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2014年 第47卷 第2期 刊出日期：2014-01-15

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

植物转录因子NAP亚家族的研究进展

范凯, 王学德, 袁淑娜, 王铭

中国农业科学. 2014, 47(2):  209-220.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.001

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植物转录因子NAP（NAC-Like，Activated by AP3/PI）是近年来发现的一类与调控植物生长发育、控制叶片衰老以及响应外界环境胁迫等功能有关的转录因子，是NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）家族中的一个重要成员，也是一类植物特有的转录因子。转录因子NAP在结构上具有NAC家族的保守结构，即在N端具有保守的NAC区以及在C末端具有相对多样性的TAR区，但也有不同于其它NAC亚家族的一些特点，如其TAR区也有一定的保守性等；同时，NAP亚家族的基因表达产物主要集中在细胞核中，表明转录因子NAP是一个核蛋白；再者转录因子NAP的基因主要包括3个外显子和2个内含子。自从第一个转录因子NAP于1998年由Robert等在拟南芥中对控制花发育的AP3/PI的靶基因进行研究时发现以来，目前已在水稻、小麦、大豆、棉花、竹子、葡萄、番红花等植物中相继发现，表明NAP是存在于植物界中的一个特有的转录因子。转录因子NAP具有多种生物学功能，广泛参与植物种子、根、花等的生长发育，对植物生长发育过程起着重要的调节作用；与此同时，转录因子NAP也在叶片凋亡过程中起着举足轻重的作用，对叶片在衰老过程中涉及到的大分子物质的降解以及营养物质的再分配等过程起着重要的调控作用；而且，转录因子NAP对包括干旱、盐渍、冷害等外界环境胁迫有一定的响应，是一类参与调控植物体内各种生理反应的关键因子；同时，转录因子NAP也与植物尤其是农作物的品质有密切的关系，这也为农作物育种提供了一种新的思路和方法。最新研究表明，NAP主要受脱落酸和乙烯调控，已发现一个定位在高尔基体的PP2C家族中的成员SAG113为转录因子NAP的一个直接的靶基因，而且发现SAG113在控制气孔运动方面尤其是在衰老叶片中可能是ABA调控中的一个负调控元件，通过酵母杂交试验以及电泳迁移率变动分析技术得出转录因子NAP受到ABA的调控并直接与其靶基因SAG113启动子区域的一个特定的区域进行专一性的结合，即在衰老叶片中转录因子NAP通过ABA-NAP-SAG113 PP2C调节链提高其靶基因SAG113的表达，以及通过促进气孔开放从而导致水分丧失和通过足够的氧气进入到组织中使得乙烯释放进而使呼吸作用加快等加速叶片衰老的信号这一调控机制。文章主要对NAP转录因子的结构特点、生物学功能以及调控机制等方面在植物中的研究现况进行较为详细的阐述，以期为后续研究提供一定的参考。

水稻507ys黄绿叶突变体的遗传鉴定与候选基因分析

李燕群1, 蒲翔1, 李春梅1, 钟萍1, 孙昌辉1, 李秀兰2, 邓晓建1, 王平荣1

中国农业科学. 2014, 47(2):  221-229.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.002

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【目的】对水稻507ys黄绿叶突变体进行遗传鉴定与候选基因分析。【方法】用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）处理粳稻品种日本晴（Nipponbare），从突变体库中获得一份黄绿叶突变体507ys。对该突变体进行表型观察以及主要农艺性状调查分析。将507ys与正常绿色品种进行杂交，调查F1代的叶色表型和F2群体的叶色分离情况，分析该突变表型的遗传行为。利用（507ys/明恢63）的F2作为定位群体，对507ys突变基因进行精细定位且遴选候选基因，对候选基因进行DNA测序验证及编码蛋白序列同源性分析。同时，测定507ys突变体和野生型亲本的光合色素含量，并利用高效液相色谱（HPLC）精确分析它们的叶绿素组成成分，以进一步揭示507ys黄绿叶突变基因的候选基因。【结果】507ys黄绿叶突变体整个生育期呈黄绿色。与野生型亲本日本晴相比，507ys突变体在分蘖期叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量分别下降52.1%和58.1%，成熟期株高、每株有效穗数、每穗着粒数和结实率分别减少8.3%、51.0%、7.4%和11.6%。507ys与正常绿色品种日本晴和明恢63杂交的F1表现正常的绿色，F2群体绿色正常植株与黄绿叶突变植株分离比符合3﹕1，表明507ys的黄绿叶突变性状由1对隐性核基因控制。该突变基因定位在第10染色体长臂近端部SSR标记RM333和InDel标记L3之间，遗传距离分别为0.56 cM和0.14 cM，两标记之间的物理距离约为60.2 kb，此区间内包含13个有注释的预测基因。基因组序列分析发现，507ys突变体中编码叶绿素酸酯a加氧酶的OsCAO1（LOC_Os10g41780）在编码区第2 198位碱基（CDS第1 057位碱基）处，碱基G突变为碱基A，造成编码蛋白的氨基酸序列第353位的谷氨酸（E）突变成赖氨酸（K）。对叶绿素组成成分分析表明，507ys突变体叶片中只有叶绿素a，没有叶绿素b。【结论】507ys突变体基因是已报道的叶绿素酸酯a加氧酶基因OsCAO1的等位基因。507ys突变体在OsCAO1外显子上发生的一个点突变使得其体内叶绿素酸酯a加氧酶失活，造成叶绿素b合成受阻。

冀豆12遗传背景下3个回交组合高低蛋白含量 后代品系SSR标记分析

陈强1, 2, 闫龙1, 杨春燕1, 张嘉楠1, 史晓蕾1, 东方阳2, 邓莹莹1, 2, 侯文焕1, 张孟臣1, 2

中国农业科学. 2014, 47(2):  230-239.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.003

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【目的】以高蛋白、高产、高配合力大豆品种冀豆12为遗传基础，创造高蛋白含量新种质，分析蛋白含量相关QTL及其连锁标记，挖掘QTL中包含的优异基因，为高蛋白育种提供新种质、新标记。【方法】以冀豆12为轮回亲本，来自东北地区的红丰11、茶秣食豆、绥农14等蛋白质含量不同的育成品种和地方品种为供体亲本，通过有限回交，创造高蛋白新种质。从3个组合的回交后代品系中，选择农艺性状一致、产量与冀豆12无显著差异的4个高蛋白（50%—53%）品系和3个中低蛋白（38%—41%）品系为试验材料，参照大豆公共遗传连锁图谱，分别在20个连锁群上，均匀选取并筛选在双亲间表现多态性的SSR标记，分析冀豆12及其后代品系的遗传相似性与遗传差异，确定与蛋白质含量相关的QTL及其连锁标记。通过对QTL候选区间内的基因功能注释，挖掘与蛋白质含量相关的优异基因。【结果】创制出一批蛋白质含量超过50%的高蛋白新种质。3个组合中分别筛选到209、201和199个双亲间多态性标记；亲本与后代间遗传相似性分析结果表明，同一组合的后代中高蛋白品系的轮回亲本遗传背景回复率高于低蛋白品系遗传背景回复率。3个组合中4个高蛋白品系与轮回亲本冀豆12之间的相似系数平均值为79.58%，显著高于3个低蛋白品系材料与轮回亲本冀豆12之间的相似系数平均值67.81%；轮回亲本冀豆12传递给高蛋白种质的SSR位点数平均为161个，传递给低蛋白材料的SSR位点平均数为135个，二者相差27%。遗传效应分析结果表明，共发掘出位于14个连锁群上的22个与蛋白质含量相关的QTL及其连锁SSR标记，其中，18个QTL的蛋白质含量增效基因来自轮回亲本冀豆12。进一步分析显示，4个共性高蛋白染色体区段对高蛋白含量形成具有关键作用，分别位于C1连锁群（第4染色体）的75.52—80.62 cM、D2连锁群（第17染色体）的67.71—84.18 cM、G连锁群（第18染色体）的80.38—96.57 cM和I连锁群（第20染色体）的46.22—50.11 cM。通过基因功能注释和代谢途径分析，预测了4个区段内20个可能参与7-磷酸景天庚酮糖、半胱氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、色氨酸等氨基酸的合成与代谢等蛋白质合成相关代谢途径的候选基因。【结论】冀豆12含有较多的高蛋白QTL位点，供体亲本的高蛋白遗传位点可以在以冀豆12为轮回亲本的后代中表现出来，并通过SSR分析检测到。以冀豆12为轮回亲本，通过有限回交，易于创造出高蛋白种质。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

硅介导稻瘟病抗性的生理机理

葛少彬, 刘敏, 蔡昆争, 蔡一霞, 骆世明

中国农业科学. 2014, 47(2):  240-251.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.004

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【目的】稻瘟病是水稻生产主要的病害之一，每年造成严重的产量损失。研究表明，施用硅肥作为一种环境友好型病害防治措施，在增强植物抗病性中起重要作用，但其作用机理还不完全清楚。本文旨在探讨硅处理对水稻稻瘟病的抗性效应及生理作用机理，为稻瘟病的有效防治提供理论依据和实践指导。【方法】选用稻瘟病广谱感病品系CO39（不含已知抗稻瘟病基因）及其近等基因系C101LAC(Pi-1)（抗病品系）为试验材料，设置（1）不加硅不接种（Si-M-）、（2）加硅不接种（Si+M-）、（3）不加硅接种（Si-M+）和（4）加硅接种（Si+M+）等4个处理，通过光照培养箱控制生长条件，用Hoagland营养液进行水培试验，研究施硅对稻瘟病的控制效果，以及对水稻根系和叶片中硅、酚类物质、水杨酸、乙烯及H2O2含量的影响。【结果】施硅显著降低两个水稻品系的稻瘟病的发病率和病情指数。抗病品系C101LAC(Pi-1)的稻瘟病的发病率和病情指数明显低于感病品系CO39。施硅后，两个水稻品系的根、茎、叶中的硅含量都显著增加，地上部的硅含量明显高于根部。稻瘟病菌侵染条件下，加硅显著降低两个材料叶片中的总酚含量，对根系中的总酚含量没有显著影响。不接种稻瘟病菌情况下，加硅对第3天叶片中总酚含量没有显著影响，而显著降低了第7天叶片中的总酚含量，两个水稻品系表现一致。对两个品系水稻品种来说，根系中的总酚含量明显低于叶片中的总酚含量。稻瘟病菌侵染条件下，加硅显著降低两个材料叶片中的木质素含量，对根系中的木质素含量没有显著影响。不接种稻瘟病菌情况下，加硅显著增高了CO39叶片中的水杨酸含量，而对于C101LAC(Pi-1)，加硅只在第3天显著增高了叶片中的水杨酸含量。接种稻瘟病菌后，施硅使CO39在第3天叶片中的水杨酸含量显著增高，而对C101LAC(Pi-1)没有显著影响。在两个品系的根系中都没有检测到水杨酸。接种稻瘟病菌后，施硅显著降低了两个水稻材料叶片和根系中的乙烯含量。不接种稻瘟病菌情况下，叶片中乙烯含量极低，加硅显著降低了CO39第3天根系中乙烯含量，而对于C101LAC(Pi-1)，加硅后，第3天和第7天根系中乙烯含量都显著降低。加硅显著降低两个材料叶片中H2O2的含量，而显著增加了根系中H2O2含量。对两个品系水稻品种来说，根系中的H2O2含量明显低于叶片中的。【结论】施硅能显著增加水稻对稻瘟病的抗性，改变植株体内的生理代谢状况，调节植物体内酚类物质的含量，并通过诱导信号物质如水杨酸、乙烯、H2O2等的变化来提高水稻植株对稻瘟病的抗性。

低温胁迫下拟南芥表皮蜡质的响应机制

倪郁, 宋超, 王小清

中国农业科学. 2014, 47(2):  252-261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.005

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【目的】低温是影响作物产量和品质的主要环境因素之一，而表皮蜡质是植物抵御外界胁迫的第一层保护性屏障。研究低温胁迫对拟南芥表皮蜡质组分含量、结构及相关蜡质基因表达的影响，有助于进一步理解植物表皮蜡质与低温互作机制，从而对后续作物的抗性机制研究起指导作用。【方法】以野生型拟南芥与蜡质突变体cer1、cer3、cer4、cer6、cer10、cer20及kcs1为试验材料，待植株生长至5—6周时进行4℃胁迫处理10 d和18 d。利用扫描电子显微镜观察表皮蜡质晶体结构变化；利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析蜡质组成及含量变化；利用qRT-PCR技术检测蜡质基因CER1、CER3、CER4、KCS1、WIN1的表达。【结果】低温胁迫后，拟南芥蜡质晶体结构在分布密度、形状与大小方面发生了不同程度的变化。野生型拟南芥蜡质晶体熔融成片，大面积覆盖茎秆表面，这可能一定程度上起到了低温阻隔作用，并减少水分散失。cer1突变体表现出松针状晶体显著减少，并以小型树枝状结构为主；cer3与cer10杆状晶体显著减少；而cer6与cer20蜡质晶体在低温胁迫后有所增加；kcs1蜡质晶体在低温胁迫后垂直杆状结构显著减少，水平杆状结构出现，并伴有蜡质晶体熔融现象。低温胁迫对一级醇减少突变体cer4结构无显著影响。GC-MS分析结果表明，拟南芥野生型与各突变体在低温胁迫下表皮蜡质组分含量也发生了不同程度的变化。野生型中醛类与酮类含量显著减少、一级醇类含量显著增加。各突变体则表现出相反的变化，蜡质组分中醛类、酮类含量增加或无显著变化、一级醇含量减少或无显著变化；受低温胁迫较重的cer3﹑cer10表皮蜡质中一级醇含量显著下降。拟南芥表皮蜡质在低温胁迫下显著积累（cer3 无显著变化、cer10 蜡质总量减少），且主要通过增加烷类与次级醇含量来增加蜡质总量。低温胁迫诱导了野生型CER1 基因的强势表达，植株通过上调CER1 的表达促进烷类物质的合成以响应低温胁迫；CER4 的表达上调促进了一级醇的合成。KCS1、CER3与WIN1在低温胁迫下表达下调，暗示了植株蜡质总量的增加主要是通过蜡质合成的下游途径如烷合成途径增加。【结论】低温胁迫可以改变表皮蜡质晶体结构及组分含量，蜡质组分中烷类与次级醇类含量的上升是响应低温胁迫的主要方式，蜡质总量的增加主要来自于烷类的增加。CER1是响应低温胁迫的主要蜡质基因。

植物保护

内生芽孢杆菌BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因与定殖相关性

范晓静1, 杨瑞先1, 2, 邱思鑫3, 胡方平1

中国农业科学. 2014, 47(2):  262-272.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.006

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【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因（β-1,4-endoglucanase gene，eglS），探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物，以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接，并对连接产物进行PCR扩增，得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段，与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力，同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带，而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带，成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示，野生菌BS2只有一个水解圈且透明，过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈，内圈的水解圈透明，外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异，过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高，分别是野生菌的111和82倍；敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明，在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内，敲除突变体的定殖数量最少，其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异（P＜0.05）。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株（P＜0.05）。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P＜0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌，互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系，其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。

锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA克隆、序列分析及原核表达

付楠霞, 翟枫, 姜鸣, 吕淑敏, 张雅林

中国农业科学. 2014, 47(2):  273-283.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.007

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【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶，获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因（FPPS）是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础。论文旨在克隆锯角豆芫菁（Epicauta gorhami Marseul）FPPS，预测该基因及其编码蛋白的结构、性质与功能，并实现其编码蛋白的原核表达。【方法】首先根据已知昆虫FPPS编码蛋白的保守区序列，利用CODEHOP软件设计简并引物，利用RT-PCR获得锯角豆芫菁的cDNA模板，巢式PCR扩增锯角豆芫菁FPPS保守区；随后根据所得的保守区片段设计特异性引物，运用RACE技术分别克隆锯角豆芫菁FPPS 3′和5′端序列；然后根据预测的FPPS开放阅读框（ORF）设计ORF区特异性引物，巢式PCR扩增编码区序列；最后用DNAMAN拼接获得锯角豆芫菁的全长cDNA序列。运用DNAMAN、MEGA 5.05、ProtParam及TargetP 1.1 Server等多种生物信息学软件对该基因全长cDNA序列、Fps系统进化关系及其基本理化性质、FPPS蛋白的亚细胞定位等进行分析；将锯角豆芫菁FPPS与pET28a（+）连接，构建原核表达载体pET28a（+）-EgFPPS并将其转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中，IPTG诱导融合蛋白的原核表达。分别收集不同诱导时间段的菌液，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段收集的菌液超声波破碎后，分离上清及沉淀并进行煮沸处理，SDS-PAGE检测融合蛋白的可溶性；Western Blot印迹杂交验证目的蛋白的表达。【结果】获得锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全长cDNA序列，命名为EgFPPS （GenBank登录号KC840040），序列分析结果表明，该基因全长1 857 bp，其中5′非编码区146 bp，3′非编码区436 bp，开放阅读框1 275 bp，共编码424个氨基酸，其编码的蛋白分子质量约为49.2 kD，理论等电点pI为8.89，预测分子式为C2192H3457N605O632S25，不稳定系数为38.62，总平均亲水系数为-0.429，为疏水的稳定蛋白。序列分析发现，锯角豆芫菁与其他6种昆虫FPPS在氨基酸水平上具有72.56%的同源性，且其近N端具有R**S四肽基序，此外还包含7个异戊烯基转移酶保守区和两个典型的DD**D的天冬氨酸富含区。系统发育树显示锯角豆芫菁与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗进化关系最近。EgFPPS的亚细胞定位进行预测发现其N端具有一段明显的线粒体靶向肽。原核表达结果表明，该蛋白在终浓度为1 mmol•L-1的IPTG诱导4 h即能实现融合蛋白的高效表达；融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在；Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌DE3中表达了一个分子量约为49 kD的蛋白质，与预测分子量大小基本一致。【结论】成功从芫菁科昆虫克隆得到FPPS，并成功实现了其编码蛋白的原核表达，为后期探索其在芫菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径中的功能提供理论基础。

巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

王婧, 毕阳, 朱艳, 韩舜愈, 祝霞, 盛文军, 李敏

中国农业科学. 2014, 47(2):  284-291.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.008

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【目的】建立nested-PCR方法，快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac），为西瓜细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon，WFB）的防控提供技术支持。【方法】 根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2，建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物，BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR，以5 µL样品处理液于99℃高温裂解10 min，再放置冰上冷却5 min，以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增，采用50 μL反应体系：5 μL 10×PCR buffer（25 mmol?L-1 MgCl2），4 μL dNTP （D4030RA，2.5 mmol?L-1），引物（5 μmol?L-1）各3 μL，0.4 μL Taq DNA酶（DR001B，5 U?μL-1），通过退火温度优化，反应条件为：引物BX-L1/BX-R5各3 μL进行第一轮扩增，95℃，2 min；95℃，30 s；65℃，45s；72℃，1 min；35个循环；72℃，延伸7 min；取扩增后的产物1 μL为模板，以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增，95℃，2 min；95℃，30 s，66℃，45 s，72℃，1 min，30个循环，72℃，7 min。在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验，对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测。【结果】引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段，并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae）、魔芋假单胞菌（A. avenae subsp. konjaci）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以BX-L1/BX-R5为外侧引物，BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR，对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101 cfu/mL，比direct-PCR灵敏度高出1 000倍。当西瓜种子带菌率在0.1%—0.5%时，nested-PCR阳性检测率为66.7%；当种子带菌率为1%—10%时，nested-PCR的阳性检测率为83%—100%。【结论】以BX-L1/BX-R5为外侧引物，BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法，能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子，检测结果重现性高。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

稻田不同供钾能力条件下秸秆还田替代钾肥效果

李继福1, 鲁剑巍1, 任涛1, 丛日环1, 李小坤1, 周鹂1, 杨文兵2, 戴志刚2

中国农业科学. 2014, 47(2):  292-302.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.009

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【目的】研究稻田不同土壤供钾能力条件下，秸秆还田配施钾肥对水稻产量、地上部钾素累积量以及钾肥利用率的影响，为秸秆还田水稻钾肥合理施用提供科学依据。【方法】2011—2012年在鄂中、江汉平原和鄂东地区的10个县（市）选择不同供钾水平田块布置水稻试验。根据湖北省第二次土壤普查制定的速效钾分级标准，本文将土壤速效钾含量＞150 mg•kg-1的试验点如钟祥和宜城归为高钾供应能力土壤（1级水平），简称为高钾土壤，标记为High-K；土壤速效钾含量100—150 mg•kg-1的试验点如团风、仙桃、洪湖和枝江归为中钾供应能力土壤（2级水平），简称为中钾土壤，标记为Middle-K；土壤速效钾含量＜100 mg•kg-1的试验点如麻城、广水、鄂州和蕲春归为低钾土壤，标记为Low-K。试验共设6个处理，分别为：（1）CK（-K）；（2）+K；（3）+S；（4）S+1/3K；（5）S+2/3K；（6）S+K，其中K和S分别表示钾肥和还田秸秆，以此来考查当前推荐钾肥用量（K2O 75 kg•hm-2）对水稻的增产效果以及轮作模式下麦秆或油菜秸秆还田钾素对钾肥的替代作用。【结果】结果显示CK处理（-K），高钾、中钾和低钾土壤的稻谷产量分别为8 372、8 710和7 767 kg•hm-2，施钾和秸秆还田均可以不同程度地增加水稻产量和地上部钾素累积量。与CK相比，高钾、中钾和低钾土壤均以秸秆还田配施钾肥处理的增产效果最显著，增产量分别为633、1 098和814 kg•hm-2，增幅分别为7.7%、12.6%和12.5%；地上部钾素累积吸收增量分别为40.2、56.5和49.3 kg•hm-2，增幅分别为15.9%、21.3%和36.8%。在当前推荐钾肥用量条件下，秸秆还田会造成高钾土壤的钾肥吸收利用率下降，但可明显提高中钾和低钾土壤的钾肥吸收利用率；同时秸秆还田也会显著降低高钾土壤的钾肥农学利用率，但对中钾和低钾土壤的钾肥农学利用率没有明显影响。同钾肥利用率相比，钾素利用率均有所降低，但中钾土壤和低钾土壤的钾素利用率要显著高于高钾土壤的钾素利用率。通过对秸秆还田条件下钾肥用量与增产率、地上部钾素累积增幅的相关性分析得出高钾土壤和中钾土壤的推荐钾肥用量偏高。根据线性加平台肥效模型拟合得出，在秸秆还田条件下，高钾土壤田块（速效钾含量＞150 mg•kg-1）适宜钾肥用量平均为38.2 kg•hm-2，比推荐用量减少49.1%；中钾土壤田块（速效钾含量100—150 mg•kg-1）适宜钾肥用量平均为60.0 kg•hm-2，比推荐用量减少20.0%；而低钾土壤田块（速效钾含量＜100 mg•kg-1），增产效果显著，推荐钾肥用量不足。【结论】因此，短期秸秆还田条件下，高钾和中钾土壤田块，秸秆还田钾素可不同程度地替代部分化学钾肥施用；而低钾供应田块推荐用量略显不足，增施钾肥仍有较大的增产空间。

红壤稻田长期施用猪粪的生态效益及承载力评估

柳开楼, 李大明, 黄庆海, 余喜初, 叶会财, 徐小林, 胡惠文, 王赛莲

中国农业科学. 2014, 47(2):  303-313.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.010

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【目的】有机粪肥还田是实现废弃物资源循环利用的重要途径之一，大量研究证实，猪粪还田施用可以显著提高土壤肥力和作物产量，但是，由于饲料添加剂含有较高的Cu、Zn、As等重金属元素，再加上养猪业中饲料添加剂的广泛应用，猪粪长期还田也可能导致土壤中重金属元素大量累积，从而威胁土壤质量和粮食安全。因此，利用长期定位探讨和综合评价长期施用猪粪下红壤稻田的生态效益就显得十分重要。【方法】以始于1981年的红壤性水稻土有机肥定位试验为载体，分析了长期施用猪粪30年间红壤稻田的水稻产量和土壤有机碳含量影响，以期明确猪粪对水稻产量的增产幅度和对土壤有机碳的贡献潜力，同时分析不同猪粪施用年限（包括试验前、试验5年、16年、22年和30年）的土壤重金属Cu、Zn、Cr和As等含量变化，基于国家土壤质量二级标准（GB 15618—1995）的土壤重金属含量的临界值，利用本研究中土壤重金属的累积速率对红壤稻田施用猪粪的超标时间进行估算，并进一步探讨猪粪的安全用量。【结果】施用猪粪显著提高了水稻产量和土壤有机碳含量，与施化肥处理（NPK）相比，产量增加了10.3%—12.0%，土壤有机碳含量增加了18.8%—23.7%，但是猪粪施用对红壤稻田的酸化阻控作用较小。在试验30年后，分别在早稻和晚稻施用猪粪的处理（OM1和OM2）的土壤pH值与未施肥对照无显著差异。此外，施用猪粪的土壤Cu、Zn、Cr和As含量亦显著增加，与施用化肥处理相比，OM1和OM2的Cu、Zn、Cr和As含量分别增加了72.0%—82.6%、29.1%—55.2%、194.8%—262.6%和90.5%—192.7%，但是未超过国家土壤环境质量二级标准（GB15618-1995）。按照现行猪粪施用量（22.5 t•hm-2•a-1）推算，土壤Cu、Zn、Cr和As含量确保安全水平的施用时间分别还有22、67、44和14年。若确保连续施用猪粪50年土壤Cu、Zn、Cr和As含量不超标，则红壤稻田每公顷最多猪粪施用量应不超过6.40 t•hm-2•a-1。【结论】在红壤稻田上，猪粪长期还田虽然能够显著提高稻米产量和土壤肥力（尤其是土壤有机碳含量），但也同时导致土壤Cu、Zn、Cr和As含量大幅增加，从而可能引起土壤出现重金属污染风险，进而威胁稻米质量和人类安全。因此，权衡稻田长期施用猪粪对作物产量、土壤肥力和重金属累积的生态效益，确定土壤对猪粪的最大环境承载力将为科学合理的利用猪粪以实现区域农业的可持续发展提供依据。

控释肥和添加剂对双季稻温室气体排放影响和减排评价

王斌, 李玉娥, 万运帆, 秦晓波, 高清竹

中国农业科学. 2014, 47(2):  314-323.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.011

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【目的】稻田生态系统的温室气体排放一直是气候变化领域的研究热点，对发展低碳农业和缓解全球变暖具有重要意义。研究控释肥和添加剂对双季稻（Oryza sative L）温室气体排放和产量的影响，旨在综合评价其减排效果，筛选既能保证产量又能有效减排的施肥措施。【方法】以华中江汉平原地区双季稻为研究对象，设置6种不同控释肥或添加剂处理，包括①习惯施肥作为对照，②硫包膜控释尿素，③树脂包膜控释尿素，④缓释碧晶尿素，⑤尿素中加入质量分数1%的硝化抑制剂二甲基吡唑磷酸盐（DMPP），⑥施肥时泼洒与尿素等量的1：200倍稀释有效微生物菌剂培养液（EM菌剂），采用自动静态箱-气相色谱法对温室气体排放通量进行长期连续监测，同步观测土壤无机氮素和产量，得出不同施肥处理的温室气体（CH4和N2O）排放特征，由内插加权法求得排放总量，最终计算出综合温室效应和排放强度。【结果】不同施肥处理下CH4和N2O排放通量具有较为明显的季节变化规律。早稻CH4排放总量以树脂包膜控释尿素最低，晚稻以碧晶尿素最低；而早稻和晚稻N2O排放总量均以硝化抑制剂DMPP最低。综合两个季节，各施肥处理的综合温室效应（以CO2当量100年算）差异显著（P＜0.05），其中常规施肥＞硫包膜控释尿素＞硝化抑制剂DMPP＞EM菌剂＞碧晶尿素＞树脂包膜控释尿素；控释肥和添加剂处理对比常规均有不同程度的减排效果，其中树脂包膜控释尿素减排效果最高为56.2%，碧晶尿素次之为45.6%，且晚稻减排效果明显高于早稻。早稻控释肥和添加剂处理产量与常规施肥差异不显著，晚稻则存在显著增产，增产幅度为13.5%—16.2%。各处理的温室气体排放强度GHGI以树脂包膜控释尿素最低，与常规施肥差异极显著（P＜0.01）。【结论】双季稻不同施肥处理CH4和N2O的排放总量差异显著，控释肥和添加剂处理均能达到不同程度的减排。控释肥和添加剂处理对早稻增产效果差异不显著，对晚稻增产效果差异显著，减排效果也高于早稻。综合考虑经济效益和减排效果，可得出在当前的稻田管理条件下施用包膜控释肥、抑制剂和生物菌剂，能保证产量并有效降低温室气体排放，是水稻低碳高产可行的施肥措施。

产芽孢木质素降解菌MN-8的筛选及其对木质素的降解

李红亚, 李术娜, 王树香, 王全, 朱宝成

中国农业科学. 2014, 47(2):  324-333.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.012

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【目的】分离、筛选产芽孢的高效木质素降解细菌，并进一步研究其对木质素的降解作用，为木质素微生物降解规模化应用提供理论依据。【方法】采用苯胺蓝（Azure-B）变色圈法，结合木质素降解酶活力测定从牛粪中分离筛选出产芽孢的木质素降解菌。通过形态特征观察、生理生化试验、16S rDNA以及gyrB序列分析对其中活性最强的菌株进行种属鉴定。利用菌株进行玉米秸秆堆积发酵，监测发酵过程中木质素过氧化物酶（LiP）酶活力、锰过氧化酶（MnP）酶活力以及玉米秸秆中木质素含量的变化，考察菌株对玉米秸秆木质素的降解作用。利用气相色谱-质谱联用（GC/MS）方法对菌株发酵后玉米秸秆中的木质素降解产物进行分析，推测菌株对木质素的降解机制。【结果】分离筛选到一株活性较高的产芽孢的木质素降解细菌MN-8，经形态特征观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析，鉴定菌株MN-8属于芽孢杆菌属（Bacillus）。利用16S rDNA序列分析发现MN-8菌株与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）同源性均高于99%。而基于gyrB序列构建的系统发育树显示，该菌株与解淀粉芽孢杆菌同源性最高，为99%。因此确定MN-8菌株为解淀粉芽孢杆菌。在玉米秸秆堆积发酵16 d后木质素降解率可达24%；发酵的6—8 d及10—12 d 两个阶段内，分别出现MnP酶活力及LiP的产酶高峰期，相对应两个阶段内秸秆木质素的降解最为显著；GC/MS分析显示菌株MN-8可将玉米秸秆中木质素降解成4-羟基-3,5二甲氧基苯乙酮等芳香族类化合物及短链脂肪酸类等小分子物质。【结论】高效木质素降解菌解淀粉芽孢杆菌MN-8可以通过断裂木质素单体之间的连接键β-O-4，高效降解秸秆木质素成为小分子芳香族化合物等物质，且其对秸秆木质素的降解依赖于LiP及MnP的产生。

园艺

野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究

曾继吾, 姜波, 吴波, 钟云, 程春振, 母红娜, 甘廉生, 彭成绩, 钟广炎, 易干军

中国农业科学. 2014, 47(2):  334-343.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.013

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【目的】广东省龙门县境内南昆山主峰天堂顶海拔1 000 m处有当地称之为‘龙门香橙’的野生柑橘，论文拟从形态学和DNA分子证据上探讨其与已知柑橘资源的异同，为合理利用该资源奠定基础。【方法】实地调查‘龙门香橙’的生长环境，观察记录叶、花、果实的形态特征。分析果实的可溶性固形物、糖、酸和抗坏血酸含量。在电子显微镜下观察花粉的显微特征。对比分析包括‘龙门香橙’在内的24个柑橘资源的AFLP图谱以及10个资源的8个SNP位点的基因型。克隆、测序分析‘龙门香橙’的β-胡萝卜素羟化酶（β-carotene hydroxylase，CHX）基因的2个等位基因，并与其他柑橘材料的CHX基因序列进行比对。【结果】生境调查结果表明‘龙门香橙’非人工种植，是真正的野生柑橘。其果实、种子的形状和单胚等特征与柚类相似，但果实与柚相比明显偏小、出汁率与可食率很低、味苦等性状提示其比较原始。叶片形状、线形翼叶、花丝联合等特征类似宽皮柑橘类，比较进化；但花丝和新叶染有紫红色等性状则比较原始。基于AFLP图谱的聚类分析显示其不与其他研究材料聚类，但介乎橘柚之间。8个SNP分子标记分析结果显示，‘龙门香橙’的3个SNP位点为宽皮柑橘纯合基因型，1个位点为橘柚杂合基因型，其余4个位点为柚子纯合基因型，这种基因型组合不同于其他任何所分析的材料。‘龙门香橙’的CHX基因的核苷酸序列显示其2个等位基因间相互差异较小，且含有其他已知柑橘CHX基因上未发现的SNP。CHX基因序列进化分析结果表明其与其他柑橘的遗传距离较远、差异似达种间水平。【结论】‘龙门香橙’是一个真正的野生柑橘资源。其形态性状兼具原始与进化特征。在DNA分子水平上，‘龙门香橙’与已知柑橘不同，甚为独特。

核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

安海山1, 杨克强1, 2

中国农业科学. 2014, 47(2):  344-356.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.014

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【目的】利用同源序列法分离核桃的NBS（Nucleotide binding site）类抗病基因类似物，为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。【方法】以35个核桃优系为试材，利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性；根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物，以核桃优系的基因组DNA为模板，通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段，并分析所得NBS类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的关系；利用BLASTN/X程序对所得NBS序列在GenBank数据库中进行同源性搜索；利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究。【结果】35个供试核桃优系中，有20个优系为抗炭疽病类型（R），其相对抗性指数在0.63—0.82；有5个优系为中抗类型（M），相对抗性指数在0.27—0.56；有10个为感病类型（S），相对抗性指数在0.00—0.21。PCR结果显示，从20个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20条NBS类抗病基因类似序列；而在其它15个优系（5个中抗优系和10个感病优系）中未扩增到条带，表明核桃NBS序列与炭疽病抗性相关联。BLASTN显示，所得NBS序列在核苷酸水平与GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89%—100%同源性，与其它物种NBS序列的同源性在69%以上；BLASTX显示，所得NBS序列与已知核桃NBS抗病蛋白同源性为77%—99%，与其它物种的NBS抗病蛋白同源性在49%—66%。氨基酸序列多重比对分析表明，所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域，如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等，在典型功能域的核苷酸多态性（Pi）明显低于非保守区，有较高保守性。系统发育分析表明，在核苷酸水平上可将所得核桃优系的NBS序列区分为7类，在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR两大类7个亚类；所得核桃NBS序列非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS在0.00—0.95，为纯化选择。氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS亚类间的相似度为28.3%—63.5%，与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0%—48.5%。【结论】核桃NBS类抗病基因类似物与炭疽病抗性相关联，NBS序列与其他物种抗病基因有较高同源性，包含抗病基因保守的功能域，在进化上为纯化选择。

加工番茄品种多性状综合评价方法研究

韩泽群, 姜波

中国农业科学. 2014, 47(2):  357-365.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.015

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【目的】确定加工番茄品种多性状评价指标，建立加工番茄农艺性状的综合评价体系，为鉴定、筛选其优良种质资源提供决策支持。【方法】通过2012年新疆某试验田的22种（系）加工番茄的品比试验,分析、测定22个加工番茄品种（系）的单果重（FW）、平均产量（AY）、番茄红素(L)、可溶性固形物(TSS)、总酸(TA)、总糖(TS)、糖酸比(SAR)、病毒病抗性(VDR)、纵径(VD)、横径(TD)、果形指数(FSI)、色差（CR）、单果耐压力(SFRP)、平均株距宽（ASW）、平均株高（APH）、平均分枝数(ANB)、生育期（GP）17项农艺性状，并联合使用主成分分析和聚类分析(PCA-CA) 经Matlab.2012a软件编程实现对样本数据的处理，并对加工番茄主要农艺性状进行综合分析。【结果】17项农艺性状的平均变异系数为18.54%，病毒病抗性的变异系数最大，为88.42%；色差的变异系数最小，仅为7.33%，加工番茄评价指标变量之间既相对独立又密切相关。运用主成分分析法，将17个评价指标变量压缩成6个综合指标（前6个主成分累计贡献率达86.0369%，已反映出17项性状指标的大部分信息），经分析6个主成分的函数式中对应的17项农艺性状系数值可将17项农艺性状归纳为果实性状因子、果实内在品质因子、果实外观品质因子、产量因子、抗病因子这5个主要指标，这5个指标可以较准确的评价番茄品种。其中，单果耐压力、单果重、总酸、番茄红素、纵径、横径、平均产量、病毒病抗性8个性状是主要性状。通过采用类平均法对22个不同番茄品种进行Q型聚类分析，在欧式距离为6.40时将所有番茄品种划分为3个类群。【结论】采用多元统计分析方法中的主成分分析和聚类分析对22个加工番茄品种（系）的17项农艺性状建立加工番茄综合评价体系是可行的，可从不同的视角给予较全面、客观的评价与分析，为加工番茄优质品种的选育提供参考依据。

秸秆和生物质炭对苹果园土壤容重、阳离子 交换量和氮素利用的影响

葛顺峰, 彭玲, 任饴华, 姜远茂

中国农业科学. 2014, 47(2):  366-373.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.016

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【目的】中国苹果园土壤有机碳含量较低，氮肥施用量偏高。本研究为苹果生产上合理应用秸秆和生物质炭来提高土壤缓冲性能和氮肥利用效率提供依据。【方法】以两年生富士/平邑甜茶为试材，采用15N标记示踪技术，研究添加秸秆和生物质炭对土壤容重、阳离子交换量、植株生长及氮素转化（树体吸收、氨挥发、N2O排放和土壤残留）的影响。试验共设4个处理：对照（CK）、单施氮肥（N）、施用氮肥并添加生物质炭（N+B）和施用氮肥并添加秸秆(N+S)。【结果】不同处理的土壤容重在0—5 cm和5—10 cm两个土层中的变化趋势一致。CK与N处理间差异不显著，但均显著高于N+B和N+S处理；两个添加外源碳的处理间，N+B处理的土壤容重显著低于N+S处理。与N处理相比，N+S和N+B处理的0—5 cm和5—10 cm两个土层的容重分别降低了0.06、0.09 g•cm-3和0.07、0.11 g•cm-3。与CK（18.32 cmol•kg-1）和N（19.61 cmol•kg-1）处理相比，N+S（22.27 cmol•kg-1）和N+B处理（25.35 cmol•kg-1）显著提高了0—10 cm土层土壤阳离子交换量，并且以N+B处理效果较好。3个施氮处理间植株总干重、15N积累量和15N利用率均以N+B处理最高，N+S处理次之，N处理最低。与CK相比，3个施氮处理（N、N+S和N+B处理）的氨挥发量均显著增加。与N处理相比，添加外源碳的两个处理（N+S和N+B处理）显著减少了氨挥发损失量，以N+B处理减少幅度最大。与CK相比，3个施N处理（N、N+S和N+B处理）的N2O排放量均显著增加，以N+B处理最高，其次为N+S处理，N处理最低，可见添加外源碳的两个处理的N2O排放量均有所增加，但3个施氮处理间差异不显著。去掉CK本底值后，N、N+S和N+B处理的氮素总气态损失量（氨挥发+N2O排放）占施氮量的比例分别为6.54%、4.33%和3.04%。可见，添加秸秆和生物质炭显著降低了氮素气态损失，以N+B处理效果较好。耕层土壤（0—50 cm）的15N残留量以N+B处理最高，N+S处理次之，N处理最低；而深层土壤（50—100 cm）则以N处理最高，N+S处理次之，N+B处理最低。3个施氮处理间，N回收率（树体吸收+土壤残留）以N+B处理最高，为42.26%，其次为N+S处理（37.22%），N处理最低（31.54%）；N损失率以N处理最高，为68.46%。其次为N+S处理（62.78%），N+B处理最低（57.74%）。【结论】添加秸秆和生物质炭显著降低了土壤容重，提高了土壤阳离子交换量，促进了苹果植株生长和对肥料氮的吸收，增加了土壤对氮的固定，减少了氮肥的气态损失，提高了氮肥利用率，其中以添加生物质炭的效果较好。

贮藏·保鲜·加工

富硒米糠蛋白的优化制备及其蛋白营养复配研究

胡秋辉1, 2, 陈曦1, 方勇1, 2, 陈悦1, 杨文建1, 马宁1, 赵立艳2

中国农业科学. 2014, 47(2):  374-382.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.017

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【目的】优化碱法提取富硒米糠蛋白的条件，根据蛋白质互补作用原理，研究并评价富硒米糠蛋白（RBP）的营养复配。【方法】碱法提取富硒米糠蛋白，按正交试验L9(34)优化富硒米糠蛋白的提取条件。将富硒米糠蛋白与大豆分离蛋白（SP）按比例60%、70%、80%、90%和100%进行复配，用凯氏定氮法、氢化物原子荧光光谱法和便携式色差仪分别测定富硒米糠蛋白和复配蛋白中的蛋白质含量、硒含量和色差值。利用高速氨基酸分析仪测定各蛋白产品的氨基酸含量，并根据必需氨基酸参考模式（WHO/ FAO）和氨基酸比值系数法，对各蛋白产品进行营养价值评价，得出营养价值最高的复配蛋白。【结果】通过正交试验考察富硒米糠蛋白的提取率、硒含量和富硒米糠蛋白的色差值，获得富硒米糠蛋白最佳提取条件为：料液比1﹕20、NaOH 浓度0.08 mol•L-1、温度30℃和时间3 h，富硒米糠蛋白纯度为（80.2±1.1）%，硒含量为（0.269±0.132）mg•kg-1，蛋白色差值为69.7±1.2，将此最优条件下提取出的富硒米糠与普通米糠蛋白产品的蛋白质和硒含量分别进行比较，结果表明，富硒米糠与普通米糠的蛋白质含量、富硒米糠蛋白与普通米糠蛋白的蛋白质含量都无显著性差异（P<0.01），而富硒米糠的硒含量为（0.401±0.021）mg•kg-1，显著高于普通米糠硒含量（0.023±0.010）mg•kg-1（P<0.01），同时富硒米糠蛋白的硒含量为（0.269±0.132）mg•kg-1，也显著高于普通米糠蛋白硒含量（0.052±0.011）mg•kg-1（P<0.01）。将富硒米糠蛋白与大豆分离蛋白（SP）按照不同比例进行营养复配，比较不同复配蛋白产品的蛋白纯度和硒含量，得出富硒米糠蛋白和各复配蛋白的硒含量均显著高于大豆分离蛋白硒含量（0.013±0.005）mg•kg-1，不同配比的复配蛋白硒含量随富硒米糠蛋白含量增加从（0.141±0.014）mg•kg-1增加至（0.269±0.032）mg•kg-1。根据必需氨基酸参考模式，采用氨基酸比值系数法评价各蛋白产品营养价值，根据比值系数分（SRC）富硒米糠蛋白和各复配蛋白的营养价值按高低顺序排列如下：60% RBP > 70% RBP > 50% RBP > 80% RBP > 90% RBP > RBP，结果表明，各复配蛋白SRC值均高于RPB的SRC值64.1，由此证明各复配蛋白营养价值均高于RBP，其中含60%富硒米糠蛋白的复配蛋白具有最高的营养价值,且其硒含量为（0.167±0.024）mg•kg-1,蛋白纯度为（84.1±0.8）%。【结论】将大豆蛋白与富硒米糠蛋白进行复配可提高蛋白的营养价值，获得一种含丰富微量元素硒的高品质蛋白。

油菜籽饼粕中硫苷的酶解条件优化及降解产物分析

丁艳1, 李丽倩1, 曹蓉2, 唐根胜2, 顾振新1, 韩永斌1

中国农业科学. 2014, 47(2):  383-393.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.018

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【目的】研究影响油菜籽饼粕中硫代葡萄糖苷在黑芥子酶作用下定向转化为异硫氰酸酯的因素，确定最佳酶解条件，探索外加黑芥子酶对硫代葡萄糖苷降解产物组分和含量的影响，为油菜籽饼粕的综合利用提供基础。【方法】测定4种反应体系中黑芥子酶活性，确定酶解反应缓冲体系。以油菜籽饼粕中异硫氰酸酯总量为指标，单因素结合正交设计研究不同料液比、时间、温度、pH、抗坏血酸添加量对外加黑芥子酶降解油菜籽饼粕中硫代葡萄糖苷转化为异硫氰酸酯的影响，优化工艺参数，获得最佳酶解条件。采用二氯甲烷为提取剂，真空浓缩得到油状降解产物，利用气相色谱-质谱（GC-MS）联用鉴定外加黑芥子酶和内源黑芥子酶酶解产物成分，分析产物相对含量。【结果】4种缓冲体系中，在柠檬酸-磷酸盐缓冲液中测得黑芥子酶活性最高，在相同条件下，外加黑芥子酶的活性显著高于内源黑芥子酶活性；外源黑芥子酶添加量大于油菜籽饼粕量的20%，异硫氰酸酯生成量无显著增加，选择外源黑芥子酶添加量为油菜籽饼粕量的20%；正交优化得到最佳酶解条件为：料液比1﹕15，pH为6.0，反应温度为50℃，抗坏血酸添加量为0.005 mg•g-1，反应时间为1 h，异硫氰酸酯含量达到1.799 mg•g-1，是油菜籽饼粕内源黑芥子酶降解硫代葡萄糖苷生成异硫氰酸酯产物总量的7.6倍。外加黑芥子酶生成异硫氰酸酯含量显著高于内源黑芥子酶降解硫苷生成异硫氰酸酯含量，但两者异硫氰酸酯含量随反应条件变化趋势一致。GC-MS鉴定外加黑芥子酶有7种酶解产物，相对含量在产物的67%以上，含有1种腈类，2种噁唑烷酮和4种异硫氰酸酯。产物中异硫氰酸酯为烯丙基异硫氰酸酯、丁烯基异硫氰酸酯、环戊基异硫氰酸酯和苯乙基异硫氰酸酯；其中丁烯基异硫氰酸酯的含量最高，占酶解产物总量的26.77%。腈类产物为苯丙腈；2种噁唑烷酮为致甲状腺肿素和2,1-苯丙噁唑烷酮。内源黑芥子酶降解硫代葡萄糖苷的产物中检测到4种产物且含量相对较少。【结论】外加黑芥子酶能有效增加油菜籽饼粕中异硫氰酸酯生成量，确定了油菜籽饼粕中硫代葡萄糖苷的最佳降解条件。鉴定出降解产物的主要成分，异硫氰酸酯有4种，其中丁烯基异硫氰酸酯含量最高。

畜牧·兽医·资源昆虫

水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达

邓彦飞, 刘庆友, 邓海莹, 罗婵, 杨素芳, 石德顺

中国农业科学. 2014, 47(2):  394-402.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.019

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【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子，在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体，并在水牛体细胞中表达，为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用，以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA，将RNA反转录成第1链cDNA，参照牛基因序列（Oct4：NM_174580，Nanog：NM_001025344）设计特异性引物，采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列（the coding sequences，CDS）和DNA全长序列，其中Oct4全长DNA分3段扩增，Nanog全长DNA分2段扩增；利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对；采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切，T4连接酶，将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上，构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog；采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts，BFFs），逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs，感染12—15h后，继续培养48 h；通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp，编码361个氨基酸，DNA全长4 509 bp，包括5个外显子和4个内含子；Nanog CDS全长903 bp，编码301个氨基酸，DNA全长4 473 bp，包括4个外显子和3个内含子；将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank，分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004；Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%，Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%；Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似，分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域；成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog；逆转录病毒系统pMX介导的Oct4和Nanog基因能转入BFFs中，在mRNA水平和蛋白水平都表达，阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4和Nanog的DNA序列全长和CDS，其基因序列和氨基酸序列在物种间高度保守；逆转录病毒转基因方法将Oct4和Nanog基因成功地转入BFFs并表达。逆转录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛iPSC生产。

C型尿钠肽在动物卵巢表达及对生殖机能影响的研究进展

贾振伟

中国农业科学. 2014, 47(2):  403-410.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.020

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C型尿钠肽（C-type natriuretic peptide, Cnp）为尿钠肽家族成员之一，广泛分布于动物大脑、肾脏、心脏及血管等组织，具有维持心血管系统功能稳态、调控细胞增殖及促进骨骼生长等功能。普遍认为哺乳动物有3种钠尿肽受体(Natriuretic peptide receptor, NPR) ：NPR1，NPR2和NPR3。Cnp主要通过结合NPR2受体激活下游信号通路，发挥生物学作用。Cnp信号传导通路的组成成分主要包括：配体（Cnp）、跨膜受体（NPR2）及cGMP等。当Cnp分子与跨膜受体NPR2结合后，使受体的激酶同型区域（kinase homology domain, KHD）构象发生变化，进而激活鸟苷酸环化酶，将GTP转化为cGMP后激活下游信号通路。目前，许多研究表明Cnp及受体在雌性动物卵巢上表达模式相似，Cnp主要在卵泡壁层颗粒细胞上表达，NPR2受体主要在卵丘颗粒细胞上表达。另外，动物体内卵泡生长期间，Cnp和受体Npr2表达受激素调控，FSH通过雌激素介导促进卵泡颗粒细胞Cnp和受体Npr2表达；同时卵母细胞通过分泌卵母细胞分泌因子促进了颗粒细胞Npr2表达。LH可能通过表皮生长因子信号通路降低卵泡颗粒细胞Cnp和受体Npr2表达。值得注意的是，研究表明Cnp与FSH功能类似能够促进动物卵泡发育，有利于卵丘颗粒细胞的形成，并能诱导一些与卵泡成熟和类固醇合成相关的颗粒细胞基因表达，揭示卵泡颗粒细胞分泌的Cnp与FSH具有类似的功能，作用于颗粒细胞上的受体分别经由cGMP和cAMP的信号通路影响颗粒细胞基因表达，刺激卵泡生长，促进卵母细胞成熟。另外，近年研究揭示Cnp是动物体内维持卵母细胞减数分裂阻滞的关键物质，卵泡壁层颗粒细胞分泌的Cnp，作用于卵丘颗粒细胞上的受体NPR2，激活鸟甘酸环化酶后将cGTP转化为cGMP，cGMP进入卵母细胞后抑制磷酸二酯酶phosphodiesterase, PDE)的活性，维持卵母细胞内高水平的cAMP，卵母细胞内高水平的cAMP通过激活蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）使成熟促进因子（maturation promoting factor, MPF）的催化亚基磷酸化，进而抑制MPF的活性、维持减数分裂阻滞，但对裸卵没有影响，说明Cnp通过作用卵丘颗粒细胞间接影响卵母细胞减数分裂成熟。此外，研究表明Cnp体外前处理卵丘卵母细胞复合体，有利于卵母细胞胞质成熟，提高了成熟受精后的发育能力。综上，动物体内卵泡生长期间，卵巢内产生的Cnp可能通过影响颗粒细胞的正常功能，在维持卵母细胞减数分裂阻滞的同时促进胞质成熟，保证成熟受精后具有较高的发育能力。基于此，Cnp在用作生理性的减数分裂阻滞剂增强家畜卵母细胞体外发育方面将具有重要的应用前景。因此，论文综述了Cnp结构、信号转导通路、在动物卵巢上表达及对卵巢生殖机能的影响。