当期目录

2018年 第51卷 第2期 刊出日期：2018-01-16

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

贵紫麦1号籽粒色素形成相关基因的差异表达

徐熙，任明见，李鲁华，杨喜翠，徐如宏

中国农业科学. 2018, 51(2):  203-216.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.001

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【目的】探明贵紫麦1号小麦灌浆期变紫后和变紫前2个时期籽粒的转录组差异，发掘影响贵紫麦1号花青素合成的关键基因和关键酶，丰富小麦籽粒色素转录组数据信息，为转录因子的克隆及表达提供参考。【方法】利用Illumina Hiseq 2000TM高通量测序技术对贵紫麦1号籽粒变紫前和变紫后2个时期进行转录组测序、文库构建及建库质量评估，对测序结果进行信息学分析。采用TTM对read count数据进行标准化处理，随后用DEGseq进行差异分析，设定q-value＜0.005且|log2 (fold change)|＞1为阈值。通过筛选分析，获得两者间差异表达基因，按照无参转录组分析方法，对差异表达基因进行BLAST搜索，Nr数据库比对，GO功能富集及KEGG pathway分析，找出与花青素相关的关键基因和关键酶，并结合qRT-PCR验证所找到的关键基因及关键酶在不同时期的表达水平，掌握这些关键基因的信息。【结果】测序结果表明，贵紫麦1号变紫后和变紫前分别获得13.36 G和12.69 G的clean bases，clean reads为106 906 108条和101 547 534条，占原始序列的93.73%和94.90%。通过Trinity软件对所得clean reads进行拼接，共获得170 396条转录本，长度为119 020 625。拼接clean reads后获得119 572条Unigenes。在BLAST搜索中，119 572个高质量独特序列中有86 004条（71.92%）Unigenes与现有基因模型具有至少1个显著匹配。在Nr数据库比对结果鉴定了至少5种具有与来自节节麦、乌拉尔图小麦、二穗短柄草、大麦、小麦等已知基因同一性且序列相似性高的Unigenes。KOG数据库比对结果显示，注释成功的基因按KOG的26个group进行分类，注释在一般功能基因，蛋白质翻译后修饰与转运、分子伴侣及翻译、核糖体结构与生物合成等类别基因所占比重较大，分别为15.79%、14.51%和10.54%。643个差异基因中，236个呈上调趋势，407个呈下调趋势。GO注释表明，按照基因参与的生物过程、所处的细胞组分、具有的分子功能下一层级分类，共44个分类，差异基因显著富集在碳水化合物代谢过程（GO:0005975，16.03%）、应激反应(GO:0006950，10.83%)和水解酶活性分子功能(GO:0016787，34.84%)等类别中。KEGG pathway富集分析可知，353个差异基因富集到153条相关通路上，其中淀粉与蔗糖代谢、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等通路富集显著。类黄酮生物合成途径相关基因共66个，2条相关上调表达Unigenes，涉及查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶2个关键酶基因，log2(fold change)分别为3.4164和2.1258。对所得关键基因进行qRT-PCR验证，证实查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶在贵紫麦中1号中表达量呈明显上调趋势，与转录组测序分析结果一致，测序结果可靠度高。【结论】比较分析贵紫麦1号籽粒变紫后和变紫前2个时期转录组测序结果，获得大量Unigenes数据及差异表达基因相关信息，明确类黄酮代谢途径中2个关键酶基因（CHS和ANS）在调控贵紫麦1号籽粒花青素合成过程中作用显著。

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

牛陆，赵倩倩，杨静，邢国杰，张伟，贺红利，杨向东

中国农业科学. 2018, 51(2):  217-225.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.002

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【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一，严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs，从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术，将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆，研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响，为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术，将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中，构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S，终止子为NOS，筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法，将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上，通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法，对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查，分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体，获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明，其中65株能够扩增出目的条带，大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁—T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明，在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后，转基因植株表型没有明显变化，而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明，外源基因以低拷贝的方式(1—2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明，在接种35 d后，对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状，而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状，其病情指数降低至11.11—22.22，较对照（病情指数36.81—46.24）显著降低，且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明，在接种SMV SC-3株系28 d后，转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明，在未接种SMV条件下，转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展，增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。

紫花苜蓿秋眠性的SSR标记关联分析

刘希强，张涵，王学敏，仪登霞，王赞

中国农业科学. 2018, 51(2):  226-232.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.003

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【目的】发掘紫花苜蓿秋眠性关联位点，为揭示紫花苜蓿秋眠性状的遗传规律和分子机制提供理论依据。【方法】紫花苜蓿关联群体由75份321个四倍体紫花苜蓿基因型构成，其中中国紫花苜蓿品种每份材料选取6—8个基因型；其余材料每份选取3—4个基因型。利用紫花苜蓿基因组均匀分布的85对SSR（Simple sequence repeats）标记，对321个紫花苜蓿基因型进行扫描。于2014—2015年连续两年对紫花苜蓿秋眠性开展调查，并利用一般线性模型（GLM）及混合线性模型（MLM）2种方法，开展秋眠性与SSR分子标记的关联分析。【结果】紫花苜蓿秋眠性表现出极显著的基因型、年际及基因型×年际互作效应。2014年，表型变异幅度为5.1—55.1 cm，平均值为22.4 cm，变异系数为45.5%。2015年，变异幅度在3.5—44.9 cm，平均为15.2 cm，变异系数为43.7%。秋季株高两年均呈现接近正态分布特征。广义遗传力为0.71。MLM模型很好的控制了紫花苜蓿秋眠性的假阳性关联。基于MLM模型，在2014年共找到12个显著关联的SSR位点，表型贡献率为2.42%—6.73%。2015年共找到11个，表型贡献率为2.45%—4.81%。在这些关联位点中，分布于Chr 2的m83_157、Chr 3的m525_230和m525_231、及Chr 4的m429_245，在两种模型及两年内均被重复检测到。【结论】通过两种模型发掘到4个与紫花苜蓿秋眠性显著相关的位点，经过验证后可以用于紫花苜蓿秋眠性分子标记辅助选择育种。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

交替沟灌玉米灌浆期茎流影响因子敏感性分析与模型适用性研究

杜斌，胡笑涛，王文娥，马黎华，周始威

中国农业科学. 2018, 51(2):  233-245.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.004

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【目的】应用人工神经网络对不同处理玉米茎流进行精准预测，为推算玉米蒸腾耗水量以及制定合理的灌水方案提供新思路。【方法】试验研究对象为夏玉米，品种为西农985。试验设置3个处理，分别为交替沟灌高水处理（alternate furrow irrigation，AFI1）、交替沟灌低水处理（alternate furrow irrigation，AFI2）和常规沟灌处理（conventional furrow irrigation，CFI）。AFI1、AFI2每次灌水量为CFI灌水量的2/3和1/2。利用通径系数与互信息分析不同处理的影响因素与玉米茎流相关关系，基于人工神经网络理论建立了玉米茎流速率估算模型，以主成分回归模型为对比，对两个模型预测精度和稳定性进行评价。【结果】（1）不同处理对环境因子的响应有所差异，影响CFI、AFI1玉米茎流的主要因素是气象因子，影响AFI2处理玉米茎流的主要因素是土壤水分；（2）不同土层含水量对各处理茎流的影响也有所不同，研究发现10—20 cm和20—30 cm土层含水量与玉米茎流相关程度最高。利用不确定性分析法进一步分析得出，常规处理与高水处理水平下，与茎液流变化关系最密切的土壤含水层为20—30 cm，其次是10—20 cm，低水处理水平下，最敏感的土层为10—20 cm，其次是20—30 cm；（3）根据模型误差分析与模型不确定性分析，神经网络模型RMSE、d-factor值较小，R²值达到了0.9以上，说明神经网络模型预测精度更高，模型更稳定。【结论】与传统方法相比，人工神经网络模型可以快速准确地对茎流进行预测，对指导玉米灌溉具有重要的指导意义。

中国粒用高粱改良品种的产量和品质性状时空变化

李嵩博，唐朝臣，陈峰，谢光辉

中国农业科学. 2018, 51(2):  246-256.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.005

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【目的】对1977—2016年粒用高粱生产现状和审定品种的产量及品质相关性状进行分析，以期为高粱品种选育和生产提供参考。【方法】通过查阅行业年鉴和相关文献，统计了国家和省级审定并公开的品种324个，搜集其区试单产、穗粒重、千粒重、生育期、株高、穗长，以及品质相关性状包括淀粉、单宁、蛋白质、赖氨酸与脂肪含量的数据。【结果】从时间演变来看，40年来审定品种数随年份持续增加。株高呈下降趋势，平均每年降低1.36 cm。区试单产呈显著上升趋势，平均每年提高69.1 kg·hm^-2；淀粉和单宁含量呈显著上升趋势（P＜0.05），蛋白质含量呈显著下降趋势（P＜0.05），赖氨酸和脂肪含量则无显著变化。从空间分布来看，生育期的平均值在春播早熟区、春播晚熟区、春夏兼播区和南方区的变化范围为94—126 d；春夏兼播区的穗粒重最高（105.4 g），南方区最低（64.6 g）；千粒重在春播晚熟区最高（30.3 g），南方区最低（22.6 g），分区间均表现出显著差异（P＜0.05）；淀粉含量在春播早熟区和春播晚熟区较高，平均为74.2%，而脂肪含量较低，平均为3.5%；单宁在南方区含量最高（1.1%）；蛋白质和赖氨酸含量在分区间无显著性差异。【结论】建议今后品种选育把植株矮化和提高千粒重作为提高产量的重点策略，品质上向专用型发展。酿酒高粱应保证适当高淀粉含量、合理的蛋白质和脂肪含量范围，注重提高单宁含量。而饲料高粱应保证高淀粉，注重降低单宁并提高蛋白质、赖氨酸含量。

植物保护

禾谷镰孢碳源代谢调控因子FgCreA的功能

侯瑞，王晨芳

中国农业科学. 2018, 51(2):  257-267.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.006

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【目的】敲除禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中碳源代谢调控因子FgCreA，并对其营养生长、有性生殖和致病力等方面进行研究，为研究禾谷镰孢中碳源代谢机制提供依据。【方法】根据酵母数据库SGD和NCBI数据库中的序列，利用酿酒酵母中碳源代谢调控因子Mig1确定禾谷镰孢中的碳源调控因子FgCreA；在NCBI数据库中检索其他物种中碳源代谢调控蛋白，使用ClustalW2软件进行多重序列比对，并用MEGA5软件构建系统进化树，同时在InterProScan网站上预测其蛋白结构域；在NCBI数据库中检索与禾谷镰孢碳源吸收相关的结构基因和真菌毒素DON生物合成的相关基因，调取起始密码子上游1 000 bp的片段，预测FgCREA基因结合位点位置；用Primer5软件设计引物，利用Split-PCR和PEG介导原生质体转化的方法进行基因敲除，并通过PCR和Southern blot验证获得FgCREA基因敲除突变体Fgcrea。根据突变体Fgcrea营养生长、有性生殖和致病力等方面的变化分析FgCREA的功能。【结果】通过生物信息学方法，明确禾谷镰孢中只有一个碳源代谢调控因子基因FgCREA(FGSG_09715)，氨基酸序列416 aa，共包含两个保守的C2H2锌指结构区域。FgCreA同源蛋白在各类真菌中均存在一定程度的同源性，具有较高的保守性。禾谷镰孢碳源吸收相关结构基因（XYL2、ARA1、ICL1、PG1、SUC2）和真菌毒素DON生物合成相关基因（TRI1、TRI3、TRI4、TRI5、TRI6、TRI7、TRI8、TRI10、TRI12、TRI101）启动子区均含有FgCREA DNA结合位点。采用Split-PCR技术和PEG介导的原生质体转化，通过PCR和Southern blot获得并验证了两个FgCREA基因敲除突变体。表型观察发现，突变体Fgcrea的生长速度与野生型相比下降90%；分生孢子形态正常，但产孢量与野生型相比降低88%；有性生殖阶段，突变体Fgcrea可以产生正常的子囊壳、子囊和子囊孢子，但需要比野生型长20—28 d；突变体Fgcrea对钠盐较敏感，侵染小麦穗不发病。【结论】获得禾谷镰孢碳代谢调控因子FgCreA敲除突变体，明确FgCreA参与营养生长和有性生殖，并能够影响致病过程。但是否影响相关结构基因的转录水平和DON生物合成仍需进一步验证。

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株的异质性

郑雪芳，刘波，朱育菁，陈德局，陈小强

中国农业科学. 2018, 51(2):  268-278.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.007

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【目的】研究青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）Tn5转座子突变菌株的异质性，筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标“弱化指数（attenuation index，AI）”和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株进行致病力测定；利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性；构建色谱效价指数（chromatography titer index, CTI_i），CTI_i=S_i/（S₁+S₂+S₃）×100%（i=1、2或3；S₁、S₂和S₃分别对应P₁、P₂和P₃的峰面积），测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTI_i值，用皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient，PCC）分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果，青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型：强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株，其AI值介于0.49—0.63，接种番茄15 d，植株发病率为66.33%—100%；无致病力菌株共有20株，其AI值介于0.78—0.89，接种番茄15 d，植株发病率为0；中间型菌株共有7株，其AI值介于0.68—0.73，接种番茄15 d，植株发病率为24.17%—45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示，防治效果介于16.68%—92.45%，菌株T831防治效果最好，达91.74%，其次是菌株T780，防治效果为87.51%，菌株T497防治效果最差，为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示，青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P₁（出峰时间为0.6 min）、P₂（出峰时间为4.4或4.5 min）和P₃峰（出峰时间为5.9或6.0 min）；强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型：单峰、双峰和3个峰，强致病力菌株的主峰为P₃峰，无致病力菌株的主峰为P₁峰，中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型；强致病力菌株中CTI₃为100%的菌株，致病力最强，诱导番茄植株发病率均达85%以上，CTI₃＜100%的菌株，接种后番茄植株发病率介于66.33%—84.14%；无致病力菌株中CTI₁达100%的菌株，其防治效果高，均达到80%以上，CTI₁＜90%的菌株，其防治效果低，介于16.68%—63.62%；CTI₃与突变菌株致病力呈极显著正相关，相关系数PCC值为0.62；CTI₁与无致病力突变菌株的防治效果呈极显著正相关，相关系数PCC值为0.80。【结论】青枯雷尔氏菌Tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型，不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI₁可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株，CTI₃可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。

大麦黄条点花叶病毒的分布及其分离物的遗传多样性

杨菲，张爱红，孟凡思，霍良占，李希望，邸垫平，苗洪芹

中国农业科学. 2018, 51(2):  279-289.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.008

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【目的】明确大麦黄条点花叶病毒（Barley yellow striate mosaic virus，BYSMV）在中国北方小麦主产区的分布及其种群遗传多样性，为病害流行预警和防控提供理论依据。【方法】2008—2016年，在河北、山东、江苏、安徽、河南、陕西和山西等7个省66个县/市/区田间，采集了864份疑似病毒病症状的植物样品。提取样品总RNA，利用一步法三重RT-PCR技术检测样品中的BYSMV、水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）和北方禾谷花叶病毒（Northern cereal mosaic virus，NCMV）。利用RT-PCR扩增获得BYSMV的L和N基因片段，克隆并测定核苷酸序列，应用MEGA、DnaSP和PAML等软件分析BYSMV分离物的系统进化和遗传多样性特征。【结果】从48个县/市/区采集的336份样品中检测到BYSMV，检出率为38.89%，该病毒主要分布于陕西、河北、山西和山东，另外，河南及安徽北部亦有分布，江苏徐州和邳州仅局部发生。基于BYSMV的L、N基因序列构建的系统发育树均可将分离物划分为2个亚组，亚组I中的分离物其来源涉及全部7个省份，而亚组II中的分离物仅来自陕西和山西2个省，基于L基因序列系统发育分析表明亚组II分离物与伊朗的分离物亲缘关系较近，BYSMV的遗传分化与分离物的地理来源相关，而与寄主植物、发生时间无明显相关性。运用RDP程序包的7个软件进行基因重组分析显示没有支持重组的证据。选择压力分析显示，亚组内和亚组间的ω（dN/dS）值（0.02—0.19）远小于1，表明群体正承受净化选择。L和N基因的单倍型多样性（Hd）值（0.90909和0.99524）均大于0.5、核苷酸多样性（π）值（0.01324和0.01224）均高于0.005，表明中国BYSMV群体遗传多样性丰富。基于L和N基因片段的遗传分化研究显示，东部和西部群体的遗传分化系数（F_ST）值（0.32201和0.37326）均大于0.25，且统计检验差异显著，表明东部和西部的BYSMV群体严重分化；基因流（Nm）值（0.53和0.42）均小于1，说明有限的基因流是促使群体发生遗传分化的主要原因。【结论】BYSMV在中国北方小麦主产区分布广泛，河北、山东、江苏、安徽、河南、陕西和山西等地均有不同程度的发生。BYSMV群体具有丰富的遗传多样性，且东部和西部群体之间存在严重的遗传分化。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

长期施肥和灌溉对土壤细菌数量、多样性和群落结构的影响

杨亚东，王志敏，曾昭海

中国农业科学. 2018, 51(2):  290-301.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.009

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【目的】通过对华北地区一年两熟种植模式下冬小麦生长季不同施肥和灌溉处理下土壤细菌群落的研究，揭示长期不同施肥和灌溉制度下土壤细菌数量、多样性和群落结构的变化规律。为科学施肥和灌溉，提高农田地力和维持土壤微生物多样性等提供依据。【方法】依托中国农业大学吴桥实验站，选取长期施肥和灌溉定位试验的6个处理冬小麦收获后耕层土壤为研究对象，分别为化肥+不灌溉（CI0）、化肥+拔节期灌溉（CI1）、化肥+拔节期灌溉+灌浆期灌溉（CI2）、有机肥+不灌溉（MI0）、有机肥+拔节期灌溉（MI1）和有机肥+拔节期灌溉+灌浆期灌溉（MI2）。借助荧光定量PCR技术和Illumina Miseq高通量测序平台，以16S rRNA基因为标靶，研究长期不同施肥和灌溉制度对土壤细菌数量、多样性和群落结构的影响，并分析细菌数量、多样性和群落结构变化与土壤理化性质的相关性。【结果】灌溉显著提高了土壤含水量和土壤pH，施有机肥比施化肥显著提高了土壤有机碳含量。不同处理细菌16S rRNA基因拷贝数为每克干土4.34×109—1.39×1010。灌溉显著提高了细菌数量，化肥和有机肥处理分别提高了1.17—1.60和0.76—1.93倍。多样性指数结果表明灌溉显著影响细菌群落α多样性指数，施肥对细菌群落α多样性指数的影响均不显著。门水平上，18个样品共获得39个类群，其中变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为优势类群，相对丰度共占77.22%—86.28%。不同处理间放线菌门（11.09%—27.01%）、拟杆菌门（5.45%—12.13%）和Saccharibacteria（2.41%—3.77%）的相对丰度差异显著。灌溉显著降低了放线菌门和Saccharibacteria的相对丰度，化肥和有机肥处理分别降低了36.48%—48.03%、22.17%—33.67%和15.21%—45.54%、13.40%—23.97%。层次聚类和主成分分析结果显示施肥和灌溉对细菌群落结构都产生影响，相同灌溉次数处理的细菌群落结构相似，而相同施肥处理间细菌群落结构差异较大，表明灌溉对细菌群落结构的影响强于施肥。此外，土壤含水量、土壤pH、全氮含量和有机碳含量与细菌数量、α多样性指数和群落结构存在一定的显著相关关系。【结论】灌溉显著改变了细菌数量、多样性和群落结构，施肥对细菌数量和群落结构的影响较小。土壤含水量和土壤pH是造成土壤细菌数量、多样性和群落结构差异的主要原因。

黄土高原植被生态系统水分利用效率时空变化及驱动因素

刘宪锋，胡宝怡，任志远

中国农业科学. 2018, 51(2):  302-314.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.010

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【目的】明晰黄土高原植被生态系统水分利用效率（water use efficiency，WUE）时空变化特征及其影响因素，为深刻理解生态恢复和气候变化双重背景下黄土高原植被生态系统与水文相互作用研究提供依据。【方法】利用趋势分析和逐步回归方法，对2000—2014年黄土高原植被生态系统WUE时空变化特征及其驱动因素进行了探讨。【结果】近15年黄土高原植被生态系统WUE呈显著增加趋势，增速为0.02 gC·kg^-1H₂O·a^-1（P<0.001），不同植被生态系统年内WUE主要呈“双峰”模式，峰值分布在4—5月和9—10月；空间上，黄土高原植被生态系统WUE整体呈现上升趋势，其中上升趋势和显著上升（P＜0.05）面积分别占研究区的95.04%和66.96%，但不同季节变化趋势特征差异较大；不同植被生态系统WUE均值和趋势差异显著，其中稀疏灌丛和草地WUE均值较低，而针叶林WUE趋势下降明显；进一步对坡度统计表明，25—50°范围内植被生态系统WUE呈持续增加趋势。当年蒸散量小于3 700 mm时，总初级生产力（gross primary productivity，GPP）随着蒸散量（evapotranspiration，ET）的增加而增加，随后GPP则随ET的增加呈下降趋势，且研究区中东部（57.25%）WUE主要由GPP控制，而西部区域（42.75%）WUE则受ET影响。近15年黄土高原植被生态系统WUE与LAI呈显著的正相关关系（P＜0.001），表明LAI的增加能够有效促进WUE的提升。逐步回归分析表明，降水量、日照时数和相对湿度3种气候因子是导致WUE及其组分GPP和ET变化的主要气候因子。【结论】在气候变化和人类活动双重影响下，2000—2014年黄土高原植被生态系统WUE呈显著上升趋势，且大部分植被类型年内分布呈现双峰结构。生态恢复工程不仅改善了黄土高原植被覆盖状况，同时显著提高了植被生态系统的WUE，成为近年来黄土高原WUE变化的主要驱动因素。

园艺

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

蒲艳，刘超，李继洋，阿尔祖古丽·塔什，胡燕，刘晓东

中国农业科学. 2018, 51(2):  315-326.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.011

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【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统，为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子，利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短，分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片，通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA，以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后，采用PEG法转化番茄原生质体，提取基因组DNA，采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况；采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR，共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子，其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp，启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样，也含有比较保守的两个元件，USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色，表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA，成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体，验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录，并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换，突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子；基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体，在番茄中成功实现对内源基因的编辑。

梨全基因组生长素反应因子（ARF）基因家族鉴定及表达分析

欧春青，姜淑苓，王斐，赵亚楠

中国农业科学. 2018, 51(2):  327-340.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.012

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【目的】明确梨ARF转录因子在梨基因组中的数量、结构和组织表达差异，为揭示ARF转录因子在梨树生长素信号途径及在矮生梨生长发育中的作用奠定理论基础。【方法】根据文献报道的苹果、拟南芥等植物中的ARF转录因子基因，利用BLAST软件鉴定梨基因组中的ARF。采用SMART、PROSITE、WebLogo 3、DNAMAN 5.0、MEME、GSDS 2.0和MEGA 5.1等软件对其蛋白和基因序列进行生物信息学分析。采用qPCR方法检测梨ARF在矮生梨‘中矮1号’不同组织器官及3个不同生长势梨品种木质部和韧皮部中的表达情况。【结果】鉴定得到31个梨ARF，所有PbARF蛋白均含有1个Auxin_resp结构域和1个B3结构域，除PbARF11、12、24、25和26外，其他序列的C末端还存在一个PB1（AUX_IAA）结构域。保守元件分析表明，PbARF基因家族包含15个保守元件，并非每个蛋白均含有所有保守元件。分组鉴定和进化树分析结果显示，PbARF蛋白可以被分为4组。基因结构分析表明，PbARF基因家族成员由2—15个外显子组成，基因结构进化高度保守。qPCR结果显示，所有PbARF在‘中矮1号’根、韧皮部、木质部、叶、花和果实中均有表达，表达模式各有不同，PbARF29在3个梨品种韧皮部中的表达表现出植株越矮表达量越高的趋势，PbARF16、17、18、27等4个基因在3个梨品种木质部中的表达表现为植株越矮表达量越低的趋势。【结论】梨基因组中含有31个ARF基因家族成员；所有PbARF蛋白均含有Auxin_resp和B3两个高度保守的结构域；PbARF结构进化高度保守；所有PbARF在‘中矮1号’不同组织器官、基砧杜梨根系及3个梨品种的木质部和韧皮部中均有表达，其中，PbARF29、16、17、18、27等5个基因的表达可能与梨树植株的高矮有关。

畜牧·兽医·资源昆虫

不同开食料采食量断液体饲粮对羔羊生长发育的影响

柴建民，王波，祁敏丽，王世琴，屠焰，陶晓菁，刁其玉，张乃锋

中国农业科学. 2018, 51(2):  341-350.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.013

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【目的】研究不同开食料采食水平断液体饲粮（代乳品）对羔羊生长、屠宰性能、内脏器官和胃肠道发育的影响，旨在确定羔羊最佳断代乳品时间，为羔羊生长发育提供理论依据。【方法】采用单因素试验设计，以断代乳品时开食料采食水平为试验因子，选取体重接近的纯种湖羊羔羊64只，分为4组，每组16只，每个重复1只。于10日龄断母乳饲喂代乳品，于15日龄开始补饲开食料，开食料自由采食。当羔羊连续3d开食料干物质采食量达到200、300、400和500g时分别断掉代乳品，对应地分别为A、B、C和D组。动物饲养试验过程中，测定羔羊生长性能包括体重、日增重和采食量并计算饲料转化率。在羔羊90日龄进行屠宰试验，测定羔羊屠宰性能、内脏器官和胃肠道发育情况。【结果】（1）90日龄羔羊体重，B和C组有高于D组的趋势（P=0.0563）；日增重方面，在10至90日龄期间，B和C组显著高于D组（P＜0.05）；代乳品采食量方面，A和B组羔羊显著低于C和D组（P＜0.05），其中A组显著低于B组（P＜0.05）；开食料采食量方面，整个试验期，A和B组开食料采食量显著高于C和D组（P＜0.05）；饲料转化率方面，断代乳品至90日龄和10-90日龄期间，B和C组羔羊料重比显著低于其余组（P＜0.05）。（2）瘤胃重量A、B和C组显著高于D组（P＜0.05），其中C组显著高于A组（P＜0.05），虽然瘤胃占复胃总重比例及占宰前活重比值无显著差异（P＞0.05），但是在数值上B和C组均高于A和D组；C组网胃和瓣胃重显著高于A和D组（P＜0.05）；C组全胃重显著高于A和D组（P＜0.05），A、B、C和D组全胃占宰前活重比值无显著差异（P＞0.05），但B和C组在数值上较其它组高；小肠重量及占宰前活重比值各组间无显著差异（P＞0.05），但是B和C组在数值上较其它组高。C组大肠重显著高于A和D组（P＜0.05），A和B组大肠重显著高于D组（P＜0.05），大肠占宰前活重比值各组间无显著差异（P＞0.05），但是B和C组在数值上较其它组高。（3）B和C组心脏重量显著高于D组（P＜0.05），C组脾脏重量有高于B和D组的趋势（P=0.0806），其余内脏器官重量及占宰前活重比值各处理组间无显著差异（P＞0.05）。（4）在90日龄，A、B和C组羔羊的宰前活重、空体重、胴体重和24h胴体重均显著高于D组（P＜0.05），C组空体重显著高于A和B组（P＜0.05），C组胴体重和24h胴体重显著高于A组（P＜0.05）；B和C组羔羊眼肌面积显著高于A和D组（P＜0.05）。【结论】当开食料干物质采食量连续3 d达到300和400g时断代乳品，羔羊生长性能、屠宰性能和胃肠道发育较好。因此，湖羊羔羊于开食料采食量达到300g时断代乳品效果最佳。

藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析

吴震洋，唐晓惠，付玉华，王昇，章程，李京津，余梅，杜小勇

中国农业科学. 2018, 51(2):  351-362.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.014

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【目的】藏绵羊又称藏系绵羊，是中国三大粗毛羊品种之一，主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区，如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长，毛质细腻且保暖性好，是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状，同时制约羊毛的经济价值。然而，目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确，以藏绵羊为研究对象，对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序，旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊，减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理，屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解，提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析，获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱，筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析，获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长，经过滤后得到85.08兆条clean reads；共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA；从中获得23个差异表达miRNA，其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调，9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达，而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达，但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a，而倍数差异最大的为miR-23b。其中，miR-10a可参与调节多种信号通路，其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面，目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道，但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关，这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析，miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控，多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关，其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时，筛选7个差异表达miRNA进行定量验证，结果表明，5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达，2个miRNA在白色组织中上调表达，定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱，并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明，藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路，这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程，并对进一步的功能验证奠定基础。

家蚕安全转基因技术研究现状与展望

龙定沛，郝占章，向仲怀，赵爱春

中国农业科学. 2018, 51(2):  363-373.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.015

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转基因技术是实现基因功能研究和生物遗传改良的重要工具。转基因生物安全问题主要包括转基因操作技术安全与转基因产品安全这两个方面。近年来业内对转基因生物的安全性研究主要集中于转基因农作物、水生动物和家禽、家畜等大型动物在医药、农业和食品工业等领域的安全评估，而对于具有重要科研与经济价值的农业昆虫安全转基因技术研究的报道则较为有限，而且农业部至今未有转基因昆虫安全性评估的先例。家蚕（Bombyx mori）是重要的鳞翅目模式昆虫和农业经济昆虫，家蚕安全转基因技术的深入研究对于促进基础遗传学发展和推动蚕丝产业发展均具有重要价值和意义。自2000年第一例转基因家蚕建立以来，转基因技术已广泛应用于家蚕基因功能鉴定的基础研究和品种改良的应用研究领域，但转基因家蚕的安全性问题却成了限制转基因家蚕实用化应用的主要瓶颈。因此，开展家蚕安全转基因技术体系研究对促进转基因家蚕安全性评估和产业化具有重要意义。本文系统地概述了基于条件基因打靶的家蚕安全转基因技术体系的建立与研究现状，讨论了家蚕安全转基因技术的发展趋势和应用前景，以期为转基因动物特别是农业转基因昆虫的安全转基因技术建立和完善提供参考。

研究简报

三种限水灌溉水平下中麦175干物质积累与水分利用特性解析

李法计，徐学欣，何中虎，肖永贵，陈新民，王志敏

中国农业科学. 2018, 51(2):  374-385.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.016

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【目的】中麦175是中国北部冬麦区水浇地和黄淮旱肥地大面积种植的水旱兼用型小麦品种。研究旨在明确其干物质积累和水分利用特征，揭示节水高产机理为培育水旱兼用的广适型小麦新品种提供理论支撑和评价指标。【方法】在河北吴桥和北京顺义两个试验点，以中麦175和京冬17为试验材料，在3种限水灌溉（W0，全生育期不灌溉；W1，灌拔节水75 mm；W2，灌拔节水和开花水共150 mm）水平下，比较两个品种群体性能、干物质积累与分配、产量及水分利用效率（water use efficiency，WUE）等性状及其对供水的响应特征。【结果】两个品种的产量均在W2水平最高，随着灌水量减少产量降低；W0主要降低单位面积粒数（每平米穗数减少47—67穗，穗粒数减少1.6—5.1粒），W1主要降低千粒重（降低0.6—1.5 g）。水分亏缺显著降低蒸散量（ET）和群体生物量，但显著促进了花前积累的干物质向籽粒的转运，适度水分亏缺（W1）提高WUE。在3种灌溉水平下，中麦175的产量及其稳定性均优于京冬17，表现为穗数、花前干物质积累量及其向籽粒的转运量和转运率、收获指数（HI）均较高，灌浆期反映群体性能的归一化植被指数（NDVI）和气冠温差（CTD）指标值及反映品种抗旱性能的茎秆可溶性糖含量（WSC）含量均较高，全生育期ET和WUE较高，大部分产量性状的水分敏感性较弱。穗粒数和生物量对水分的敏感系数（WS）与产量对水分的WS呈密切相关性，而灌浆前期群体NDVI和CTD对水分的WS也与产量对水分的WS高度相关。【结论】前期干物质积累快、群体库容量大及花后群体性能稳定性强可能是中麦175节水高产的主要原因。不同供水条件下灌浆期群体NDVI和CTD的差异性可作为小麦品种对水分敏感性的快速综合评价指标。

中国不同气候区小麦产量及发育期持续时间对田间增温的响应

高美玲，张旭博，孙志刚，孙楠，李仕冀，高永华，张崇玉

中国农业科学. 2018, 51(2):  386-400.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.02.017

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【目的】气候变暖对小麦生长发育有重要影响。然而，中国不同气候区小麦生长发育对温度升高的响应程度仍未系统量化。因此，急需阐明不同气候区增温及不同时段增温对小麦产量及发育期持续时间的影响程度，揭示小麦产量及发育期对增温的响应规律。【方法】本文搜集了1990—2017年间已发表的关于中国小麦全生育期田间持续增温条件下小麦产量变化的21篇文献，运用整合分析（Meta-analysis）量化田间不同增温幅度及不同时段增温对中国小麦产量及生育期的影响程度，系统阐明其在不同气候区的差异及规律。【结果】（1）亚热带季风区增温（0—3℃）显著增加小麦产量、千粒重和穗粒数，其平均增幅分别为8.2%、6.3%和4.7%；温带季风区增温（0—3℃）显著增加小麦产量、穗粒数和穗数，其平均增幅分别为6.8%、3.9%和5.5%，而温带大陆性气候区增温（0—3℃）显著降低小麦产量、千粒重和穗粒数，其平均降幅分别为10.2%、5.9%和8.3%。其中，亚热带季风区增温0—2℃，小麦产量显著提高了8.5%，而增温2—3℃时，小麦并未增产；温带季风气候区小麦增产愈为明显，当增温2—3℃时小麦的增产幅度达14.5%；相反，在温带大陆性气候区增温0—2℃和2—3℃时，小麦分别显著减产10.1%和15.9%。（2）亚热带季风区和温带大陆性气候区增温（0—3℃）小麦全生育期持续时间分别缩短了3.3%和7.1%，相反，在温带季风区，增温并未明显改变小麦全生育期持续时间；与此同时温带大陆性气候区和温带季风气候区的生殖期持续时间并无明显变化，而亚热带季风区小麦生殖生长持续时间却显著增加（8.7%）。（3）总体来看（季风气候区所有独立研究结果）夜间增温0—2℃和2—3℃对小麦产量有显著影响，小麦分别增产10.5%和15.0%。【结论】田间增温会显著影响中国粮食主产区小麦产量以及发育期持续时间，但不同气候区及不同时段增温对小麦生长和发育的影响不同。本研究结果可为未来气候变化新态势下中国粮食主产区种植制度优化与合理布局提供科学依据。