牧管理的便利性，二区轮牧方式是宁夏荒漠草原滩羊暖季的最优放牧方式。

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

郑秀平，丁豪杰，郭筱璐，杨怡，黄艳，陈学秋，周前进，杜爱芳

中国农业科学. 2017, 50(8): 1535-1542. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.017

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【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一，该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性，对其基因进行了克隆、原核表达，并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H. contortus ZJ株daf-22 cDNA序列（GenBank：HQ738470.1）设计特异性引物，克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22，经测序鉴定正确后将其转化E. coli BL21，经终浓度为0.1 mmol·L^-1 IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h，离心菌液，50 mmol·L^-1浓度的PBS溶液重悬菌体溶液，冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22，并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分，并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA（AcAc-CoA）分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性，酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为（50 mmol·L^-1 Tris-Cl pH 8.1，20 mmol·L^-1 MgCl₂，60 μmol·L^-1 CoA，10 μmol·L^-1 AcAc-CoA，加入约0.1 μg蛋白），通过记录反应过程中由于底物（AcAc-CoA）的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化，从而计算出硫解反应的初始反应速率，最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下，取AcAc-CoA底物浓度为10 μmol·L^-1的反应体系（50 mmol·L^-1 Tris-Cl pH 8.1，20 mmol·L^-1 MgCl₂，60 μmol·L^-1 CoA，10 μmol·L^-1 AcAc-CoA，加入约0.1 μg蛋白于室温起始反应），分别调节反应体系的温度及pH梯度，确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因，测序结果与NCBI已公布的H. contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%，并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E. coli BL21体内进行表达，表达产物经 SDS-PAGE和Western Blot检测显示，pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达，呈部分可溶性，融合蛋白的分子量约为59 kD，测得蛋白浓度为1.70 μg·μL^-1；针对该表达产物的酶活分析结果表明，原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性，其最适反应pH为8.0，最佳反应温度为37℃，酶学常数K_m值和V_max值分别为33.765 μmol·L^-1和1 784 nmol·L^-1·min^-1。【结论】捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一，本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性，证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性，但与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）同源蛋白相比硫解酶活性较低。

绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

李海军，于泊洋，段云娇，刘星宇，翁娅政，杜晨光，王秀梅

中国农业科学. 2017, 50(8): 1543-1550. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.018

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【目的】在绵羊有腔卵泡发育过程中，多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complex，COCs）特殊结构，存在于卵泡腔内。卵泡成熟后，绵羊COC从卵泡内排出，进入输卵管，等待受精。现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术，或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理，或者将COCs从卵泡内分离，在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色。但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时，存在显著缺陷。研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进，以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求。【方法】首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs，以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的“包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构”。然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象，分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程，检测了目的蛋白，尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase-type plasminogen activator, uPA）与其受体（urokinase-type plasminogen activator recepter, uPAR），在绵羊COCs中的表达情况，比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异。【结果】将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织，进行石蜡组织切片处理，经切片、贴片与脱蜡等步骤，分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层（厚度5µm）。经间接免疫染色处理后，结果显示：?目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的，即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达，而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中；?在绵羊COCs薄片结构中，COCs整体形态完好，卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰，蛋白定位清楚，染色效果良好；在卵巢薄层结构中，绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整，卵母细胞蛋白定位清楚，但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰；?与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较，绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术，在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短，例如固定处理由24h缩短为2h；由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h；透明由30min缩短为10min；软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h；由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等。【结论】改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术，显示更优质的免疫定位与染色效果，不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点，而且显著缩短了操作时间，简化了操作流程。该技术在保留COCs结构完整的基础上，有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式，对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制，具有重要意义。

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