中国农业科学

水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR遗传多态分析

刘立娜, 杨静, 徐刘燕, 李成云

中国农业科学. 2017, 50(15): 2851-2860. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.001

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【目的】分析Pi-ta的3'-UTR区遗传变异与该基因抗性功能之间的关系，了解Pi-ta的抗性决定机制，为培养更持久的抗性品种提供依据。【方法】以遗传多样性极高的云南水稻地方品种为研究对象，收集了137个云南地方水稻品种。育苗后提取三叶一心期的水稻幼苗总DNA，设计引物扩增了Pi-ta的3'-UTR区的DNA序列，并扩增了关键功能位点6 640到终止密码子第6 675处这一段的DNA序列。通过双向序列测定获得了137条3'-UTR区的DNA序列并提交至GenBank，通过变异位点检测分析云南水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR区的遗传多样性程度，并基于最大简约法构建单倍型网络图，分析不同单倍型之间的谱系关系。同时，联合编码区关键抗病位点6 640的碱基状态对3'-UTR单倍型的分布进行分析，讨论3'-UTR区与Pi-ta抗性功能之间的关系。【结果】云南水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR区呈现出高度的遗传多样性，长度为1.1 kb的3'-UTR区共有12个SNP位点，由这些SNP可将137个品种划分成7个单倍型。不同单倍型之间没有重组的信号。Pi-ta的3'-UTR对应的DNA编码区长为1 120 bp，是植物基因3'-UTR平均长度（200 bp）的5倍多，G+C含量相对较低，为40.43%，不存在插入或缺失导致的长度多态性。Pi-ta的3'-UTR序列中存在多个非保守的潜在polyA位点，此外，Pi-ta的3'-UTR区还存在非常高频率的TTTT序列，提示Pi-ta在转录终止时可能具有复杂的调控机制；而对Pi-ta的不同转录本的分析也表明3'-UTR对应于DNA编码区序列时呈现复杂多变的剪切方式，3'-UTR这种选择性拼接可能与抗性决定作用有关。对遗传多态的进一步分析表明，3'-UTR的SNP高度多态性都出现在感病品种中，所有抗性品种只共享一种单倍型。有趣的是，唯一的3'-UTR抗性单倍型与Pi-ta编码区唯一的抗性单倍型相对应，也即是6 640G所在单倍型也是3'-UTR唯一抗性单倍型。这表明3'-UTR与其编码区是紧密关联的，在功能上和所受到的选择压力方面是连续和一致的。Pi-ta的抗性单倍型区域已从编码区扩展到了3'-UTR区，在研制广谱抗性品种引入Pi-ta时需要同时保证其3'-UTR区不能有额外的SNP，必须是抗性单倍型特有的SNPs。【结论】 Pi-ta的3'-UTR与其编码区紧密连锁，抗性品种的3'-UTR受到纯净化选择，维持单一单倍型，3'-UTR对于Pi-ta的抗性功能具有不可或缺的作用。

基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

季新, 李飞, 晏云, 孙红正, 张静, 李俊周, 彭廷, 杜彦修, 赵全志

中国农业科学. 2017, 50(15): 2861-2871. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.002

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【目的】光作为一种环境信号，可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体，创制OsPIL15突变体，挖掘水稻功能基因，丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理，设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对，排除非特异性靶位点，同时使该靶序列含有常用酶切位点，方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T₀代转基因植株是否发生突变，结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析，选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估，分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑，酶切显示在选取的25株T₀代转基因植株中获得15株突变体，其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体，共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主，同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T₁代植株进行分析，结果表明，T₀代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T₀代纯合突变体后代为纯合突变单株，仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株；T₀代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型；T₀代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T₀代未突变植株的后继世代酶切分析显示，62株T₁代转基因植株均未发生突变，表明CRISPR/Cas9在T₁代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析，5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应，表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T₁代突变体表型进行初步观察，结果表明，突变体生育期和分蘖数未出现明显变化，株高极显著下降，籽粒粒长极显著增加，最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑，获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。

薏苡种质资源苗期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选

汪灿，周棱波，张国兵，张立异，徐燕，高旭，姜讷，邵明波

中国农业科学. 2017, 50(15): 2872-2887. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.003

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【目的】干旱是影响薏苡生产的重要非生物胁迫因素，鉴定薏苡种质资源的抗旱性，确定抗旱指标，筛选抗旱种质，促进薏苡产业发展。【方法】以50份薏苡种质为材料，设置正常供水和反复干旱2个处理，在旱棚内进行盆栽试验，测定干旱对幼苗存活率、株高、茎粗、叶长、叶宽、地上部鲜重、地上部干重、根长、根粗、根鲜重和根干重的影响；采用抗旱性度量值（D值）、综合抗旱系数（CDC值）、加权抗旱系数（WDC）、相关分析、频次分析、主成分分析、灰色关联度分析、隶属函数分析、聚类分析和逐步回归分析相结合的方法，对其进行苗期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选。【结果】干旱胁迫对各指标均有极显著影响。相关分析表明，幼苗干旱存活率与茎粗、叶宽和根粗呈极显著正相关，与叶长、地上部鲜重、地上部干重、根长、根鲜重和根干重呈显著正相关，与株高呈不显著的正相关。频次分析表明，各指标对干旱胁迫反应的敏感程度依次为根干重、根鲜重、叶宽、根粗、根长、幼苗干旱存活率、地上部干重、茎粗、地上部鲜重、叶长和株高。主成分分析表明，6个主成分可代表薏苡抗旱性91.40%的原始数据信息量。基于D值、CDC值和WDC值的供试薏苡种质抗旱性排序相近。灰色关联度分析表明，各指标DC值与D值间的关联度大小依次为根干重、叶宽、根鲜重、茎粗、根粗、幼苗干旱存活率、根长、株高、地上部鲜重、地上部干重、叶长，这与各指标DC值与WDC值的密切程度基本吻合。根据D值进行聚类分析，可将供试薏苡种质划分为5个抗旱级别，其中Ⅰ级3份、Ⅱ级17份、Ⅲ级9份、Ⅳ级20份、Ⅴ级1份。除叶长、地上部鲜重、地上部干重和根干重外，其余指标的隶属函数值、CDC值、D值和WDC值均随抗旱级别的升高而增大。逐步回归分析表明，与D值密切相关的指标有幼苗干旱存活率、株高、叶宽、根长和根鲜重。【结论】苗期抗旱性强的薏苡种质yy18-1、yy14-3和yy13-1，可作为薏苡抗旱育种、抗旱机理及干旱调控缓解机制研究材料。幼苗存活率、株高、叶宽、根长和根鲜重可作为评价薏苡种质资源苗期抗旱性的指标性状。

夏闲期覆盖配施氮肥对旱地小麦土壤水分及氮素利用的影响

任爱霞，孙敏，高志强，王培如，薛建福，薛玲珠，雷妙妙

中国农业科学. 2017, 50(15): 2888-2903. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.004

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【目的】针对黄土高原旱地小麦降水少且分配不均、水分和氮素利用效率低的问题，探索旱地小麦覆盖保水和氮肥施用的最佳技术途径。【方法】于2010—2013年在山西省闻喜县邱家岭村开展试验，主区为覆盖方式，设夏闲期深翻后覆盖与不覆盖2个水平，副区为施氮量，设低（纯氮75 kg·hm^-2）、中（纯氮150 kg·hm^-2）、高（纯氮225 kg·hm^-2）3个水平，明确年际间夏闲期深翻覆盖配施氮肥对旱地麦田土壤水分、植株氮素利用、产量的影响。【结果】各生育时期土壤水分、植株氮素积累量、花前氮素转运量及其对籽粒的贡献率均以丰水年最高，欠水年最低，丰水年、平水年较欠水年分别提高产量80%、69%，提高水分利用效率7%、20%，提高氮素利用效率6%、5%。夏闲期覆盖较不覆盖，播种期0—300 cm土壤蓄水量显著提高，达50—62 mm；花前各生育时期土壤蓄水量显著提高，各生育时期植株氮素积累量提高，籽粒氮素积累量显著提高；丰水年和平水年拔节后各阶段氮素积累量显著提高，花前叶片和穗氮素转运量对籽粒贡献率提高；欠水年花前各阶段氮素积累量及其所占比例提高，花前茎秆+茎鞘氮素转运量对籽粒贡献率显著提高；产量显著提高，达23%—41%；水分利用效率提高3%—15%；丰水年和平水年氮素利用效率显著提高，达14%—26%，欠水年低氮条件下也显著提高，达10%。丰水年配施高氮，平水年和覆盖条件下的欠水年配施中氮，不覆盖条件下的欠水年配施低氮，孕穗期前土壤蓄水量、产量和水分利用效率均较高。丰水年配施高氮，花前氮素转运量和花后氮素积累量均最高，且各处理间差异显著，主要是由于促进花前叶片和穗中氮素向籽粒转运；平水年和覆盖条件下的欠水年配施中氮，花前氮素转运量和籽粒氮素积累量最高，且各处理间差异显著，平水年主要促进叶片和穗中氮素向籽粒转运，穗＞叶片，覆盖条件下的欠水年主要促进茎秆+茎鞘和穗中氮素向籽粒中转运，茎秆+茎鞘＞穗；不覆盖条件下的欠水年配施低氮，籽粒氮素积累量最高，且各处理间差异显著，花前氮素转运量及其对籽粒贡献率最高，茎秆+茎鞘和穗氮素转运量及其对籽粒贡献率最高，且各处理间差异显著。【结论】旱地麦田夏闲期覆盖有利于蓄积降水，有利于促进丰水年和平水年小麦生育中后期氮素积累，促进叶片和穗中氮素向籽粒转运；有利于促进欠水年生育前中期氮素积累，促进茎秆+茎鞘中氮素向籽粒转运。丰水年施氮225 kg·hm^-2，平水年和覆盖条件下的欠水年施氮150 kg·hm^-2，不覆盖条件下的欠水年施氮量75 kg·hm^-2可实现产量和水分利用效率的同步提升。

休闲期深松蓄水适期播种对旱地小麦产量的影响

雷妙妙，孙敏，高志强，王培如，任爱霞，薛玲珠，杨珍平

中国农业科学. 2017, 50(15): 2904-2915. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.005

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【目的】解决黄土高原旱地麦区多数年份只能等雨晚播种导致产量降低等生产实际问题，研究休闲期深松蓄水和适期播种对旱地小麦产量及其构成因素的影响，以提高自然降水利用效率，构建合理群体结构，实现高产、高效。【方法】于2012—2014年度在山西省闻喜县邱家岭开展大田试验研究，以休闲期深松和当地传统耕作（对照）为主区，以9月20日（早播，T₁）、10月1日（适期播种，T₂）、10月10日（晚播，T₃）3个播期为副区，研究休闲期深松蓄水对旱地小麦产量形成的影响及播期的调节效应。【结果】休闲期深松较对照，两试验年度播种期3 m内土壤水分分别提高59—71 mm、34—52 mm；冬前分蘖数、各生育时期植株干物质量显著提高，两试验年度分别提高穗数8%—18%、8%—15%，产量19%—36%、17%—22%，水分利用效率6%—21%、10%—12%。休闲期深松条件下，越冬至孕穗期土壤蓄水量以适期播种处理最高；冬前群体分蘖数、开花前植株干物质量以适期播种处理最高，但与早播处理差异不显著；开花后植株干物质量以晚播处理最高，但与适期播种处理差异不显著；穗数、穗粒数、产量和水分利用效率均以适期播种处理最高，且与其他处理差异显著，而千粒重随播期推迟而增加。传统耕作条件下，降水少的年份（2012—2013年度）越冬至孕穗期土壤蓄水量以早播处理最高，穗数、穗粒数、产量也均以早播处理最高。此外，3个播期休闲期深松处理，穗数、穗粒数、成熟期植株干物质量、产量与开花前各土层土壤蓄水量相关性较开花后显著，且与开花前深层土壤水分相关性极显著。休闲期深松配套适期播种，播种期土壤水分每增加1 mm，两试验年度增产分别达17 kg·hm^-2、23 kg·hm^-2。【结论】休闲期深松有利于蓄积休闲期降雨，提高底墒；且休闲期深松蓄水条件下，采用早播和适期播种处理均有利于形成冬前壮苗，但最终以适期播种处理穗数、产量和水分利用效率最高。总之，旱地小麦休闲期采用深松蓄水前提下，10月1日播种可优化产量结构，实现高产与高效。

氮肥后移对绿洲灌区玉米干物质积累和产量构成的调控效应

魏廷邦，胡发龙，赵财，冯福学，于爱忠，刘畅，柴强

中国农业科学. 2017, 50(15): 2916-2927. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.006

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【目的】针对绿洲灌区传统施氮技术下，全膜覆盖玉米生育后期土壤氮肥供应不足、早衰和减产等问题，探讨氮肥后移对玉米干物质积累和产量构成的影响，以期为优化试区氮肥管理提供理论依据。【方法】2012—2015年，于河西绿洲灌区进行大田试验，在总施氮量相同且基肥和大喇叭口期追肥分别占总施氮量20%和40%条件下，设3个施氮处理：氮肥后移20%（拔节肥10%+花粒肥30%，M₁）、氮肥后移10%（拔节肥20%+花粒肥20%，M₂）和传统施氮（拔节肥30%+花粒肥10%，M₃），研究不同氮肥追施制度对玉米干物质积累动态和产量构成的调控效应。【结果】氮肥后移增大了玉米干物质最大增长速率和干物质平均增长速率，提前了干物质最大增长速度出现的天数。在氮肥后移20%施氮制度下，玉米干物质最大增长速率和干物质平均增长速率分别较传统施氮处理提高15.6%和6.6%，玉米干物质最大增长速率出现的天数较传统施氮提前2.9 d。施氮制度对玉米生物产量、籽粒产量、收获指数、有效穗数、穗粒数和千粒重均有显著影响。氮肥后移20%施氮制度下，玉米生物产量较传统施氮处理高6.6%，但氮肥后移10%处理生物产量与传统施氮处理差异不显著；氮肥后移20%和10%处理玉米的籽粒产量分别较传统施氮处理提高14.1%和5.1%；氮肥后移20%施氮处理收获指数较传统施氮处理高7.5%，但氮肥后移10%施氮处理与传统施氮处理差异不显著；氮肥后移20%施氮处理下，玉米有效穗数、穗粒数和千粒重分别较传统施氮处理高8.9%、12.9%、5.8%，但氮肥后移10%处理的千粒重与传统施氮处理差异不显著。通径分析表明，氮肥后移主要通过提高有效穗数，进一步提高穗粒数和千粒重，从而提高产量。说明氮肥后移20%施氮处理通过优化玉米有效穗数、穗粒数和千粒重对产量产生了调控作用。【结论】在河西绿洲灌区，总施氮量450 kg·hm^-2时，玉米拔节期追肥45 kg·hm^-2、大喇叭口期追肥180 kg·hm^-2、花后10 d追肥135 kg·hm^-2为该区获得玉米高产的理想施氮制度。

STK1对玉米大斑病菌附着胞发育过程中糖原和脂肪积累的影响

张运峰，张淑红，武秋颖，范永山

中国农业科学. 2017, 50(15): 2928-2935. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.007

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【目的】通过研究STK1与附着胞发育的关系，明确附着胞发育过程中STK1对糖原和脂肪合成的调控作用，为阐明玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)附着胞发育的分子机制打下基础。【方法】以玻璃平板为疏水基质表面，通过“插片分离菌丝”法使菌丝附着于载玻平板表面，然后将附着有菌丝的玻璃平板置于保湿培养皿中22℃、14 h光照和10 h黑暗交替培养，诱导野生型菌株（WT）和STK1基因敲除突变体（ΔSTK1）的菌丝形成附着胞，每隔12 h显微观测附着胞的形态和发育过程；分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板浸没在I₂/KI染色液中静置染色48 h，显微观察附着胞发育过程中糖原的变化；分别将附着有未经诱导的WT和ΔSTK1菌丝的玻璃平板和经过48 h附着胞诱导的玻璃平板置于-70℃的超低温冰箱中冷冻处理30 min，然后将玻璃平板置于Oil-red O染色液中静置染色24 h，显微观察附着胞发育过程中脂肪的代谢变化；利用real-time PCR技术检测附着胞发育过程中糖原和脂肪合成关键酶基因的表达情况。【结果】玉米大斑病菌WT菌株和ΔSTK1菌株利用菌丝尖端在玻璃平板的疏水表面均能够产生附着胞，但ΔSTK1菌株的附着胞发育与WT菌株显著不同，WT菌株48 h内为单胞附着胞，诱导48 h后少数附着胞形成了多细胞附着胞，而ΔSTK1菌株在诱导24 h后即出现了扭曲附着胞的异形附着胞形态，48 h后还出现了双杈、多杈和O型等多种异常的附着胞类型；WT菌株和ΔSTK1菌株的菌丝和附着胞进行糖原和脂肪的染色后，发现WT菌株的菌丝和附着胞都有均匀分布的糖原和脂肪，而ΔSTK1菌株的附着胞内几乎没有糖原和脂肪的积累，与WT菌丝的结果不同，在ΔSTK1菌株的菌丝内糖原沉积减少，脂肪主要分布于菌隔部位；附着胞诱导48 h后，WT菌株糖原合酶（glycogen synthase，GS）和二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol O-acyltransferase，DGAT）基因的表达量比诱导前分别增加了6.6%和40.3%，而⊿STK1菌株GS基因的表达量则下降了9.0%，DGAT基因的表达量仅上升了24.5%。【结论】STK1的功能缺失使玉米大斑病菌的附着胞发育形态异常，糖原积累下降，脂肪分布不均，糖原和脂肪合成的关键酶基因表达量均显著下降，表明糖原和脂肪代谢与玉米大斑病菌的附着胞发育密切相关。

番茄SYTA的克隆及表达分析

潘琪，刘旭旭，彭浩然，蒲运丹，张永至，叶思涵，吴根土，青玲，孙现超

中国农业科学. 2017, 50(15): 2936-2945. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.008

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【目的】克隆获得番茄SYTA（Solanum lycopersicum SYTA，S.l SYTA），分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征，明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达，并分析其在绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）标记的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响，为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物，采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列；应用生物信息学方法分析该基因的序列特征；使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对，并构建同源物种间系统进化树；通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位；利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化；构建植物瞬时表达载体pCV-SYTA-mGFP，通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达，TMV-GFP攻毒，利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长，序列比对及生物信息学分析表明，其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征，含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域；多序列对比及系统进化树分析发现，与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近，与黄瓜较远；亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根＞叶＞茎；TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调，在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP，TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶，而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP，且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的S.l SYTA具有SYTs家族的典型特征。S.l SYTA定位于细胞质膜，S.l SYTA在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下，番茄中S.l SYTA表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。

西瓜细菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析

杨丙烨，付丹，胡方平，蔡学清

中国农业科学. 2017, 50(15): 2946-2956. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.009

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【目的】西瓜细菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac) 引起，是一种严重的世界性病害。细菌的鞭毛通常被认为是细菌的运动器官，在细菌的侵染过程中也起重要作用，已有报道表明这种作用可受鞭毛蛋白基因fliS的调控，目前西瓜细菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS 的功能及其调控机理尚不清楚，本研究旨在探讨该基因在鞭毛形成和致病性等生物学特性中的作用。【方法】以果斑病菌野生型致病菌株1号基因组DNA为模板，设计一系列引物，PCR扩增敲除基因fliS的上下游片段，通过回收、酶切、连接、转化等步骤构建敲除载体和互补载体，然后采用三亲杂交法，根据同源重组的原理，构建fliS基因缺失突变菌株及其互补菌株，并对其鞭毛的形态特征、致病性、过敏反应、游动性、群体感应、菌膜、生长速率、菌落形态等生物学特性进行测定；进一步提取细菌总RNA，以谷氨酰胺合成酶基因glnA为参照来校正目标基因的表达量，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法，比较野生菌株、敲除菌株和互补菌株部分鞭毛蛋白基因flhD、fliE、fliC、flgK、flgM、fliD和fliA的表达量差异。【结果】通过抗性基因Gm的筛选和PCR验证，成功构建了果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS缺失突变菌株1-fliS及其互补菌株1-fliShb，并对所得菌株的生物学特性和鞭毛进行观察，结果表明，与野生菌株相比，鞭毛蛋白基因缺失突变菌株的游动性、菌膜形成能力减弱，互补后游动性、菌膜形成能力基本恢复；缺失突变菌株对甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果实的致病性降低，互补后对西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果实的致病力完全恢复。电镜测试显示，突变菌株鞭毛变短，长度约为野生菌株的1/3—1/4，互补后鞭毛合成能力基本恢复，鞭毛长度约为野生菌的4/5；光学显微镜下，可观察到在NA平板上的野生菌株菌落周围有明显的由细菌颤泳形成的特殊晕圈，而缺失突变菌株在NA平板上不能形成这种晕圈，互补后晕圈形成能力部分恢复；缺失突变菌株的生长速率比野生菌株慢，互补后生长速率没有恢复；野生菌株、突变菌株和互补菌株在过敏性反应和群体感应方面无差异。qRT-PCR分析结果显示，fliS基因缺失突变后，flhD表达量较野生菌株明显降低，fliE、fliC和flgK表达量较野生菌株明显升高，flgM和fliD表达量略微上升，fliA表达量基本不变；互补菌株中flhD、fliE和fliC表达量部分恢复，flgK、flgM和fliD表达量没有恢复，与突变菌株相同。【结论】鞭毛基因fliS对果斑病菌鞭毛丝的形成、游动性、菌膜形成能力、生长速率、菌落形态、致病性等均有调控作用。

不同施氮处理对水稻油菜轮作土壤氮素供应与作物产量的影响

何杰，李冰，王昌全，李玉浩，杨帮凤，张敬昇，向毫，尹斌，李鸿浩

中国农业科学. 2017, 50(15): 2957-2968. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.010

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【目的】探究不同施氮处理对水稻油菜轮作区土壤氮素养分及作物产量的影响，并重点分析不同处理在水稻油菜轮作间的差异及原因。【方法】2014—2015年在成都市典型水稻油菜轮作区进行连续两年小区定位试验，试验处理包括不施氮（CK）、单施尿素（UR）、40%控释氮肥+60%尿素（40%CRU）和单施控释氮肥（CRU）。研究不同处理对水稻油菜轮作条件下土壤无机氮、酶活性、作物产量及氮素利用率的影响。【结果】（1）相较UR处理，40%CRU处理能显著提高水稻生育中后期土壤无机氮含量；油菜蕾薹期到成熟期，土壤无机氮含量随控释氮肥添加量的增加而增大，40%CRU、CRU处理间无显著差异。（2）各施氮处理相比，在作物生育前期UR处理土壤脲酶和蛋白酶活性最高。随生育期推进，添加控释氮肥处理土壤酶活性均高于UR处理，但40%CRU、CRU处理间差异较小。两季作物相比，水稻季土壤脲酶和蛋白酶活性整体均呈升高-降低的趋势，孕穗期出现峰值；而油菜季土壤脲酶活性随生育期发展逐渐降低，添加控释氮肥处理蛋白酶活性先升高后降低。（3）水稻油菜产量均以40%CRU处理最大，两年水稻产量分别较UR处理增产597.04 kg·hm^-2（2014年）和582.61 kg·hm^-2（2015年），提高了7.50%—7.83%；油菜增产391.19 kg·hm^-2（2014年）和378.49 kg·hm^-2（2015年），提高了15.39%—16.70%。产量与构成因子的回归方程显示，水稻穗粒数和结实率与产量呈显著正相关，40%CRU处理穗粒数较UR处理提高15.17%（2014年）和17.72%（2015年），结实率提高4.49%（2014年）和4.44%（2015年）。油菜产量与每角粒数和总角果数相关性显著，40%CRU处理每角粒数最多，总角果数较UR处理两年分别增加8.98%（2014年）和13.80%（2015年）。（4）施氮显著提高水稻油菜成熟期地上部分氮积累量，且均以40%CRU处理最大。相较其余施氮处理，40%CRU处理的水稻成熟期氮积累量提高了6.21%—21.83%（2014年）、6.51%—20.74%（2015年），油菜成熟期氮积累量提高了8.42%—24.74%（2014年）、9.39%—22.77%（2015年）。施氮处理能有效提高水稻油菜作物的氮肥表观利用率、氮肥偏生产力和氮肥农学利用率，且均以40%CRU处理最优，CRU处理次之。【结论】添加控释氮肥的处理可有效改善水稻油菜生育中后期的土壤酶活性与氮素供应，显著增加水稻和油菜作物产量，提高氮素利用率。其中，控释掺混尿素处理土壤的氮素供应适宜，能有效促进作物对氮素的吸收利用，产量水平更大。

基于Landsat OLI的绿洲灌区土壤盐度最优预测尺度分析

魏阳，丁建丽，王飞

中国农业科学. 2017, 50(15): 2969-2982. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.011

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【目的】基于遥感提取的多尺度遥感指示因子和土壤实测电导率数据，借助统计分析，试图探寻适合干旱区典型绿洲灌区土壤盐度变异的最佳观测尺度和指征变量，为快速评估绿洲土壤盐渍化提供备选方案。【方法】以新疆渭干河-库车河绿洲为研究区，以野外采集的土壤盐度数据（采集0—10、10—20、20—40和40—60 cm土层土样，制备土壤饱和溶液并测试电导率（ms·cm^-1））并将其作为预测对象（n=87），借助Landsat OLI遥感影像数据，利用栅格重采样（30—1 000 m）和领域滤波（原始分辨率为30、60、90、120、150、180、210 m，滤波尺度为3×3至31×31）两种方式，生成多个尺度若干种指示因子（主成分分析、缨帽变化、植被指数、湿度指数），共计获得1 078个（其中，栅格重采样生成352个，领域滤波生成726个）环境变量。在此基础之上，利用线性和非线性曲线模型分别拟合上述两种模式下土壤盐度和环境变量之间的相关性，进而找出最优环境因子和预测尺度。【结果】栅格重采样模式下能够较好响应各层土壤变异性的皆为非线性模式。其次，该模式下，拟合精度随着空间分辨率的降低而降低。此模式下最佳推理尺度为30 m，该尺度下最佳响应变量除了40—60 cm处为三波段差分指数（Three-band Maximal Gradient Difference，TGDVI）外，其余深度皆为扩展的归一化指数（Extended Normalized Difference Vegetation Index，ENDVI）。领域滤波模式下的最佳推理尺度为180 m（滤波尺度3×3），同时，各层最佳拟合变量皆为扩展的增强型植被指数（Extented Enhanced Vegetation Index，EEVI）。相比较栅格重采样模式，该模式下的拟合精度全面优于前者，各层依次提高14.60%、34.40%、32.10%和21.70%。【结论】基于领域滤波模式下，像元分辨率为180 m，窗口大小为3×3的ENDVI指数更适合预测本研究区土壤盐度的空间变异性。

基于无人机载LiDAR数据的玉米涝灾灾情评估

甘平，董燕生，孙林，杨贵军，李振海，杨凡，王立志，王建雯

中国农业科学. 2017, 50(15): 2983-2992. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.012

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【目的】基于无人机平台的遥感技术是目前研究的热点，也是推动现代化农业快速发展的主要力量之一。笔者欲通过分析涝灾研究区激光雷达点云数据反演的玉米冠层高度，快速准确实现玉米涝灾受灾范围监测和灾情评估，为防灾减灾、高产稳产、农业保险理赔等提供依据。拓展无人机载LiDAR数据在农业领域的应用价值，为农业等相关部门快速有效掌握农情信息提供保障。【方法】2016年7月19—20日，以因大暴雨导致涝灾的北京市昌平区一块玉米大田作为研究区，基于无人机平台获取研究区激光雷达数据。通过冠层高度模型（canopy height model，CHM）反演出玉米冠层高度，采用正态统计理论的双阈值划分策略确定阈值，构建基于玉米冠层高度差异的涝灾灾情遥感监测模型，评价玉米涝灾灾情严重程度，并基于地面实测数据进行精度评价。【结果】涝灾发生后，玉米长势存在一定差异，最明显的差异体现在玉米植株高度。基于正态统计理论和野外测量，最终确定严重涝灾玉米冠层高度为0.30—0.84 m，中度涝灾玉米冠层高度为0.84—1.70 m，冠层高度1.70 m以上为轻度受灾区域。通过野外实测样本对无人机载LiDAR数据估算结果进行混淆矩阵分析，总体分类精度达到72.15%，Kappa系数为0.44。结合数码影像做进一步验证，结果表明研究区玉米涝灾遥感空间制图结果与数码影像结果基本一致。【结论】通过无人机载LiDAR数据能实现玉米冠层高度反演，结合涝灾后玉米植株高度差异特征能有效反映不同涝灾程度，实现区域尺度下玉米涝灾受灾范围监测和灾情等级评估，有利于便捷高效获取灾情灾害信息。

黄瓜光合特征及水分利用效率对土壤含水量的响应

李生平，武雪萍，高丽丽，龙怀玉，李景，王碧胜，党建友，裴雪霞

中国农业科学. 2017, 50(15): 2993-3005. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.013

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【目的】采用新型负压灌溉系统，研究不同系统供水负压控制下的土壤含水量对黄瓜叶片碳同化和蒸腾耗水协同作用的影响，旨在分析与确定黄瓜适宜土壤含水量范围，为黄瓜的节水生理研究提供参考依据。【方法】通过遮雨网室盆栽试验，设4个系统供水负压水平（W1：0，W2：-5 kPa，W3：-10 kPa，W4：-15 kPa），研究不同土壤含水量对黄瓜光合特征、产量和水分利用效率的影响。【结果】同一系统供水负压下，黄瓜整个生育期土壤含水量基本保持稳定，W1、W2、W3和W4处理下控制的土壤相对含水量（RSWC）分别为（103.8±1.2）%、（88.7±3.7）%、（77.4±4.5）%和（61.8±3.2）%。RSWC在61.8%-88.7%范围，黄瓜叶片气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）日均值均随着土壤含水量降低而下降。黄瓜叶片净光合速率（Pn）和LWUE在同一生育时期的日均值与土壤相对含水量（RSWC）均呈极显著抛物线型关系（P＜0.01），且不同生育时期P_n和LWUE的最高值对应的RSWC不相同。黄瓜植株干物质量和产量均以W2（RSWC为88.7%）处理最高，黄瓜经济水分利用效率以W3（RSWC为77.4%）处理最高。【结论】负压灌溉条件下，达到黄瓜叶片碳同化和蒸腾耗水之间协同平衡关系的适宜土壤相对含水量为：开花期RSWC为70%—93%、盛瓜期RSWC为78%—103%、末瓜期RSWC为73%—104%。在此范围内，黄瓜能够获得较大的叶面积、蒸腾速率、光合速率和水分利用效率，从而获得较高的干物质量和黄瓜产量。

利用2b-RAD测序结合HRM分析技术开发与梨矮生性状相关的DNA分子标记

肖玉雄，王彩虹，田义轲，杨绍兰，李鼎立，张海月

中国农业科学. 2017, 50(15): 3006-3012. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.014

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【目的】果树的矮生性状是一种重要的农艺性状，对果树的集约化栽培具有重要意义。来自西洋梨实生变异品种‘Le Nain Vert’的矮生性状受控于一个单显性基因PcDw，目前关于该基因的序列信息等还不清楚。本研究的目的是开发与其紧密连锁的DNA分子标记，为鉴定该基因提供依据。【方法】根据分离群体分组分析的原理，以‘矮生梨’×‘茌梨’和‘2-3’×‘绿宝石’2个F₁杂交分离群体为试材，应用IIB型限制性内切酶的RAD技术（Restriction association site DNA，2b-RAD）对2对矮生型/普通型对比基因池进行基因组测序分析，在对比基因池间筛选出单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位点，从中筛查出位于PcDw，以确定其与PcDw位点的连锁关系。【结果】对4个样本（即4个对比基因池）的2b-RAD标签测序文库的测序结果共产生67 186 260条reads，平均每个样本测序reads数为16 796 565。将原始reads进行质量过滤后的统计结果表明，每个样本获得平均unique标签数目为86 810，平均测序深度为77定位染色体上的SNPs，用高分辨率熔解曲线分析技术（High-resolution melting analysis，HRM）在群体上进一步检测验证×，该测序深度能够达到准确分型的标准。SOAP软件定位结果表明，4个测序文库中含有酶切位点的高质量reads占测序原始reads的70%以上，表明测序质量较好。在来自2个不同群体的矮生型基因池与普通型基因池间进行对比分析，初步筛选出SNP位点1 317个，其中有8个位于PcDw的定位染色体scaffold00074上。用HRM技术对这8个SNP标记在群体上的进一步检测结果表明，在‘矮生梨’×‘茌梨’群体上有2个SNP标记、在‘2-3’×‘绿宝石’群体上有4个SNP标记表现出与PcDw位点共分离的特性，根据其扩增子的熔解曲线形状差异，可有效区分矮生型和普通型表型。在来自‘矮生梨’×‘茌梨’群体的215个杂种后代和来自‘2-3’×‘绿宝石’群体的168个杂种后代中，未发现有标记与性状的重组类型。【结论】2b-RAD测序技术与HRM分析技术相结合，进行果树重要农艺性状分子标记的开发，是一种行之有效的方法。基于这一策略，本研究鉴定获得了4个与西洋梨矮生性状单显性基因PcDw连锁的SNP标记。

羟基自由基氧化对牛血清白蛋白结构及水合特性的影响

王策，李侠，邓少颖，王航，张春晖

中国农业科学. 2017, 50(15): 3013-3023. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.015

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【目的】研究羟基自由基（·OH）氧化对蛋白结构及其水合特性的影响，探讨氧化介导的关于蛋白质和水分相互作用的变化情况。【方法】将牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶解在含15 mmol·L^-1的PIPES缓冲溶液中（pH 6.0），并在不同浓度H₂O₂（0、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0 mmol·L^-1）的铁-抗坏血酸-过氧化氢（FeCl₃-Vc-H₂O₂）羟基自由基氧化体系孵育12 h，采用氨基酸自动分析仪分析BSA不同程度氧化的氨基酸含量变化；通过测定羰基含量、巯基含量分析蛋白的氧化程度；通过测定BSA表面疏水性、离子键、氢键，考察BSA氧化不同程度后水合能力的变化情况；通过测定Zeta电位值来分析蛋白氧化后表面电荷的变化；采用傅里叶红外光谱法分析蛋白二级结构的变化。【结果】随着羟基自由基氧化体系中H₂O₂浓度的增加，氨基酸含量呈下降趋势，但不同种类氨基酸对·OH氧化敏感性不同，在1 mmol·L^-1 H₂O₂处理浓度下，苏氨酸（Thr）、赖氨酸（Lys）含量显著降低，较对照组（未经H₂O₂处理组）分别下降了4.30%、4.22%；当H₂O₂浓度升高到20 mmol·L^-1时，较对照组蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、组氨酸（His）这3类氨基酸的含量下降程度最大，分别为35.32%、19.19%、11.15%，其次为异亮氨酸（Ile）、甘氨酸（Gly）、半胱氨酸（Cys）。随H₂O₂浓度的增加，BSA的羰基含量显著增加（P＜0.05），20 mmol·L^-1 H₂O₂处理组比对照组羰基含量升高了57.52%；巯基含量显著降低（P＜0.05），20 mmol·L^-1 H₂O₂处理组比对照组巯基含量降低了74.04%，蛋白氧化程度显著加剧；BSA经氧化处理后，蛋白二级结构发生变化，α-螺旋、无规卷曲含量显著降低（P＜0.05），β-折叠、β-转角含量显著增加（P＜0.05），多肽链中α-螺旋结构伸展变成线性结构，蛋白表面疏水性随着氧化程度的加剧而显著增加（P＜0.05），蛋白持水力降低；同时氧化作用降低了蛋白表面的净电荷数，Zeta电位的绝对值随着羟基自由基氧化体系中H₂O₂浓度的增加而显著降低（P＜0.05），离子键和氢键作用力显著减弱，降低了蛋白-水分子相互作用力，蛋白持水力降低。【结论】BSA在羟基自由基氧化体系中，存在显著的浓度效应，随着氧化程度加剧，蛋白表面的净电荷显著降低，离子键和氢键作用力显著减弱，蛋白二级结构发生了变化，蛋白-水分子相互作用力降低。

海南特种野公猪不同世代膻味物质含量及相关性分析

蔡克奇，羊宣科，王鹏，吴科榜

中国农业科学. 2017, 50(15): 3024-3032. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.016

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【目的】通过比较不同世代杂交海南特种野公猪F₁、F₂、F₃膻味物质雄烯酮、粪臭素和吲哚含量，及血清性激素水平的差异，揭示公猪膻味物质的变化规律及性激素的变化对膻味物质含量的影响，为选育低膻味性状的公猪提供理论基础。【方法】以12月龄F₁、F₂、F₃不同世代杂交公猪（野猪♂×屯昌猪♀）各18头为研究对象。试验猪空腹12 h，于前腔静脉采取血液样本并提取血清样品，采血后将试验猪屠宰，按照商品猪分割标准从第三和第四颈椎之间的颈部区采集脂肪和肌肉样品。利用（ELISA）试剂盒检测血清样品雄烯酮和性激素水平及脂肪和肌肉样本的雄烯酮含量，采用高效液相色谱法检测血清、脂肪和肌肉样本的粪臭素和吲哚含量。【结果】海南特种野公猪膻味物质雄烯酮、粪臭素和吲哚在血清、脂肪和肌肉组织中非均匀分布。脂肪和肌肉组织中的粪臭素和雄烯酮含量均与血清中的粪臭素和雄烯酮含量存在显著或极显著相关性（P＜0.05或P＜0.01），脂肪中粪臭素的含量与血清中粪臭素含量的相关系数最大为0.94。公猪肉品膻味物质粪臭素、雄烯酮和吲哚的沉积量在不同杂交代公猪间存在明显差异，其中雄烯酮的沉积量随着野猪血统的增加而增加，粪臭素的沉积量则随着野猪血统的增加而降低，而吲哚的沉积量不存在随野猪血统的变化规律。性激素水平在不同杂交代野猪间存在明显差异，其中雄激素睾酮水平随着野猪血统的增加而极显著增加（P＜0.01），而F₁公猪的雌二醇水平极显著低于F₂和F₃公猪（P＜0.01）。雄烯酮含量均与血清睾酮水平呈极显著正相关（P＜0.01），而粪臭素含量均与血清睾酮水平呈显著或极显著负相关（P＜0.01），血清雄烯酮含量与睾酮水平的相关系数最大为0.95。【结论】随着海南特种野公猪血统的增加，睾酮水平和雄烯酮的沉积量显著增加，而粪臭素的沉积量显著降低。因此，海南特种野公猪睾酮水平的变化影响粪臭素和雄烯酮含量的变化。

猪睾丸组织定量PCR分析中内参基因的选择

彭馥芝，冉茂良，翁波，李智，董莲花，陈斌

中国农业科学. 2017, 50(15): 3033-3041. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.017

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【目的】采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）对基因表达进行分析时，选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中，表达稳定的蛋白编码内参基因和microRNA（miRNA）内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因，为准确定量不同时期猪睾丸组织中目的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用8个不同发育时期（E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM）的猪睾丸组织为材料，采用Trizol裂解法提取各样品的总RNA，利用NanDrop ND-2000分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。设计并合成已报道的猪其他组织中表达相对稳定的5个编码内参基因（GAPDH、TBP、β-actin、SDHA和B2M）以及5个miRNA内参基因（U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103）的特异性引物序列，逆转录得到cDNA模板后，按1:10梯度稀释为7个浓度梯度进行qRT-PCR反应以构建标准曲线。并对10个候选内参基因在各时期睾丸组织中的表达情况进行实时荧光定量全面检测，采用GeNorm法对定量结果进行综合分析，最后根据内参基因稳定性值（M值）的大小筛选出最稳定的参考基因；M值越小，表明内参基因的稳定性越好，反之则越差。【结果】对GAPDH、TBP、β-actin、SDHA、B2M 、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10个候选内参基因的熔解曲线进行分析发现，均无非特异扩增及引物二聚体，说明各内参基因特异性良好，qRT-PCR反应的专一性高；以Ct值为纵坐标，相对拷贝数的对数为横坐标进行标准曲线分析可知，各内参基因在系列稀释的浓度梯度内具有良好的线性关系；通过对10个候选内参基因在不同时期猪睾丸组织中的表达稳定性分析发现，蛋白编码基因中，最稳定的为TBP，最不稳定的是GAPDH；miRNA候选内参中，最稳定的为U6，最不稳定的是ssc-miR-26a。【结论】成功筛选出猪睾丸组织基因表达分析中稳定表达的内参基因TBP和U6，可作为猪睾丸组织基因表达研究中最佳内参基因候选者。

基于GC/MS技术的产后卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析

范子玲，许楚楚，舒适，肖鑫焕，王刚，白云龙，张江，赵畅，夏成

中国农业科学. 2017, 50(15): 3042-3051. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.018

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【目的】运用代谢组学中气相色谱/质谱联用技术（GC/MS）筛选卵巢静止奶牛和正常发情奶牛的血浆差异代谢物，探究奶牛发生卵巢静止时其体内代谢的变化。【方法】在黑龙江省某集约化牛场选取产后60—90 d，年龄、胎次、体况相近的经产高产奶牛为实验动物。根据奶牛的发情表现、直肠检查、B超检查及激素检测的结果，将奶牛分为发情组（A）22头和卵巢静止组（B）20头。应用GC/MS对两组奶牛的血浆样品进行检测得到其代谢组图谱，利用Chroma TOF软件对得到的峰图进行分析，得到原始数据。将标准化的GC/MS数据矩阵导入SIMCA-P+14.0软件包中，进行多元统计分析，先进行无监督的主成分分析PCA来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的（正交）偏最小二乘法分析(O)PLS-DA来区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物。为防止模型过拟合，采用七次循环交互验证和200次响应排序检验的方法来考察模型的质量。采用多维分析(O)PLS-DA和单维分析（t-test）相结合的办法，来筛选组间差异代谢物。在（O）PLS-DA分析中，变量权重值VIP＞1的变量为差异变量；在t-test中，P＜0.05的变量为差异变量。筛选VIP＞1且P＜0.05的代谢物作为差异代谢物，最后采用KEGG途径数据库对两组奶牛血浆样本进行代谢组学差异代谢物通路富集及互作网络构建分析。【结果】与正常发情奶牛相比，卵巢静止奶牛血浆中共有20种代谢产物表现异常，其中17种差异表达代谢物与奶牛卵巢静止的发生密切相关，包括水平增加的胆酸，水平下降的香草扁桃酸、烟酸甘氨酸、6-羟基烟酸、β-丙氨酸、L-酪氨酸、苯丙酮酸等，这些代谢产物参与了苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成，并参与了丙酸乙酯、烟酸烟碱、苯丙氨酸和酪氨酸的代谢，它们通过单一途径或综合途径对奶牛卵泡的正常生长产生干扰，从而引起卵巢静止。另外3种化合物亚氨基二乙酸、N-甲基-L-谷氨酸、3-氨基异丁酸可能与氨基酸代谢和细胞能量转运有关，其在奶牛卵巢静止中的生物学作用有待进一步证实。【结论】应用GC/MS技术有效的筛选出正常发情奶牛和卵巢静止奶牛之间的血浆差异代谢物，这些差异代谢物提示奶牛产后发生卵巢静止与体内多种物质代谢紊乱有关。这为今后深入探索奶牛产后卵巢静止的发病机理以及防治策略奠定了基础。

中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位

谭静，宋欣密，傅晓斌，唐明珠，吴帆，华启云，李红亮

中国农业科学. 2017, 50(15): 3052-3062. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.019

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【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位，明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1构建至pET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)感受态细菌中，挑取单克隆菌落接种于LB培养基，培养过夜后按1%（V/V）进行转接，继续培养至OD₆₀₀≈0.4左右时，加入IPTG至终浓度为1 mmol·L^-1后继续诱导 5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清，再加入细菌裂解液超声破碎，离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化，再经PBS透析液透析后，最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm，测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用，用Scatchard方程计算其解离常数，再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbraA6晶体结构（PDB代码：1n8v）为模板，通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式，根据MolDock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析，获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况，以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体，并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片，然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位，以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白，利用荧光光谱分析1-NPN与CSP1的解离常数K_1-NPN为2.1 μmol·L^-1，结合位点数n为0.99，表明结合时基本以1﹕1结合，线性相关系数为0.9933。在9种化学信息物质中，CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2癸烯酸（9-ODA），和植物挥发物成分3-蒈烯均具有较强的结合能力，其中与CSP1亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯的[IC₅₀]和解离常数K_D分别达到10.1和7.68 μmol·L^-1。分子对接显示不同配基与CSP1的结合分别是通过与CSP1疏水腔中特定氨基酸残基（或借助于氢键）作用结合。典型的如CSP1与HOB相互作用过程中，预测主要由8个氨基酸残基贡献能量，包括4个疏水性残基（Phe30、Phe44、Leu70和Phe85），3个极性中性残基（Tyr26、Tyr27和Ser41）以及1个酸性残基（Asp40），其中Asp40中两个羧基上的氧原子分别与HOB苯环中羟基上的氧原子分别产生一个氢键。免疫电镜定位结果显示CSP1主要表达于板形感器周围附属支持细胞中，少量表达于感器内部，这与气味结合蛋白的定位存在明显区别。【结论】中蜂CSP1与两种蜂王信息素成分和某些植物花香成分具有较强的结合能力，集合了信息素结合蛋白和普通气味结合蛋白的功能和相似的作用模式，但其亚细胞定位与气味结合蛋白存在明显区别，显示化学感受类蛋白生理特征的多样性。

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