中国农业科学

转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测

郭亚璐，马晓飞，史佳楠，张柳，张剑硕，黄腾，武鹏程，康昊翔，耿广荟，陈浩，魏健，窦世娟，李莉云，尹长城，刘国振

中国农业科学. 2017, 50(19): 3631-3639. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.001

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【目的】制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体，建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法，了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以带Cas9的质粒DNA为模板，PCR扩增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到pET30a载体中，将酶切验证且序列正确的重组质粒转入表达菌Condon Plus中，经IPTG诱导表达CAS9蛋白质（N端270氨基酸），用纯化的重组蛋白质作为免疫原免疫小鼠，制备单克隆抗体，用免疫印迹分析筛选特异性和灵敏度高的抗体细胞株。用特异性引物PCR扩增转基因水稻的Cas9，用免疫印迹检测转基因水稻中的CAS9蛋白质。将重组CAS9蛋白质和带有CAS9的水稻苗期叶片蛋白质进行平行免疫印迹分析，用Image J软件采集信号绘制CAS9蛋白质的标准曲线，进而对水稻叶片中的CAS9蛋白质进行定量分析。提取单粒稻米的总蛋白质，稀释后用免疫印迹分析CAS9蛋白质的检测下限，提取多个时期、部位的水稻材料的总蛋白质，包括苗期的地上部和地下部，分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶片等，用SDS-PAGE分离后免疫印迹检测比较CAS9蛋白质的表达特征。【结果】通过体外克隆、诱导表达获得了纯化的重组CAS9蛋白质N端片段，免疫小鼠后得到42株阳性杂交瘤细胞株，经筛选鉴定到#12D2细胞株对水稻样品的检测具有较好的特异性和灵敏度。用该抗体通过免疫印迹检测了转基因水稻，所建立的免疫印迹方法对重组CAS9蛋白质的检测下限约为0.25 ng。在水稻苗期叶片中，CAS9蛋白质约占鲜重的0.00005%，可检出单粒稻米8%样品（约2 mg）中的CAS9蛋白质。在苗期地上部CAS9蛋白质的表达丰度高于地下部，分蘖期茎和叶片中表达量较高，根和叶鞘表达量较低。【结论】获得特异性强、灵敏度高的抗CAS9单克隆抗体，建立了检测转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印记方法，揭示了CAS9蛋白质在水稻不同部位的表达特征，并展示了在其他植物中的应用潜力。

日本晴/中嘉早17重组自交系产量性状QTL定位

张应洲，罗荣剑，圣忠华，焦桂爱，唐绍清，胡培松，魏祥进

中国农业科学. 2017, 50(19): 3640-3651. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.002

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【目的】对产量相关性状进行多年、多环境的QTL分析，寻找能够稳定遗传的产量性状主效QTL，剖析超级早籼稻中嘉早17的高产机理，为选育高产新品种提供有用信息。【方法】以日本晴×中嘉早17构建的重组自交系群体为研究材料。筛选亲本间多态性SSR标记，对群体各家系进行基因型分析，利用mapmarker/exp 3.0构建分子遗传连锁图谱。群体于2015—2016年，两地三季种植于杭州、海南和杭州，成熟期考察有效穗数、每穗粒数、单株产量、结实率、千粒重、粒长、粒宽和粒厚等产量相关性状。运用Windows QTL Cartographer 2.5检测产量相关性状QTL，运用QTL Network 2.2检测QTL与环境互作效应。【结果】构建的连锁图谱共包含163对SSR标记，73%的标记父母本基因型比例符合1﹕1理论分离比，23%标记显著偏分离，主要偏向父本中嘉早17，图谱总图距约1 479.4 cM，标记间平均距离约为9.08 cM。3个环境下共检测到46个QTL，分布于除第11染色体外的其他染色体上，贡献率变幅为3.78%—25.45%。共有10个QTL在3个环境下能被重复检测到，分别是控制有效穗数的qEP1、qEP2、qEP4a，控制每穗粒数的qNGPE1、qNGPE7，控制结实率的qSRT7，控制千粒重的qTGW2，控制粒长的qGL3和qGL9，控制粒宽的qGW2b；其中qEP1、qEP2、qNGPE7、qTGW2和qGW2b的增效等位来自亲本日本晴；而qEP4a、qNGPE1、qSRT7、qGL3和qGL9的增效等位来自亲本中嘉早17；除此之外，所检测到的每穗粒数、结实率、粒长和单株产量QTL中大部分增效等位基因均来自中嘉早17。产量性状与环境互作分析显示,控制每穗粒数qNGPE1和qNGPE7、控制结实率的qSRT1a和qSRT7、控制单株产量的qYPP1和qYPP7等6个QTL与环境互作效应显著或极显著。此外，在第1、2、7染色体某区段多个与产量相关的QTL成簇分布。【结论】以日本晴×中嘉早17构建的重组自交系群体连锁图谱具有丰富的多态性标记，覆盖水稻基因组的93.64%，可较好地满足水稻重要农艺性状QTL定位要求。利用该套群体检测到多个产量相关性状QTL，其中，多数控制每穗粒数、结实率、粒长和单株产量的QTL的增效等位基因均来自中嘉早17。该结果与中嘉早17的每穗粒数、结实率、单株产量、千粒重和粒长等性状显著明显优于日本晴的结果一致，这些产量增效QTL可能是中嘉早17高产、稳产的遗传基础。

蛋白质组学方法评估转基因抗虫玉米非预期效应

郝文媛，李飞武，闫伟，李葱葱，郝东云，郭长虹

中国农业科学. 2017, 50(19): 3652-3664. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.003

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【目的】转基因育种是将对人类有益的外源基因通过生物技术整合进受体植物的基因组中，使其获得通过自然进化无法获得优异性状，这是转入外源基因的“预期效应”。然而，外源基因插入受体植物还可能产生无法控制和预期的细胞、代谢或表型等方面的改变，即“非预期效应”。非预期效应是转基因植物安全评价的核心内容之一，也是近年来研究的热点和难点。本研究以抗虫转基因玉米为材料，利用差异蛋白质组学技术比较研究转基因玉米与其非转基因玉米之间的非预期效应，为蛋白质组学技术解析转基因植物非预期效应提供理论参考。【方法】选取4份已经进入中国农业部安全评价阶段转苏云芽孢杆菌（Bacillus thuringeinsis，Bt）内毒素基因的抗虫玉米材料，即SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd，以及它们的对照玉米材料郑单958和郑58，分别种植于可控人工温室中。待玉米幼苗生长至5叶1心期时，每份材料取长势一致的6个单株最上部完全展开叶片，混合作为一个样本进行取样，并提取叶片蛋白质。双向电泳技术分别分离4种转基因玉米和它们各自对应的非转基因材料高丰度蛋白质组，利用Image Scanner扫描仪扫描脱色后的蛋白质凝胶，PD Quest 8.0软件（Biorad，USA）分析蛋白质凝胶图谱，以蛋白点相对体积（% Vol）来表述每一个匹配蛋白质的表达丰度，将电泳凝胶上特异性蛋白质和相对体积大于2倍的差异蛋白质点取样，依据相应蛋白质数据库进行质谱鉴定，并对鉴定出的特异性和差异性蛋白质进行细胞功能富集分析（GO）和代谢途径富集分析（KEGG），以评价转基因抗虫玉米的可能非预期效应。【结果】通过比较4种不同转基因抗虫玉米及其非转基因对照的高丰度蛋白质组，除目标抗虫基因外，共鉴定出61个蛋白质，其功能主要是富集于光合作用、碳固定、能量转运等基础细胞功能相关酶类，如核酮糖二磷酸羧化酶、ATP合成酶、丙酮酸磷酸双激酶等。仅有少数几个与光合作用、碳固定和ATP合成途径等基础代谢过程相关基因出现上调表达。KEGG分析表明，与对照ZD958相比，SK12-5zd的差异蛋白在光合生物碳固定途径中显著富集；Bt799zd的差异蛋白则分别在光合生物碳固定途径、光合作用和碳代谢途径中显著富集。与对照Z58相比，IE034z和Bt799z的差异蛋白均在光合作用代谢途径中显著富集。证明4种转基因材料与对照蛋白质组相似性较高，未见基因的异常表达。【结论】测试的4种转基因材料在蛋白质水平未发生影响其安全性的非预期效应；当前结果表明蛋白质组学技术可以用来验证转基因植物的非预期效应。

基于iTRAQ技术对棉花叶片响应化学打顶的差异蛋白质组学分析

侯晓梦，刘连涛，李梦，孙红春，张永江，杜欢，李存东

中国农业科学. 2017, 50(19): 3665-3677. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.004

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【目的】比较化学打顶和人工打顶方式下棉花植株生理变化及蛋白质的差异表达，为化学打顶的作用机理提供理论依据。【方法】以黄河流域大面积推广的冀棉863为试验品种，于2015—2016年设置人工打顶、化学打顶和未打顶3种处理，于7月20日进行统一打顶处理，化学打顶剂为人工喷施，用量为1.125 L·hm^-2。打顶处理后定期测定各处理间棉花株高与主茎功能叶内源激素含量。株高测量为子叶节到主茎生长点的高度，使用直尺测量。使用酶联免疫法测定棉花功能叶的生长素（IAA）、赤霉素（GA₃）、脱落酸（ABA）和玉米素核苷（ZR）含量。采用iTRAQ技术对人工打顶和化学打顶处理的打顶后20 d的主茎功能叶进行差异蛋白质组学分析。【结果】与人工打顶的棉花相比，化学打顶处理株高显著高于人工打顶处理，两年试验中分别高11.8%和14.5%，但显著低于未打顶处理，两年试验中分别低6.0%和6.5%，喷施化学打顶剂有效抑制了棉花株高的增长。不同打顶处理对棉花功能叶GA₃含量影响较大，打顶后GA₃含量变化为单峰曲线，处理30 d各处理之间达到显著差异，GA₃含量为未打顶＞化学打顶＞人工打顶，30 d后化学打顶与未打顶处理呈下降趋势，人工打顶处理则在20 d时出现下降趋势，在处理后50 d时各处理GA₃含量无显著差异。2016年IAA含量峰值出现在处理后40 d，化学打顶处理峰值显著低于其他两个处理，2015年3种打顶处理间无显著差异。ABA含量在处理后40 d时达到最大值，未打顶处理峰值显著低于其他两个处理。3种打顶处理的ZR含量无显著差异。化学打顶与人工打顶处理相比，iTRAQ标记方法检测到69个差异表达蛋白，29个上调表达，40个下调表达，其中碳水化合物和能量代谢相关的蛋白多下调表达，降低了植株的长势；与GA调节正相关蛋白多上调表达，增强GA效应。【结论】化学打顶能有效控制棉花株高，对棉花功能叶的GA含量影响较大，化学打顶处理含量显著高于人工打顶处理，与人工打顶处理相比，化学打顶与植物生长发育相关蛋白多下调表达，可能是植株通过降低碳水化合物合成，减少能量代谢，增加GA含量，激活GA效应来实现株高的控制。

深松蓄水和施磷对旱地小麦产量和水分利用效率的影响

任爱霞，孙敏，王培如，薛玲珠，雷妙妙，薛建福，高志强

中国农业科学. 2017, 50(19): 3678-3689. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.005

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【目的】针对黄土高原旱地小麦干旱缺水、肥料不合理施用的问题，探索旱地小麦休闲期深松蓄水和播前配施磷肥的最佳技术途径。【方法】于2012—2016年连续4年在山西农业大学闻喜旱地小麦试验基地开展试验，主区为休闲期深松与对照2个耕作方式，副区为施磷（P₂O₅）0、75、150、225、300、375 kg·hm^-2 6个施磷量处理，以明确年际间休闲期深松和播前配施磷肥对旱地小麦产量和水分利用效率的影响。【结果】夏季休闲利于旱地麦田土壤水分恢复，可提高土壤蓄水效率20%—86%；休闲期深松较对照显著提高播种期3 m内土壤蓄水量24—90 mm；提高穗数1%—18%，提高产量3%—25%，提高2012—2013年水分利用效率4%—20%。施磷肥对土壤水分有一定影响，施磷量在0—225 kg·hm^-2范围内，旱地小麦生育期内0—300 cm土壤蓄水量以施磷量150 kg·hm^-2最低；施磷（4年定位试验）降低了生育期内0—300 cm土壤蓄水量，各处理间差异以第4年最显著。本试验中施磷肥的第3年和第4年的土壤水分未达平衡，施磷量150 kg·hm^-2与未施磷肥间的周年耗水量差异显著，说明长期施磷肥增加了作物对水分的消耗和利用，0—300 cm土壤蓄水量会降低。随施磷量（0—225 kg·hm^-2）增加，旱地小麦4年平均产量和水分利用效率表现为先增加后降低的变化趋势，并且均以施磷量150 kg·hm^-2最高，产量各处理间差异显著，水分利用效率施磷量150 kg·hm^-2与未施磷肥处理间差异显著。此外，F测验显示年份对产量和水分利用效率影响最大，增产效果显示休闲期深松的增产效果高于磷肥的增产效果，最终4年定位试验形成的播前0—300 cm底墒414—546 mm配施磷量150 kg·hm^-2、底墒556—607 mm配施磷量75 kg·hm^-2，穗数、产量、水分利用效率均较高。【结论】旱地麦田休闲期深松有利于蓄积休闲期降水，改善底墒；施磷增加了旱地小麦对土壤水分的消耗和利用，降低了生育期土壤水分，增加了周年耗水；休闲期深松每多蓄1 mm水分可增产2—31 kg·hm^-2，在施磷量0—150 kg·hm^-2范围内每多施1 kg·hm^-2磷肥可增产2—13 kg·hm^-2；播前0—300 cm底墒550 mm以下配施磷量150 kg·hm^-2、底墒550 mm以上配施磷量75 kg·hm^-2均可实现较高的产量和水分利用效率。

氮密互作对不同株型玉米形态、光合性能及产量的影响

肖万欣，刘晶，史磊，赵海岩，王延波

中国农业科学. 2017, 50(19): 3690-3701. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.006

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【目的】阐明不同株型玉米在氮素和密度互作下获得高产的形态生理互利机理，进一步提升密植玉米综合生产力。【方法】2014—2015年，在大田条件下，采用裂-裂区试验设计，以不同株型玉米品种为主区，氮素（N₁：0，N₂：90 kg N·hm^-2和N₃：180 kg N·hm^-2）为裂区、密度（D₁：45 000 株/hm²，D₂：60 000 株/hm²和D₃：75 000 株/hm²）为裂裂区，测定了植株形态、叶片光合性能和产量等指标。【结果】施氮对节间长度、叶倾角、叶色值、粒重和产量的影响程度均高于密度调控，茎粗、光合速率和穗粒数对增密响应程度较高。与平展型玉米相比，紧凑型玉米茎粗随密度提高降幅较小，第1—3节间长度对增密响应迟钝，随施氮量增加显著缩短（P_N2_→N3=0.004—0.028），第4—5节间长度对增密的负响应幅度（10.9%）均高于平展型玉米同节间长度对其的正响应幅度（3.3%）。施氮可降低紧凑型玉米棒三叶叶倾角2.9°±1.1°，增密后，其穗下叶叶倾角降幅较高。紧凑型玉米叶色值对施氮量的响应峰值（N₃）高于平展型玉米（N₂），增密对其光合速率的负效应相对较小，在N₃和D₃处理下，其叶色值和光合速率均高于平展型玉米。紧凑型玉米穗粒数与粒重受氮密调控影响比平展型玉米小，其收获指数较高，且在氮/密处理间差异均不显著（P_N1→N3 =0.16，P_D1→D3 =0.12），而平展型玉米在氮/密处理间差异均达显著或极显著水平（P_N1→N3 =0.03，P_D1-D3＜0.01）。紧凑型玉米和平展型玉米分别在N₃D₃和N₃D₁处理下获得较高产量，增密和施氮对其籽粒产量的贡献比分别是1﹕2.3和1﹕4.0。【结论】与平展型玉米相比，紧凑型玉米茎基部横/纵向生长对氮密协同提高具有较强的适应能力，施氮可降低紧凑型玉米棒三叶叶倾角，提高穗位叶光合性能。紧凑型玉米在高密高氮处理下较好的形态生理协调性保证了生育后期相对较高的物质转化效率，最终获得较高群体产量。

辽西半干旱区玉米与花生间作对土地生产力和水分利用效率的影响

高砚亮，孙占祥，白伟，冯良山，杨宁，蔡倩，冯晨，张哲

中国农业科学. 2017, 50(19): 3702-3713. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.007

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【目的】通过对不同行比玉米与花生间作模式中作物产量、土地生产能力及水分利用效率的比较分析，探讨间作模式提高土地生产能力和水分利用效率的机理，提出适合于辽西旱作农业区的玉米与花生间作模式。【方法】试验于2015—2016年在农业部阜新农业环境与保育科学观测试验站进行，设置2行玉米4行花生间作（2M:4P）、4行玉米4行花生间作（4M:4P）和玉米单作（S-M）、花生单作（S-P）4种种植模式，通过研究间作复合系统产量、土地当量比、土壤水分分布和水分当量比等指标来分析玉米花生间作对土地生产力和水分利用效率的影响。【结果】受玉米行比设置和资源竞争影响，玉米与花生间作中玉米和花生的产量较相对应单作产量有不同程度降低；在系统整体收益衡量下，2M:4P和4M:4P间作模式的土地当量比（LER）为1.10—1.24、1.12—1.16，表明间作具有优化利用土地的功能，同时，间作系统中花生的偏土地当量比（LER_P）达到0.41—0.57，显示出豆科作物花生弱化了与禾本科作物玉米搭配间作的劣势；间作复合系统土壤含水量呈单作花生＞间作花生＞间作玉米＞单作玉米的分布特征，表明间作玉米可能会吸收花生条带的土壤水分，降低高耗水作物玉米对自身条带土壤水分的过度消耗来改善间作玉米土壤水分利用环境；2M:4P间作模式的水分当量比（WER）为1.12—1.23，4M:4P间作模式的WER为1.16—1.17，两间作模式的WER均大于1，显著提高了农田水分利用效率。【结论】玉米与花生间作能够改善辽西旱作农业区作物土壤水分利用环境，提高农田土地和水分生产力。2M:4P间作模式在降雨较少年份（2015年）具有一定的土地生产力和水分利用效率优势，而4M:4P间作模式在辽西降雨较多年份（2016年）具有一定的土地生产力和水分利用效率优势，并且4M:4P间作模式在2015—2016年不同降雨变化干扰下的年际差异较小，具有稳产增产的抗气候变化干扰能力。综合分析认为，4M:4P间作模式更适合于辽西旱作农业区。

微生物源挥发性化合物苯并噻唑对灰霉病菌的抑制效应

崔凯娣，黄学屏，何磊鸣，翟永彪，慕卫，刘峰

中国农业科学. 2017, 50(19): 3714-3722. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.008

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【目的】评价挥发性化合物苯并噻唑防治灰霉病的应用潜力，为进一步开发利用提供依据。【方法】采用密封盘菌丝生长速率法测定山东省73株灰霉病菌（Botrytis cinerea）对苯并噻唑的敏感性，并比较不同地区和不同表现型菌株（多菌灵抗性和敏感菌株：Car^R，Car^S；腐霉利抗性和敏感菌株：Prc^R，Prc^S；嘧霉胺抗性和敏感菌株：Pyr^R，Pyr^S；啶酰菌胺抗性和敏感菌株：Bos^R，Bos^S）间的敏感性差异；测定苯并噻唑与多菌灵、啶酰菌胺室内混用对灰霉病菌的抑制作用。通过离体黄瓜叶片接种试验验证苯并噻唑对黄瓜灰霉病的保护、治疗效果以及不同熏蒸剂量和时间对灰霉病菌致病力的影响，并用扫描电子显微镜观察苯并噻唑对灰霉菌丝形态的影响。【结果】苯并噻唑对灰霉病菌菌丝的EC₅₀范围为0.38—1.08 μL·L^-1，均值为0.62 μL·L^-1，不同地区之间无敏感性差异；山东地区多菌灵、腐霉利、嘧霉胺、啶酰菌胺抗性和敏感灰霉病菌对苯并噻唑均比较敏感，说明这4种杀菌剂与苯并噻唑无交互抗性；在苯并噻唑0.1—3 μL·L^-1范围内，菌丝比孢子对其更敏感；2 μL·L^-1苯并噻唑对菌丝的抑制率高达86.12%，对芽管伸长的抑制率为55.15%，而对孢子萌发的抑制率仅为19.30%。可见，病菌不同生长阶段对此化合物的敏感性不同。苯并噻唑与多菌灵混用防治黄瓜灰霉病无增效或相加作用，两者混用时哪种药剂发挥主要抑菌作用与各组分在混用中使用的浓度和比例有关；苯并噻唑与啶酰菌胺混用有显著增效作用，其田间实际应用方式、效果以及增效机制还有待进一步明确。离体叶片试验表明，苯并噻唑对黄瓜灰霉病兼具保护和治疗防效，2 μL·L^-1的治疗防效为91.01%，高于对照药剂啶酰菌胺300 mg·L^-1（78.90%），并显著高于48.25%的保护防效。苯并噻唑能够显著降低灰霉病菌菌丝的致病力，受抑制程度与苯并噻唑浓度呈正相关。扫描电镜观察发现，苯并噻唑能够使菌丝形态异常，菌丝干瘪，分枝增多，表面凹陷。【结论】苯并噻唑对山东省不同地区的灰霉病菌均有较高的毒力，适合作为防治灰霉病的熏蒸剂使用。

禾谷孢囊线虫果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1的鉴定与表达特征分析

李新，顾晓川，龙海波，彭焕，黄文坤，彭德良

中国农业科学. 2017, 50(19): 3723-3732. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.009

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【目的】禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae。）是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫，对农业生产造成巨大的经济损失，然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1，并对其表达特性进行分析，为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据，并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因；采用DNAMAN、Clustal、SignalP 4.0 Server和GSDS等相关生物信息学软件和在线工具分析该基因的核苷酸和氨基酸序列，并使用MEGA 5.0构建系统进化树；采用原位杂交和半定量PCR方法确定该基因的在禾谷孢囊线虫中的表达部位及其在线虫不同龄期中的表达情况。【结果】从禾谷孢囊线虫中成功克隆出一个果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1（GenBank登录号GQ998895)，该基因cDNA全长1 717 bp，包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框，编码一个长度为521个氨基酸残基的蛋白，其理论分子量为57.5 kD，理论等电点为8.52。从线虫基因组DNA中扩增获得长度为7 199 bp的Ha-pel-1基因组全长，基因结构显示分析发现，Ha-pel-1基因组包含14个外显子和13个内含子，除第3个内含子剪接位点是GC-AG外，其余12个内含子都符合真核生物基因剪接位点GT-AG规则。同源比对结果表明，预测蛋白Ha-PEL-1的C端与大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊线虫果胶酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性；此外，其N端信号肽后比报道的其他植物寄生线虫果胶酸裂解酶多出一段长度为254个氨基酸残基的序列，这段序列中，靠近N端的184个氨基酸残基与数据库中的蛋白均无相似性，而靠近C端有70个氨基酸残基（Lys205—Glu274）与韦塞尔斯布朗病毒NS5蛋白（注册号3ELD）的甲基转移酶区域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析发现，预测蛋白Ha-PEL-1包含一个长度为20个氨基酸残基的信号肽和4个果胶酸裂解酶第3家族（PL3）的高度保守区域以及多个保守的半胱氨酸残基；系统进化分析发现，Ha-pel-1及其他已报道的线虫果胶酸裂解酶基因与细菌和真菌来源的PEL聚在一个大的分支中；原位杂交结果显示Ha-pel-1主要在禾谷孢囊线虫亚腹食道腺中表达；半定量RT-PCR确定Ha-pel-1在寄生前和寄生后的2龄幼虫中大量表达。【结论】通过对禾谷孢囊线虫中一个新果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1的克隆和表达特征分析，揭示该基因与禾谷孢囊线虫的侵染和寄生过程密切相关。

棉铃虫复眼中Clock生物钟基因的昼夜表达模式

闫硕，刘彦君，张馨方，秦萌，刘慧，朱家林，李贞，张青文，刘小侠

中国农业科学. 2017, 50(19): 3733-3744. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.010

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【目的】克隆并分析棉铃虫（Helicoverpa armigera)复眼Clock(Clk)生物钟基因的cDNA序列,探讨棉铃虫复眼中Clk生物钟基因的昼夜表达模式及其表达水平的影响因子，以确认其在复眼中是否起着调节生物节律的功能，为理解复眼中生物钟基因网络提供理论参考。【方法】以2日龄棉铃虫复眼为试验材料，采用RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆棉铃虫Clk生物钟基因。利用生物信息学软件对得到的棉铃虫CLK氨基酸序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，检测棉铃虫成虫不同器官(头、胸、腹、足、翅、脑、触角、复眼)中Clk生物钟基因的表达水平；通过设置不同的光周期环境，检测复眼中Clk生物钟基因的昼夜表达模式；通过在暗期设置6 h不同波段光 (UV、蓝光和绿光)照射，检测复眼中Clk生物钟基因的表达水平；通过设置棉铃虫雌雄蛾交配处理，检测交配结束0 h和3 h复眼中Clk生物钟基因的表达水平；通过饥饿处理棉铃虫雌雄蛾，检测复眼中Clk生物钟基因的表达水平。【结果】克隆得到棉铃虫Clk生物钟基因的cDNA序列，命名为HeCLK(GenBank登录号为KM233158)，开放读码框1 860 bp，编码619个氨基酸组成的多肽，理论推测分子量(Mw)为69.32 kD，等电点(pI)为5.71。推导得到的氨基酸序列具有3个跨膜拓扑结构，包含多个昆虫CLK蛋白的保守区域(PAS和HLH)，其与甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)的同源性较高，分别为97%和74%。与点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)和马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)的同源性较低，分别为53%和52%。qRT-PCR结果表明在检测的成虫器官中，HeCLK在复眼中表达水平最低，触角中表达水平最高。在14L﹕10D光周期下，复眼中HeCLK的表达量在白天增高，夜晚下降。生物钟基因的昼夜表达模式在1 d黑暗下可以持续，而在持续黑暗下固有表达节律消失。复眼中HeCLK的表达水平在6 h光照后上调，但不同波段光照射无显著性差异。复眼中HeCLK的表达水平在交配后有下调趋势，在雄蛾交配后表达水平显著性下降。复眼中HeCLK的表达水平在饥饿处理后无显著性变化。【结论】成功从夜蛾棉铃虫的复眼中克隆得到Clk生物钟基因，由Clk生物钟基因推导得到的氨基酸序列具有典型的CLK蛋白特征，且与昆虫CLK蛋白同源性较高。在检测的棉铃虫成虫器官中，HeCLK在复眼中的表达水平最低。HeCLK在外周组织复眼中的表达水平受蛾类自身节律、光照和蛾类生理状态的影响，证实棉铃虫复眼中HeCLK在调节生物节律方面具有重要作用，但生物钟基因网络在复眼与中枢神经中是否类似有待进一步深入研究。

秸秆还田条件下不同供钾能力土壤水稻、油菜、小麦钾肥减量研究

张磊，张维乐，鲁剑巍，戴志刚，易妍睿，丛日环

中国农业科学. 2017, 50(19): 3745-3756. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.011

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【目的】研究不同供钾能力土壤在秸秆还田条件下钾肥减量施用对水稻、油菜、小麦的产量、钾素吸收量及钾肥利用率的影响，计算秸秆还田条件下3种作物的钾肥适宜用量，为秸秆还田条件下钾肥资源的合理利用及农田钾素养分管理和调控提供理论依据。【方法】2013—2015年在湖北省38个县（市）的水稻、油菜及小麦3种作物上开展秸秆还田钾肥减量施用田间试验。试验设置6个处理，分别为（1）对照，不施钾（CK）；（2）施用全量化学钾肥（+K）；（3）秸秆还田处理（+S）；（4）秸秆还田配施50%钾肥（S+1/2K）；（5）秸秆还田配施75%钾肥（S+3/4K）；（6）秸秆还田配施全量钾肥（S+K）。参考不施钾肥处理的作物相对产量（即CK处理产量/+K处理产量）将土壤供钾能力分为高、中、低3个水平。【结果】不同供钾水平土壤施钾和秸秆还田均能不同程度增加水稻、油菜和小麦的产量和地上部钾素吸收量。其中，高供钾能力的土壤水稻、油菜和小麦仅通过上季作物秸秆全量还田即可满足作物高产的钾素需求；中等供钾能力的土壤3种作物可在秸秆还田条件下减少50%钾肥用量；而低供钾能力的土壤，秸秆还田条件下水稻季可减少25%钾肥用量，油菜和小麦季可减少50%钾肥用量。从土壤钾素表观平衡来看，秸秆还田可缓解土壤钾素亏缺，其中油菜季平均盈余量为14.1—152.6 kg K₂O·hm^-2，小麦季平均盈余量为25.5—95.9 kg K₂O·hm^-2，水稻季则仍表现为钾素亏缺。在考虑秸秆钾素投入量的情况下，通过一元二次方程和线性加平台方程拟合秸秆还田条件下钾肥用量与作物产量之间的关系，以+K处理产量为标准得到秸秆还田条件下的适宜钾肥用量。结果表明，在前茬作物秸秆全量还田的条件下，供钾能力为中、高等水平的土壤3种作物钾肥适宜施用量为20—33 kg K₂O·hm^-2，油菜钾肥施用量低于水稻和小麦；而供钾能力低的土壤上，秸秆还田土壤钾肥适宜施用量为45—49 kg K₂O·hm^-2，油菜钾肥推荐用量高于水稻和小麦。与目前钾肥经济施用量60 kg K₂O·hm^-2相比，3种作物在供钾能力为中、高等水平的土壤通过秸秆还田可节省钾肥45.0%—66.7%，供钾能力低的土壤也可节省钾肥18.3%—25.0%。【结论】秸秆还田条件下水稻、油菜及小麦可以在减少18.3%—66.7%钾肥用量的同时保证作物产量，钾肥施用量减少的比例应根据土壤供钾水平进行调整。

不同灌溉施肥模式对温室番茄产量、品质及水肥利用的影响

李银坤，郭文忠，薛绪掌，乔晓军，王利春，陈红，赵倩，陈菲

中国农业科学. 2017, 50(19): 3757-3765. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.012

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【目的】建立适用于日光温室番茄水肥一体化的管理模式，探讨不同灌溉施肥模式在日光温室番茄节水节肥增产效能上的差异。【方法】基于负压装置和滴灌系统，研究常规施基肥（CK）、营养液滴灌施肥（DI）和负压供液施肥（NI）对温室番茄产量、品质及水肥利用效率的影响。【结果】负压供液施肥模式下土壤水分具有相对的稳定性，0—20 cm土层含水量周年变化幅度为20.8%—25.0%，低于滴灌施肥处理的19.7%—28.6%。基于负压装置的供液模式（NI）相对于处理CK和DI，不但养分（N+P₂O₅+K₂O）的周年总投入量分别降低了5.0%和17.2%，而且显著促进了番茄植株生长，增加了产量，改善了果实品质。其中处理NI与CK相比，番茄生物量提高了23.0%以上（P＜0.05），产量增加了7.5%—10.0%，而与处理DI相比，果实硝酸盐含量降低了17.3%—21.5%（P＜0.05）。负压供液施肥模式能够减少水肥用量，降低温室番茄周年耗水量，提高水肥利用率。与处理CK和DI相比，处理NI的年灌水量分别减少了18.4%和17.2%，番茄年耗水量分别降低了12.8%和12.1%（P＜0.05），而水分利用效率分别提高了12.7%—40.1%和10.0%—30.3%（P＜0.05），肥料偏生产力则分别提高了10.4%—19.6%和14.5%—42.7%（P＜0.05）。水分的持续稳定供给是负压供液施肥模式实现节水节肥增产保质等效能的重要原因。【结论】基于负压装置的供液模式不仅减少了水肥的投入量，而且能够促进温室番茄生长、确保产量，同时改善了果实品质并大幅度提高了水肥利用效率，可作为日光温室番茄水肥一体化管理的新模式。

利用OSC算法消除土壤含水量变化对Vis-NIR光谱估算有机质的影响

洪永胜，于雷，朱亚星，李思缔，郭力，刘家胜，聂艳，周勇

中国农业科学. 2017, 50(19): 3766-3777. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.013

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【目的】快速、准确地监测土壤有机质对于精准农业的发展具有重要意义。可见光-近红外（visible and near-infrared，Vis-NIR）光谱技术在土壤属性估算、数字化土壤制图等方面应用较为广泛，然而，在田间进行光谱测量，易受土壤含水量（soil moisture，SM）、温度、土壤表面状况等因素的影响，导致光谱信息中包含大量干扰信息，其中，SM变化是影响光谱观测结果最为显著的因素之一。此研究的目的是探讨OSC算法消除其影响，提升Vis-NIR光谱定量估算土壤有机质（soil organic matter，SOM）的精度。【方法】以江汉平原公安县和潜江市为研究区域，采集217份耕层（0—20 cm）土壤样本，进行风干、研磨、过筛等处理，采用重铬酸钾-外加热法测定SOM；将总体样本划分为3个互不重叠的样本集：建模集S⁰（122个样本）、训练集S¹（60个样本）、验证集S²（35个样本）；设计SM梯度试验（梯度间隔为4%），在实验室内获取S¹和S²样本集的9个梯度SM（0%—32%）的土壤光谱数据；分析SM对土壤Vis-NIR光谱反射率的影响，采用外部参数正交化算法（external parameter orthogonalization，EPO）、正交信号校正算法（orthogonal signal correction，OSC）消除SM对土壤光谱的干扰；利用主成分分析（principal component analysis，PCA）的前两个主成分得分和光谱相关系数两种方法检验消除SM干扰前、后的效果；基于偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）方法建立EPO和OSC处理前、后的SOM估算模型，利用决定系数（coefficient of determination，R²）、均方根误差（root mean square error，RMSE）和RPD（the ratio of prediction to deviation）3个指标比较PLSR、EPO-PLSR、OSC-PLSR模型的性能。【结果】土壤Vis-NIR光谱受SM的影响十分明显，随着SM的增加，土壤光谱反射率呈非线性降低趋势。OSC处理前的湿土光谱数据主成分得分散点相对分散，与干土光谱数据主成分得分空间的位置不重叠，不同SM梯度之间的光谱相关系数变化较大；OSC处理后的湿土光谱数据主成分得分空间的位置基本与干土光谱数据相重合，各样本光谱数据之间相似性很高，不同SM梯度之间的光谱相关系数变化较小。9个SM梯度的EPO-PLSR模型的验证平均R²_pre、RPD分别为0.69、1.7。9个SM梯度的OSC-PLSR模型的验证平均R²_pre、RPD分别为0.72、1.89，校正后的OSC-PLSR模型受SM的较小，有效提升SOM估算模型的精度和鲁棒性。【结论】OSC能够消除SM变化对土壤Vis-NIR光谱的影响，可为将来田间原位实时监测SOM信息提供一定的理论支撑。

盐胁迫下内源NO对黄瓜幼苗活性氧代谢和光合特性的影响

杨建军，张国斌，郁继华，胡琳莉，罗石磊，牛童，张婧

中国农业科学. 2017, 50(19): 3778-3788. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.014

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【目的】探讨盐胁迫下黄瓜幼苗内源一氧化氮（NO）的生理生化调节机理及其调控途径，为揭示黄瓜的抗盐机理和生产应用提供参考。【方法】以黄瓜幼苗为研究对象，采用一氧化氮合成酶抑制剂（L-NAME，L-硝基精氨酸甲酯）、硝酸还原酶抑制剂（tungstate，钨酸钠）和一氧化氮清除剂（cPTIO，4-羧基苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物）处理盐胁迫下的黄瓜幼苗，研究处理对黄瓜幼苗叶片内源NO含量、活性氧代谢、光合参数和叶绿素荧光参数的影响。【结果】盐胁迫可诱导黄瓜幼苗叶片内源NO含量增加，采用200 μmol·L^-1 L-NAME、100 μmol·L^-1 tungstate和200 μmol·L^-1 cPTIO处理均抑制了盐胁迫下的黄瓜幼苗叶片中抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））的活性，降低了游离脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白质的含量，增加了丙二醛（MDA）含量、超氧阴离子自由基（O₂·^-）产生速率和质膜透性，使细胞膜脂过氧化加剧，加重了盐胁迫对黄瓜幼苗的损伤。同时，气体交换参数Pn、Gs、Tr、Ci显著降低，叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP降低，NPQ显著升高，导致叶片光合机构受损，叶片光合速率下降。【结论】在盐胁迫条件下，内源NO的变化可能直接调节了黄瓜幼苗的抗氧化能力，有效地缓解了脂膜过氧化伤害和对叶片光合机构的损伤，且黄瓜幼苗的活性氧代谢和光合特性主要通过一氧化氮合酶途径调控。

SH6矮化中间砧‘富士’苹果不同树形对树体生长和果实产量、品质的影响

李民吉，张强，李兴亮，周贝贝，杨雨璋，周佳，张军科，魏钦平

中国农业科学. 2017, 50(19): 3789-3796. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.015

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【目的】探讨矮化中间砧‘富士’（宫藤富士/SH6/平邑甜茶）苹果3种不同树形（自由纺锤形、V字形和篱壁形）的树体生长和果实产量、品质的差异，为矮化中间砧苹果的早果、优质最佳树形选择应用提供理论依据。【方法】以2010年春季定植的3年根1年干SH6矮化中间砧‘富士’成品苗（宫藤富士/SH6/平邑甜茶）为试材，单位面积种植株数相同，分别为自由纺锤形（2 m×4.5 m）、V字形（1.5 m×6 m）和篱壁形（3 m×3 m）3种方式建园，自栽植后分别采用相应的树形修剪方法，连续6年调查不同树形SH6矮化中间砧‘富士’苹果树体生长、枝类组成及果实产量、单果重、固酸比等品质指标。【结果】不同树形SH6矮化中间砧‘富士’苹果树体生长和果实产量、品质存在较大差异。自栽植后第3年开始，不同树形的树体总枝量和覆盖率开始呈现显著差异，自由纺锤形树体总枝量和覆盖率最大，V字形次之，篱壁形最小；3种树形的枝类组成差异不显著。种植后第4年初结果和5—6年结果期的单株产量和累计产量均为自由纺锤形最高，显著高于V字形和篱壁形；自由纺锤形果实的平均单果重最大，V字形最小；各树形果实的果形指数、可溶性糖含量、可滴定酸含量、固酸比和果肉硬度均无显著差异。【结论】SH6矮化中间砧‘富士’苹果树采用自由纺锤形树形与V字形和蓠壁形相比，具有幼树生长快、成形早、总枝量高、枝类组成合理，结果早、稳产丰产、大果比例高、果实单果重高等特点。自由纺锤形是苹果矮砧规模化生产的适宜树形。

纳米抗菌包装对胚芽米储藏过程中陈化的抑制作用

谢骏琦，李莉，时优，沈婷，陈宇洁，洪阳，曹崇江

中国农业科学. 2017, 50(19): 3797-3807. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.016

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【目的】胚芽米的营养价值相当丰富，具有广阔的市场前景，但其极易变质且不易储藏的现状是影响其推广的一大问题。探索胚芽米陈化过程中的成分变化及劣变情况，开发一种符合市场需求的、能够延缓胚芽米陈化的新型纳米抗菌包装材料。【方法】以五优稻4号胚芽米为试材，以普通聚乙烯包装材料为对照，分别制备两种不同的纳米抗菌包装材料，在常温环境下（25℃、65%湿度）储藏胚芽米28 d。每7 d取样一次，分别检测包装材料内部气体组成及胚芽米储存过程中菌落总数、脂肪酶活力、脂肪酸总量、淀粉糊化特性等指标；在初期和末期检测脂肪酸组成，胚芽米胚乳切面微观结构，以及纳米包装薄膜本身的抗菌性。比较抗菌性纳米包装材料对延缓胚芽米陈化的作用。【结果】包装袋内部气体组成检测数据表明，纳米包装材料改变了包装袋内部气体组成，降低了O₂/CO₂的比值，低氧环境也抑制了胚芽米的呼吸作用。抑菌性试验数据显示，两种纳米抗菌包装材料的抑菌性能较好，对大肠埃希氏菌与大米霉菌的抗菌率分别达99%与95%以上。普通包装下的胚芽米常温贮藏第28天菌落数即达41×10⁴ cfu/g，而同期两种纳米包装下的胚芽米霉菌数仅分别为17×10⁴ cfu/g与18×10⁴ cfu/g（P＜0.05）；抗菌包装中的胚芽米脂肪酶活性值较低，减少了游离脂肪酸的产生；胚芽米的脂肪酸组成适宜人体，较为合理，其初始不饱和比例为71.22%，贮藏28 d后普通包装下的胚芽米脂肪酸不饱和度为65.95%，而两种抗菌包装分别下降至69.10%与67.41%，变化幅度较小；抗菌包装中的胚芽米淀粉糊化特征值变化小，即口感劣变较慢；从胚乳切面微观结构上看，纳米抗菌包装材料在一定程度上具有延缓胚芽米陈化的作用，其内部淀粉质体裂解程度较低。【结论】常温环境下胚芽米陈化较快，霉菌繁殖、脂肪分解及结构等变化反应了胚芽米的陈化过程。纳米抗菌包装材料抑制了霉菌生长并能调节包装材料内部气体组成，达到降低胚芽米劣变速度与延缓陈化的作用。

PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析

张雪，黄雷，阮进学，刘志国，程英，冯书堂，牟玉莲，李奎

中国农业科学. 2017, 50(19): 3808-3816. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.017

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【目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9，PCSK9）基因是人类高胆固醇血症（autosomal dominant hypercholesterolemia, ADH）的主效基因之一，其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）的降解能力比野生型蛋白强十倍，增加了患高胆固醇血症的风险，从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近，成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏，且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备PCSK9获得型突变体转基因猪，以模拟动脉血管的病理学变化，加速发病进程，为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人PCSK9基因D374Y突变体载体，用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中，并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因D374Y突变体转基因猪个体。通过Southern-blot、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法，分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时，通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现，至第7天形成较大的单克隆点，且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段，说明外源片段在基因组中具有完整性；将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞，通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR及Southern-blot 检测结果显示，D374Y-PCSK9基因可以完整的插入猪的基因组中，且有串联重复现象；RT-PCR和QPCR检测结果表明，人PCSK9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9基因的转录，且在其它内脏器官，如心、脾、肺、肾也能检测人PCSK9基因的表达，而猪内源性PCSK9基因在这些组织中表达量很低；Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中，且能够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现，与野生型猪肝脏相比，克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生型。另外，对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化，该结果说明，LDLR水平的急剧下降有可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9基因D374Y突变体的克隆猪；与野生型猪肝脏相比，克隆猪肝脏中LDLR水平显著降低，并且克隆猪肝脏发生了明显病变。

体外法研究纤维日粮的发酵特性及对猪氮排放相关指标的影响

朱丽媛，卢庆萍，夏冰，刘正群，孙永波，张宏福

中国农业科学. 2017, 50(19): 3817-3827. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.018

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【目的】利用体外法探讨并比较不同纤维日粮的发酵特性及对猪氮排放相关指标的影响，为生猪生产中合理应用日粮纤维及减少氮排放的日粮配制提供试验依据。【方法】选择小麦、麦麸与燕麦麸3种原料，采用酶-重量法（AOAC Method 985.29）提取原料中的总日粮纤维组分，得到小麦纤维、麦麸纤维与燕麦麸纤维。以玉米-豆粕为基础，分别添加5%的提取纤维，形成3种纤维日粮：小麦纤维日粮（WF）、麦麸纤维日粮（WBF）与燕麦麸纤维日粮（OBF）。利用单胃动物仿生消化系统（SDS-Ⅱ）模拟猪胃-小肠消化；采集6头健康、体重接近的生长猪的新鲜粪便，混合均匀后与培养液按一定比例配制接种液，定量装入发酵瓶中模拟大肠发酵。日粮经胃-小肠仿生消化后，称取200 mg的消化产物于装有30 mL接种液的发酵瓶中，转入（39±0.25）℃培养箱中，分别在发酵4、12、24、36、48和72 h，取出对应发酵瓶，收集发酵残渣与发酵液，进行相关指标的检测。【结果】在体外大肠发酵阶段，不同纤维日粮组的干物质降解率（IVDMD）及发酵液短链脂肪酸（SCFA）含量、pH、氨氮（NH₃-N）浓度、微生物蛋白（MCP）产量有显著差异（P＜0.05）：(1)在发酵4与12 h，OBF组的IVDMD在3组中最高（P＜0.01），其他时间点3组差异不显著（P＞0.05）。在4 h，OBF组的IVDMD比WF组与WBF组分别高18.32%、15.21%（P＜0.01）；在12 h，比WF组与WBF组分别高14.87%、10.06%（P＜0.01）。(2)在发酵24与36 h，OBF组发酵液总SCFA含量显著高于其他两组（P＜0.05），在72 h，OBF组与WBF组极显著高于WF组（P＜0.01），在4与12 h，OBF组有高于其他两组的趋势（P=0.0599；P=0.0504）。在24 h，OBF组发酵液总SCFA含量比WF组与WBF组分别高27.32%、17.11%（P＜0.05）；在36 h，比WF组与WBF组分别高16.65%、25.96%（P＜0.05）。(3)在发酵4与12 h，OBF组发酵液pH在3组中最低（P＜0.01）；在24、36与72 h，OBF组与WBF组显著低于WF组（P＜0.05）。(4)在发酵24与48 h，OBF组发酵液NH₃-N浓度显著低于其他两组（P＜0.05），并在12 h，有低于其他两组的趋势（P=0.0559）。在24 h，OBF组发酵液NH₃-N浓度比WF组与WBF组分别低6.86%、4.59%（P＜0.05）；在48 h，比WF组与WBF组分别低8.44%、7.09%（P＜0.05）。(5)在发酵4 h，OBF组发酵液MCP产量显著高于其他两组（P＜0.05），并分别在12、24 h与36、48 h，显著高于WF组与WBF组（P＜0.05）。在4 h，OBF组发酵液MCP产量比WF组与WBF组分别高69.85%、82.25%（P＜0.05）。【结论】体外条件下，燕麦麸纤维显著提高了日粮在发酵阶段的干物质降解率、发酵液总短链脂肪酸含量与微生物蛋白产量，并显著降低了发酵液pH与氨氮浓度。因此，相比小麦纤维与麦麸纤维，燕麦麸纤维在促进微生物发酵及氮减排方面具有更高的潜力。

天然蜂粮生产技术研究与应用

江武军，吴小波，刘光楠，何旭江，颜伟玉，曾志将

中国农业科学. 2017, 50(19): 3828-3836. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.019

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【目的】蜂粮是蜂群中幼虫和幼蜂的食物，也是幼虫发育过程中的全价营养来源，同时也是供人类食用的蜂产品，其开发利用前景广阔，但目前因生产技术的制约导致不能市场化。本论文旨在研究如何快速生产优质的天然蜂粮，为天然蜂粮的机械化生产提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂贮粉生物学原理设计一种能快速生产天然蜂粮的装置——天然蜂粮生产器，包括贮粮器和脱粮器，并以西方蜜蜂(Apis mellifera)为试验材料，研究天然蜂粮生产器在蜂群中使用的可行性。在白莲花期，选取5个强势相当的继箱群作为试验蜂群，分别将贮粮器放入每个试验继箱群巢箱内，待蜂粮酿制为成熟蜂粮后将其从蜂群提出，利用脱粮器将蜂粮生产出来（贮粮器蜂粮）；在相同蜂群利用脱粉器分别收集新鲜白莲蜂花粉（新鲜蜂花粉）；同时从蜂群中提出贮有成熟蜂粮的天然巢脾，采用手工挖取方法收集蜂粮（蜡脾蜂粮）。所有样品分别进行理化性质和营养成分分析：在常温下利用pH计测定其pH，利用水分活度仪扩散法测定其水活度，用直接干燥法测定其水分含量，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定其花粉粒活性，运用Marklund法测定其超氧化物歧化酶活力，运用紫外分光光度法测定其过氧化氢酶活力，使用氨基酸自动分析仪测定其水解氨基酸和游离氨基酸种类及含量。【结果】工蜂能在天然蜂粮贮粮器中贮存并酿制蜂粮，脱粮器可以快速地将贮粮器中的蜂粮生产出来，且生产出的蜂粮保持了原有状态。新鲜蜂花粉的pH、水活度、水分含量、花粉粒活性、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性均显著高于蜡脾蜂粮和贮粮器蜂粮。新鲜蜂花粉、蜡脾蜂粮和贮粮器蜂粮中的游离氨基酸总含量和水解氨基酸总含量三者间均不存在显著差异，但蜡脾蜂粮和贮粮器蜂粮水解氨基酸中缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸含量，以及游离氨基酸中的天冬氨酸、脯氨酸含量均显著高于新鲜蜂花粉。蜡脾蜂粮与贮粮器蜂粮两者间理化性质和营养成分总体无显著差异。【结论】本研究设计的天然蜂粮生产器，可以生产天然蜂粮，值得在养蜂生产中推广应用。

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