中国农业科学

中国农业科学. 2021, 54(2): 0.

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小麦籽粒黄色素含量检测方法的改良与应用

翟胜男,刘爱峰,李法计,刘成,郭军,韩冉,訾妍,汪晓璐,吕莹莹,刘建军

中国农业科学. 2021, 54(2): 239-247. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.001

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【目的】小麦籽粒黄色素含量是影响面制品颜色和营养品质的重要因素,为快速、准确、简便地检测小麦籽粒黄色素含量,对传统小麦籽粒黄色素测定方法AACC 14-50进行改良,为面制品颜色性状和营养品质遗传改良提供技术支撑。【方法】将酶标仪应用于小麦籽粒黄色素含量测定,对传统AACC 14-50法进行改良,分析改良方法的准确性和稳定性,探讨不同提取时间和保存时间对面粉黄色素含量的影响,利用新改良方法测定283份国内外小麦品种籽粒黄色素含量,进一步验证改良方法的有效性,发掘面制品颜色性状和营养品质优异的种质资源。【结果】改良方法与传统AACC 14-50法所测黄色素含量呈极显著正相关,相关系数达0.994（P<0.001）,方差分析显示,2种方法所测黄色素含量在品种间差异均极显著（P<0.01）。应用改良方法对144份小麦品种籽粒黄色素含量进行重复测定,3次重复两两间的相关系数分别为0.997、0.998和0.998。藁优5218、冀师02-2和郑麦366面粉黄色素含量在提取时间为30 min时达到最大值,分别为0.93、1.24和1.53 μg·g^-1,且提取时间为30—120 min时,黄色素含量保持在稳定水平（0.94—0.97、1.30—1.33和1.59—1.62 μg·g^-1）。在室温保存0—20 d的藁优5218、冀师02-2和郑麦366的面粉,其黄色素含量没有显著变化（0.93—0.97、1.29—1.33和1.60—1.64 μg·g^-1;P>0.05）。283份国内外小麦品种籽粒黄色素含量变异范围广,不同环境间相关系数为0.73—0.98。其中,黄淮麦区小麦品种黄色素含量平均值为1.15 μg·g^-1,变异范围为0.51—2.42 μg·g^-1;北部冬麦区平均值为1.57 μg·g^-1,变异范围为0.90—2.52 μg·g^-1;长江中下游麦区平均值为1.07 μg·g^-1,变异范围为0.56—2.54 μg·g^-1;国外品种平均值为1.61 μg·g^-1,变异范围为0.94—2.48 μg·g^-1。筛选到24份黄色素含量较低和26份黄色素含量较高的品种,可作为亲本材料用于面制品颜色性状和营养品质遗传改良。与传统方法相比,改良方法显著降低了工作量,缩短检测时间,效率提高12—15倍,且样本、试剂用量仅为原来的1/16,大大节约了成本。【结论】建立了一个准确稳定、经济高效、操作简便的小麦籽粒黄色素含量检测方法,可代替传统AACC 14-50法用于大规模样本黄色素含量测定。

陆地棉盐胁迫应答基因GhPEAMT1的克隆及功能分析

王娜,赵资博,高琼,何守朴,马晨辉,彭振,杜雄明

中国农业科学. 2021, 54(2): 248-260. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.002

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【目的】磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（phosphoethanolamine N-methyltransferse,PEAMT）是植物磷酸胆碱合成的关键酶,而磷酸胆碱是可以增强植物抗性的甘氨酸甜菜碱合成底物胆碱的前体。通过对陆地棉磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（GhPEAMT1）的克隆、表达模式分析,以及功能验证,探究GhPEAMT1在陆地棉响应盐胁迫中的生物学功能,为棉花耐盐品种的选育提供基因资源。【方法】根据转录组测序数据分析,最终确定GhPEAMT1为耐盐候选基因;通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因;通过生物信息学分析基因结构特征、预测蛋白质相对分子质量以及进化关系;利用荧光定量PCR（qRT-PCR）分析耐盐棉花品种早熟长绒7号和感盐棉花品种南丹巴地大花在NaCl胁迫后不同时间点不同组织的表达特征;构建亚细胞定位载体,进行烟草的瞬时转化,确定蛋白质在细胞中的位置;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,分析转基因拟南芥种子在盐胁迫下的萌发率和转基因拟南芥主根长度;利用病毒诱导基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）对早熟长绒7号棉花品种进行目的基因沉默,提取棉花叶片的RNA进行实时荧光定量用以检测基因沉默效率,随后用40 g·L^-1的NaCl溶液的处理对照棉花植株（CK）、注射TRV2:00的棉花植株、GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株,测定棉花叶片过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）的活性。【结果】克隆获得GhPEAMT1的2个同源基因GhPEAMT1A和GhPEAMT1D,2个基因的CDS全长分别为1 488和1 485 bp;构建进化树发现,GhPEAMT1与海岛棉同源基因的亲缘关系最近,而与其他物种相比,与可可同源性最高;盐胁迫条件下,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D在耐盐品种早熟长绒7号叶片和根中的表达量显著高于感盐品种南丹巴地大花。亚细胞定位显示该基因位于细胞质中;超表达转基因拟南芥后,在100和150 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的种子萌发率显著高于野生型拟南芥。在50和100 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的主根长极显著高于野生型拟南芥的主根长;用40 g·L^-1的NaCl溶液处理24 h后,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株叶片比CK和注射TRV2:00的棉花植株的棉花叶片萎蔫严重,盐胁迫后,与注射空载棉花植株相比,注射TRV2::GhPEAMT1A棉花植株过氧化氢酶（CAT）活性降低、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性降低。【结论】GhPEAMT1可以增强拟南芥对盐胁迫的耐性,GhPEAMT1能够响应盐胁迫并起正向调控作用。

油菜高油酸种质的创建及高油酸性状遗传与生理特性的分析

龙卫华,浦惠明,高建芹,胡茂龙,张洁夫,陈松

中国农业科学. 2021, 54(2): 261-270. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.003

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【目的】创建高油酸（high oleic,HO）油菜新种质,探明HO新种质中高油酸性状的遗传模式,明确HO新种质油酸含量变化的生理特性,为培育HO油菜新品种奠定基础。【方法】采用辐射处理油菜萌动发芽种子,获得初级诱变群体后在后续世代利用极端选择法结合小孢子培养技术筛选油菜HO新种质。以HO新种质分别与3个不同遗传背景的常规油菜品系为亲本组合杂交构建6个世代（P₁、P₂、F₁、BC₁P₁、BC₁P₂和F₂）的遗传群体,测定各群体脂肪酸含量后应用主基因+多基因混合遗传模型联合分析方法对遗传群体的高油酸性状进行遗传分析。测定HO新种质种子发芽过程中子叶、不同温度处理下苗期营养器官以及角果成熟过程中种子的油酸含量,明确其变化规律及生理效应。【结果】通过辐射获得油酸含量显著变化的初级诱变群体,在后续世代持续利用极端选择法得到平均油酸含量升高20个百分点的高世代群体,采用小孢子培养得到纯合稳定的油菜HO双单倍体群体,最终根据品质性状筛选成功得到HO新种质B161,其油脂中油酸含量为85%,亚麻酸含量为3%。以B161为HO亲本和常规品系杂交配置得到3个具有不同遗传背景的遗传群体并测定获得各群体的油酸含量表型数据。脂肪酸含量相关性分析表明,十八碳脂肪酸中油酸含量与亚油酸含量和亚麻酸含量具有显著负相关关系。遗传分析结果表明,该种质中高油酸性状由2对具有加性效应的主效基因控制,并且2对基因对油酸含量的效应值接近。生理分析表明,常温下HO品系营养器官（根、茎、叶和叶柄）的油酸含量均显著高于常规品系,亚麻酸含量显著低于常规品系。低温下HO品系营养器官的油酸含量降低,但仍高于常规品系;常规品系油酸含量在低温下稳定。低温下两类品系营养器官的亚麻酸含量均显著提高,但HO品系亚麻酸含量仍低于常规品系。在种子成熟过程和种子发芽过程中,HOLL品系中油酸含量持续显著高于常规油菜,而亚麻酸含量则持续显著低于常规油菜。【结论】成功创制了油菜HO新品系B161,明确了新种质HO性状的遗传规律和生理特性。获得的HO品系具有潜在育种利用价值。

初花期淹水胁迫对大豆叶片AsA-GSH循环的损伤及烯效唑的缓解效应

王诗雅,郑殿峰,项洪涛,冯乃杰,刘雅,刘美玲,靳丹,牟保民

中国农业科学. 2021, 54(2): 271-285. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.004

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【目的】研究淹水胁迫对初花期（R1）大豆叶片抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环的影响及烯效唑（uniconazole,S3307）的调控效应,为提高大豆耐涝性及烯效唑的应用提供理论依据。【方法】2019年在黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心盆栽场,以耐涝品种垦丰14和涝渍敏感品种垦丰16为试验材料,进行盆栽试验。待植株生长至R1期时叶片喷施S3307（浓度为50 mg·L^-1,喷施量为225 L·hm^-2）,喷施5 d后开始淹水胁迫处理,分别于淹水后0 d（R1+5）、5 d（R1+10）和恢复正常水分处理5 d（R1+15）后进行取样,以2个品种大豆正常水分管理为对照组(CK)、淹水胁迫处理（W）和淹水胁迫处理+S3307（W+S）为处理组,分别采用分光光度计法对各项生理指标进行测定,研究淹水胁迫对大豆叶片膜脂过氧化程度（MDA）、活性氧（ROS）和AsA-GSH循环系统中非酶抗氧化剂（AsA、DHA、GSH和GSSG）和关键酶（APX、GR、MDHAR和DHAR）的影响及S3307的缓解效应。【结果】R1期,淹水胁迫R1+5时,与CK相比,喷施S3307降低了垦丰14和垦丰16叶片内MDA、$\mathop{{O}}_{2}^{{\mathop{}_{\ ·}^{-}}}$产生速率和H₂O₂含量,同时提高了AsA-GSH循环中非酶抗氧化剂和关键酶含量,以维持ROS平衡,促进2种大豆品种的生长发育。淹水胁迫R1+10时,W处理增加了垦丰14和垦丰16 2个大豆品种叶片内MDA含量,分别较CK显著增加40.02%和37.53%,并加速了ROS（$\mathop{{O}}_{2}^{{\mathop{}_{\ ·}^{-}}}$和H₂O₂）的积累,淹水胁迫下2个品种$\mathop{{O}}_{2}^{{\mathop{}_{\ ·}^{-}}}$产生速率分别较CK显著增加60.29%和27.77%,H₂O₂含量分别较CK显著增加49.45%和43.40%,且涝渍敏感品种垦丰16的受害程度大于耐涝品种垦丰14,同时,在淹水胁迫下,2个品种叶片内的抗氧化物质和关键酶活性均有所提高,以适应淹水胁迫所产生的应激反应。叶面喷施S3307后,W+S处理可进一步提高2个大豆品种淹水胁迫下抗氧化物质（AsA、GSH）、氧化还原物质（DHA、GSSG）及总抗坏血酸（AsA+DHA）和总谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量,并提高抗氧化酶（APX、GR、MDHAR、DHAR）活性,降低叶片MDA含量,抑制ROS积累,减少淹水胁迫对膜系统造成的伤害。恢复正常水分处理5 d（R1+15）后,2个品种W处理的上述指标均有所降低,但W+S处理能维持大豆叶片内较高的抗氧化酶活性和抗氧化物质含量,加速清除MDA和ROS的过度积累,促进淹水胁迫下大豆叶片内AsA-GSH循环运转,进而促进大豆品种叶片恢复至正常状态。【结论】淹水胁迫对大豆叶片膜脂过氧化程度、ROS积累及AsA-GSH循环中关键酶活性和非酶抗氧化剂具有不同程度的影响,喷施S3307可在一定程度上提高关键酶活性,提高抗氧化能力,减缓淹水胁迫所造成的危害。

光周期对糜子生长发育及叶片内源激素的调控效应

王君杰,田翔,秦慧彬,王海岗,曹晓宁,陈凌,刘思辰,乔治军

中国农业科学. 2021, 54(2): 286-295. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.005

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【目的】明确光周期对糜子生理生态指标的影响,为糜子光周期遗传调控网络及相关基因定位奠定基础。【方法】通过盆栽试验设置4种光周期处理,选用光敏感性差异不同的3个品种（N1-光钝感-内糜1号,N2-光中间-内糜2号,N3-光敏感-宁糜14号）,调查不同处理植株的物候期,测定不同处理抽穗期内源激素含量、成熟期株高、籽粒蛋白质含量和光钝感品种抽穗后的净光合速率。【结果】长日照显著延长糜子生育期,增加株高,光敏感品种N3全生育期长日照生育期天数和株高较短日照分别增加62.07%、104.24%,光钝感品种N1为3.51%、33.35%;随着生育进程的推进,抽穗后叶片净光合速率表现出明显差异,延长光照能显著增强糜子叶片净光合速率,增加干物质积累;光周期处理下不同光敏感品种内源激素变化明显,一定浓度IAA促进抽穗,IAA与GA和ZR呈极显著正相关,相关系数分别为0.51和0.40,与ABA呈极显著负相关（-0.62）,ABA与GA和ZR呈极显著负相关,分别为-0.70和-0.39,GA与ZR呈极显著正相关（0.47）;全生育期短日照条件下不同光敏感品种籽粒蛋白质含量显著高于其他处理,全生育期短日照N1-2、N2-2、N3-2蛋白质含量较全生育期长日照N1-4、N2-4、N3-4分别高18.89%、80.50%和61.23%。光敏感品种较光钝感品种的籽粒蛋白质含量更容易受短日照影响。【结论】光周期显著影响不同光敏感性糜子生长发育及内源激素含量,长日照显著延长糜子生育期、增加植株株高和增强叶片净光合速率,但降低籽粒蛋白质含量,一定浓度IAA含量调控糜子由营养生长向生殖生长转变。

马铃薯健株与黄萎病株根际土壤真菌群落结构及其对碳源利用特征

赵卫松,郭庆港,苏振贺,王培培,董丽红,胡卿,鹿秀云,张晓云,李社增,马平

中国农业科学. 2021, 54(2): 296-309. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.006

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【目的】通过研究马铃薯健康植株与黄萎病株的根际土壤真菌群落结构与功能多样性的差异,明确土壤真菌群落结构与黄萎病发生之间的关系,为最终从微生物生态学的角度解释马铃薯黄萎病的发生原因及其生态防控提供理论依据。【方法】以河北省坝上地区马铃薯健株与黄萎病株的根际土壤为研究对象,分别利用实时荧光定量PCR（real-time PCR）和高通量测序（Illumina MiSeq）技术检测根际土壤中大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）ITS基因拷贝数量并分析真菌群落结构变化,结合冗余分析（RDA）明确真菌群落结构与土壤养分的相关性。同时利用Biolog-ECO平板法比较健株与黄萎病株根际土壤微生物对碳源的利用能力。【结果】马铃薯黄萎病的发生与土壤中大丽轮枝菌ITS基因拷贝数量存在相关性,在病株根际土壤中病原菌数量高,而在健株根际土壤中未检测到病原菌。高通量测序分析表明,病株根际土壤真菌多样性指数低于健康植株,但多样性差异不显著。在群落组成的门水平上,与健株根际土壤相比,病株根际土壤中的子囊菌门（Ascomycota）和丝孢菌门（Mortierellomycota）相对丰度上升幅度分别为20.68%和16.16%,而担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度下降51.43%。在属水平上,病株根际土壤中轮枝菌属（Verticillium）、青霉属（Penicillium）、维希尼克氏酵母属（Vishniacozyma）、红酵母属（Rhodotorula）和芽枝霉属（Cladosporium）的相对丰度呈上升趋势,增加倍数分别为71.96、3.62、6.11、15.38和6.24倍,而小不整球壳属（Plectosphaerella）、Guehomyces、葡萄穗霉属（Stachybotrys）、赤霉属（Gibberella）、曲霉属（Aspergillus）菌群的相对丰度下降幅度分别为45.10%、61.41%、96.87%、45.85%和44.39%。真菌群落组成与土壤养分的冗余分析（RDA）表明,健株根际土壤优势群落的相对丰度（如小不整球壳属、Guehomyces、葡萄穗霉属、赤霉属、曲霉属）与硝态氮、有机质和pH呈正相关,而黄萎病株根际土壤优势群落的相对丰度（如轮枝菌属、链格孢属、刺盘孢属、被孢霉属、腐质霉属、青霉属、维希尼克氏酵母属、红酵母属和芽枝霉属）与无机磷和速效磷呈正相关。不同根际土壤的AWCD值表明,病株根际土壤微生物对碳源的利用能力高于健株。进一步分析发现,与健株相比,病株土壤微生物对羧酸类碳源的利用能力显著提高,而对氨基酸类、胺类、碳水化合物类、聚合物类和双亲化合物类碳源利用能力差异不显著。【结论】病株的根际土壤真菌多样性降低和群落结构改变是马铃薯黄萎病发生的重要特征,其中轮枝菌属菌群的相对丰度显著提高是最主要特征,并且真菌群落结构受土壤养分影响。同时,病株根际土壤微生物对羧酸类碳源利用能力显著提高。

中国野生毛葡萄芪合酶基因表达及对葡萄抗白粉病的影响

丁茜,赵凯茜,王跃进

中国农业科学. 2021, 54(2): 310-323. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.007

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【目的】克隆中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤-2’芪合酶（stilbene synthase）基因（STS）并研究其功能,为提高欧洲葡萄（V. vinifera）的白粉病抗性及品质提供依据。【方法】利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因VqSTS9和VqSTS21,构建植物过表达载体;用无核白单芽茎段诱导出分生愈伤组织,作为农杆菌介导法遗传转化的受体材料,获得抗性植株,经过不同水平检测,确定转基因植株;对野生型和转基因植株叶片人工接种葡萄白粉病菌（Uncinula necator）,通过显微技术观察叶片受白粉病菌侵染后的情况,比较两者对白粉病的抗性;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析野生型和转基因植株在自然条件和接种白粉病菌后STS及其相关基因的表达,用高效液相色谱法（HPLC）检测转基因植株中芪类物质的种类与含量。【结果】同源序列克隆得到VqSTS9（JQ868689）与VqSTS21（JQ868677）的cDNA序列,长度为1 179 bp。经PCR和Western blot检测,鉴定出过表达VqSTS9无核白植株4株和过表达VqSTS21无核白植株3株。显微观察发现,与野生型植株相比,转VqSTS9 和VqSTS21植株叶片上的菌丝生长较慢,表现出对白粉病的抗性。qRT-PCR结果表明,自然生长条件下,与野生型植株相比,转VqSTS9和VqSTS21植株STS的表达量提高,STS上游苯丙氨酸裂解酶基因（PAL）、下游白藜芦醇糖基转移酶基因（RSGT）、转录因子基因（MYB14、MYB15）的表达量均不同程度上升,而查尔酮合成酶基因（CHS）表达量降低;人工接种白粉病菌后,与野生型植株相比,转基因植株STS表达量显著上调。高效液相色谱分析表明,自然条件下,芪类物质主要以反式云杉新苷形式存在,转基因植株芪类物质的含量高于野生型植株;在接种白粉病菌诱导表达后,除了反式云杉新苷,还产生了反式白藜芦醇和葡萄素,即转基因植株体内芪类物质的种类和含量均有所增加。【结论】将VqSTS9、VqSTS21转入无核白后,转基因植株STS的表达量增高,芪类物质的含量与种类增加,并抑制白粉病菌的生长。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’携带的VqSTS9和VqSTS21能够增强欧洲葡萄对白粉病的抗性,‘丹凤-2’可用作葡萄抗病性育种的种质资源。

四种杀虫剂LC₂₅对Q型烟粉虱成虫取食行为的影响

何云川,王新谱,洪波,张婷婷,周雪飞,贾彦霞

中国农业科学. 2021, 54(2): 324-333. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.008

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【目的】利用刺吸电位技术（electronic penetration graph,EPG）研究Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）成虫对吡虫啉、吡蚜酮、螺虫乙酯和溴氰虫酰胺4种杀虫剂LC₂₅处理24 h番茄苗的取食行为,探明内吸性杀虫剂亚致死剂量对烟粉虱成虫取食行为的影响。【方法】以无农药暴露史的Q型烟粉虱成虫为供试昆虫,番茄品种‘粉印三号’为供试植株。通过水培生测法确定4种内吸性杀虫剂的亚致死浓度LC₂₅。在此基础上利用EPG监测Q型烟粉虱成虫取食寄主的13个非韧皮部指标和8个韧皮部指标,并对叶片刺吸孔进行显微观察。以无农药处理为对照（CK）。【结果】4种杀虫剂对Q型烟粉虱成虫的LC₂₅值为溴氰虫酰胺>吡蚜酮>吡虫啉>螺虫乙酯。在总记录时间8 h内,Q型烟粉虱成虫的取食在各处理中均产生非刺探波（np）、路径波（C）、电位下降波（pd）、韧皮部分泌唾液波（El）、韧皮部被动吸食波（E2）以及木质部主动吸食波（G）6种波形。在非韧皮部的np波次数上,溴氰虫酰胺处理的次数最多,其次是螺虫乙酯处理,两者间差异不显著（P>0.05）,但均显著高于CK和吡虫啉处理（P<0.05）。C波和G波总持续时间均为CK处理最长,溴氰虫酰胺处理最短,两处理间差异显著（P<0.05）。CK处理的pd波总持续时间显著长于4种杀虫剂处理（P<0.05）,其中螺虫乙酯处理最短,但4种杀虫剂处理间差异不显著（P>0.05）。螺虫乙酯处理的F波总持续时间最长,吡虫啉处理最短,两者间差异显著（P<0.05）。CK处理韧皮部的E1波和E2波总持续时间分别为20.52和50.60 min,显著长于吡虫啉处理和溴氰虫酰胺处理对应波的总持续时间（P<0.05）,但E1波总持续时间与吡蚜酮和螺虫乙酯处理均差异不显著（P>0.05）。【结论】4种杀虫剂LC₂₅均引起Q型烟粉虱成虫的拒食行为,为研究烟粉虱或具刺吸式口器农业害虫对4类杀虫剂亚致死效应的拒食作用机理及防治提供了理论依据。

长期免耕和深松提高了土壤团聚体颗粒态有机碳及全氮含量

李景,吴会军,武雪萍,王碧胜,姚宇卿,吕军杰

中国农业科学. 2021, 54(2): 334-344. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.009

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【目的】耕作措施对土壤有机碳（SOC）和全氮（TN）具有重要影响。本研究利用团聚体和密度联合分级方法,旨在揭示长期耕作对表层土壤团聚体内密度颗粒组分SOC及TN的影响,为深入理解黄土高原农田土壤碳氮提升机理提供依据。【方法】长期试验位于黄土高原东部边缘地区,开始于1999年,共设4个处理：少耕无覆盖（RT）、免耕覆盖（NT）、深松覆盖（SM）和传统翻耕（CT）。于2013年7月采集0—10 cm土层样品,首先通过干筛法筛分>2、1—2、0.25—1和<0.25 mm粒级团聚体,之后利用颗粒密度分组,将团聚体有机质分为轻组有机质（LF）、粗颗粒有机质（cPOM）、细颗粒有机质（fPOM）和矿质结合有机质（m-SOM）。【结果】（1）15年保护性耕作（包括NT和SM处理）显著提高了0—10 cm土层的SOC和TN含量,与CT相比,NT和SM处理的SOC含量分别提高了22.9%和21.8%,TN含量分别提高了35.2%和42.3%。不进行秸秆覆盖的少耕处理（RT）对SOC和TN无显著影响。（2）不同耕作措施改变了团聚体质量组成及其内部SOC和TN含量。NT和SM处理显著提高了1—2 mm和0.25—1 mm粒级的干筛大团聚体含量,相对地,降低了>2 mm和<0.25 mm粒级团聚体的含量。NT和SM处理不同程度提高了团聚体的SOC和TN含量,与CT相比,团聚体SOC平均提高了8.5%和9.5%,尤其对>1 mm粒级团聚体SOC含量提高幅度最大;团聚体TN平均提高了12.2%和24.1%,尤其对<0.25 mm微团聚体TN含量提高幅度最大。（3）fPOM和m-SOM组分对团聚体SOC和TN的贡献最大,对SOC的贡献率分别为27.3%—45.1%和25.0%—52.6%;对TN的贡献率分别为23.5%—34.7%和42.2%—64.3%。不同有机质组分对耕作的响应不同,cPOM和fPOM组分最为敏感。与CT相比,NT和SM处理显著提高了土壤所有粒级团聚体的cPOM和fPOM的SOC和TN含量,尤其对>2 mm团聚体cPOM和<2 mm团聚体fPOM的SOC和TN含量提升幅度最大。【结论】长期免耕和深松提高了团聚体中有机碳及全氮含量,尤其提高了团聚体中颗粒有机质的碳氮含量,有利于土壤碳氮的长效累积,是黄土高原坡耕地区值得推荐的耕作管理方式。

地膜覆盖与施肥对秸秆碳氮在土壤中固存的影响

王淑颖,李小红,程娜,付时丰,李双异,孙良杰,安婷婷,汪景宽

中国农业科学. 2021, 54(2): 345-356. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.010

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【目的】作物秸秆不仅含有较高的有机碳,而且含有丰富的矿质营养元素。秸秆还田是东北黑土地区培肥土壤和农业可持续发展的重要技术措施。然而不同地膜覆盖（简称“覆膜”）及施肥方式下秸秆碳（C）和氮（N）在土壤中的固持特征还不是很明确。本研究通过定量分析秸秆碳对土壤有机碳（SOC）和秸秆氮对土壤全氮（TN）的贡献,探讨不同覆膜和施肥条件下秸秆碳和氮在土壤中固定的差异,以期为土壤肥力提升和东北黑土地保护提供依据。【方法】基于覆膜与施肥的长期定位试验,选择覆膜和不覆膜（裸地）栽培条件下不施肥（CK）、单施氮肥（N₄）和有机肥配施氮肥（M₂N₂）处理,在表层（0—20 cm）土壤添加¹³C¹⁵N双标记秸秆后在田间原位培养150 d,测定SOC含量及其δ¹³C值、TN含量及其δ¹⁵N值,分析SOC中秸秆来源C（¹³C-SOC）、TN中秸秆来源N（¹⁵N-TN）和土壤碳氮比随时间的动态变化特征。【结果】施肥、覆膜及其它们的交互作用显著影响（P<0.05）¹³C-SOC和¹⁵N-TN含量。整个培养期间,M₂N₂处理秸秆碳对SOC的贡献率（¹³C-SOC/SOC）和秸秆氮对TN贡献率（¹⁵N-TN/TN）平均分别为10.48%和3.18%;施肥（N₄和M₂N₂）处理¹³C-SOC/SOC和秸秆碳残留率在覆膜方式下平均分别为12.65%和37.14%,不覆膜方式下分别为12.08%和34.50%。同一栽培方式培养第150天,N₄处理¹³C-SOC/SOC和秸秆碳残留率平均分别为14.33%和39.40%,其他施肥处理平均分别为11.77%和33.21%;CK处理¹⁵N-TN/TN平均为4.56%,分别比N₄和M₂N₂处理高26.00%和44.53%。培养第150天,秸秆氮残留率在覆膜和不覆膜条件下CK处理最高,平均为10.03%;不覆膜N₄处理最低,为7.87%。无论覆膜与否,N₄处理¹³C-SOC与¹⁵N-TN比值为32—39,其他施肥处理均<30。【结论】秸秆碳氮在土壤中的固存对覆膜与施肥的响应敏感。单施氮肥有利于秸秆碳在土壤中的积累和有机碳的更新,不施肥处理秸秆氮对土壤氮库的固定起正反馈效应,而有机肥配施氮肥土壤碳氮的更新相对滞后。

GA₃介导miR171s及其靶基因VvSCLs调控葡萄种子发育的作用分析

王文然,解振强,诸葛雅贤,白云赫,管乐,吴伟民,张培安,郑婷,房经贵,王晨

中国农业科学. 2021, 54(2): 357-369. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.011

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【目的】鉴定vvi-miR171s成员及其靶基因,明确vvi-miR171s成员及其靶基因在葡萄种子发育中的重要作用及其响应赤霉素（Gibberellin,GA）调控种子发育的表达模式。【方法】以‘魏可’葡萄（‘Wink’）果实为试材,利用miR-RACE技术鉴定vvi-miR171a/b/e/f/g/h的成熟体序列;通过PsRNATarget软件预测vvi-miR171s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行染色体定位、系统进化树、基因结构、保守结构域及motif分析;通过启动子作用元件分析预测vvi-miR171s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证vvi-miR171s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA₃在葡萄种子区中的表达模式。【结果】从‘魏可’葡萄果实中鉴定并克隆了6条葡萄vvi-miR171s成熟体序列,并用RLM-RACE和PPM-RACE鉴定到3条靶基因VvSCL6/15/22。靶基因的生物信息学分析显示,VvSCL6/22与苹果、桃子和樱桃同源基因遗传距离较近,而VvSCL15则与拟南芥、苹果、桃子和樱桃中的同源基因遗传距离相同,且VvSCLs的基因结构也与进化树中亲缘关系较近的基因相似;SCLs蛋白均具有GRAS结构域,鉴定到5个与GRAS结构域对应的保守motif,且它们含有的motif元件类型及排列顺序均相似,表明SCL家族结构较为保守。vvi-miR171s及靶基因的启动子均具有大量的GA、水杨酸（Salicylic acid,SA）和种子发育相关作用元件,表明它们可能参与响应GA、SA和种子发育过程;qRT-PCR表达分析显示,GA₃强烈抑制了种子区vvi-miR171a的表达,但同时显著上调种子区的VvSCL15和VvSCL22表达;vvi-miR171a和VvSCL15在对照组和GA₃处理后的种子/种子区均呈强烈的负相关,表明GA₃可能在葡萄种子/种子区显著增强vvi-miR171a对VvSCL15的负调控作用,从而介导葡萄种子发育。【结论】在‘魏可’葡萄中鉴定到vvi-miR171a/b/e/f/g/h 6个成员;均可裂解VvSCl6/15/22 3个靶基因;vvi-miR171a-VvSCL15可能作为主要的调控途径响应赤霉素并参与调控葡萄种子发育。

基于简化基因组测序的越橘杂交后代鉴定

刘有春,刘威生,王兴东,孙斌,刘修丽,杨艳敏,魏鑫,杨玉春,张舵,刘成,李天忠

中国农业科学. 2021, 54(2): 370-378. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.012

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【目的】针对遗传群体测序数据开发一种杂交后代鉴定方法,以获得继承双亲基因的真杂种后代,为果树杂交育种、遗传分析及遗传图谱构建奠定基础。【方法】本研究以越橘正反交群体共计318个F₁子代和2个亲本为试材,利用SLAF技术进行简化基因组测序并比对越橘参考基因组获得群体SNP数据,通过稀有等位变异分析和基于PCA、K-means聚类的遗传关系分析鉴定供试群体中的非杂交后代,结果利用双亲纯合显性SNP标记进行验证。【结果】SLAF简化测序共获得65.89 Gb数据,GC含量39.72%,平均Q30为95.04%,亲本和子代平均测序深度为12.86×和5.41×。参照四倍体越橘基因组信息,正、反交组合分别获得73 543个和114 851个SNP,利用次等位基因频率（MAF）>0.05的SNP数据集分别对正、反交群体进行PCA和K-means聚类分析,鉴定出4个离群个体;利用MAF<0.05的SNP数据集对正、反交群体进行个体稀有等位变异和个体特有的稀有等位变异数统计,共鉴定出10个离群个体（包含了MAF>0.05的SNP数据集鉴定的4个离群个体）。通过双亲纯合显性SNP标记进行验证,正、反交群体双亲纯合SNP位点分别占群体总SNP的34.56%和38.95%,除H194-123个体外,其余非杂交后代在验证结果中同为离群个体,即准确通过验证。【结论】对于有参考基因组物种的杂交群体,利用基于测序的SNP次等位基因频率（MAF）数据集,采用遗传关系和个体特有的稀有等位变异分析方法,从不同角度反映群体子代间的遗传关系以鉴别离群个体,是一种鉴定群体假杂交后代的有效方法。

高温胁迫下糙米短期储藏气味指纹图谱变化规律的动态分析

刘强,刘纪伟,田恬,严薇,刘兵,赵思琪,胡秋辉,丁超

中国农业科学. 2021, 54(2): 379-391. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.013

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【目的】探讨高温胁迫下短期储藏时间内糙米气味指纹图谱变化规律性,为糙米品质劣变的快速检测提供参考。【方法】以17.0%水分含量的新鲜糙米随机等分成6组进行储藏,采用顶空进样方式,分别结合气相色谱质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）和气相离子迁移谱技术（gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS）,对高温储藏环境（40℃、相对湿度70%）中0、5、10、15、20和25 d的糙米挥发性化学成分及GC-IMS指纹图谱进行对比分析,并结合动态主成分和统计学方法进行数据分析。【结果】GC-MS定量分析表明,在新鲜糙米顶空气体成分中共检测出42种挥发性成分（GC-MS匹配度>85%）,主要由醛类、醇类、烃类组成,含量占比超过85%。高温短期储藏15 d后,正己醛含量从初始的（81.09±0.53）μg·kg^-1显著上升至（185.18±15.71）μg·kg^-1,储藏25 d时,又急剧下降至（12.89±0.72）μg·kg^-1（P<0.01）。部分物质如苯甲醇、1-辛烯-3-醇、苯乙烯等在储藏过程中被检出。结合GC-IMS方法,乙酸丙酯对应的气味挥发性色谱分离离子迁移信号随储藏时间延长而逐渐降低,可以作为糙米高温储藏期的重要标识物质。动态主成分降维处理后表明,基于GC-IMS气味指纹图谱可以区分不同储藏时间的糙米样品。与GC-MS相比,GC-IMS在糙米挥发性醇类、酮类等挥发性物质定性识别方面优势较为明显。【结论】GC-MS和GC-IMS技术结合气味指纹图谱的主成分分析可以对高温胁迫下短期储藏糙米的挥发特性进行有效的定性与定量分析,为高温环境下不同储藏阶段糙米样品的准确区分和糙米储藏新鲜度的判定提供技术参考。

稳定同位素技术在肉羊产地溯源中的应用

王倩,李政,赵姗姗,郄梦洁,张九凯,王明林,郭军,赵燕

中国农业科学. 2021, 54(2): 392-399. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.014

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【目的】通过比较不同部位羊肉中碳氮稳定同位素差异,以及对羊肉、全骨粉、脱脂骨粉与骨胶原的稳定同位素分析,为肉羊产地溯源鉴别提供技术支持。【方法】利用同位素比率质谱仪（IRMS）测定不同部位脱脂羊肉中δ¹³C和δ¹⁵N值,进而比较不同产地来源（新西兰和中国宁夏、甘肃、安徽）的羊肉、全骨粉、脱脂骨粉与骨胶原中δ¹³C和δ¹⁵N值,并对结果进行方差分析、线性判别分析与相关性分析,确定碳氮稳定同位素对肉羊产地的溯源能力。【结果】后腿、排骨与胸叉、腹腩、脖子中δ¹³C值具有显著性差异（P<0.05）,δ¹⁵N值在后腿、胸叉、排骨、腹腩和脖子5个部位间无显著差异（P>0.05）。不同产地（宁夏、甘肃、安徽和新西兰）的脱脂羊肉、全骨粉、脱脂骨粉与骨胶原中δ¹³C和δ¹⁵N值差异显著（P<0.05）,其中脱脂羊肉对产地溯源判别效果最佳,原始判别正确率为84.9%,交叉验证判别正确率为82.4%。全骨粉与骨胶原对产地判别正确率达65%以上。相关性分析结果表明脱脂羊肉、全骨粉、脱脂骨粉与骨胶原中δ¹³C、δ¹⁵N具有极显著相关性（P<0.01）,骨胶原与脱脂骨粉、全骨粉中碳同位素相关性最高,相关系数分别为0.903和0.866。【结论】稳定同位素可有效鉴别不同产地来源的肉羊样品,羊肉、全骨粉、脱脂骨粉及骨胶原中稳定同位素组成变化趋势基本一致,因此,利用稳定同位素技术对肉羊进行产地溯源是可行的。

CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

李松美,仇雨歌,陈胜男,王晓萌,王春生

中国农业科学. 2021, 54(2): 400-411. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.015

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【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。

rhPA/GH双转基因兔的制备及rhPA表达检测

宋绍征,于康英,张婷,陆睿,潘生强,成勇,周鸣鸣

中国农业科学. 2021, 54(2): 412-421. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.016

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【目的】双基因共整合可协同促进转基因生物的目的基因表达水平提高,研究获得rhPA/GH双转基因兔,并比较分析目的基因rhPA的表达水平及兔个体生长发育情况,为制备高表达rhPA转基因动物和遗传育种提供新思路。【方法】利用NotⅠ/SalⅠ双酶切PCL25/GH质粒和QIAGEN DNA胶纯化试剂盒回收显微注射用基因片段。以3只rhPA单转基因兔（标号K06、K10、K17）作为供体兔,通过FSH/hCG超数排卵、受精卵原核显微注射、胚胎移植、苯酚/氯仿抽提新生仔兔耳尖组织基因组、PCR整合检测等方法获得rhPA/GH双转基因兔。经ELISA和Western blotting对转基因兔乳清进行表达检测,比较分析单、双基因表达rhPA水平。测量不同月龄的转基因兔体重,通过监测双转基因兔不同生长阶段的体重来分析GH对兔生长发育的影响。【结果】成功获得了约16 700 bp 大小的显微注射用基因片段,共超排3只供体兔获得122枚卵,其中103枚受精卵,受精率为84.4%（103/122）,显微注射后挑取形态较好的81枚移植6只同步发情受体兔,5只兔怀孕,妊娠率为83.3%（5/6）,妊娠到期共出生32只仔兔。通过PCR检测鉴定有19只携带rhPA基因的转基因兔,其中有11只rhPA/GH双转基因兔（7♂,4♀）,双基因整合率为34.4%（11/32）,且4只rhPA/GH双转基因母兔来源亲代分别为K06供体兔2只（标号K06-1、K06-2）、K10供体兔1只（标号K10-1）、K17供体兔1只（标号K17-1）。K06号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.2μg·mL^-1,K06-1和K06-2号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量分别为432、444μg·mL^-1;K10号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.8μg·mL^-1,K10-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为636μg·mL^-1;K17号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为15.2 μg·mL ^-1,K17-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为248 μg·mL ^-1。4只rhPA/GH双转基因母兔（K06-1、K06-2、K10-1、K17-1）乳腺表达rhPA含量在248-636μg·mL^-1之间,远远高于rhPA单转基因母兔（K06、K10、K17）乳腺的表达含量（15.2-42.8μg·mL^-1）,表达水平显著提高了约10.2-16.3倍,说明GH能够协同促进目的基因rhPA在转基因兔乳腺中的表达水平。Western blotting结果显示出现一约39.0 kD大小的条带,与目的蛋白rhPA大小相同,进一步证明转基因兔乳腺中表达的这种蛋白为目标产物rhPA。对rhPA/GH双转基因兔从出生到6个月的体重进行连续测量,发现与正常非转基因兔的体重没有明显的差异,绘制生长曲线进一步表明4只整合GH的转基因兔与2只未整合GH的正常兔在生长发育的不同阶段体重上没有显著性差异,成长至6个月的体重均在4.0-5.0 kg之间,这证明GH的导入并不影响转基因兔的存活和正常生长发育至成年。【结论】成功地制备了rhPA/GH双转基因兔,并证明了GH基因的导入能够显著地提高目的基因rhPA的表达量,且不会对转基因兔的生长发育产生影响,这为将来制备高表达转基因兔及其它动物奠定了基础,也为转基因动物乳腺生物反应器和转基因育种建立提供了新思路、新方法。

断奶前后非特异病原性腹泻羔羊生长生理及肠道菌群差异性比较

杨柠芝,李婷,王燕,陈卓,马义诚,任强林,刘佳佳,杨会国,姚刚

中国农业科学. 2021, 54(2): 422-434. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.017

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【目的】羔羊腹泻是由病原微生物、营养改变、环境应激等多因素互作所致的新生和断奶时期危害羔羊生长的临床常见病之一。对断奶前后腹泻羔羊的生长生理与肠道菌群变化与其同期健康羔羊进行比较。为不同生长阶段羔羊腹泻的针对性防治研究奠定科学基础。【方法】在对羔羊腹泻进行临床调查的基础上,随机选择断奶前（31—45日龄）健康和腹泻羔羊各10只、断奶后（60—75日龄）健康和腹泻羔羊各10只分成4组进行生长生理、血液生理生化指标及相关炎性因子指标测定。采集直肠粪样,用16S rRNA测序进行肠道菌群组成结构比较分析。【结果】（1）断奶前健康与腹泻羔羊体重差异不显著。而断奶后腹泻羔羊体重极显著低于健康羔羊（P<0.01）,且腹泻羔羊的体温、脉搏和呼吸频率也均显著低于健康羔羊（P<0.05）。（2）断奶前腹泻羔羊总蛋白、球蛋白、胆固醇等生化指标显著低于健康羔羊（P<0.05）。断奶后腹泻羔羊白细胞总数极显著高于健康羔羊（P<0.01）,尿素氮、肌酐、磷、血糖和总胆红素显著低于健康羔羊（P<0.05）,炎性因子IL-4、IL-6、IL-8显著高于健康羔羊。（3）断奶后健康羔羊与腹泻羔羊肠道菌群共有OTUs占比较断奶前上升近一倍。断奶前腹泻羔羊肠道菌群Alpha多样性显著降低（P<0.05）。健康与腹泻羔羊的肠道菌群PCoA分布差异显著（Weighted UniFrac Adonis和Anosim检验水平,P<0.05）,而断奶后组间差异不显著。门水平：与其同期健康羔羊相比,断奶前腹泻羔羊梭杆菌门相对丰度显著升高（P<0.05）,疣微菌门和放线菌门相对丰度显著下降（P<0.05）。断奶后,腹泻羔羊黏胶球形菌门和放线菌门相对丰度显著下降（P<0.05）。属水平：与其同期健康羔羊相比,断奶前腹泻羔羊梭杆菌属和梭菌属显著升高（P<0.05）,而艾克曼菌属、脱硫弧菌属和丁酸弧菌属显著下降（P<0.05）。断奶后,腹泻羔羊瘤胃球菌属显著下降（P<0.05）,而脱硫弧菌属显著升高（P<0.05）。【结论】本研究结果表明断奶前腹泻羔羊主要发生蛋白质和血脂降低;而断奶后腹泻羔羊的生理变化以尿素氮、肌酐和血糖等指标的下降为特点。断奶前腹泻羔羊肠道菌群失调变化明显;而断奶后腹泻羔羊炎症反应等变化明显。这些差异可能与断奶所引起的日粮组成结构和环境因素改变密切相关。

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中长链非编码RNA的比较及潜在功能分析

陈华枝,王杰,祝智威,蒋海宾,范元婵,范小雪,万洁琦,卢家轩,郑燕珍,付中民,徐国钧,陈大福,郭睿

中国农业科学. 2021, 54(2): 435-448. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.018

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【背景】蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,可引起成年蜜蜂数量和蜂群群势的急剧下降。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类新近发现的非编码RNA,在表观遗传、细胞周期、剂量补偿等众多生命活动中发挥重要生物学功能。【目的】明确球囊菌菌丝和孢子中lncRNA的数量、种类和表达谱差异,并探究共有lncRNA、特有lncRNA和差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）在菌丝与孢子中的潜在功能。【方法】利用基于链特异性建库的lncRNA-seq技术对球囊菌的纯化菌丝（AaM）和纯化孢子（AaS）分别进行测序。根据FPKM（Fragment Per Kilobase of per Million mapped reads）法计算lncRNA在AaM和AaS中的表达水平。通过Venn分析筛选AaM与AaS的共有lncRNA和特有lncRNA。按照P≤0.05且|log₂ fold change|≥1的标准筛选AaM vs AaS比较组中的DElncRNA。通过Blast工具将共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的上下游基因比对GO和KEGG数据库,以进行功能及通路注释。根据靶向结合关系构建共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络并利用Cytoscape软件进行可视化。利用RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】AaM和AaS分别测得108 614 646和105 675 408条原始读段（raw reads）,经严格过滤得到107 780 032和104 621 402条有效读段（clean reads）,Q20分别为98.76%和98.72%,Q30分别达到95.84%和95.78%。共鉴定到850个lncRNA。AaM和AaS的共有lncRNA为701个,二者的特有lncRNA分别为39和110个。上述共有lncRNA通过顺式作用调控3 992个上下游基因,它们涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等42个功能条目,以及代谢途径、次生代谢物的生物合成和抗生素的生物合成等117条通路;AaM的特有lncRNA和AaS的特有lncRNA通过顺式作用分别调控243和672个上下游基因。AaM vs AaS比较组包含的255个DElncRNA通过顺式作用调控1 479个上下游基因,它们涉及代谢进程、细胞进程和催化活性等41个功能条目,以及代谢途径、次生代谢产物的生物合成和抗生素的生物合成等107条通路。从共有lncRNA、孢子特有lncRNA和DElncRNA中分别预测到41、5和13个微小RNA（microRNA,miRNA）的前体序列。调控网络分析结果显示,菌丝lncRNA、孢子lncRNA形成较为复杂的ceRNA调控网络;菌丝lncRNA可靶向结合8个miRNA,进而调控77个mRNA;孢子lncRNA可靶向结合7个miRNA,进而调控87个mRNA;2个DElncRNA（TCONS_00008630与TCONS_00009302）可靶向结合miR-4968-y,进而调控10个mRNA。RT-qPCR验证结果显示4个DElncRNA的差异表达趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可靠。【结论】共有lncRNA、特有lncRNA和DElncRNA可能通过调控上下游基因的表达,作为miRNA的前体,以及充当ceRNA影响菌丝和孢子的物质和能量代谢、自噬、转录、MAPK信号通路、泛素介导的蛋白水解、蛋白酶体以及次生代谢产物的生物合成等生物学过程,从而调节球囊菌的生长、发育、生殖和致病性。

大豆品种特性对腐竹产量及品质的影响

曾仕晓,年海,程艳波,马启彬,王亮

中国农业科学. 2021, 54(2): 449-458. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.019

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【目的】大豆（Glycine max L.）含有丰富的植物蛋白和油脂,因而成为一种具有较高经济价值的作物。探究不同大豆品种的腐竹加工产量及不同大豆品种生产的腐竹在蛋白质、油分、可溶性糖、异黄酮之间的相关性,为制作生产高异黄酮腐竹提供参考依据。【方法】采用来自黑龙江和广东大豆产区的品种24份,用同一工艺制作腐竹,然后用凯氏定氮法测定大豆和腐竹中蛋白质,用索氏抽提法测定油分,用蒽酮比色法测定可溶性糖,用高效液相色谱法测定大豆和腐竹中的异黄酮含量。【结果】不同品种在腐竹产量和品质方面都存在明显的差异,大豆品种华夏8号制得腐竹产率最高,达到60.50%;其次为品种华春2号,为52.44%,这两个品种是制作腐竹的理想品种;此外,绥农37、华春6号和黑河43的腐竹生产率分别达到了48.59%、48.37%和47.91%,也是产率比较高的品种。相关分析结果表明,腐竹产量与大豆中蛋白质含量呈显著正相关（r=0.598**）,与大豆中的可溶性糖呈负相关（r=-0.423*）。腐竹蛋白质含量、油分含量及异黄酮含量3个性状都分别与大豆种子对应的性状呈极显著正相关（r分别为0.700**、0.537**和0.879**）;腐竹可溶性糖含量与大豆可溶性糖含量呈显著正相关（r=0.441*）。腐竹中的蛋白质含量与大豆可溶性糖含量呈极显著负相关（r=-0.519**）。腐竹中的油分含量与大豆中蛋白质呈极显著负相关（r=-0.889**）,与大豆中可溶性糖和异黄酮含量呈极显著正相关（r分别为0.614**和0.574**）;腐竹中异黄酮含量与大豆中蛋白质含量呈极显著负相关（r=-0.589**）,与大豆中可溶性糖含量呈极显著正相关（r=0.568**）。【结论】大豆品种的腐竹产率和主要品质性状存在显著差异,其中,华夏8号、华春2号是制作腐竹的高产品种,大豆品种的品质特性决定了腐竹的品质特性,其主要由大豆品种的遗传特性决定的。

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