中国农业科学

基于荧光检测技术的小麦品种SSR鉴定体系的建立

郑永胜，张晗，王东建，孙加梅，王雪梅，段丽丽，李华，王玮，李汝玉

中国农业科学. 2014, 47(19): 3725-3735. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.001

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【目的】建立基于SSR荧光标记的小麦品种DNA指纹鉴定体系，为中国小麦育成品种鉴定提供高通量技术手段。【方法】收集已定位到小麦21条染色体上的SSR标记引物，通过PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，筛选在中国小麦育成品种中多态性高的标记，对筛选出的引物5′末端利用6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4种荧光染料之一进行标记,利用DNA分析仪对扩增产物的峰型进行评价并检测不同等位变异的扩增片段大小，选择峰型简单易读、多态性高、较均匀分布到21条染色体上的标记，确定不同位点等位变异的大小及相应的参照品种，建立基于荧光SSR标记的高通量小麦品种鉴定体系。【结果】利用2 438对SSR标记对8份植物学性状差异大的小麦育成品种进行初步筛选，共筛选出260对多态性较高、扩增稳定的SSR引物。利用上述260对引物对48份小麦品种继续进行复筛，选出130对扩增稳定、多态性高、带型好的SSR引物。对这些引物的正向5′末端分别标记6-FAM、HEX、ROX和TAMRA荧光后，利用DNA分析仪进行检测评价，最终选择了42个PCR扩增稳定、峰图简单、多态性高、连锁群分布均匀的SSR荧光标记。根据DNA分析仪检测到的每个标记的不同等位变异大小，为相应位点的不同等位变异进行了命名，并为每个等位变异选取了相应参照品种。根据每个引物标记的荧光和扩增的片段大小范围对42对引物进行合理搭配，在同一毛细管内对多个荧光标记进行检测，提高了DNA指纹数据采集效率,降低了检测成本。利用该体系对1 625份小麦育成品种进行DNA指纹数据采集，在42个位点中共检测到434个等位变异，每个位点的等位变异个数在3—23，平均10.3个；每个位点的PIC值范围为0.240—0.829，平均0.610。利用1 625份小麦育成品种DNA指纹数据,构建了中国小麦育成品种的DNA指纹数据库。【结论】筛选出42对SSR标记引物，建立了基于荧光SSR标记的小麦品种鉴定体系，可用于高通量小麦品种DNA指纹鉴定。

两个小麦LEA基因的特征及其对非生物胁迫的响应

刘露露，陈雷，张春艳，石瑞杰，任江萍，孟凡荣，尹钧，李永春

中国农业科学. 2014, 47(19): 3736-3745. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.002

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【目的】分析小麦LEA基因TaLEA4和TaLEA5及其编码蛋白的特征，比较它们在干旱、高盐、热和冷胁迫过程中的表达模式，探讨这两个LEA基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能，为其在小麦抗逆分子育种中的应用提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术克隆小麦的LEA基因，通过生物信息学方法分析克隆基因及其编码蛋白的结构特性，采用qRT-PCR技术检测克隆基因对ABA及非生物胁迫的响应模式。【结果】克隆了2个包含完整编码框的小麦LEA基因TaLEA4和TaLEA5，分别编码180和163个氨基酸，推断其分子量分别为18.8和16.9 kD，理论等电点分别为5.6和7.2。基因组序列分析发现，2个LEA基因中均包含1个100 bp的内含子。氨基酸序列分析发现，这两个LEA基因编码蛋白均富含极性氨基酸（约占整个氨基酸序列的71%），具有较强的亲水性。结构域分析显示，TaLEA4和TaLEA5蛋白中均包含1个典型的LEA_4（pfam:02987）保守域，属于LEA_4类蛋白。蛋白质高级结构分析显示，α-螺旋分别占TaLEA4和TaLEA5蛋白的96.7%和96.3%，并可形成弓形的空间结构；在TaLEA4中，检测到1个配体PEV（C₃₉H₇₈NO₈P）的结合位点，而在TaLEA5中存在2个这样的配体结合位点。表达特性分析显示，2个LEA基因均可被植物激素ABA诱导而上调表达，其中，TaLEA4的表达水平显著高于TaLEA5；TaLEA4在干旱、高盐和高温胁迫过程中均受胁迫诱导而迅速上调表达，但TaLEA5却只受干旱胁迫的诱导，且其表达水平显著低于TaLEA4；2个LEA基因对冷胁迫均无响应；干旱和高盐胁迫过程中，TaLEA4在根系中的诱导表达水平显著高于叶片，而热胁迫过程中该基因在叶片中的表达水平要显著高于根系，这可能与根系直接感受渗透胁迫而叶片直接感受热胁迫有关。【结论】小麦TaLEA4和TaLEA5均属于LEA基因家族的LEA_4亚类，具有较强的亲水性，它们属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络；TaLEA4可能在干旱、高盐和热胁迫过程中均发挥重要功能，TaLEA5仅参与小麦对干旱胁迫的响应，其作用要弱于TaLEA4。

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

李静雯，张正英，令利军，李淑洁

中国农业科学. 2014, 47(19): 3746-3756. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.003

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【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达，获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质，探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列，通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4，利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚，获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量，并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测，以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验，检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5），测序结果表明该片段大小为349 bp，聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%，与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%，确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207，反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接，构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚，结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证，获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T₂/T₃转基因大麦基因组。随机选取6个T₃转基因大麦株系，半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照，20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%—55.19%，而且在各时期中也最低。利用随机选取的T₁和T₃籽粒进行蛋白质含量测定表明，8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低，SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比，转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低，其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显，平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验，结果表明，高氮肥水平HN₂及HN₃处理，该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照；施以等量高氮肥时，伴随氮肥后移（HN₂到HN₃），该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低，电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达，降低B-醇溶蛋白含量，高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。

不同类型水稻品种胚乳发育的研究

李栋梁，李小刚，顾蕴洁，王忠

中国农业科学. 2014, 47(19): 3757-3768. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.004

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【目的】探明不同水稻品种胚乳发育过程的异同。【方法】以日本晴（粳）、扬稻6号（籼）、武育糯16号（粳糯）和扬辐糯4号（籼糯）4个水稻品种为试验材料，通过精确标记颖果受精后的发育天数，观测颖果的生长；采用碘-碘化钾、TTC染色法观察胚乳细胞发育过程中淀粉的积累和生理活性的变化差异；采取树脂包埋法制作半薄切片，用光镜详细观察水稻内胚乳细胞和糊粉层细胞在颖果发育过程中结构的变化差异；用扫描电镜研究水稻成熟籽粒断面的超微结构，并使用能谱仪对其相关部位元素组成的差异进行探测。【结果】粳稻与籼稻颖果长、宽、高的变化存在明显区别，二者粒型存在显著差异，是否为糯性并不影响颖果的外形发育。供试的4种水稻颖果中，2个籼稻品种，扬稻6号与扬辐糯4号发育要快于粳稻品种；2个糯稻品种，武育糯16号与扬辐糯4号有着近乎一致的干重增长曲线；随着细胞内淀粉体和蛋白体的充实，内胚乳细胞在发育的中后期会发生核变形而衰亡；细胞核衰亡以后，胞内淀粉体仍可膨大生长。4种水稻内胚乳细胞所含淀粉体均为复粒；直链淀粉含量高的非糯品种，其胚乳淀粉充实程度高；2个籼稻品种的糊粉层细胞体积要大于2个粳稻品种；粳糯品种武育糯16号P、K、Mg、S等矿质元素含量低于其他3个供试品种；籼糯品种扬辐糯4号糊粉层含有少量单粒淀粉体，O元素含量高于其他品种。【结论】水稻颖果胚乳发育是一种特殊的细胞程序性死亡方式，细胞核的死亡并不影响胚乳同化产物的积累，淀粉体在内胚乳细胞内都是以复粒淀粉形式存在。以上这几点，供试的4个品种水稻之间几乎没有区别。而在总体发育进程、分化、细胞形态、活性变化、同化产物积累、淀粉体形态大小及在不同部位的分布上，4种水稻品种各自呈现了一定程度的差异与联系。粳稻2个品种与籼稻2个品种间差异更多体现在颖果发育进程上；而糯稻与非糯稻的区别则更多体现在淀粉体的形态与灌浆的充实程度上。

江汉平原小麦孕穗期空气相对湿度升高的产量效应

王小燕，赵晓宇，陈恢富，王晓玲，熊勤学

中国农业科学. 2014, 47(19): 3769-3779. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.005

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【目的】江汉平原为湖北省小麦主产区之一，小麦孕穗至成熟期空气相对湿度偏高是限制该地区小麦籽粒产量提高的重要气候因素。随着全球气候变化，在空气温度逐年升高的同时，空气中水汽的含量也在相应增加。论文旨在研究空气相对湿度升高对小麦的产量效应，以期为提高江汉平原小麦籽粒产量奠定理论基础。【方法】在系统分析江汉平原近30年空气相对湿度分布特征的基础上，通过人工气候室等设施于小麦孕穗期进行高空气湿度处理（处理时间为10 d），并以外界空气湿度处理为对照，于处理第5天、处理第10天、恢复后第5天、恢复后第15 天等时期取样，分析孕穗期空气相对湿度升高对小麦旗叶光合特性、旗叶及倒三叶SPAD值、叶片衰老进程、根系活力、株高、干物质积累量、籽粒产量及产量构成因素等的影响。【结果】（1）1983—2013年江汉平原空气相对湿度呈不规则波动，2—5年为一个周期，孕穗期空气相对湿度达78%以上年份有12个；2011—2012年度及2012—2013年度江汉平原小麦孕穗期空气相对湿度偏高，平均分别为77.4%和79.1%；表明江汉平原小麦孕穗期高空气湿度天气频繁出现。（2）人为增加空气相对湿度达100%条件下，与对照相比，旗叶及倒三叶SPAD值均降低，其中高空气湿度处理第5天差异不显著，第10天差异达显著水平；恢复正常空气湿度后，高空气湿度处理与对照间差异幅度缩小，但仍低于对照水平。（3）空气湿度升高对旗叶光合速率的影响与SPAD一致，即空气相对湿度升高，旗叶光合速率下降，撤除高空气相对湿度处理后，旗叶光合速率与对照间差异减小。（4）人为增加空气相对湿度达100%条件下，分析旗叶及倒三叶丙二醛含量及根系活力表明，空气相对湿度升高，叶片膜质过氧化加速、根系活力降低，撤除高空气湿度处理后，叶片膜质过氧化程度及根系活力与对照间差异幅度均减小，但仍显著低于对照水平，表明高空气湿度对叶片衰老及根系活力的副效应是不可逆转的。（5）空气相对湿度升高，植株干物质积累量及籽粒产量均显著降低，成熟期干物质积累量较对照降低5.5%，籽粒产量降低10.0%，其中籽粒产量降低归因于穗粒数和穗粒重的降低，分析表明穗粒数较对照降低6.0%，穗粒重较对照降低4.2%。【结论】在本试验条件下，孕穗期空气相对湿度升高导致小麦旗叶光合速率等光合指标下降、膜质过氧化加速、根系活力降低，最终生物产量（含株高）和籽粒产量均显著降低，其中籽粒产量的降低主要归因于穗粒数的降低，其次为穗粒重。

基于氮素运转原理和GRA-PLS算法的冬小麦籽粒蛋白质含量遥感预测

李振海，徐新刚，金秀良，张竞成，宋晓宇，宋森楠，杨贵军，王纪华

中国农业科学. 2014, 47(19): 3780-3790. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.006

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【目的】及时、有效地预测籽粒蛋白质含量，能够为优质小麦品种的收购和加工提供科学合理的决策支持信息。本研究从籽粒蛋白质形成的氮素运转规律出发，研究冬小麦籽粒蛋白质遥感预测的可行性及在区域与年际间的扩展性，为高分辨率遥感卫星进行大面积蛋白质预测提供理论依据。【方法】利用2012—2013年4个冬小麦品种×4个氮肥梯度的试验数据和地面高光谱数据进行建模；基于小麦籽粒蛋白质形成的氮素运转机理，通过分析籽粒氮素累积量的两个主要来源及其之间的比例关系，重点抓住开花前的植株氮素累积量再运转这一主要来源，而灌浆期根际的氮素直接吸收则通过其与前者的比例关系来确定，通过相关农学参数模型的耦合，同时加入温度影响因子对籽粒氮素运转的影响，初步阐明了利用开花期小麦叶片氮含量可以预测籽粒蛋白质含量的应用机理；然后选择与叶片氮含量相关的植被指数，利用灰色关联分析-偏最小二乘算法（GRA-PLS）选择与叶片氮含量关联度较高的植被指数并进行小麦叶片氮含量的估算，通过与氮素运转模型的耦合构建了基于氮素运转原理的籽粒蛋白质含量遥感预测模型；最后利用2009—2010年的品种×播期×肥料试验和2012—2013年的其他品种氮肥处理试验进行验证。【结果】（1）通过GRA方法对叶片氮含量和植被指数间的关联度进行计算，选择关联度较大的前5个植被指数进行叶片氮含量建模，其植被指数分别为mND705、NDVIcanste、Readone、DCNI和NDCI；（2）通过PLS方法构建的叶片氮含量模型，建模结果的预测值与实测值的决定系数（R2）和均方根误差（RMSE）分别为0.859和0.257%，验证结果的R2和RMSE分别为0.726和0.063%，利用GRA-PLS方法估算叶片氮素含量具有较好的稳定性；（3）构建的蛋白质预测模型，建模结果和验证结果的预测值与实测值的R2和RMSE分别为0.713、1.30%和0.609、1.19%，预测模型具有较高的精度与可靠性。【结论】基于氮素运转规律构建的小麦籽粒蛋白质含量遥感预测模型，可以作为应用开花期遥感信息来预测籽粒蛋白质含量的机理性解释，初步实现了本研究区域和年际间的籽粒蛋白质含量预测，具有一定的应用前景。

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

徐秋芳，陈晴晴，倪海平，李硕，张金凤，周益军

中国农业科学. 2014, 47(19): 3791-3798. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.007

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【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin，Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm），将其在原核细胞中进行表达，纯化Tm蛋白，免疫大白兔并制备其多克隆抗体，为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame，ORF）。提取灰飞虱总RNA，采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF，连接至pMD-18T载体后进行测序分析，利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液，进行超声波破碎处理，收集上清及沉淀，采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白，经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白，免疫大白兔，制备多克隆抗血清，并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后，用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测，分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示，灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析，结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp，编码283个氨基酸，理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE分析显示，融合蛋白大小约为55 kD，主要以可溶性蛋白形式表达，在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白，免疫大白兔，制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度，效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白，分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带，表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达，纯化获得了Tm融合蛋白，制备了高效价的Tm多克隆抗体。

豌豆蚜温度受体基因Painless的克隆及时间和组织表达

魏金金，曹德盼，杨婷，王桂荣

中国农业科学. 2014, 47(19): 3799-3809. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.008

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【目的】从豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）触角中克隆候选的温度受体基因——Painless，分析该基因所编码的蛋白结构特点，研究该基因在昆虫不同发育时期和不同组织中的表达谱，探讨该基因的功能。【方法】通过生物信息学的方法，使用果蝇（Drosophila melanogaster）Painless从豌豆蚜基因组数据库AphidBase中预测ApisPainless的假定全长序列，之后根据预测得到的假定全长序列，使用Primer premier 5.0 设计全长引物，使用RT-PCR方法从豌豆蚜触角cDNA中克隆ApisPainless的全长序列，并应用DNAMAN软件对预测序列与克隆序列进行比对，确定克隆序列与预测序列一致后，使用在线工具SMART（simple modular architecture research tool）对克隆得到的ApisPainless蛋白结构进行预测，分析其序列N端的锚蛋白重复序列及跨膜域，通过使用在线比对软件Clustal Omega对ApisPainless与DmelPainless的3个可变剪切型（isoform A、B、C）进行多序列比对，分析ApisPainless的可变剪切类型，通过构建昆虫TRP（transient receptor potential）离子通道超家族的进化树，分析ApisPainless的进化地位，并通过绘图直观地比较TRPA亚家族4个成员TRPA1、Painless、Pyrexia和Water witch的序列长短及N端锚蛋白重复序列的差异，使用实时定量荧光PCR技术，研究ApisPainless在1—4龄若虫以及成虫这5个不同发育时期的相对表达量，以及其在豌豆蚜成虫的触角、头、足和胸腹这4个不同组织中的相对表达量。【结果】预测并克隆得到ApisPainless全长序列，该基因的全长序列为2 832 bp，编码943个氨基酸，蛋白结构分析表明ApisPainless具有8个锚蛋白重复序列以及6次跨膜结构，通过序列比较发现ApisPainless与DmelPainless isform A的相似性最高，达到42.3%。进化树分析结果表明昆虫TRP超家族分为TRPA、TRPC、TRPM、TRPN、TRPV、TRPP和TRPML 7个亚家族，而ApisPainless聚类于TRPA亚家族Painless一支，在TRPA亚家族TRPA1、Painless、Pyrexia和Water witch这4个成员中，TRPA1的序列最长，约为1 200个氨基酸，其后依次是Water witch、Pyrexia和Painless，氨基酸数目约有920—1 000个。从N端的锚蛋白重复序列上看，Water witch和Pyrexia约有9个重复序列，Painless约为8个，而TRPA1则高达15—16个，发育时期表达谱分析结果显示ApisPainless在豌豆蚜的各个发育阶段均有表达，其中以1龄若虫期表达量最高。组织表达谱分析结果显示，ApisPainless在豌豆蚜的触角、头、足和胸腹各组织中均有表达，其中以在触角中的表达量最高，足中的表达量居其次。【结论】克隆得到的ApisPainless是TRPA亚家族Painlss基因，其在触角及足中表达量高，推测其功能可能类似于果蝇的Painless，参与高温伤害识别、机械刺激识别及味觉探测等过程。

三种本地赤眼蜂对大豆食心虫卵的寄生潜能

林英，宋丽威，臧连生，阮长春，史树森

中国农业科学. 2014, 47(19): 3810-3816. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.009

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【目的】大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella Matsumura）是中国北方大豆生产上的最重要蛀荚害虫，研究旨在明确3种本地赤眼蜂即黏虫赤眼蜂（Trichogramma leucaniae ）、玉米螟赤眼蜂（T. ostriniae）和螟黄赤眼蜂（T. chilonis）对自然寄主大豆食心虫卵的寄生潜能，为选育优良蜂种、定量评估赤眼蜂对大豆食心虫的控害潜能提供科学依据。【方法】在室内采用编制以米蛾卵为中间寄主繁育的3种赤眼蜂在大豆食心虫卵上的实验种群生命表的方法，比较分析其在大豆食心虫卵上的繁殖特性以及净增殖率（R₀）、平均世代周期（T）、内禀增长率（rm）、周限增长率（λ）、平均单雌寄生卵数、雌蜂平均寿命和羽化率等寄生特性参数。【结果】螟黄赤眼蜂、玉米螟赤眼蜂和黏虫赤眼蜂在羽化当日均达到产卵高峰，分别占其总产卵量的68.1%、69.1%和64.0%，随着时间的延长，螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂的产卵量呈明显下降趋势，在无任何营养补给时，10.0%的黏虫赤眼蜂雌蜂个体可存活7 d，羽化3 d后，平均单雌寄生10.5粒大豆食心虫卵，占总寄生量的22.5%；黏虫赤眼蜂、螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂的R₀、T、rm和λ分别为24.75、23.78和21.13；9.46、10.34和10.37 d；0.3393、0.3064和0.2941；1.4040、1.3585和1.3419；而3种供试赤眼蜂的平均单雌寄生卵数、平均寿命以及在大豆食心虫卵上的羽化率均无显著差异。综合比较结果显示，黏虫赤眼蜂在大豆食心虫卵上的各项实验种群生命表参数（R₀、T、rm和λ）最好，其次是螟黄赤眼蜂，玉米螟赤眼蜂的表现最差。【结论】黏虫赤眼蜂对大豆食心虫卵有较强的嗜好性和适应性，其主要生殖力特征参数均优于螟黄赤眼蜂和玉米螟赤眼蜂，是寄生大豆食心虫卵的优势蜂种，具有较大的应用前景。

长期施肥下黄壤性水稻土有机碳组分变化特征

张丽敏，徐明岗，娄翼来，王小利，秦松，蒋太明，李忠芳

中国农业科学. 2014, 47(19): 3817-3825. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.010

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【目的】土壤有机碳具有高度异质性，不同组分的有机碳由于化学性质和存在方式等不同，其生物有效性和肥力功能不同，并反映出不同的稳定机制，所以深入研究土壤有机碳的组分特征，对于更好地了解土壤有机碳的稳定性和肥力机制具有重要意义。本研究以黄壤性水稻土为对象，旨在研究揭示长期施肥对土壤有机碳组分特征的影响并探讨合理培肥模式。【方法】以中国黄壤性水稻土18年长期施肥定位试验为依托，通过田间取样和室内分析，采用土壤有机碳物理-化学联合分组方法，重点研究不同施肥条件下土壤有机碳组分含量及分配比例的变化，并通过定量分析组分碳含量与年均碳投入量的关系，探讨土壤有机碳饱和现象。试验处理包括不施肥对照（CK）、单施化肥（NPK）、单施有机肥（M）、无机肥配施低量有机肥（0.5MNPK）和无机肥配施高量有机肥（MNPK），碳投入梯度为0.87—6.02 t·hm^-2·a^-1。【结果】与不施肥（CK）相比，单施化肥（NPK）处理显著增加了土壤游离态粗颗粒有机碳、化学保护粉粒组有机碳和生物化学保护粉粒组有机碳含量，总有机碳提升10%；有机肥处理（0.5MNPK、M、MNPK）显著增加了土壤游离态粗颗粒有机碳、物理保护有机碳、化学保护粉粒组、黏粒组有机碳和生物化学保护粉粒组、黏粒组有机碳，增加幅度高于化肥处理，总有机碳提升24%—46%，其中以有机无机肥配施（MNPK）的提升幅度最大；与不施肥（CK）及单施化肥（NPK）处理相比，有机肥处理（0.5MNPK、M、MNPK）土壤物理保护有机碳的分配比例显著升高；模型分析发现，长期施肥条件下土壤游离态粗颗粒有机碳浓度与年均碳投入量呈显著的线性关系，而化学保护态有机碳浓度与生物化学保护态有机碳浓度以及土壤总有机碳含量，均与年均碳投入量呈显著的“饱和曲线效应”的对数函数关系。【结论】有机无机肥配施是提升黄壤性水稻土有机碳水平的最佳培肥措施，并以物理保护有机碳的提升幅度最大，强化了有机碳的物理稳定机制；黄壤性水稻土较稳定的有机碳组分（化学保护态、生物化学保护态）以及总有机碳存在饱和现象，在当前条件下出现饱和限制。

渭北旱地冬小麦监控施氮技术的优化

曹寒冰，王朝辉，师渊超，杜明叶，雷小青，张文忠，张璐，蒲岳建

中国农业科学. 2014, 47(19): 3826-3838. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.011

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【目的】氮素是限制旱地小麦增产的主要养分因子，不合理施氮不仅难以增加小麦产量，还会造成土壤剖面硝态氮累积、氮素损失增大和氮素利用效率降低。优化氮肥用量推荐方法、解决旱地小麦不合理施氮问题，对旱地小麦可持续生产有重要意义。【方法】基于平衡土壤氮素携出，以稳定作物产量、培肥土壤和调控硝态氮残留为目标，对现有的土壤硝态氮监控施氮方案（施氮量=作物目标产量需氮量+肥料氮素损失量+收获/播前土壤硝态氮安全阈值（55.0/110.0 kg•hm-2）-环境氮素投入量-秸秆还田带入氮素量-种子带入氮素量-生长季土壤氮素矿化量-收获/播前1 m土壤硝态氮）进一步优化，得出公式：施氮量=作物目标产量需氮量+收获/播前土壤硝态氮安全阈值（55.0/110.0 kg•hm-2）-收获/播前1 m土壤硝态氮。应用这一方法在西北典型旱地冬小麦种植区渭北旱塬两年6县30个地块布置田间试验。【结果】在该区域由于不合理施氮或没有规范的氮肥推荐方法，不同试验地播种前1 m土壤累积硝态氮积累量变化较大，介于34.2—708.4 kg•hm-2，平均为165.2 kg•hm-2，其中有17块在小麦播种前超过110 kg•hm-2。优化后的监控施氮技术确定的小麦氮肥用量介于30.0—247.3 kg•hm-2，平均为128.4 kg•hm-2，较农户习惯氮肥用量（171.6 kg•hm-2）减少25.2%。监控施肥和农户习惯施肥的小麦籽粒产量平均分别为5 658和5 489 kg•hm-2，籽粒氮含量为20.8和20.3 g•kg-1，两者均无显著性差异。监控施肥能够显著提高氮素利用率和氮肥偏生产力，较农户习惯施肥分别提高24.0%（由46.3%提高到57.3%）和130.1%（由34.9 kg•kg-1提高到80.3 kg•kg-1）。收获时，农户习惯施肥0—100 cm土层的硝态氮残留量介于17.4—203.4 kg•hm-2，地块间变幅大，平均为70.6 kg•hm-2；而监控施肥介于15.6—113.9 kg•hm-2，平均为51.4 kg•hm-2，稍低于预期的55 kg•hm-2的目标。在降水较多的夏闲期，优化的监控施氮技术可使0—100 cm土层的硝态氮淋失减少47.9%。【结论】优化后的旱地冬小麦监控施氮技术可以方便地确定和有效调控氮肥用量，稳定小麦籽粒产量，提高氮素利用效率和氮肥偏生产力，降低土壤硝态氮残留和淋溶。

水氮对冬小麦-夏玉米产量及氮利用效应研究

吕丽华，董志强，张经廷，张丽华，梁双波，贾秀领，姚海坡

中国农业科学. 2014, 47(19): 3839-3849. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.012

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【目的】水肥是作物产量的两大限制因子。当前在作物生产中对水氮资源利用不够合理，不仅浪费水资源，而且严重威胁环境。为了探讨华北山前平原冬小麦-夏玉米轮作体系合理的水氮配合措施，在5年水氮定位试验基础上对周年轮作体系产量、氮吸收与利用状况进行了分析。【方法】试验为冬小麦夏玉米周年轮作种植，设置水、氮两因子，裂区试验设计，水分为主区，施氮量为副区。水分设置限水和适水两个处理，根据华北山前平原冬小麦夏玉米灌溉制度，冬小麦限水和适水下灌水次数分别为1水（拔节期）和2水（拔节+开花水），夏玉米限水和适水下灌水次数根据不同年型降水量而定（1水为播前水，2水为播前水+12展叶水，3水为播前水+12展叶水+开花水）。周年设置6个施氮水平，小麦+玉米氮肥用量分别为（0+0）、（60+60）、（120+120）、（180+180）、（240+240）、（300+300）kg·hm^-2。【结果】在供水量较高和较适宜的条件下（年供水量大于609.5 mm），水分不是氮肥肥效发挥的限制因素，氮肥对产量的贡献较大；而供水量较低的条件下，肥效受较大抑制，供水对产量贡献较大。供水量和施氮量有明显的耦合效应，限水和适水下得到最高产量的施氮量冬小麦分别为134.8和126.4 kg·hm^-2、夏玉米分别为176.8和127.2 kg·hm^-2。限水和适水下单季施氮量分别为300和240 kg·hm^-2时，地上部总氮量达较高值，但限水和适水下夏玉米和限水下冬小麦氮量超过60 kg·hm^-2、适水下冬小麦施氮量超过120 kg·hm^-2时，秸秆残留氮素明显增加，对籽粒氮的贡献变小。氮肥偏生产力随施氮量增加而降低，且随年度推移氮肥偏生产力明显降低，尤其是小麦季施氮量60 kg·hm^-2处理随年份增加降低尤为迅速。在本试验条件下周年施氮量限水240 kg·hm^-2、适水120 kg·hm^-2就能保持土壤有机质和全氮含量不降低。【结论】限水条件下水是限制氮肥肥效发挥的主要因素，通过改善水分条件可更有效的提高氮肥肥效，因此在干旱年型应降低施氮量。中高产田冬小麦-夏玉米轮作体系限水和适水下得到最高产量的施氮量分别为311.6和253.6 kg·hm^-2，此时最佳产量可分别达16 127.5和17 272.9 kg·hm^-2。

炭化秸秆对苹果根系一氧化氮生成及根区土壤硝酸盐代谢的影响

闫丽娟，杨洪强，苏倩，门秀巾，张玮玮

中国农业科学. 2014, 47(19): 3850-3856. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.013

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【目的】土壤硝酸盐既是果树的氮素营养来源，也是潜在的环境污染因素；炭化秸秆是作物秸秆不完全燃烧的产物，施入土壤能够改善土壤的理化特性。本研究主要探讨苹果根系和根区土壤一氧化氮（NO）及土壤硝酸盐代谢相关酶在土壤施用炭化玉米秸秆后的变化，旨在揭示炭化秸秆对苹果根系及根区土壤硝酸盐代谢的调控作用，从而为控制土壤硝酸盐转化及改善果园土壤管理提供理论依据。【方法】在春季，将炭化玉米秸秆与土壤按照0.5%—8.0%（w/w）的比例混匀后装入陶盆，然后将生长势相近的3年生‘富士’苹果幼树（砧木为平邑甜茶）移栽到陶盆中，于移栽120—190 d后定期检测苹果根系和根区土壤NO生成速率以及硝酸还原酶（NR）的活性，并分别测定根系一氧化氮合酶（NOS）活性和根区土壤亚硝酸还原酶（NiR）与羟胺还原酶（HyR）活性以及土壤硝化强度的变化等。【结果】苹果根系及其根区土壤NO生成和硝酸盐代谢对炭化秸秆施用量的反应明显不同，根系NO生成速率和一氧化氮合酶活性在炭化秸秆施用量为1.0%—2.0%（w/w）时明显升高，在8.0%时显著下降；根系硝酸还原酶活性在炭化秸秆施用量为0.5%—2.0%（w/w）时明显升高，在4.0%—8.0%时显著下降；在处理后第120—170天，炭化秸秆对根系NO生成和硝酸还原的作用效果更突出。在炭化秸秆施用量为0.5%时，根区土壤NO生成速率、硝酸还原酶活性和亚硝酸还原酶活性均明显升高；在炭化秸秆施用量超过1%后，土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性明显降低；在炭化秸秆施用量超过2%时，土壤NO生成速率则明显降低；在处理后第120—155天，炭化秸秆对根区土壤NO生成和硝酸还原的作用最明显。施用炭化秸秆还明显促进苹果根区土壤的硝化作用，在炭化秸秆施用量为2.0%—4.0%时，土壤硝化强度提高最明显；随着炭化秸秆用量由0.5%增加到8.0%，根区土壤羟胺还原酶活性逐渐升高；在施用后140—170 d，炭化秸秆对根区土壤硝化作用的效果最显著。【结论】土壤施用炭化秸秆明显干扰苹果根系及根区土壤硝酸盐代谢，较低施用量（0.5%—1.0%）的炭化秸秆促进根系和土壤硝酸盐还原形成NO，较高施用量（2.0%—4.0%）的炭化秸秆增强根区土壤的硝化作用，其中，0.5%的炭化秸秆对根区土壤硝酸盐还原的促进作用最突出，1.0%的炭化秸秆对根系NO的生成作用最显著，根区土壤硝化强度在炭化秸秆施用量为2%时达到最大。

荧光假单胞菌对樱桃根系呼吸和幼苗生长的影响

张鹏，秦嗣军，周文杰，吕德国，马怀宇

中国农业科学. 2014, 47(19): 3857-3865. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.014

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【目的】合理利用土壤有益微生物改善土壤环境，有助于提高作物产量与品质。樱桃根系适应性普遍较差，对土壤理化和生物环境变化反应敏感。探讨土壤接种荧光假单胞菌等根际促生细菌对根系功能及幼苗生长的影响效应，可为樱桃园根际环境调控提供参考依据。【方法】以土壤灭菌的钵栽山樱幼苗为试材，测定根系呼吸代谢相关指标，研究根系呼吸等生理功能对定量接种荧光假单胞菌的响应特征。【结果】幼苗根系呼吸途径以糖酵解-三羧酸循环-细胞色素途径（EMP-TCA-COX）为主。接种处理结束后5 d时，幼苗根系总呼吸速率未发生显著改变；20—35 d时接种处理EMP途径以及TCA途径呼吸速率降低，从而导致总呼吸速率较对照分别降低了34.9%和30.9%，而在50 d时接种处理的EMP途径及TCA途径呼吸速率升高，使得根系总呼吸速率较对照显著提高了135.8%。接种荧光假单胞菌处理后5 d时显著提高了丙酮酸激酶（PK）、苹果酸脱氢酶（MDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）活性，降低了磷酸果糖激酶（PFK）活性。而接种处理后20 d时PK活性高于对照，PFK和G-6-PDH活性低于对照，其余根系呼吸途径相关酶活性与对照相比无显著差异。接种处理35 d时PFK活性较对照提高了127.0%，50 d时G-6-PDH活性升高至对照的2倍，其余酶活性与同期对照相比虽有差异但不显著。土壤接种荧光假单胞菌的幼苗叶片数增加了16.7%，茎粗增加了9.3%，说明接种处理促进了植株生长。【结论】灭菌条件下接种荧光假单胞菌影响山樱幼苗根系呼吸功能及生长，接种OD值为0.4的菌液（共6次）处理后20—35 d，引起了根系呼吸途径分配比例变化，部分相关酶活性发生改变，影响根系总呼吸速率，进而引起植株形态指标的改变。

变温条件下钙对山定子根系线粒体功能的影响

苏宏，李丽杰，马怀宇，吕德国，孙靖

中国农业科学. 2014, 47(19): 3866-3873. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.015

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【目的】探讨山定子根系线粒体功能对变温胁迫的响应机制及钙在此过程中的调节效应，为深入研究山定子根系适应温度逆境的生理机制奠定基础。【方法】以山定子幼苗为试材，进行变温处理（5℃→20℃→0℃）和CaCl₂浇灌处理，测定根系线粒体膜通透性（MPT）、膜电位（?ψm）、超氧阴离子（）产生速率、线粒体细胞色素途径（CP）和交替途径（AP）、钙调素（CaM）含量、钙调磷酸酶（CaN）含量等指标的变化。【结果】大幅度变温导致山定子根系MPT不断增大，?ψm明显下降，产生速率持续升高，引起根系MDA含量不断增加。CaCl₂处理使根系MPT处于较稳定的水平；明显提高降温阶段?ψm的水平；逐渐降低降温阶段的产生速率，使根系MDA含量始终稳定在较低水平。变温过程中根系CP活性和贡献率先下降后升高，AP活性则持续升高。CaCl₂处理显著提高了20℃时CP和AP的活性，且AP活性和贡献率的变化趋势与CP互补。变温过程中根系CaM含量逐渐升高，CaN含量先下降后升高；而CaCl₂处理后CaM含量先降低后升高，CaN含量则持续降低。【结论】大幅度变温抑制了山定子根系线粒体的功能，导致电子漏增加，膜脂过氧化程度加剧。外源钙通过稳定MPT，调节CP和AP活性等方式，有效降低了膜脂过氧化程度。在升温阶段，钙处理通过下调CaM和上调CaN来缓解温度胁迫；在降温阶段，钙处理则通过大幅度上调CaM和下调CaN来缓解温度胁迫。

鸡钙离子结合分子伴侣Calreticulin的结构与功能预测及组织表达特性

王丽丽，李楠，曹嫦妤，龚都强，于东，王伟，李金龙

中国农业科学. 2014, 47(19): 3874-3882. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.016

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【目的】揭示鸡组织细胞内质网(endoplasmic reticulum, ER)中关键Ca²⁺结合分子伴侣钙网蛋白(calreticulin, CRT)的结构与功能及组织表达特性。【方法】应用Laser Gene软件，通过比对Gene bank已登录的12种脊椎动物CRT核苷酸及氨基酸序列以分析其进化关系，利用生物信息学方法预测鸡CRT蛋白的结构与功能，并采用荧光定量RT-PCR方法检测CRT在鸡30个不同组织中的表达特性。【结果】同源性分析结果显示：鸡与其他11个物种CRT基因核苷酸序列中，鸡与兔核苷酸序列同源性最高，为78.7%，与虹鳟的同源性最低，为70.5%；氨基酸序列中，鸡与蛇的亲缘关系最近，为85.0%，与虹鳟的亲缘关系最远，为69.0%，与鼠、猕猴、人、兔、猪、牛和非洲爪蟾蜍的亲缘关系也相对较近，并均在80.1%及以上。蛋白结构与功能预测结果为：鸡CRT由404个氨基酸组成，相对分子质量46.8802 kD，理论等电点为4.41，负电荷氨基酸残基数为102，正电荷氨基酸残基数为53，分子式为C₂₀₇₄H₃₁₀₇N₅₄₃O₆₈₄S₉，鸡CRT具有22个疏水区域，其C端与N端具有很高的疏水性，而C端的亲水性要强于N端，且形成α_1(7-17)-α_2(22-25)-β₁₍₂₆₎-β_2(38-41)-β_3(50-54)-β_4(69-70)-β_5(75-82)-β_6(92-99)-β_{7 (110-114)}-β_8(129-133)-β_9(144-151)-β_10(171-178)-β_11(183-187)- β_12(314-322)-β_13(326-332)-α_3(337-348)-α_4(350-375)-α_5(377-379)-α_6(395-401)的二级结构。CRT蛋白属于跨膜蛋白，存在信号肽，且为分泌蛋白，酶分类属于EC 3.2.1.55或EC 3.4.24.68。组织表达检测结果表明：CRT基因在鸡各组织中广泛表达，其中在回肠、腺胃和十二指肠等组织中表达量较高，且高出肾脏（对照）20倍以上。【结论】鸡CRT核苷酸及氨基酸序列在12种脊椎动物物种中具有相对保守性，鸡CRT为跨膜分泌蛋白，为酸性蛋白，属于α-N-阿拉伯糖苷酶或Tentoxilysin，催化α-L-阿拉伯糖苷内的终端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解，作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含（1,3）和/或（1,5）糖苷键的阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖，能与糖类分子及Ca²⁺特异性结合，可监控糖蛋白组装折叠及Ca²⁺调控，且在消化系统中发挥重要作用。

同时检测牛奶中喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法研究

李向梅，王战辉，肖希龙，王照鹏，温凯，吴小平，夏曦，武晋孝，江海洋

中国农业科学. 2014, 47(19): 3883-3889. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.017

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【目的】喹诺酮类药物和庆大霉素均为高效、广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，是中国畜牧业和水产业中常用的两类兽药。由于这两类药物在动物源性食品中的残留可能导致对人类健康的危害，因此，为了保护消费者的健康，研究和制定动物源性食品中同时检测这两类药物的残留检测方法对完善中国的食品安全监测体系具有重要意义。【方法】建立了同时检测牛奶中13种喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并对喹诺酮类和庆大霉素单克隆抗体按比例进行混合标记。同时，采用方阵法系统研究了胶体金标记这两类抗体时的pH值和抗体用量对灵敏度的影响，并对这两类药物抗原的包被条件进行选择确定。在此基础上研发出可同时检测牛奶中13种喹诺酮类药物和庆大霉素的胶体金快速检测试纸条，试纸条采用直接竞争法原理。【结果】该方法可同时检测恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氟甲喹、培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、噁喹酸、麻保沙星、氟罗沙星、奥比沙星、达氟沙星和洛美沙星这13种喹诺酮类药物和庆大霉素，对其他喹诺酮类药物如：沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、帕珠沙星等无交叉反应，同时对其他氨基糖苷类药物如：链霉素、新霉素、卡那霉素等也无交叉反应。该试纸条对牛奶中这13种喹诺酮类药物和庆大霉素的检测限均为20 ng·mL^-1，完全满足国家对这两类药物的残留限量要求。牛奶样本直接检测，无需处理，整个检测过程5 min内完成。【结论】采用该方法和HPLC-MS/MS对60份牛奶盲样进行比对试验，阳性样品全部检出，同时筛选方法未出现假阳性和假阴性现象，二者的测定结果基本相符，表明该方法准确可靠，适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。实际操作过程中，可以采用胶体金免疫层析对样品进行现场快速初筛；筛选的疑似阳性样品，可以采用HPLC-MS/MS方法对样品中QNS和GEN的含量进一步确认。

沙丁胺醇对果蝇的化蛹、羽化、寿命及抗氧化能力和DNA损伤的影响

孙冰，林欣大，张春红

中国农业科学. 2014, 47(19): 3890-3897. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.018

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【目的】利用重要的模式生物果蝇研究沙丁胺醇的作用机制，探索瘦肉精对生物体产生的影响及其分子机制，为进一步在生产中开发出更快速、精准且高效的瘦肉精检测方法提供重要的基础。【方法】将果蝇一龄幼虫放到不同浓度的沙丁胺醇培养基上饲喂，每天记录果蝇化蛹和羽化的情况，并统计出果蝇的化蛹率和羽化率及化蛹时间和羽化时间。收集24 h内羽化的果蝇，放入不同浓度沙丁胺醇培养基和基础培养基中，每管放入雌雄果蝇各25只，每个浓度设置4个平行实验。每天记录果蝇的存活数，每3 d更换一次培养基，直至果蝇全部死亡。分别统计雌雄果蝇半数死亡天数，平均寿命和平均最高寿命。收集不同浓度沙丁胺醇培养基上的3日龄成虫，雌雄果蝇各取15只放入离心管，研磨制成组织匀浆，离心（2 500 r/min，10 min）后取上清，然后按照试剂盒的方法测定SOD和CAT活力，同时检测MDA的含量；以果蝇3日龄成虫的中肠细胞为研究对象，采用单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE）对细胞进行处理，经EB染色后，在荧光显微镜下观察果蝇细胞DNA损伤情况并拍照，结合Cometscore^TM软件对图像进行分析。【结果】在沙丁胺醇的作用下，果蝇化蛹率和羽化率随处理浓度增加而降低，但是经统计分析发现差异不显著（P＞0.05），对果蝇化蛹时间和羽化时间也没有显著影响（P＞0.05）；用沙丁胺醇饲喂果蝇之后，对3日龄成虫体内SOD、CAT活力和MDA含量进行测定表明，随处理浓度的增加使体内MDA含量显著增加（P＜0.05），CAT的活力被抑制，呈现出显著降低的趋势（P＜0.05），促使体内抗氧化系统产生作用SOD活力显著提高（P＜0.05）；正是由于机体内抗氧化系统的保护机制产生作用，使得在一定浓度下处理的果蝇寿命呈现增加的趋势。对果蝇DNA损伤检测的试验表明，经沙丁胺醇处理之后，果蝇细胞就出现损伤，在SCGE的检测下可以观察到DNA损伤形成的拖尾，并且随着浓度的增加损伤情况也越严重，但是彗星图片中没有出现细胞核首尾分离的情况，可知沙丁胺醇并没有引起细胞凋亡。经统计分析，各处理浓度组的“彗星”尾长（Tail length, TL）、尾距（Olive tail moment, OTM）和尾部DNA百分含量（% DNA in tail），与对照组相比，均有显著差异（P＜0.05）。【结论】沙丁胺醇对果蝇化蛹和羽化没有显著影响；对果蝇抗氧化系统产生作用，抑制CAT活力，使SOD活力显著增加，使得在较高浓度处理时出现显著延长果蝇的寿命的情况；经沙丁胺醇处理之后，就会引起果蝇DNA损伤并且与对照组存在显著差异，但是并没有出现细胞凋亡的情况。

高油酸、中果型花生新材料的创制与鉴定

李丽，何美敬，崔顺立，侯名语，陈焕英，杨鑫雷，王鹏超，刘立峰，穆国俊

中国农业科学. 2014, 47(19): 3898-3906. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.019

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【目的】种质资源是作物育种的基础，创制具有多种表型特征的高油酸花生新材料，对高油酸花生育种具有重要意义。【方法】以常规品种白沙1016和高油酸花生品系CTWE为材料，通过对2个亲本ahFAD2A和ahFAD2B ORF的扩增与序列分析，确定其突变类型；利用等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）对两亲本油酸性状基因型进行确认；采用单粒近红外光谱技术（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）结合气相色谱（gas chromatographic，GC）分析对各世代单株的油酸及亚油酸含量进行测定；利用产量性状及油酸含量双重选择压力对F_2:3家系及F₄种子进行筛选，并对筛选得到的新材料进行表型鉴定及AS-PCR鉴定。【结果】ahFAD2A和ahFAD2B ORF区域扩增与序列测定结果表明，CTWE与突变体F435的突变位点完全一致，即ahFAD2A在448 bp处发生G-A碱基替换，同时ahFAD2B 在442 bp处发生碱基A的插入。白沙1016在这2个位点保持野生型状态。借助AS-PCR反应确定两亲本油酸性状基因型，结果表明，CTWE为ol₁ol₁ol₂ol₂，白沙1016为OL₁OL₁OL₂OL₂，两亲本存在2对差异基因。该结果与测序结果相一致。通过设立产量性状和油酸性状双重选择压力对241个F_2:3家系进行选择，单株荚果重高于对照冀花2号30%的家系共20个，对20个高产家系均随机抽取5个单粒进行NIRS检测，淘汰13个低油酸家系。对至少含有1粒高油酸类型的7个家系内的所有单株进行AS-PCR检测，共检测到4种基因型的个体。通过对F_2:3家系和F₄单株的室内外考种及GC值的测定，筛选出具有不同表型特征、产量高出对照冀花2号30%的纯合高油酸材料4个，百仁重介于54.00—75.29 g，均属中果类型，油酸GC值介于81.10%—82.71%，油亚比介于28.66—41.19。11-3和13-2的株型均为匍匐3型，均有轻微果嘴和轻微网纹。11-3为蜂腰形荚果，轻微果腰。13-2为普通形荚果，无果腰。15-2株型为直立型、普通形荚果、无果腰、无果嘴和中等明显程度网纹。16-1株型为匍匐2型、普通形荚果、无果腰、轻微果嘴和轻微网纹。【结论】借助AS-PCR辅助选择的方法创制了具有不同表型特征的中果型高油酸新材料4份。

平邑甜茶根系构型、养分吸收和新梢生长对根域形状的反应

范伟国，杨洪强

中国农业科学. 2014, 47(19): 3907-3913. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.020

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【目的】根系构型是根系的重要形态特征，也是影响植株养分吸收的重要因素，栽培容器可以通过特异的根域形状影响根系形态、结构和养分吸收特性；平邑甜茶[Malus hupehensis (Pamp) Rehd.]是优良的苹果砧木，对根域环境反应敏感，本研究主要探讨不同形状的根域对平邑甜茶新梢生长、根系构型参数及根系养分吸收的影响，为分析和塑造理想根系构型及改善苹果砧木养分吸收和植株生长提供依据。【方法】分别利用盆口直径小于盆高、盆口直径大于盆高和盆口直径等于盆高3种陶土盆，创造深窄形根域、浅宽形根域和等高等径根域3种根系构型环境，早春将等体积、同类型的营养土装入盆中，并选择植株长势和根系形态相近的平邑甜茶幼苗移栽至上述陶盆中，8个月后取样调查根系形态构型参数、新梢生长量、根系活力和根系养分吸收速率。【结果】在根域形状不同的3种栽培环境中生长8个月后，平邑甜茶幼苗新梢生长、根系构型和养分吸收特性差异明显，其中，生长在深窄形根域中的幼苗一级侧根数量最多，一级和二级侧根长度最短，植株根/冠比最大，其根系活力和对钾的吸收速率最低，对磷、钙和锌的吸收速率较低，对铁的吸收速率较强。生长在浅宽形根域中的幼苗新梢粗长、叶片多，新梢生长量最大，一级侧根和二级侧根最粗和最长，二级侧根数量和毛细根数量最多，根/冠比较小，根系对钾的吸收速率最高，对磷和锌的吸收速率较高，对钙的吸收速率较低，对铁的吸收速率最低。生长在等高等径根域中幼苗新梢细短、叶片少，新梢生长量最小，主根最细，一级侧根数量和毛细根最少，根/冠比较小，其根系活力最高，对钙和锌的吸收速率较高，对磷、钾和铁的吸收速率较低。【结论】根域形状对平邑甜茶幼苗根系形态构型、养分吸收性能、根/冠比和新梢生长影响显著；深窄形根域使幼苗侧根长度和直径变小、一级侧根数量增多，植株根/冠比增大及对铁的吸收能力提高；浅宽形根域使平邑甜茶幼苗侧根粗且长、毛细根更丰富，植株对磷、钾的吸收能力和新梢生长增大；等高等径根域使幼苗主根直径变小、一级侧根和毛细根数量减少，使根系活力和植株对钙的吸收能力提高。

浙江省十大名茶主要重金属元素分析

章剑扬，张颖彬，金寿珍，马桂岑，陈利燕，刘新

中国农业科学. 2014, 47(19): 3914-3921. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.021

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【目的】调查浙江省十大名茶（含西湖龙井）样品中稀土（以氧化物总量ΣReOs计）、砷（As）、铬（Cr）、镉（Cd）、铅（Pb）的含量，分析浙江十大名茶中的主要重金属含量分布规律，为名茶安全评估和地理溯源研究提供科学数据。【方法】在浙江省名茶主产区的6个地（市）11个县（市、区）采集西湖龙井（West Lake longjing）、惠明茶（Huiming tea）、径山茶（Jingshan tea）、开化龙顶（Kaihua longding）、安吉白茶（Anji white tea）、千岛玉叶（Qiandao yuye）、大佛龙井（Dafo longjing）、越乡龙井（Yuexiang longjing）、武阳春雨（Wuyang chunyu）、绿剑茶（Lujian tea）、松阳银猴（Songyang yinhou）11类名茶共78个样品。采用硝酸-微波消解对ΣReOs、As、Cr、Cd、Pb含量进行测定，并使用主成分分析和聚类分析技术对测定结果进行分析。【结果】各茶类中ΣReOs、As、Cr、Cd和Pb的含量均在相关标准允许范围内，但含量存在差异。其中，ΣReOs平均含量为（0.305—1.049）mg·kg^-1，最高的是越乡龙井，最低的是绿剑茶；As平均含量为（0.053—0.121）mg·kg^-1，最高的是西湖龙井，最低的是松阳银猴；Cr平均含量为（0.553—2.079）mg·kg^-1，最高的是西湖龙井，最低的是开化龙顶；Cd平均含量为（0.033—0.099）mg·kg^-1，最高的是开化龙顶，最低的是大佛龙井；Pb平均含量为（0.510—2.763）mg·kg^-1，最高的是大佛龙井，最低的是开化龙顶。被测元素通过主成分分析可得到4个主成分，方差贡献率为总方差的88.159%；大多数茶类能通过聚类分析找到集群，其中千岛玉叶全部在群集7，而安吉白茶、惠明茶和径山茶则分别分布于4个不同集群。【结论】浙江省主要名茶在种植、采摘、加工和储存等环节质量控制整体较好。不同种类名茶中ΣReOs、As、Cr、Cd和Pb含量存在显著差异。

家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达

罗娟，陈恩祥，刘红玲，彭芷昕，杨从文，沈关望，张海燕，邢润苗，林英，夏庆友

中国农业科学. 2014, 47(19): 3922-3928. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.022

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【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR），分析其在昆虫细胞中的表达特征，了解正常VgR和突变VgR的表达模式，为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物，扩增的目的片段连接到载体pET28a上，构建原核表达载体，转化E. coil BL21（DE3）表达菌株，IPTG诱导获得目的蛋白；用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白；将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体；PCR扩增获得大造和突变型白妙卵（scanty vitellin，vit）的LBD1+EGF1结构域（C11D和C11V）片段，连接到细胞表达载体上，通过细胞转染表达目的蛋白，采用细胞免疫组化检测大造和突变型vit的VgR在细胞里的表达情况；通过Western blot检测细胞培养液中大造和突变型vit VgR的表达量。【结果】原核表达获得了一个大小约为22 kD的融合蛋白，以包涵体形式表达；镍柱亲和层析初纯化得到BmVgR的肽蛋白，进一步切胶纯化后，以此为抗原制备BmVgR的兔源多克隆抗体，其抗体效价＞1﹕512 000，纯度为95%以上。转录水平检测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有BmVgR和BmVg内源基因的表达；在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型和突变型vit BmVgR的结构域SP+LBD1+EGF1肽段，家蚕突变型vit在BmVgR第1个表皮生长因子同源区域的第3个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失；细胞免疫组化试验表明，突变型和正常型的C11V和C11D都能在Sf9细胞质中正常表达；制备的BmVgR兔源多克隆抗体和Myc标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白，表明试验所制备的VgR抗体特异性较好；由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽，细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培养液中，Western blot对培养液进行蛋白检测，表明突变型vit存在氨基酸缺失，但并不影响肽蛋白的正常表达，且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的正常表达，可能是其蛋白功能异常导致突变型vit表型产生。

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