中国农业科学

《中国农业科学》2018年第51卷第13期目次

中国农业科学. 2018, 51(13): 0.

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不同光温条件谷子资源主要农艺性状的综合评价

贾小平，袁玺垒，李剑峰，张博，张小梅，郭秀璞，陈春燕

中国农业科学. 2018, 51(13): 2429-2441. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.001

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【目的】通过在海南省、吉林省2个不同光温环境调查100份春谷材料和60份夏谷材料抽穗期、株高、叶片数、穗长、穗粗、穗码数、码粒数、穗重、穗粒重、千粒重10个主要性状，揭示春谷、夏谷光温反应特性，筛选出适合用于谷子光温敏感性评价的性状指标。【方法】在连续两年两个地点对100份春谷材料和60份夏谷材料10个主要农艺性状调查的基础上，利用方差分析，建立光温敏感性综合评价指标D值进行回归分析、通径分析，光温相对敏感度比较分析3种方法评价春谷、夏谷10个性状对光温反应的敏感性。【结果】方差分析表明春谷、夏谷10个性状在不同光温条件均存在显著差异（P＜0.01），说明光温条件对春谷和夏谷的影响是全方位的，无论春谷还是夏谷，抽穗期、株高、叶片数、穗长、穗粗、穗码数、码粒数、穗重、穗粒重9个性状在吉林光温条件下的调查值高于海南光温条件下的调查值，相反，千粒重在吉林光温条件下的调查值要低于在海南光温条件下的调查值；通过主成分分析建立光温敏感性综合评价指标D值，10个性状对D值进行回归分析、通径分析，春谷2个调查年份穗重、穗粒重、穗长、码粒数对D值直接效应较大，均表现较强的光温敏感性，夏谷2个调查年份结果差异较大，只有穗重、穗长2个性状对D值的效应较明显，均表现较强的光温敏感性；通过比较10个性状的光温相对敏感度，发现春谷2个调查年份穗重、穗粒重、抽穗期、穗长、穗码数光温相对敏感度较其他性状高，表现出更强的光温敏感性，夏谷2个年份穗重、穗长、抽穗期、穗码数光温相对敏感度较其他性状高，表现出更强的光温敏感性。综合D值回归分析、光温相对敏感度比较分析2个年份的结果及水稻研究成果，本研究认为春谷穗重、穗粒重、穗长、穗码数、抽穗期光温敏感性较强，其次为叶片数与株高，穗粗与千粒重光温敏感性较弱，码粒数光温敏感性不能确定；夏谷穗重、穗长、抽穗期、叶片数、穗码数光温敏感性较强，穗粗、码粒数、千粒重3个性状的光温敏感性较弱，穗粒重与株高的光温敏感性不确定。春谷和夏谷的穗重、穗长、抽穗期3个性状均稳定表现对光温较强敏感性。【结论】春谷、夏谷均受光温条件的显著影响，穗重、穗长、抽穗期3个性状在春谷和夏谷中均稳定表现对光温强敏感性，适合作为谷子光温敏感性评价的指标性状，叶片数适合作为夏谷光温敏感性评价指标，株高不适合用来评价谷子光温敏感性。

陆地棉CRK基因家族的鉴定及其表达分析

张中起，王娇，靳炜，葛冬冬，刘康，吕芬妮，孙敬

中国农业科学. 2018, 51(13): 2442-2461. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.002

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【目的】富含半胱氨酸类受体激酶（CRK）是植物中最大的类受体激酶家族之一，在植物生长发育、激素信号传导和抗逆境胁迫中发挥重要作用。从全基因组水平鉴定陆地棉CRK基因家族并进行生物信息学和表达模式分析，为研究和利用陆地棉CRK基因家族奠定基础。【方法】从Pfam数据库下载stress-antifung结构域氨基酸序列，应用BLASTp程序搜索棉花基因组数据库，鉴定棉花CRK基因家族；利用Compute pI/Mw tool、SignalP、TMHMM Server V2.0、WoLF POSRT等在线工具预测陆地棉CRK家族蛋白的分子量、信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位等；用ClustalX1.8软件对棉花和拟南芥CRK蛋白质进行氨基酸序列比对，MEGA5.0分析棉花和拟南芥CRK蛋白的系统进化关系；使用TBtools制作陆地棉CRK基因家族的染色体定位、基因结构和蛋白质结构域示意图；应用植物顺式调控元件数据库PlantCARE分析棉花启动子序列；通过植物磷酸化位点数据库PlantPhos预测陆地棉CRK家族蛋白的磷酸化位点；从NCBI数据库下载RNA-Seq数据，利用转录组定量工具Kallisto计算TPM值，通过在线工具Morpheus绘制陆地棉CRK家族基因表达热图。【结果】陆地棉基因组中有70个CRK基因，分布于14条染色体，其中52个基因（74.3%）集中串联成簇分布于A6/D6、A9/D9、A10/D10染色体，且在A/D染色体组之间呈现高度共线性关系。编码302—901个氨基酸，58个蛋白质（82.9%）具有跨膜结构域，主要定位于叶绿体、质膜和胞外。磷酸化位点预测结果表明，陆地棉和拟南芥CRK有5个相同的磷酸化位点基序，包括3种丝氨酸磷酸化位点基序和2种苏氨酸磷酸化位点基序。65个陆地棉CRK基因的启动子区（92.9%）至少含有一种逆境激素响应元件，69个基因启动子区（98.6%）至少含有一种生物或非生物胁迫响应元件。根据RNA-Seq数据分析结果，陆地棉CRK基因可分为3种不同的组织表达特征类型；盐、干旱、冷、热胁迫以及接种大丽轮枝菌均可以导致部分陆地棉CRK基因表达水平的改变。GhCRK25在根、茎、叶和胚珠中优势表达，在纤维中几乎不表达，ABA、GA3、SA、PEG-6000、氯化钠和大丽轮枝菌Vd991处理均能刺激GhCRK25迅速上调表达。应用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）沉默GhCRK25可导致棉花对大丽轮枝菌Vd991更为敏感。【结论】陆地棉CRK基因家族有70个成员，具有保守的基因结构和功能结构域，多样化的组织表达特征，大多数基因受激素和逆境调控。

大气环境变化导致水稻品质总体变劣

景立权，户少武，穆海蓉，王云霞，杨连新

中国农业科学. 2018, 51(13): 2462-2475. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.003

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气候变化将改变作物的生长环境，进而影响作物产量和品质。气候变化对重要粮食作物水稻产量形成的影响已有很多报道，但对同样重要的品质研究较少。在简要介绍实验平台基础上，本文总结了气候变化对水稻品质影响的研究进展。品质性状分为加工、外观、蒸煮/食味、营养和饲用品质，气候变化包括大气CO₂浓度升高、近地层O₃浓度增高和气温升高等，本文重点聚焦大气组分变化及其与高温的互作。已有文献表明，气候变化对水稻品质的影响尚存在诸多不确定性，但本文也发现了一些重要趋势，这些趋势多为不利的变化。高CO₂浓度、高O₃浓度或高温环境下生长的水稻表现出垩白增加、碎米增多的趋势；高CO₂浓度导致稻米蛋白质和多种元素浓度下降，但食味品质可能变优；臭氧胁迫水稻的食用和饲用品质均有变劣趋势。目前这方面认知多来自于单一气候因子的影响研究，但已有少量研究观察到CO₂与温度或O₃之间的交互作用；另外，水稻品质性状对气候变化的响应可能还受熏蒸方式、基因型和施肥量等影响。未来这一领域需继续利用不同尺度的试验平台验证已有趋势并拓展研究内容，在这基础上评估气候变化因子之间以及与其他因子的交互作用，重点揭示这些交互作用的内在机制，以便开发出真正适应未来气候变化的稻作生产技术。

有机无机肥配施对夏玉米氮素气态损失及籽粒产量的影响

杨清龙，刘鹏，董树亭，张吉旺，赵斌，李荣发，任昊，任寒，韩祥飞

中国农业科学. 2018, 51(13): 2476-2488. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.004

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【目的】本研究在定位试验平台上监测了不同施肥处理夏玉米田NH₃和N₂O的排放规律及其损失量，以探讨减少黄淮海区域夏玉米田氮素气态损失的有效途径，为提高夏玉米籽粒产量及肥料利用效率提供理论依据。【方法】2016—2017年利用水肥渗漏研究池进行试验，以郑单958（ZD958）为材料，以不施氮肥（CK）为对照处理，在同等施氮量下设置单施尿素（U₁）、单施牛粪（M₁）和尿素牛粪1﹕1配施（U₂M₂）3种氮肥处理。采用通气法和静态箱-气相色谱法研究了不同施肥处理对玉米田NH₃和N₂O排放规律和损失量、籽粒产量及氮肥利用效率的影响。【结果】玉米田氮素气态损失以NH₃挥发为主，占氮素气态损失量的88.55%—96.42%，N₂O排放量较少。不同施肥处理显著影响NH₃和N₂O排放量及氮素利用效率。U₁处理NH₃挥发量最高，两年平均为38.19 kg·hm^-2；以M₁处理最低，为19.10 kg·hm^-2，U₂M₂处理介于两者之间，施用有机肥的M₁或U₂M₂处理可以显著降低NH₃挥发损失量。N₂O排放氮素损失以M₁处理最高，平均达到1.65 kg·hm^-2，较U₁和U₂M₂处理分别提高了77.42%和34.15%。2016—2017年不同施肥处理间籽粒产量差异显著，表现为U₂M₂＞U₁＞M₁＞CK，2016年U₂M₂处理籽粒产量较U₁和M₁处理分别提高了3.45%和5.25%，U₁和M₁处理之间籽粒产量无明显差异；2017年U₂M₂处理籽粒产量较U₁和M₁处理分别提高了5.83%和12.53%，U₁显著高于M₁处理，提高了6.33%。氮素利用效率以U₂M₂处理最高，平均为58.20%，较M₁和U₁处理分别提高了32.15%和15.13%。【结论】有机无机肥配施增加了干物质和氮素积累量，提高了夏玉米籽粒产量和氮素利用效率，较单施尿素氨挥发减少，较单施有机肥N₂O排放降低，是实现增产增效的合理施肥方式。

深松（耕）方式对砂姜黑土耕层特性、作物产量和水分利用效率的影响

赵亚丽，刘卫玲，程思贤，周亚男，周金龙，王秀玲，张谋彪，王群，李潮海

中国农业科学. 2018, 51(13): 2489-2503. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.005

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【目的】研究深松（耕）方式对砂姜黑土耕层特性、作物产量、水分利用效率和经济效益的影响，筛选砂姜黑土区适宜的土壤耕作制度，为构建砂姜黑土合理耕层提供依据。【方法】试验设置5个冬小麦-夏玉米周年耕作处理，分别为秋季旋耕+夏季免耕（ART+SNT，对照）、秋季深松+夏季免耕（ASS+SNT）、秋季深耕+夏季免耕（ADMP+SNT）、秋季深耕+夏季下位深松（ADMP+SSSS）和秋季深耕+夏季侧位深松（ADMP+SSSL）。研究深松（耕）方式对冬小麦-夏玉米土壤物理特性、根系形态、作物产量和水分利用效率的影响。【结果】深松（耕）显著降低了土壤紧实度和土壤三相比R值，促进了冬小麦和夏玉米根系生长，提高了作物产量和水分利用效率，且深耕的效应大于深松，在冬小麦季深松（耕）的影响大于夏玉米季。与秋季旋耕+夏季免耕相比，秋季深松（耕）土壤紧实度降低20.9%，土壤三相比R值降低12.9%，作物根系干重密度增加29.8%，冬小麦、夏玉米及周年总产分别增加22.0%、8.8%和15.2%，冬小麦季、夏玉米季及周年水分利用效率分别增加18.2%、7.9%和14.0%，经济效益增加19.8%。秋季深耕+夏季深松对土壤耕层特性的改良效果优于单一秋季深松（耕），其作物根系生长、产量和水分利用效率均高于单一秋季深松（耕）。与单一秋季深松（耕）相比，秋季深耕+夏季深松土壤紧实度和土壤三相比R值降低5.6%和15.0%，作物增产4.4%，水分利用效率和经济效益增加4.0%和3.3%。5个处理中，以秋季深耕+夏季侧位深松对土壤耕层特性的改良效果最好，作物根系生长量、产量和水分利用效率最高。秋季深耕+夏季侧位深松土壤紧实度和土壤三相比R值比秋季旋耕+夏季免耕分别降低28.4%和26.6%，夏玉米根长、根系表面积、根系体积和根系干重密度分别增加67.0%、45.3%、23.1%和49.5%。秋季深耕+夏季侧位深松冬小麦、夏玉米和周年作物产量比秋季深耕+夏季免耕分别增加5.5%、3.4%和4.4%，比秋季旋耕+夏季免耕分别增加27.8%、11.6%和19.4%；冬小麦季、夏玉米季及周年水分利用效率比秋季深耕+夏季免耕分别增加3.7%、3.5%和4.1%，比秋季旋耕+夏季免耕分别增加20.9%、10.7%和18.1%；经济效益比秋季旋耕+夏季免耕增加24.4%。【结论】秋季深耕+夏季深松的作物产量和水分利用效率均高于单一秋季深松（耕）。在5个不同的深松（耕）方式处理中，秋季深耕+夏季侧位深松的产量和水分利用效率最高，是砂姜黑土区适宜的深松（耕）方式。

灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径的关系

袁雪梅，王敏，藏金萍，曹宏哲，张康，张靖，邢继红，董金皋

中国农业科学. 2018, 51(13): 2504-2512. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.006

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【目的】明确灰葡萄孢（Botrytis cinerea）犬尿氨酸单加氧酶基因BcKMO与病菌cAMP信号途径之间的关系，为进一步阐明BcKMO调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制打下基础。【方法】利用cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536，检测灰葡萄孢野生型BC22、BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO对cAMP信号途径特异性抑制剂的敏感性；分别提取灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCG183和回复菌株BCG183/BcKMO中的cAMP，利用HPLC检测各菌株中cAMP的含量；利用real-time PCR技术检测BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1和pka2、调节亚基基因pkaR、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3在病菌不同发育阶段、组织部位以及培养条件下的表达规律；利用real-time PCR技术检测BcKMO突变体中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平；利用real-time PCR技术检测cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的RNAi突变中BcKMO的表达水平。【结果】灰葡萄孢BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183对cAMP信号途径特异性抑制剂SQ22536不敏感，受抑制的程度明显低于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP含量明显低于野生型菌株BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。BcKMO与cAMP信号途径中cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）的催化亚基基因pka1、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3的表达规律基本一致，均为在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高；此外，BcKMO和cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3均为在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达水平均明显高于野生型BC22和回复菌株BCG183/BcKMO。pka1、bcg2的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显高于野生型，而pka2、pkaR、bcg3的RNAi突变体中BcKMO表达水平明显低于野生型。【结论】BcKMO负调控cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的表达；cAMP信号途径关键基因pka1、bcg2负调控BcKMO的表达，而cAMP信号途径关键基因pka2、pkaR、bcg3正调控BcKMO的表达。

田间药液用量影响农药单位剂量防治效果的原因分析

顾中言，徐德进，徐广春

中国农业科学. 2018, 51(13): 2513-2523. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.007

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【目的】分析药液用量与水稻植株持液量的关系，探索稻田药液用量影响农药单位剂量防治效果的机制，为科学使用农药提供依据。【方法】在喷雾状态下计量水稻单位面积的持液量变化，明确液体在水稻叶片上的流失点和稳定持液量。依照国家标准GB/T 5549-2010测定液体表面张力，利用表面活性溶液的表面张力随表面活性剂浓度变化的规律，测定表面活性剂溶液的临界胶束浓度；用Zisman的方法测定水稻叶片的临界表面张力，分析影响水稻叶片持液量的关键因子。在喷雾塔内模拟用氯虫苯甲酰胺防治稻纵卷叶螟、用吡蚜酮和毒死蜱防治褐飞虱的试验，分析药液用量与雾滴密度的关系及农药单位剂量对防治效果的影响。【结果】随着喷液量的增加，水稻叶片的持液量经历增加、达到最大值后开始流失、随之下降到稳定值并不再随喷液量而变化，与最大值比，稳定值减少持液量约50%。供试水稻的临界表面张力为29.90—31.22 mN·m^-1，为低能表面，清水的表面张力为71.8 mN·m^-1，大于水稻的临界表面张力，限制了水稻叶片的持液量；助剂TX-10和Silwet-408可使液体的表面张力小于水稻临界表面张力，增加水稻叶片的持液量，当助剂达到临界胶束浓度时，增加持液量的效果最好；喷液量影响雾滴密度，从而影响农药单位剂量的防治效果。雾滴体积中径为200 μm时，药液量150 L·hm^-2的雾滴少于10滴/cm²，20、25和30 g 3个有效剂量的氯虫苯甲酰胺对稻纵卷叶螟的防治效果不足60%；药液量450 L·hm^-2的雾滴少于40滴/cm²，氯虫苯甲酰胺3个有效剂量对稻纵卷叶螟的防治效果分别为56.92%、62.86%和65.07%；药液量900 L·hm^-2的雾滴为82滴/cm²，氯虫苯甲酰胺3个有效剂量对水稻纵卷叶螟的防治效果最好，达到70%以上。减小雾滴体积中径，增加单位体积液体的雾滴数量，可以适量减少喷液量。雾滴体积中径为75 μm、药液量450 L·hm^-2时，雾滴为140滴/cm²，氯虫苯甲酰胺防治稻纵卷叶螟的效果与雾滴体积中径为200 μm、药液量900 L·hm^-2的防治效果无显著差异。由于水稻冠层的阻挡，叶面喷雾时冠层下的雾滴极少，雾滴体积中径200 μm喷药液量900 L·hm^-2和雾滴体积中径75 μm喷药液量450 L·hm^-2，冠层下的雾滴不足20滴/cm²，农药对褐飞虱防治效果差。冠层下喷雾，直接将农药喷洒到褐飞虱栖息危害的部位，显著提高了吡蚜酮和毒死蜱单位剂量对褐飞虱的防治效果。【结论】药液用量影响农药在水稻植株上的沉积量和水稻单位面积上的雾滴密度，从而影响农药单位剂量对害虫的防治效果。当稻田药液用量在450 L·hm^-2（雾滴体积中径75 μm）或900 L·hm^-2（雾滴体积中径200 μm），冠层上下喷雾均匀，能确保药液在水稻最大持液量范围内并使植株表面有足够的雾滴密度，可取得良好的防治效果。

夏闲期耕作对黄土高原旱地麦田土壤水稳性团聚体稳定性的影响

李慧，代新俊，高志强

中国农业科学. 2018, 51(13): 2524-2534. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.008

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【目的】研究不同夏闲期耕作方式对黄土高原旱地麦田土壤水稳性团聚体稳定性的影响。【方法】于2013—2017年在山西省闻喜县邱家岭村开展免耕—免耕—免耕—免耕（4aNT）、深翻—深翻—深翻—深松（3aPT-ST）、深松—深松—深松—深翻（3aST-PT）和深松/深翻（4aST/PT）轮耕4种耕作处理，测定了平均重量直径（MWD）、几何平均直径（GMD）、稳定率（WSAR）、破坏率（PAD）、分形维数（D）、峰凸系数（C_E）和偏倚系数（C_S）等水稳性团聚体稳定性指标。【结果】4年轮耕处理结果表明，深松/深翻轮耕能够有效提高土壤有机质含量和旱地麦田产量。深松/深翻轮耕0—50 cm土层＞0.25 mm水稳性团聚体含量分别比连续免耕、深翻—深翻—深翻—深松和深松—深松—深松—深翻高40.4%—45.5%、61.8%—98.0%和39.4%—106.1%，且深松/深翻轮耕处理下的GMD、MWD、WSAR和C_S均显著高于其他耕作处理，而D、PAD和C_E均显著低于其他耕作处理（P＜0.05）。各参数之间的相关分析结果显示，WSAR、MWD、GMD和C_S之间相互呈极显著正相关，且均与PAD、D和C_E呈极显著负相关（P＜0.01）。【结论】夏闲期耕作会显著影响土壤水稳性团聚体的稳定性，而夏闲期深松/深翻轮耕处理能提高耕层水稳定性团聚体含量与稳定性，更好的改善旱地土壤结构，提高产量。

大气CO₂浓度和温度升高对稻麦轮作生态系统N₂O排放的影响

王从，李舒清，刘树伟，邹建文

中国农业科学. 2018, 51(13): 2535-2550. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.009

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【目的】研究大气CO₂浓度和温度升高条件下稻麦轮作生态系统N₂O排放的响应规律，以期科学评估未来气候变化情境下，CO₂浓度和温度升高对稻麦轮作生态系统N₂O排放的影响，为中国应对未来气候变化提供数据支持。【方法】依托同步模拟自由大气CO₂浓度升高和温度升高的T-FACE试验平台，设置本底大气CO₂浓度和温度（Ambient）、500 μmol·mol^-1 CO₂ +本底大气温度（C）、本底大气CO₂浓度+温度增加2℃（T）和500 μmol·mol^-1 CO₂ +温度增加2℃（C+T）等4个处理。采用静态暗箱-气相色谱法原位观测稻麦轮作生态系统N₂O排放通量，研究稻麦轮作生态系统N₂O排放对大气CO₂浓度和温度升高的响应规律。【结果】（1）CO₂浓度升高使水稻和小麦生物量和产量分别显著增加9.7%、11.3%和5.6%、5.7%（P＜0.05）；温度升高使水稻和小麦生物量和产量分别显著减少21.1%、18.0%和31.6%、17.7%（P＜0.05）；CO₂浓度和温度的同步升高使水稻和小麦生物量和产量分别显著降低13.5%、8.7%和26.0%、10.3%（P＜0.05）。（2）CO₂浓度和温度升高，均未改变稻麦轮作系统N₂O的季节排放模式。CO₂浓度升高条件下，水稻季和小麦季N₂O排放分别增加15.2%和39.9%，其中后者达显著水平（P＜0.05）；温度升高未显著影响水稻季N₂O排放，但显著增加小麦季N₂O排放20.5%（P＜0.05）；CO₂浓度和温度同步升高对水稻季N₂O排放的影响存在较大的年际差异，但总体上有促进N₂O排放的趋势；CO₂浓度和温度同步升高极显著增加小麦季N₂O排放（46.0%，P＜0.01）。（3）小麦季N₂O排放与小麦生物量密切相关，在CO₂浓度和温度升高条件下，小麦季N₂O排放与小麦地下部生物量和ΔSOC之间具有显著的正相关关系。（4）与对照组相比，CO₂浓度升高、温度升高以及两者的共同作用，分别导致稻麦轮作系统单位产量的N₂O排放强度（GHGI）分别增加29.1%、66.3%和81.8%，其中温度升高和CO₂浓度和温度同步升高处理达显著水平（P＜0.05）。【结论】CO₂浓度升高和温度升高均未改变稻麦轮作生态系统N₂O的季节排放模式。CO₂浓度升高导致稻麦轮作系统N₂O排放显著增加；温度升高显著增加小麦季N₂O排放，但未显著影响水稻季N₂O排放。CO₂浓度和温度升高导致稻麦轮作系统温室气体排放强度增加，各处理条件下温室气体排放强度的响应从大小依次为：C+T >T>C。可见，在未来CO₂浓度和温度升高情境下，为保证现有粮食供应水平不变，由稻麦生产所导致的N₂O排放强度变化可能会进一步加剧气候变化进程。

超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱结合Progenesis QI 分析不同品种橙的指纹图谱及其差异性代谢物

赵希娟，赵无疾，许华超

中国农业科学. 2018, 51(13): 2551-2560. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.010

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【目的】建立分析不同品种橙之间差异性代谢物的方法，找出各品种橙的特征代谢物，服务于橙的代谢组学研究，为橙果实和橙汁的鉴别提供参考。【方法】选取相同产地8个不同的橙品种，取其果皮的甲醇提取物，使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-QToF-MS）得到对应的指纹图谱，结合组学软件Progenesis QI，通过主成分分析、偏最小二乘判别分析和变量变化趋势图等进行综合评价，筛选出各品种间的差异性代谢物。根据精确分子量、二级碎片、标准品以及数据库和相关文献信息，对差异性代谢物进行鉴定。【结果】通过UPLC-QToF-MS指纹图谱得出8个橙品种的代谢物存在明显差异，使用Progenesis QI建立的流程筛选得到各品种正、负离子模式下的差异性代谢物，包含保留时间、分子式、二级碎片等信息。鉴定出17种差异代谢物，其中3-羟基-5,7,3',4'-四甲氧基黄酮和木犀草素-7-O-新橙皮糖苷是血橙区别于其他7种橙的特征代谢物，橙皮苷是S26锦橙的代谢标志物，芸香柚皮苷-4'-O-葡萄糖苷和异橙黄酮可以作为8045甜橙的特征代谢物。【结论】基于UPLC-QToF-MS和Progenesis QI建立的方法可以筛选出8个品种橙果实的差异性代谢物，鉴定了其中的17种物质，分别对应不同品种。该研究方法和技术路线具有通用性，适用于不同水果、不同产地、不同成熟度等因素引起的样品差异分析。

甜瓜叶片光合产物输出能力对弱光的响应

杨柳燕，陈菁菁，陈年来

中国农业科学. 2018, 51(13): 2561-2569. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.011

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【目的】研究甜瓜果实发育期坐果节位叶片光合能力、蔗糖合成能力和水苏糖装载能力对遮光的响应,分析不同耐弱光性甜瓜品种同化物输出能力的差异，为进一步研究甜瓜耐弱光品种果实糖分卸载与积累机理奠定基础。【方法】以耐弱光甜瓜品种‘玉金香’和不耐弱光品种‘钰雪三号’为试材，在日光温室条件下于授粉后进行遮光处理，每5 d取样一次，取坐果节位叶片测定叶绿素含量、气体交换参数、葡萄糖、果糖、蔗糖、肌醇半乳糖苷、棉子糖、水苏糖和淀粉含量，同时测定叶片蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）、中性转化酶（NI）、酸性转化酶（AI）、肌醇半乳糖苷合成酶（GS）和水苏糖合成酶（STS）活性。【结果】遮光处理后，两个甜瓜品种叶片叶绿素a/b、净光合速率（Pn）、葡萄糖、果糖和蔗糖含量均显著降低，淀粉含量升高，‘玉金香’叶绿素a/b降幅（10.0%）大于‘钰雪三号’（5.8%），而Pn、蔗糖含量降幅（分别为30.3%和30.9%）和淀粉含量增幅（3.6%）均显著小于‘钰雪三号’（分别为45.2%、60.6%和20.4%）。遮阴条件下，两个品种叶片蔗糖代谢相关酶SPS、SS、AI和NI活性均显著降低，‘玉金香’SPS和SS酶活降幅（分别为16.5%和30.0%）显著小于‘钰雪三号’（31.6%和40.5%），而AI和NI降幅（分别为23.8%和12.7%）高于‘钰雪三号’。遮光后甜瓜叶片肌醇半乳糖苷含量和GS活性均显著降低，但品种间差异不显著。棉子糖、水苏糖和STS活性均显著降低，‘玉金香’棉子糖含量降幅（65.3%）显著高于‘钰雪三号’（35.0%），而水苏糖和STS活性降幅（分别为79.5%和23.8%）小于‘钰雪三号’。【结论】遮光条件下，耐弱光品种‘玉金香’叶片蔗糖合成能力和水苏糖装载能力下降较少，具有较强的同化物输出能力。

不同干燥方式对蓝莓叶中酚类物质及其抗氧化活性的影响

李晓英，薛梅，樊汶樵，罗洁

中国农业科学. 2018, 51(13): 2570-2578. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.012

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【目的】探讨对蓝莓叶酚类物质含量及抗氧化活性的影响，为蓝莓叶的综合开发利用提供参考。【方法】以蓝莓叶为试验材料，设置不同干燥方式处理分别采用福林酚和比色法、亚硝酸盐比色法及高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测各样品的总酚、总黄酮、绿原酸和芦丁含量，采用亚铁还原力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）、DPPH和ABTS⁺自由基清除法测定各样品的抗氧化能力，并分析样品酚类物质含量与抗氧化活性的关系。【结果】4种干燥方式对蓝莓叶中总酚、总黄酮含量及多酚类组份均有不同程度的影响。其中，真空冷冻干燥蓝莓叶中酚类物质含量最高，总酚（55.7 mg GAE·g^-1 DW）、总黄酮（104.8 mg RE·g^-1DW）两者含量均为微波干燥方式的1.2倍左右，真空和热风干燥方式的3倍左右；多酚单体绿原酸（38.3 mg·g^-1）、芦丁（10.2 mg·g^-1）两者含量是微波干燥方式的1.5倍左右，热风和真空干燥方式的2—6倍。不同干燥方式对蓝莓叶的抗氧化活性影响显著（P＜0.05）。其中，真空冷冻干燥样品的抗氧化能力最强，DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为54.8 µg·mL^-1和183.9µg·mL^-1，亚铁还原能力FRAP值达到6.0，抗氧化能力略高于微波干燥法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为61.8 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1，FRAP值4.0）。微波干燥法样品的抗氧化能力显著高于热风干燥（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.6 µg·mL^-1和575.1 µg·mL^-1，FRAP值1.7）和真空干燥方法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.1 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1，FRAP值1.8）(P＜0.05)。热风和真空干燥样品间抗氧化活性没有明显差异(P＞0.05)。相关性分析表明，除芦丁外，其他酚类物质含量与其抗氧化活性均存在极显著相关(P＜0.01)。【结论】真空冷冻干燥能较好地保留蓝莓叶中的多酚类物质，且具备较强的抗氧化能力和还原能力；微波干燥的效果略低于真空冷冻干燥，生产上可根据样品处理量的大小和具体情况选择干燥方式。

Loxp序列位置对基因表达的影响

许盈盈，靳伟，代敏敏，樊宝良

中国农业科学. 2018, 51(13): 2579-2591. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.013

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【目的】先选用绿色荧光蛋白基因（egfp）作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构，对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶（phytase）基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接共表达的转基因动物制作中，打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因（egfp）为试验基因,红色荧光蛋白基因（dsred2）为内参基因。以pEGFP-N2、pGEM-5zf-loxp质粒为基础，构建了ploxp-EGFP（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、pEGFP-loxp（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）、ploxp-EGFP-loxp（egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）。以pEGFP-N2质粒为对照质粒，以pDsRed2-N1为内参质粒，与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞，转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况，用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度，进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析，确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证，本试验选择植酸酶（phytase基因）基因为试验基因，egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因（luciferase基因）为表达内参基因。以pIREsNEo、pGEM-5zf-loxp和pT-phytase、pGL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp（phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）、p-SV40-luciferase-CMV-phytase-loxp（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）和p-SV40-luciferase-CMV-phytase（phytase基因开放阅读框的上下游均无loxp序列）等试验质粒,以egfp基因(pEGFP-N2)为转染内参基因与所构建的各种phytase基因表达结构共转染PK15细胞，同时设置一个转pEGFP-N2+ pDsRed2-N1的空白对照。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白基因表达情况，用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度，应用SPSS19.0软件对各转染绿色荧光表达情况进行分析。同时应用钼蓝法测定各转染的植酸酶活性。应用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各转染萤火虫荧光素酶活性。用SPSS19.0软件对各转染的植酸酶和萤火虫荧光素酶表达水平（活性）进行统计分析。【结果】试验中以dsred2为内参基因，对转染后每个转染的不同区域红色荧光强度平均值(代表各转染红色荧光蛋白的表达水平)进行统计分析表明egfp基因各结构每个转染的间红色荧光蛋白表达水平差异不显著，表明不同转染间排除了转染操作、质粒纯度、细胞活性等的差异对分析结果的影响，转染前质粒的电泳结果表明，各质粒间不同构象的质粒比例基本一致，这也基本排除了转染用质粒质量的差异对转染效果的影响，对各转染不同区域绿色荧光强度的平均值（代表各转染的egfp基因表达水平）进行的统计分析表明，同一结构不同转染间egfp基因表达水平差异不显著，不同结构的转染间存在差异，其中ploxp-EGFP和ploxp-EGFP-loxp结构转染中绿色荧光蛋白的表达水平显著低于pEGFP-loxp和pEGFP-N2，而pEGFP-loxp和pEGFP-N2转染间egfp基因间的表达差异不显著。这一结果初步说明loxp序列在外源基因开放阅读框下游时对基因表达水平没有影响，在外源基因开放阅读框上游时对基因表达呈负影响，为了进一步验证上述结果的可靠性，本研究以植酸酶基因作为另一试验基因，以萤火虫荧光素酶基因为表达内参基因，以egfp基因为转染内参基因再次进行了验证，验证试验得到了相似的结果。【结论】开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接，实现外源基因和内源基因共表达的转基因动物制作研究中，以Cre/loxp系统作为报告基因删除工具时，则内源基因的下游为最佳的打靶位点。

苜蓿方捆袋贮饲料品质评价

孙娟娟，王国良，阿拉木斯，赵金梅，白春生

中国农业科学. 2018, 51(13): 2592-2599. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.014

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【目的】方捆袋贮是紫花苜蓿青贮模式之一，具有运输使用方便灵活等优点，然而，草捆青贮袋容易破损，导致青贮饲料内部或表面呈斑块状发霉。通过对青贮袋破损与未破损方捆苜蓿青贮饲料品质的综合评价，为紫花苜蓿青贮模式的选择及其在养殖业中的利用提供理论依据。【方法】取青贮袋破损的草捆中未发霉的青贮饲料以及青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料，分别从草捆上、中、下三层取样，比较微生物菌落数、化学成分及pH、有机酸和氨态氮含量，使用V-Score和Kariser两种评价方法，综合评价两者的青贮发酵品质。【结果】苜蓿方捆袋贮饲料的干物质含量为43.86%—45.47%，粗蛋白含量为21%以上，中性洗涤纤维含量为35.87%—37.42%，酸性洗涤纤维含量为30.68%—31.79%，灰分含量为8.37%—8.50%，可溶性碳水化合物含量为0.46%—0.53%。青贮袋破损的未发霉苜蓿青贮饲料除了干物质含量显著低于青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料之外，两者的各营养成分无显著差异。苜蓿方捆袋贮饲料pH值为4.63—4.72，乳酸、乙酸、丙酸和丁酸占干物质的百分比分别为6.12%—7.04%、2.41%—3.21%、0.18%—0.20%、0.67%—0.89%，氨态氮占总氮的百分比为5.33%—5.79%。青贮袋破损的未发霉苜蓿青贮饲料除了pH值和乙酸含量高于青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料之外，两者的乳酸、丙酸、丁酸和氨态氮含量均无显著差异。未发霉的苜蓿青贮饲料中霉菌酵母菌的数量均在104cfu/FM以下。两者V-Score评分等级均属尚可，Kariser评分等级均为3级。【结论】苜蓿方捆袋贮饲料具有良好的发酵品质，方捆袋贮是较理想的苜蓿青贮模式。去除发霉部分，青贮袋破损的青贮饲料其营养成分与青贮袋未破损的苜蓿青贮饲料相同。

日本血吸虫SjELAV-like 1的克隆、表达及功能分析

许蓉，张媛媛，李肖纯，程贵凤，何川川，郭露，李浩，刘金明，古少鹏，金亚美

中国农业科学. 2018, 51(13): 2600-2613. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.015

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【目的】克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（SjELAV-like 1），分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位，探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。【方法】利用RACE技术扩增5′/3′末端，获得SjELAV-like 1基因序列提交至NCBI，Gene Bank登录号：MG515727，构建该序列的重组表达质粒 pET28-SjELAV-like 1，并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达，收集不同诱导时间的菌体，SDS-PAGE法进行蛋白电泳。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白，用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，用于Western blotting 分析虫体内该天然蛋白的免疫原性，以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴，收集虫体不同发育阶段混合和合抱分开的雌、雄虫体，以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体，通过实时定量 PCR分析该基因的表达情况。通过尾静脉注射小干扰RNA（siRNA）于感染小鼠体内，使该基因表达沉默，筛选最佳干扰效果的siRNA，用于长期RNA干扰（RNAi）试验，分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响。利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响。【结果】获得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾，其中编码序列为1 533 bp，编码510个氨基酸。重组质粒pET28-SjELAV-like 1在诱导4 h时表达量最高，主要以包涵体的形式存在，利用纯化蛋白获得了优质多抗，获得的重组蛋白具有良好的免疫原性，经分析发现SjELAV-like 1蛋白主要分布在虫体体被。RT-qPCR 发现SjELAV-like 1在不同时期雌、雄虫体内均有表达，在雄虫体内表达稳定，但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势；在不同感染状态的雌、雄虫体内，与正常发育雌虫相比，该基因在发育阻遏雌虫体内高表达，而在雄虫体内无明显差异。RNAi试验中，与NC组相比，长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27%（P＜0.05）、40.59%（P＜0.01）和74.58%（P＜0.01）；电镜观察发现，干扰组虫体体被结构改变，雄虫体表粘附的泡状物消失，立体的褶脊结构塌陷，整齐排列的条索状皮脊变的疏松，网状结构消失，雌虫体壁表面组织间隙增宽，分布于其上的体棘减少、变钝，雄虫精母细胞数目减少，其内的染色质减少，细胞肿大，细胞间质增宽，雌虫卵黄细胞中卵黄球减少，其中包含的卵黄滴也减少，内质网肿大，皮质颗粒排列散乱。【结论】成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列，且发现该基因主要在虫体体被表达。该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显著降低，并改变虫体体被结构，抑制生殖腺的正常发育，提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用。

一种高通量提取桃DNA方法的建立与应用

张南南，牛良，崔国朝，潘磊，曾文芳，王志强，鲁振华

中国农业科学. 2018, 51(13): 2614-2621. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.016

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【目的】DNA制备是大规模基因型筛选和分子标记辅助选种的重要前提，本研究采用一种1.2 mL八联排管代替单个离心管，探索一种操作简便、节约时间、成本低的桃DNA快速提取方法，以满足高通量遗传研究的需求，提高工作效率。【方法】以普通生长型桃（standard type，ST）‘中油桃8号’为母本，温度敏感半矮生型桃（temperature-sensitive semi-dwarf in Prunus persica，PpTssd）‘09-1-112’为父本，杂交获得F₁代分离群体500株实生苗为载体，包括温度敏感半矮生型246株，普通生长型254株，建立一种高通量、低成本桃DNA提取方法。利用1.2 mL八联排管结合八通道移液器，简化提取步骤，提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA；通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA浓度、纯度和完整性进行检测。基于高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM），采用96孔板对温度敏感半矮生型桃和普通生长型桃共500个F₁分离后代单株进行PCR扩增和基因分型，区分TSSDtssd基因型与tssdtssd基因型。基于双亲表型与基因型一致，开发InDel位点，PCR扩增后，采用SDS-PAGE在F₁群体中进行验证，确定利用分离的DNA是否正确区分不同基因型。【结果】分离的DNA经紫外分光光度计检测，浓度范围约为25—200 ng·μL^-1，OD_260nm/OD_280nm约为1.81—1.98，DNA纯度较高；琼脂糖凝胶电泳条带清晰、单一，DNA完整度较高。参考桃基因组（Version 2.0），根据双亲深度测序数据，开发获得SNP标记SNP_Pp03_3758620，应用于高分辨率熔解曲线基因分型，发现温度敏感半矮生型和普通生长型呈现明显不同的峰型，证明提取的DNA模板可应用于HRM基因分型。基于双亲基因型与表型一致，开发InDel标记InDel_Pp03_3829009，聚丙烯酰胺凝胶电泳的验证结果显示PCR扩增具有较高的强度，获得与目的片段大小一致的特异性条带，且在两种不同生长型单株中具有明显的多态性，表明PCR扩增稳定，提取的DNA可用于基于InDel标记的多态性分析。使用该提取方法，每人每天可以完成1 000个样品的DNA提取，成本较低，且不会对幼苗早期生长造成影响。【结论】建立了一种简便、有效、低成本的桃基因组DNA提取方法，可以满足基因分型、品种鉴定及遗传分析等分子生物学研究，实现了大批量不同样本基因组DNA的同时提取，具有较高应用价值。

葡萄无核性状的SSR新分子标记开发及应用

马亚茹，冯建灿，刘崇怀，樊秀彩，孙海生，姜建福，张颖

中国农业科学. 2018, 51(13): 2622-2630. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.13.017

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【目的】开发葡萄无核性状的SSR新分子标记，对葡萄杂种后代进行早期无核性状鉴定，为分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’及F₁代杂交群体的133份葡萄材料进行RAD-seq，将测序结果比对到参考基因组上；运用SAMtools软件生成CaSFS软件所需的pileup和glf文件，过滤获得亲本之间的有效SNP集；采用窗口滑动的方法，确定每个窗口的基因型，选择以每15个SNP为一个窗口，每次滑动一个SNP，得到每个个体的基因型并生成bin图；对生成的bin图采用拟测交的方式利用Joinmap软件进行连锁分析，构建‘红地球’与‘森田尼无核’遗传连锁图谱；用WindowQTLCartographer2.0软件进行QTL定位，在定位区间通过Perl程序语言找到符合SSR特征序列的35个SSR分子标记，用Primer premier5.0软件设计35个SSR分子标记引物对，通过HRM技术筛选亲本之间在无核性状上存在差异的SSR分子标记，并在131株F₁代杂交群体及65个葡萄品种的自然群体中检测无核分型正确率、无核检测率、无核保持率。【结果】在‘红地球’与‘森田尼无核’构建的遗传连锁图谱上，将葡萄无核性状定位在chr18号染色体上，定位区间26 835 846—26 960 426，对无核的贡献率为77.9%，LOD阈值为26.3。亲本之间在无核性状上存在差异的SSR分子标记为VvSD10，其在111 bp等位点能对葡萄无核性状进行鉴定，利用分子标记VvSD10上的111 bp等位点通过HRM技术在葡萄F₁代杂交群体及自然群体中进行葡萄无核性状的鉴定。结果表明，分子标记VvSD10在F₁代杂交群体及自然群体中的无核分型正确率分别为97%、94%，其无核检测率均为56%，无核保持率分别为77%、85%。【结论】分子标记VvSD10在遗传群体及自然群体中的无核分型均能提供较高的准确信息，为无核葡萄的分子标记辅助育种奠定了基础。

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