中国农业科学

青藏高原青稞蛋白质含量空间分异规律及其与环境因子的关系

王建林，钟志明，冯西博，付刚，侯维海，王改花，大次卓嘎

中国农业科学. 2017, 50(6): 969-977. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.001

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【目的】揭示不同环境因子对青藏高原青稞籽粒蛋白质含量（GPC）的影响程度，完善青稞GPC空间分异与环境因子的关系，明确青藏高原不同地区青稞GPC的环境响应。【方法】利用农学和地理学相结合的研究方法，研究青藏高原青稞GPC的分布特征及其与环境因子之间的关系。【结果】在地理水平方向上，青藏高原青稞GPC总体呈现出斑块状交错分布的格局和南高北低的态势，并形成了2个青稞GPC高值区。其中一个是介于东经100.0°—102.5°、北纬35.0°—37.5°，以青海共和、贵德、门源、同德和甘肃合作为中心的青藏高原东北部高值区，这一区域青稞GPC平均值为（13.1163±0.5939）%；另一个是介于东经86.0°—92.0°、北纬28.0°—29.0°，以西藏贡嘎、拉孜、尼木、扎囊、聂拉木、堆龙德庆、桑日、康马为中心的青藏高原中南部高值区，这一区域青稞GPC平均值为（12.8715±0.6609）%；在地理垂直方向上，随着海拔升高，青稞GPC呈现出“倒N”型分布格局，即从海拔3 000 m以下的高值区（此海拔区间青稞GPC平均为（10.8650±1.8600%））随着海拔的升高，青稞GPC逐渐减少，在海拔3 000—3 300 m达到低值区。在海拔3 000—3 300 m，随着海拔的升高，青稞GPC逐渐增加，在3 600—3 900 m达到最高值区，此海拔区间青稞GPC平均为（10.8937±2.0719）%。此后，又随着海拔的升高，青稞GPC逐渐减少。影响青稞GPC的环境因子从大到小的顺序是土壤速效氮含量＞抽穗-成熟期日照时数＞出苗-分蘖期平均气温日较差＞分蘖-拔节期平均气温日较差＞拔节-抽穗期相对湿度。【结论】影响青稞GPC最大的环境因子主要是土壤因子，其次是气候因素，地理因子无明显影响。影响青稞GPC的土壤因子主要是土壤速效氮含量，气候因子主要是抽穗-成熟期日照时数、出苗-分蘖期平均气温日较差、分蘖-拔节期平均气温日较差和拔节-抽穗期相对湿度。青稞GPC含量随着分蘖-拔节期平均气温日较差、拔节-抽穗期相对湿度的增加而显著增加，但随着抽穗-成熟期日照时数、出苗-分蘖期平均气温日较差和土壤速效氮含量的增加而显著降低。

玉米穗下节间长的杂种优势位点解析

李慧敏，李卫华，郭海平，刘坤，张向歌，张晓祥，谢惠玲，汤继华，丁冬

中国农业科学. 2017, 50(6): 978-989. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.002

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【目的】穗下节间长决定着玉米的株高和穗位高2个重要的农艺性状，并与产量、抗倒性等性状密切相关。前期研究发现玉米穗下第7、8、9节间长对穗位高具有决定作用，并表现出较强的杂种优势。文章拟解析玉米穗下节间长，尤其是穗下第7、8、9节间长杂种优势的决定因子，为全面了解和应用杂种优势奠定基础。【方法】利用以lx9801为遗传背景的昌7-2染色体单片段代换系（single segment substitution lines, SSSL）为基础材料，分别与优良自交系郑58和浚9058构建了两套测交群体，通过两年两点试验对玉米第7、8、9节间长进行杂种优势位点分析。【结果】利用SSSL×郑58测交群体和SSSL×浚9058测交群体通过两年两点试验发现，2012年在浚县的第7、8、9节间长的中亲优势值分别为57.25%和78.16%、68.30%和75.04%、59.48%和62.85%；2012年在长葛的第7、8、9节间长的中亲优势值分别为48.27%和63.02%、43.36%和54.80%、37.26%和42.62%；2013年在浚县的第7、8、9节间长的中亲优势值分别为23.01%和37.00%、22.69%和35.65%、22.20%和34.74%；2013年在长葛的第7、8、9节间长的中亲优势值分别为21.86%和33.19%、20.99%和35.57%、27.55%和42.19%；共定位了18个和18个第7节间长杂种优势位点，20个和23个第8节间长杂种优势位点，17个和19个第9节间长杂种优势位点。2个测交群体第7、8、9节间长相同的HL分别有3个、3个和1个，共有7个HL相同，分别占2个总测交群体中HL数的12.7%和11.6%。【结论】在SSSL×郑58群体定位的第7、8、9节间长HL与SSSL×浚9058群体的定位结果相比仅有7个（6%）相同位点，说明不同群体之间的杂种优势位点差别较大，几乎没有相同的杂种优势位点，推测在不同遗传背景下控制同一性状的杂种优势位点并不相同，据此推论，在单基因水平上，杂种优势位点表现出杂交组合（遗传背景）特异的特征。

马铃薯遗传育种研究：现状与展望

徐建飞，金黎平

中国农业科学. 2017, 50(6): 990-1015. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.003

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马铃薯是世界第三大粮食作物，马铃薯产业的可持续发展对保障世界和中国的粮食安全具有重要意义。优良品种是支撑马铃薯产业发展的基础。马铃薯经常遭受病虫害的侵袭和非生物胁迫，加工业的迅速发展和人们对食物营养的重视，迫切需要选育出更抗病、更耐逆、更高产、更优质和专用的马铃薯新品种。培育一个优良马铃薯品种，种质资源是基础，重要性状的遗传学是理论指导，先进的育种技术是保障，完善的推广和栽培模式是支撑。世界范围内，保存了大约65 000份马铃薯种质资源，通过对种质资源抗病、抗逆和品质方面的系统评价，并应用多种资源利用技术，将三大类约17个野生种的种质导入到普通栽培种中，应用于育种和遗传学研究。利用纯合双单倍体材料作为测序对象，马铃薯基因组序列已经被揭示，预测出了39 031个蛋白编码基因，目前更多的种质资源正在被重测序以揭示更多的等位变异。马铃薯普通栽培品种是无性繁殖四倍体作物，具有四体遗传特性，尽管如此，许多植株发育和形态、块茎品质和抗病抗逆等重要性状的遗传特性基本明确，并定位和克隆了大量重要性状相关基因。目前，马铃薯育种技术主要涵盖传统育种技术、倍性育种技术、标记辅助选择育种技术、基因工程育种技术和新兴的基因组选择育种技术。中国马铃薯遗传育种研究队伍不断壮大，品种选育取得了重大进展。荷兰马铃薯遗传育种水平居于世界前列，合作育种模式推动了商业化育种。不断完善马铃薯综合育种技术，创新育种模式和机制，充分利用现有种质资源培育突破性、专用型品种将是未来马铃薯遗传育种发展的主要方向。

黄土旱塬耕作方式和施肥对冬小麦产量和水分利用特性的影响

张建军，樊廷录，党翼，赵刚，王磊，李尚中，王淑英，王勇

中国农业科学. 2017, 50(6): 1016-1030. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.004

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【目的】探讨耕作方式与施肥措施对陇东黄土旱塬黑垆土冬小麦-春玉米轮作农田冬小麦产量、水分利用效率及耗水特性的影响。【方法】以设在半湿润偏旱区甘肃省镇原县连续12年的耕作与肥料长期定位试验为平台，采用裂区设计，以传统耕作和免耕为主处理，CK、N、P、M、NP、NMP为副处理，栽培制度为1年春玉米-3年冬小麦轮作，研究了不同耕作方式及施肥措施条件下的冬小麦产量、水分利用效率、耗水特性及产量与耗水量的关系。【结果】在产量方面，相同耕作方式以有机无机肥配施或无机肥配施高于有机肥或无机肥单施，有机肥单施优于化肥单施，磷肥单施优于氮肥单施；耕作方式间为传统耕作高于免耕。在水分利用特性方面，无论何种耕作方式及降雨年型，不同施肥措施在不同年份均以NMP水分利用效率最高，显著高于CK和其他处理，平均水分利用效率大小顺序为NMP＞NP＞M＞P＞CK＞N，传统耕作和免耕NMP较CK分别增加84.0%和84.1%；相同施肥措施中传统耕作高于免耕，NMP传统耕作较免耕增加13.6%。不同耕作方式及施肥措施冬小麦阶段耗水量与降雨量密切相关，其中NMP总耗水量相对较高，传统耕作干旱年、平水年、丰水年较CK分别增加了3.0%、4.4%、31.4%，免耕分别增加了10.2%、1.5%、25.7%，且NMP明显降低了播种—返青阶段耗水量及占总耗水量的比例，增加了返青—成熟阶段耗水量。耕作方式间总耗水量变化趋势基本为干旱年传统耕作高于免耕，丰水年和平水年免耕高于传统耕作，而降雨年型间总耗水量变化不一致。另外，无论何种降雨年型，不同耕作方式及施肥措施均在60 cm土层含水量呈拐点变化趋势，但拐点处含水量变化不同，其中NMP低于CK及其他施肥处理，变化顺序为丰水年＞平水年＞干旱年。不同施肥措施的边际水分利用效率以NMP最高，耕作方式为传统耕作高于免耕。【结论】无论何种耕作方式及降雨年型，不同年份NMP冬小麦产量、水分利用效率及边际水分利用效率均最高，收获期60 cm土层处含水量出现低值。总耗水量以NMP相对较高，且NMP有利于降低播种—返青阶段耗水量及其占总耗水量的比例，增加返青—成熟阶段耗水量和0—200 cm土层贮水量的消耗。耕作方式及施肥措施间冬小麦水分利用效率、边际水分利用效率均为传统耕作高于免耕。因此，综合考虑冬小麦产量、水分利用效率及耗水特性，认为无论何种降雨年型，采用传统耕作结合有机无机肥配施是本试验条件下的最优耕作施肥组合模式。

周年氮磷钾配施模式对砂姜黑土麦玉轮作体系籽粒产量和养分利用效率的影响

王永华，黄源，辛明华，苑沙沙，康国章，冯伟，谢迎新，朱云集，郭天财

中国农业科学. 2017, 50(6): 1031-1046. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.005

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【目的】探讨周年不同氮磷钾配施对砂姜黑土麦玉轮作体系产量及养分利用效率的影响，明确适宜豫东南砂姜黑土麦玉一体化种植的氮磷钾配施模式。【方法】于2012—2014年连续两年在河南省周口市商水县典型砂姜黑土区设置氮磷钾不同配施大田定位试验，研究磷钾肥总用量不变、2种氮用量投入水平下麦玉两季磷钾配施模式对冬小麦-夏玉米轮作种植体系氮、磷、钾养分吸收利用及产量的调控效应。其中，氮肥设全年用量360.00 kg·hm^-2和540.00 kg·hm^-2两个梯度，磷钾肥总量不变，设计4种配施方式，即麦季全磷玉米全钾（磷肥和钾肥分别全部施用于小麦季和玉米季）、麦季全磷玉米重钾（磷肥全部施用于小麦季，钾肥按麦玉两季42﹕58的比例分配）、麦季重磷玉米全钾（磷肥按麦玉两季64﹕36的比例分配，钾肥全部施用于玉米季）、麦季重磷玉米重钾（磷肥按麦玉两季64﹕36的比例分配，钾肥按麦玉两季42﹕58的比例分配）。【结果】高氮水平下麦玉两季磷钾肥分施能促进作物产量三要素的协调发展，显著提高冬小麦的穗数和夏玉米的穗长与行粒数，且两年度单季作物和全年籽粒产量均以麦季重磷且玉米季重钾P8处理最高，周年产量分别达21 274.2 kg·hm^-2和20 219.1 kg·hm^-2。砂姜黑土区冬小麦和夏玉米地上部养分含量大小均表现为氮＞钾＞磷。与低氮水平相比，高氮水平有利于提高植株地上部总氮、磷、钾的含量，然而氮素的偏生产力（NPFP）、吸收效率(NUPE)、利用效率(NUE)有所降低。磷钾肥分施不仅能促进冬小麦和夏玉米对氮素的吸收，还可有效防止元素的流失，提高作物对磷素和氮素的吸收和利用，显著提高磷钾两类元素的偏生产力（PFP）、吸收效率(UPE)。而磷钾全施在麦玉某一季作物上，由于磷肥易固定、钾肥易流失的原因，造成肥料后效减小，下茬作物因养分供给不平衡而影响作物对氮磷钾的吸收利用，致使产量降低。低氮水平下麦季重磷、玉米季重钾P4处理的氮磷钾养分利用较其他处理表现较优；高氮水平下麦季重磷、玉米季重钾P8处理的单季和周年氮素偏生产力及吸收效率均显著高于其他处理。【结论】综合考虑养分利用效率和籽粒产量，在本试验条件下，麦季重磷、玉米季重钾配施模式有利于养分效率和产量的同步提高，可作为豫东南砂姜黑土及相似生态类型区冬小麦-夏玉米轮作种植高产高效施肥的优选模式。

褐飞虱海藻糖酶基因在表皮几丁质代谢中的调控作用

张露，朱世城，郑好，沈祺达，王世贵，唐斌

中国农业科学. 2017, 50(6): 1047-1056. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.006

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【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后，检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶（chitin synthase，CHS）和几丁质酶（chitinase，Cht）基因表达情况，探究不同的海藻糖酶（trehalase，TRE）在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术，以实验室饲养种群褐飞虱为材料，通过向其体内注射双链RNA（dsRNA）分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因，注射48 h后通过Trizol法提取褐飞虱总RNA，反转录试剂盒合成第一链DNA后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测该基因的表达情况，确定RNAi效果。氢氧化钾法测定48 h褐飞虱整体几丁质含量变化并对蜕皮困难虫体进行拍照；最后采用qRT-PCR检测褐飞虱CHS和Cht在mRNA水平上的相对表达量变化，分析TRE在调控几丁质代谢中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较，其余各注射组褐飞虱整体几丁质含量显著下降，其中dsTRE1混合注射组与Validamycin注射组呈极显著下降，同时褐飞虱出现蜕皮困难等现象。qRT-PCR检测结果显示单个TRE的dsRNA注射后该基因的表达被抑制，但是部分TRE的表达有互补性上升。其中TRE1-2和TRE2在各注射组处理下表达均下降，dsTRE1s对TRE2的表达也有抑制效果，整体上dsTRE1混合注射组和海藻糖酶抑制剂Validamycin抑制效果明显；dsTRE注射组抑制CHS表达效果不明显，Validamycin能够显著降低CHS1和CHS1a在表皮中的表达，且2种dsTRE1注射后CHS1表达在上升，dsTRE1-2注射后表皮中的CHS1a的表达上升；Cht1和Cht8在dsTRE各注射组及Validamycin处理中表达下降或显著下降，dsTRE1-1注射后Cht2和Cht5表达显著上升；dsTRE1-2注射后Cht1、Cht6和Cht8表达下降，Cht2和Cht4表达显著上升；dsTRE2处理组中Cht1、Cht8和Cht10表达下降而Cht9表达显著上升；dsTRE1s注射后，Cht1和Cht5表达显著下降，而Cht9表达显著上升；Validamycin注射组中10个几丁质酶基因表达都显著或者极显著下降。【结论】TRE能够通过调控褐飞虱几丁质代谢途径来控制几丁质的合成，结果可为开展和筛选有效的海藻糖酶抑制剂控制褐飞虱等害虫提供理论依据。

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

赵盼，张学尧，刘晓健，赵小明，于荣荣，董玮，马恩波，张建珍，张敏

中国农业科学. 2017, 50(6): 1057-1066. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.007

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【目的】体外真核表达飞蝗（Locusta migratoria）几丁质脱乙酰基酶1和2（chitin deacetylase 1 and 2，LmCDA1和LmCDA2）并测定其酶活性，为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域；PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列，并分别构建pFastBac-LmCDAs重组质粒，转化获得Bacmid重组质粒后，转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测，并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子（Q-Sepharose）交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12% SDS-PAGE检测蛋白纯度后，采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性，T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域：N-端信号肽（signal peptide）、几丁质结合域（chitin binding peritrophin-A，ChBD）、A型低密度脂蛋白受体结构域（low-density lipoprotein receptor class A，LDLa）和脱乙酰基酶催化结构域（catalytic domain，CDA）。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间（67—84 aa）的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸（84—106 aa）之间的序列存在差异外，其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 kD左右，与预测的蛋白分子量大小一致，表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12% SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测，结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱，而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL^-1，并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力，且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异，推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。

不同气候与施肥条件下农田土壤微生物生物量特征与容量分析

王传杰，肖婧，蔡岸冬，张文菊，徐明岗

中国农业科学. 2017, 50(6): 1067-1075. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.008

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【目的】土壤微生物生物量是土壤生物肥力的重要指标，是土壤养分重要的周转库。探讨不同气候和施肥条件下土壤微生物生物量（生物量碳、氮）的特征及容量，对于深刻认识土壤微生物生物量的影响因素及提高土壤生物肥力具有重要意义。【方法】本研究从中国知网、万方和web of Science 3个文献数据库，以“土壤微生物生物量”、“中国农田”和“长期施肥”为关键词，共收集目标文献42篇，包括458组含土壤有机碳（SOC）与土壤微生物生物量碳（SMBC）和414组含土壤全氮（TN）与土壤微生物生物量氮（SMBN）的数据集，涵盖了4种气候下的2类施肥条件（施有机肥：单施或配施，＋OM；不施有机肥：无肥和化肥，－OM）。土壤微生物熵（SMBC/SOC）和SMBN/TN的中值差异性均采用Kruskal-Wallis H 单向显著性检验（P＜0.05），容量分析采用界限分析方法。【结果】统计分析结果表明，不同施肥处理下，SMBC与SOC和SMBN与TN之间均存在显著线性正相关关系（P＜0.01），长期施用有机肥条件下，土壤微生物生物量碳、氮对土壤有机碳和全氮增加的响应系数分别为24.77和30.27，显著高于化肥或不施肥条件（分别为19.88和19.86）（P＜0.05）。界限分析结果显示，不同施肥措施下SMBC对SOC增加响应的最大值为33.45—36.00，SMBN对TN的最大响应系数为45.45—49.79，当前条件下SMBC和SMBN还有37.99%和49.66%的提升空间。不同气候条件下SMBC/SOC和SMBN/TN均存在显著差异（P＜0.05），其中，中温带半干旱半湿润区SMBC/SOC的中值最高为2.73%，其次为亚热带湿润区（2.45%）和暖温带湿润区（2.31%），中温带湿润区最低为1.48%；SMBN/TN的中值大小顺序为：暖温带湿润区（4.72%）＞中温带半干旱半湿润区（3.50%）＞亚热带湿润区（2.99%）＞中温带湿润区（1.80%）。不同施肥条件下SMBC/SOC和SMBN/TN的变化范围分别为0.35%—6.50%和0.50%—9.72%，但其中值并无显著差异（P＞0.05）。对于同一气候条件不同施肥措施而言，仅在中温带湿润区，施有机肥处理对微生物量碳（氮）占总有机碳（氮）的比例有显著影响（P＜0.05）。【结论】气候对土壤微生物生物量碳、氮所占比例具有显著影响，不同施肥模式虽然不能显著改变微生物生物量碳、氮的比例，但有机肥的施用对微生物生物量碳、氮的提升效果显著高于化肥或不施肥，该结果对于土壤生物肥力的调控有重要指导意义。

减量施氮对玉米/大豆套作系统中作物氮素吸收及土壤氨氧化与反硝化细菌多样性的影响

周丽，付智丹，杜青，陈平，杨文钰，雍太文

中国农业科学. 2017, 50(6): 1076-1087. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.009

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【目的】揭示玉米/大豆套作系统下作物根际土壤细菌数量及群落多样性变化特征与土壤总氮含量、作物氮素吸收之间的关系，为禾/豆间（套）作减肥增效生产提供理论和技术支撑。【方法】大田试验于2013—2015年进行，采用两因素裂区设计，主因素为种植模式，设玉米单作（MM）、大豆单作（SS）和玉米/大豆套作（IMS）；副因素为玉米、大豆施氮总量，设不施氮（NN：0）、减量施氮（RN：180 kg·hm^-2）和常量施氮（CN：240 kg·hm^-2）。在玉米V12期、VT期和R6期，大豆V5期、R2期、R5期和R8期，利用稀释平板法和凯氏定氮法测定各作物根际土壤细菌数量、非根际土壤和植株总氮含量；结合克隆文库和荧光定量PCR技术研究各处理氨氧化细菌（amoA基因）、反硝化细菌（nirS基因）多样性及其基因丰度。【结果】与相应的单作相比，套作玉米（IM）的作物根际土壤细菌数量提高2.6%，套作大豆提高12.9%；套作玉米土壤总氮含量和植株吸氮量分别提高13.39%和2.10%，大豆的分别降低5.81%和3.24%；套作玉米、大豆的amoA基因丰度比单作增加了38.5%、64.8%，nirS基因丰度比单作提高57.77%、126.39%。各施氮水平间，RN的玉米根际土壤细菌数量比NN和CN的分别提高9.6%和9.8%，大豆的分别提高11.7%和11.0%；施氮提高了玉米、大豆植株吸氮量和土壤总氮含量，单作玉米随施氮量的增加而增加，套作玉米及单、套作大豆的均在RN下最高；减量施氮提高了玉米、大豆amoA基因多样性指数和单作玉米nirS基因多样性指数，降低了套作玉米和单套作大豆nirS基因多样性指数。【结论】减量施氮有利于增加玉米/大豆套作系统中作物根际土壤细菌数量，调节氨氧化细菌和反硝化细菌群落结构及多样性，改善土壤氮素转化过程，促进玉米、大豆对氮素的吸收，实现节肥增效。

遮光性套袋对桃果实转录组的影响

何平，李林光，王海波，常源升，李慧峰

中国农业科学. 2017, 50(6): 1088-1097. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.010

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【目的】探明遮光性套袋在桃果实上的转录组差异，丰富桃转录组数据信息。【方法】选取遮光性套袋与对照的桃果实样品，利用Illumina HiSeq^TM 2500进行高通量测序，构建桃果实转录组文库，并用测序评估、基因功能注释等生物信息学方法进行分析。【结果】经过测序获得16.62 Gb clean data测序数据，且碱基百分比（Q30）大于91%，遮光性套袋和对照2个桃果实样品分别获得65 300 730个reads和66 603 686个reads，分别有85.73%和84.60%的reads与桃参考基因组匹配。以无袋处理为参考，对转录组数据进行比较，遮光性套袋处理共获得1 963个差异表达基因，其中，下调基因708个，上调基因1 255个；在Nr数据库中对差异基因进一步进行注释，注释到1 957个基因，其中，下调基因有705个，上调基因有1 252个；COG功能注释分析发现这些差异表达基因共获得853个功能注释，涉及23个功能类别；在GO功能注释分析中，注释到1 609个基因，可以分为53个功能分类，这些分类主要涉及到分子结合、催化活性、细胞过程、生物调节等诸多生理生化过程；KEGG分析发现共有421个基因被注释到94个代谢通路中，其中，光合作用相关通路、类黄酮生物合成、核糖体生物合成等通路显著富集。光合作用通路和类黄酮生物合成通路在果实着色中发挥了重要作用，而核糖体生物合成代谢通路在果实成熟着色中的作用尚不明确。同时也进行了两组样品的果实品质检测，结果表明，遮光性套袋对桃果实的可溶性固形物及可溶性总糖产生显著性影响，可溶性固形物及可溶性总糖显著降低，而对于果实总酸的影响不大，在果实大小上几乎没有影响。【结论】在遮光性套袋处理状态下，获得一定数量的桃果实差异表达基因，光合作用通路和类黄酮生物合成通路基因在果实着色中发挥重要作用，遮光性套袋对桃果实的可溶性固形物及可溶性总糖产生显著性影响。

基于EST-SSR标记的贵州野生刺梨居群遗传多样性分析

张怀山，鄢秀芹，鲁敏，王道平，安华明

中国农业科学. 2017, 50(6): 1098-1108. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.011

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【目的】通过分析评价贵州野生刺梨（Rosa roxburghii Tratt）资源居群遗传多样性和遗传结构，为刺梨资源的保护和发掘利用提供科学依据。【方法】从刺梨EST-SSR引物中筛选扩增效果好、多态性较高的10对引物，对收集的12个野生刺梨自然居群（共255份资源）的遗传多样性及遗传结构应用POPGENE 1.31软件进行分析,并根据Nei’s标准遗传距离，利用NTSYS-pc2.10e软件对各居群进行聚类分析，同时进行Nei’s遗传距离与地理距离的Mantel相关性检验。【结果】居群内Shannon信息指数（I）为0.62—0.88，基因多样性指数（Nei’s）为0.40—0.52，且除福泉（FQ）和晴隆（QL）居群外，其余10个居群的多态位点百分率均为100%。此外，卡方检验显示12个居群在大多数位点上等位基因显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P<0.05），且居群内近交系数（F_it）、总近交系数（F_is）均为负值，居群间分化系数F_st平均值0.0403，居群间基因流N_em平均值为5.9484、遗传一致度GI为0.9068—0.9926、最大Nei’s遗传距离为0.0978。各自然居群间Nei’s遗传距离与地理距离存在显著相关性（r=0.2498，P=0.9512）。【结论】10对EST-SSR引物具有高度的多态性，可作为有效的遗传标记用于刺梨居群遗传多样性和遗传结构评价。贵州省野生刺梨自然居群内的遗传多样性较高，存在杂合度过剩的现象，且绝大多数的遗传变异发生在居群内；居群间具有基因交流频繁、遗传一致度高、Nei’s遗传距离小等特点。

不同茶类中挥发性萜类化合物的对映异构体

邵晨阳，吕海鹏，朱荫，张悦，林智

中国农业科学. 2017, 50(6): 1109-1125. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.012

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【目的】挥发性萜类化合物是茶叶香气的重要成分，大多数具有手性结构，存在香气特性完全不同的对映异构体。查明不同茶类中挥发性萜类化合物的立体构型分布特征，为深入研究茶叶香气的形成机理及提高茶叶的香气品质提供科学的理论依据。【方法】采用顶空固相微萃取法结合手性气相色谱-质谱联用技术，以Supelco β-DEX110为手性气相色谱柱，以萜类化合物的不同手性异构体标准品为定性和定量分析的依据，建立茶叶中挥发性萜类化合物的对映异构体分析方法，并对代表性绿茶、红茶、乌龙茶、白茶及黑茶样品中萜类化合物的对映异构体组成及含量进行分析。【结果】建立了9种萜类化合物的对映异构体的检测方法，发现所有茶样中均能检测到芳樟醇、芳樟醇氧化物B的对映异构体：大部分茶样中芳樟醇的主导构型为S型，但英德红茶、云南滇红和印尼白茶中以罕见的R-(-)-芳樟醇为主；芳樟醇氧化物B在绿茶、红茶、白茶及黑茶中的构型完全一致，而部分乌龙茶（岭头单枞、文山包种）中该物质的主导构型与之相反。芳樟醇氧化物A在绿茶及黑茶中主导构型一致，而在祁门红茶、印度大吉岭红茶、水仙乌岽单枞及铁观音中构型相反；芳樟醇氧化物C和D在所有茶样中的构型均保持一致，且大部分仅检测到单一构型。其他重要萜类化合物在茶样中分布情况各异：α-蒎烯仅在正山小种红茶中以高比例的S-(-)-α-蒎烯被检测出；α-松油醇的主导构型及对映异构体过量值在不同种类的茶叶中各不相同；4-萜品醇在所有可测得的茶样中均以R构型为主导，且除六堡茶（黑茶）外，其他茶样中均未检测到S-(+)-4-萜品醇；α-紫罗兰酮在除了绿茶以外的茶样中均能被检测到，且均以单一的R构型存在。定量分析结果表明，芳樟醇在大部分茶样中都具有最高的含量，平均含量白茶>红茶>乌龙茶>绿茶>黑茶；芳樟醇氧化物B的含量在茶叶中往往仅次于芳樟醇，呈现红茶>白茶>乌龙茶>黑茶>绿茶的规律性；而其他萜类化合物在茶样中的含量普遍低于100 ng·g-1，且在不同茶类中含量分布迥异。【结论】明确了不同种类茶叶中9种重要挥发性萜类化合物对映异构体的变化情况，有助于从更深层次上了解茶叶香气品质的化学实质，为今后茶叶香气品质调控、茶叶品种、产地判别以及质量认证等提供了新思路。

八种中式烹饪工艺对牛肉中多环芳烃、反式脂肪酸和亚硝酸盐的影响

张兰，高天丽，刘永峰，赵晶，廖晶，库婷

中国农业科学. 2017, 50(6): 1126-1138. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.013

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【目的】从蒸、煮、炖、烤、炸、煎、干制及腌制八种传统中式烹饪工艺中筛选获得有害物质较少的牛肉处理工艺，为消费者选择有害物质含量较低的烹饪工艺提供理论参考。【方法】通过调控烤、炸、煎3种高温处理的温度和时间，对比分析多环芳烃（PAHs）、反式油酸（C_{18:1 trans-9}）及亚硝酸盐3类有害物质的组分及含量，选出较优的烤、炸、煎烹饪条件；在此基础上，综合分析烤、炸、煎与蒸、煮、炖、干制及腌制8种烹饪工艺对牛肉中有害物质的影响，进而选择较优的中式烹饪工艺。试验分别采用高效液相色谱外标法、气相色谱-质谱外标法及分光光度法测定牛肉中PAHs、C_{18:1 trans-9}及亚硝酸盐的含量。【结果】对照组中共检测出芘、苯并[a]蒽、苣和苯并[k]荧蒽4种，烤制以160—180℃处理为较优，有5种PAHs且含量低，炸制以3—4 min处理含量较低，煎制以2—3 min处理含量较低；8种中式烹饪中，炸、煎的肉样中PAHs种类最多，炸、腌制的肉样中苯并[a]蒽含量较高，蒸制及煎制的肉样中苣含量较高，烤、炸、煎的肉样中苯并[b]荧蒽含量较高，炸、煎的肉样中苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘和二苯并[a, h]蒽含量较高。烤制温度对C_{18:1 trans-9}含量影响不显著（P＞0.05），炸制3 min和煎制2min的肉样中C_{18:1 trans-9}含量均最低（P＜0.05）；8种中式烹饪中，炸、煎的肉样中C_{18:1 trans-9}含量较高（P＜0.05）。烤制160℃和180℃的肉样中亚硝酸盐含量均较低，炸制3 min和煎制2 min的亚硝酸盐含量最低（P＜0.05）；8种烹饪工艺中，炸、煎及腌制的肉样中亚硝酸盐含量较高（P＜0.05）。【结论】对烤、炸、煎3种高温处理，肉样在160℃下烤制40 min，在226—228℃下炸制3 min、煎制2 min时3类有害物质含量较低；综合分析8种工艺，蒸制、煮制、炖制及干制的肉样中3类有害物质种类较少且含量较低。

内皮素3对不同毛色绵羊黑色素细胞的影响

李亚楠，赵兵令，王海东，陈天直，刘颖，常露程，董常生

中国农业科学. 2017, 50(6): 1139-1146. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.014

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【目的】探索内皮素3（EDN3）对来源于不同毛色体外培养的黑色素细胞产生黑色素作用机制及差异的影响。【方法】体外培养不同毛色皮肤来源的黑色素细胞，通过MTT法检测不同细胞在EDN3影响下的增殖率，分别提取两种细胞的总RNA和总蛋白，总RNA经反转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在mRNA水平相对表达量的影响，总蛋白通过Western blot方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在蛋白水平的表达量是否发生变化，结果均使用SPSS19.0软件进行差异显著性分析。【结果】MTT法测得EDN3对黑白两种来源的黑色素细胞的增殖均产生促进作用，实时荧光定量PCR结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB mRNA的相对表达量是正常细胞组的1.7992倍，NRas是正常细胞组的1.8536倍差异极显著(P<0.01)，但TYR mRNA的相对表达量未发生明显变化；添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB mRNA的相对表达量是正常细胞组的2.2512倍，NRas是正常细胞组的1.3859倍，TYR是正常细胞组的15.5710倍差异极显著(P<0.01)；Western blot结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB 蛋白表达量是正常细胞组的3.0827倍差异极显著(P<0.01)，NRas是正常细胞组的1.2936倍差异显著(P<0.05)，TYR蛋白表达量未发生明显变化；添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB 蛋白表达量是正常细胞组的3.9800倍差异极显著(P<0.01)，NRas是正常细胞组的1.3658倍差异显著(P<0.05)，TYR是正常细胞组的1.8498倍差异显著(P<0.05)。【结论】EDN3促进白色来源的黑色素细胞增殖但对色素合成的限速酶TYR未产生促进作用；EDN3促进黑色来源的黑色素细胞增殖并可能促进黑色素生成。

LPS对鹅等级卵泡基质层TLR家族基因表达的影响

应诗家，戴子淳，郭佳佳，施振旦

中国农业科学. 2017, 50(6): 1147-1156. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.015

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【目的】研究鹅卵泡基质层TLR家族基因表达谱及其对LPS不同处理时间后的反应性。【方法】在大群散养条件下，实时观察鹅产蛋过程，分别在产蛋后8和2 h以及产前4、16和28 h注射LPS，并在产蛋后8h屠宰，即LPS作用0、6、12、24和36 h，每个时间点各5只鹅。屠宰时，取卵巢，观察卵泡外观形态，并分离F1 - F5级卵泡基质层。试验鹅自由饮水、自由采食、自然光照。LPS处理0、24和36 h的单个F1-F5级卵泡基质层或卵泡用于基因表达分析，而其他LPS处理的每只鹅等级卵泡基质层RNA等质量混合后用于基因表达分析。采用普通PCR方法检测10种鸟类TLR家族基因的在鹅等级卵泡基质层的表达谱，其中以脾脏组织为阳性对照，以不加cDNA模板为阴性对照。根据RT-PCR的表达谱结果，采用Real-time PCR检测不同等级卵泡基质层TLRs表达水平以及不同LPS处理时间对基质层TLRs表达水平的影响。对不同等级卵泡和不同LPS处理时间对基质层TLRs表达的数据，采用单因子方差分析，Duncan法多重比较；对变性卵泡与对照组基质层TLRs表达水平的数据，采用T检验分析。【结果】（1）已公开的10种鸟类TLR家族基因，如TLRs 1A、1B、2A、2B、3、4、5、7、15和21基因均在等级卵泡基质层组织中表达。（2）随等级卵泡生长，TLRs 2A和15表达水平逐渐升高；F1级卵泡基质层TLR2A表达水平显著高于F3、F4和F5级卵泡，TLR15表达水平显著高于F5级卵泡；其他TLR家族基因，如TLRs 1A、1B、2B、3、4、5、7和21在不同等级卵泡基质层中的表达水平差异不显著。（3）在LPS处理0、6和12 h时，等级卵泡外观形态无明显变化，但在LPS处理24 h时，3只鹅的等级卵泡呈深黄色胶冻状变性；在LPS处理36 h时，全部试验鹅等级卵泡呈深黄色胶冻状变性。（4）与对照组（LPS处理0 h）相比，TLRs 2A、4和5表达水平在LPS处理12和24 h时显著升高，TLR2B表达水平在LPS处理24 h时显著升高，TLRs 7和15表达水平在LPS处理6 - 24 h期间均显著升高，而TLRs 1A、1B、3和21表达水平在LPS处理6 - 24 h期间差异不显著。（5）与等级卵泡基质层相比，在LPS处理24和36 h的变性卵泡中，TLRs 1A、2A、2B、4、5、7和15表达水平显著升高，TLR3表达水平显著降低，而在LPS处理36 h的变性卵泡中，TLRs 1B和21表达水平显著升高。【结论】已发现的10种鸟类TLR家族基因均在种鹅等级卵泡基质层表达，且随LPS作用时间延长，等级卵泡形态结构发生变化，但TLRs表达水平逐渐升高。

中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记鉴定

徐细建，郭睿，骆群，熊翠玲，梁勤，张串联，郑燕珍，张曌楠，黄枳腱，张璐，李汶东，陈大福

中国农业科学. 2017, 50(6): 1157-1166. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.016

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【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）幼虫肠道参考转录组进行de novo组装，并进行功能及代谢通路注释，进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫，将纯化的蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis，简称球囊菌）孢子饲喂3日龄幼虫，剖取4、5和6日龄幼虫肠道，液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染球囊菌的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads，利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx（E-value＜10−5）比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库，对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索，并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物，通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads，de novo组装得到43 557个unigenes，平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库，单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示，11 442条unigenes分布于25个基因家族，其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多，达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示，在生物学进程分类中，注释到细胞进程的基因最多，达4 201个，在分子功能和细胞组分类中，注释到结合与细胞的基因数最多，分别为4 935和2 900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路，注释到核糖体的基因数最多，达385个。利用MISA软件，可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点，随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增，有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组，可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息，也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组，基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记，可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究，也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。

干旱胁迫下割手密根系转录组差异表达分析

刘洪博，刘新龙，苏火生，陆鑫，徐超华，毛钧，林秀琴，李纯佳，李旭娟，字秋艳

中国农业科学. 2017, 50(6): 1167-1178. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.017

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【目的】探明云南割手密82-114受干旱胁迫的内在分子机制，挖掘与抗旱密切相关的功能基因，提高割手密抗旱基因的研究与利用。【方法】以干旱胁迫24、48和72 h的云南割手密82-114的根系进行Illumina HiSeqTM 4000高通量转录组测序分析，将组装得到的Unigene分别与Swiss-Prot、Nr、KOG、Pfam和KEGG数据库进行比对，利用RPKM来衡量各样本间的基因表达丰度，以FDR≤0.05和|log2 fold change|≥1来评估样本间的差异表达基因，通过Gene Ontology（GO）数据库、KEGG pathway数据库对不同干旱胁迫样本差异表达基因的功能和参与的调控路径进行分析。【结果】未胁迫处理的CK与胁迫24、48和72 h后的样本转录组分别检测到134 724、130 368、133 564和131 321个表达基因，与CK相比，各胁迫样本显著上调（或下调）的差异表达基因分别有3 061（1 302）、2 304（2 841）和3 236（2 525）个；以FDR值= 0为筛选条件，3个样本的极显著差异表达基因主要参与转录激活、水分运输、DNA结合、ATP结合及细胞膜、跨膜运输和防御反应等有关代谢活动。GO富集分析表明：3个胁迫处理的样本在生物学途径中富集最多的类别并不完全相同，其中，胁迫24 h与48 h的样本富集最多的类别是与DNA依赖型转录和转录调节子相关的基因，胁迫72 h样本富集最多的类别是与翻译相关的基因；而在细胞组件和分子功能中，3个胁迫样本富集最多的基因类别均是与内在的膜、核和ATP结合相关的基因。KEGG富集分析表明：胁迫24 h的样本有2 248个差异表达基因参与了107条代谢途径，胁迫48 h的样本有2 114个差异表达基因参与了130条代谢途径，胁迫72 h的样本有2 392个差异表达基因参与了144条代谢途径；经KEGG显著性富集分析，筛选到鞘糖脂生物合成途径、MAP激酶信号途径和ABC转运蛋白等与非生物胁迫或逆境相关。【结论】获得3个干旱胁迫样本与CK样本间差异表达基因的变化及其功能信息，发现参与云南割手密82-114干旱胁迫响应相关的细胞外信号调节激酶、磷脂酶D、β-氨基己糖苷酶和ATP结合盒B亚族（MDR/TAP）-1等，获得在整个干旱胁迫时期稳定上调表达基因70个，稳定下调表达基因11个，通过同源基因序列的比对分析，阐明这些基因在各自的代谢通路中被强烈诱导或抑制表达，显示与干旱胁迫存在密切关系。

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