中国农业科学

玉米Glyco-hydro-16糖苷酶家族全基因组的鉴定及其遗传分化

林峰，葛敏，周玲，赵涵

中国农业科学. 2016, 49(11): 2039-2048. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.001

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【目的】全基因组水平鉴定玉米Glyco-hydro-16家族，分析该家族基因在不同组织中的表达模式以及在不同玉米杂种优势群中的遗传分化。【方法】根据Glyco-hydro-16家族相对保守的序列及结构域，构建Glyco-hydro-16家族的隐马尔科夫模型文件（Glyco-hydro-16.hmm），利用hmmersearch程序在玉米全基因组中进行比对，获得玉米中含有该家族保守结构域的所有序列。通过Blast2GO进行功能注释，利用蛋白质序列构建该家族的系统发育进化树。使用玉米自交系B73不同组织及不同发育时期的RNA-seq数据库分析该家族基因的表达模式。根据该家族基因在染色体上的位置筛选SNP标记，计算其在不同玉米杂种优势群间的群间遗传分化系数（genetic differentiation coefficient，Fst），分析其遗传分化。【结果】根据该家族相对保守的序列及结构域，在全基因组水平共鉴定出34个玉米Glyco-hydro-16家族成员，注释表明所有基因都是木葡聚糖转移酶/水解酶基因，3个保守性较高的Motif区段存在于该家族所有成员中。通过系统发育关系和序列相似性将该家族分为8个亚家族，每个亚家族有2—8个基因，分布在除第3和第6染色体外的其他8条染色体上，在第2、第5及第10染色体上成簇分布。该家族在禾本科作物中同源性较高，与拟南芥分属不同的分支，但只有3个玉米成员（AC210669.3、GRMZM2G413006和GRMZM2G166944）被划分到禾本科分支中，其他玉米成员被划分到单独的分支中。通过表达谱分析表明该家族成员在玉米中均有表达，但在不同组织中的表达水平有差异。为解析该家族基因在不同玉米种质资源中等位基因的变异，根据玉米Glyco-hydro-16家族基因在染色体上的位置筛选SNP标记，计算其在玉米杂种优势群SS及NSS间的群间遗传分化系数。结果显示，共有10个该家族基因所处位点的Fst值高于阈值0.15，达到高度分化水平，分别位于第1、第2、第4、第5、第7以及第9染色体上。其中，位于第2染色体上的GRMZM2G091118相应位点的Fst值为0.52，表明该位点在SS群和NSS群间的群间遗传分化度极大。【结论】通过全基因组扫描在玉米中鉴定出34个Glyco-hydro-16家族成员，均为木葡聚糖转移酶/水解酶基因，在不同组织中，其表达模式不同，可能参与不同生理发育过程。部分该家族成员所处位点在玉米杂种优势群SS和NSS间的等位基因分化极大。

苦荞产区种质资源遗传多样性和遗传结构分析

屈洋，周瑜，王钊，王鹏科，高金锋，高小丽，冯佰利

中国农业科学. 2016, 49(11): 2049-2062. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.002

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【目的】了解苦荞产区种质资源遗传多样性和遗传结构，为苦荞资源的有效利用提供参考。【方法】采用相关性分析、主成分分析方法对苦荞8个植株性状进行分析；温室内培养苦荞资源，于3叶期，每个资源选取10株新鲜叶片，采用CTAB方法提取苦荞基因组DNA，结合SSR分子标记方法进行PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳检测并照相保存，根据SSR检测位点构建[0，1] 矩阵，最后利用PowerMarker3.25和Structure2.3.4软件对83份苦荞种质资源进行遗传多样性和群体遗传结构分析。【结果】8个植株性状分布较分散，大部分植株性状间呈现显著相关，植株性状的前4个主成分累计贡献率达到85.22%，基本可以显示苦荞种质资源植株性状的相关性关系；不同植株性状间株高和主茎粗变异系数最大，遗传变异最丰富。不同省份的资源表现出不同的遗传多样性，西藏资源的表型遗传多样指数H′ 均值最高，为1.82，其次为四川，遗传多样性指数H′ 均值为1.78；不同省份资源植株性状的遗传多样性存在差异，四川生育期、株高、主茎分枝的遗传多样性指数H′ 最高，陕西叶宽的遗传多样性指数H′ 最高，云南千粒重的遗传多样性指数H′ 最高；植株性状的主成分分析表明相似产区的植株性状具有一定的相关性。13条核心引物共检测出208条清晰的条带，其中200条（96.15%）具有多态性，平均每条引物扩增出的条带数和多态性条带数分别为16个和15.4个；不同引物等位基因变化范围为4—58个，重要的基因频率变化范围为0.02—0.86，多样性指数变化范围为0.38—0.98，多态信息量（PIC）变化范围为0.35—0.98；不同地理来源苦荞种质资源的遗传多样性表明，北方产区亲缘关系较近，西南产区亲缘关系较近，说明不同地理来源的群体类别与产区存在一定的关系；来自陕西群体的等位基因数量最多、基因多样性指数和多态性信息量最高，分别为12.0769、0.8365和0.8265；基于模型的遗传结构分析将苦荞资源划分为3个类群，基于遗传距离的聚类显示苦荞种质资源穿插分布，资源的地理来源地分化不明显，但是同一产区的资源遗传距离较近，资源之间具有一定的产区分化。【结论】苦荞产区种质资源PIC较高，遗传多样性丰富，2大产区具有一定的资源交流和遗传物质交换。

铝胁迫诱导根系分泌异羟肟酸及其对玉米抵御铝毒害的作用

高小凤，郭添香，唐新莲，黎晓峰

中国农业科学. 2016, 49(11): 2063-2071. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.003

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【目的】通过对铝诱导玉米根系分泌异羟肟酸的研究，为揭示玉米的耐铝机制提供理论依据。【方法】选用玉米品种郑单958和泰玉11号，采用水培方法，设置铝胁迫试验，测定它们在铝胁迫下根伸长量、根尖铝含量、根尖胼胝质含量、根系异羟肟酸的分泌量、异羟肟酸解铝毒的相关指标等，分析玉米的抗铝性、铝对根系分泌异羟肟酸的影响及异羟肟酸的解铝毒作用。【结果】与对照（不加铝）处理相比，10 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理后郑单品种幼根伸长显著受阻而根尖铝含量和根尖胼胝质积累量显著增加。根伸长量降低了47.77%，根尖铝含量和根尖胼胝质含量分别增加了226.64%和60.74%。相反，铝处理对泰玉品种幼根伸长、根尖胼胝质积累的影响不显著。虽然20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理44 h后泰玉品种根系柠檬酸分泌量比对照（不加铝）处理显著增加了41.28%，但处理24 h内2个玉米品种根系柠檬酸分泌量与对照（不加铝）处理的差异不显著，即24 h内铝不能诱导玉米根系分泌柠檬酸。而铝处理24 h后，铝能诱导泰玉根系分泌异羟肟酸（丁布和门布），且异羟肟酸的分泌量随着铝浓度（10、15和20 μmol·L^-1）的增加和处理时间（3、6、9、12和24 h）的延长而显著增加，但铝（10、15和20 μmol·L^-1）不能诱导郑单品种根系分泌异羟肟酸。与光照条件相比，在黑暗条件下20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）诱导泰玉品种异羟肟酸的分泌量显著增加而根伸长也随之显著改善，丁布和门布的分泌量分别增加了40.81% 和72.02%，根伸长量增加了33.15%。与单独20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理相比，铝溶液中添加丁布（3 mg·L^-1）和门布（3 mg·L^-1）后玉米初生根伸长量显著增加而根尖铝含量显著降低。添加丁布和门布后，郑单品种根伸长量分别增加了14.16%和13.85%，泰玉品种分别增加了16.16%和11.33%；郑单品种根尖铝含量分别降低了39.94%和43.54%，泰玉品种分别降低了39.92%和42.10%。另一方面，20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理显著增加泰玉品种根和叶片中的异羟肟酸含量。然而，铝胁迫下郑单叶片中的异羟肟酸含量显著降低。【结论】玉米对铝的抗性与异羟肟酸的分泌有关，铝诱导玉米根系分泌异羟肟酸是玉米抵御铝毒害的一种有效机制，而植株叶片中的异羟肟酸含量可能与异羟肟酸的分泌有关。

不同生育时期遮阴对大豆叶片光合和叶绿素荧光特性的影响

王一，张霞，杨文钰，孙歆，苏本营，崔亮

中国农业科学. 2016, 49(11): 2072-2081. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.004

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【目的】研究在不同生育时期遮阴处理下，不同大豆品种植株叶片叶面积、比叶重、叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数和产量构成因素的变化规律，为中国南方丘陵和山区大面积推广的玉米大豆间套作种植技术提供理论依据。【方法】采用透光率50%的遮阳网对生育期和生育时期总天数不同的3个参试大豆品种桂夏2号、南豆12和C103进行遮阴，设置4个处理，分别为不遮阴（CK）、出苗至盛花期遮阴（VER2）、出苗至鼓粒期遮阴（VER5）和盛花期至完熟期遮阴（R2R8），测定叶面积、比叶重、叶绿素含量、光合参数、荧光参数和产量构成因素。【结果】VER2处理下大豆品种叶面积、叶绿素（a+b）含量和表观量子效率分别比对照高15.50%、12.95%和74.13%，比叶重、光补偿点和最大光合速率分别比对照低15.78%、26.16%和26.52%，R2R8处理下大豆品种叶面积、叶绿素（a+b）和表观量子效率平均分别比对照高0.3%、10.53%和28.07%，比叶重、光补偿点和最大光合速率平均分别比对照低10.15%、20.34%和12.13%；盛花期复光PSⅡ最大量子产量平均比对照低3.01%，非光化学荧光淬灭系数平均比对照高26.80%，鼓粒期复光PSⅡ最大量子产量平均比对照低8.47%，非光化学荧光淬灭系数平均比对照高40.79%；VER2、VER5和R2R8处理下，桂夏2号单株粒重分别比对照低40.84%、48.67%和59.16%，百粒重分别比对照低23.69%、39.31%和26.39%，南豆12单株粒重分别比对照低46.67%、54.16%和21.19%，百粒重分别比对照低3.91%、19.93%和26.14%，C103单株粒重分别比对照低69.8%、74.85%和73.89%，百粒重分别比对照低68.8%、69.55%和71.64%。【结论】出苗至盛花期遮阴对参试大豆品种叶片光合及叶绿素荧光特性的影响大于盛花期至完熟期遮阴，大豆植株遮阴后在盛花期复光，叶片光合能力有一定程度的恢复，在鼓粒期复光，则表现为受到强光胁迫，因此，从减小遮阴对大豆叶片光合作用不良影响的角度考虑，在中国南方丘陵和山区玉米大豆间作优于玉米大豆套作，在玉米大豆套作模式下选择品种、播期及种植技术时，应确保大豆在盛花期前恢复光照，避免遮阴超过大豆鼓粒期。前期遮阴和后期遮阴对大豆产量的影响大小因大豆品种而异，但遮阴时间越长对大豆产量构成影响越大。

国家尺度上基于地形因子的光温及气候生产潜力修正算法

陈彦清，杨建宇，郧文聚，杜萌，杜振博

中国农业科学. 2016, 49(11): 2082-2092. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.005

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【目的】光温/气候生产潜力作为农用地分等中的重要指标之一，直接影响分等结果的准确性。从理论上来说，不同地形地区的光温条件应各不相同，以目前这种一个县一种作物只具有一个生产潜力值的情况来看，当县内地形差异明显时，仅使用一个生产潜力值不能反应出光温条件在县内的异质性，从而使分等结果不能准确描述耕地质量的差异性。论文旨在解决这一问题。【方法】从地形对于光照、温度和降水等与生产潜力密切相关的因子具有严重关联性的角度入手，通过寻找地形因子与生产潜力的关系，利用地形因子对生产潜力进行修正。由于生产潜力是以国家级尺度的数据进行计算的，为了保证修正后生产潜力值的可比性，在国家级尺度上开展修正，以900 m×900 m的DEM数据为计算地形因子的数据来源，首先利用SPSS软件，分别对坡度、坡向、海拔与生产潜力做回归分析，筛选相关性最高的回归模型，确定不同地形因子与生产潜力的相关性；其次利用回归方程、县内平均地形因子值、平均生产潜力值和待修正区的地形因子值得出生产潜力修正公式；最后以不同地形因子与生产潜力的相关系数为权重，将单因子修正后的生产潜力值进行加权，得到最终的综合修正生产潜力值。【结果】以目前农用地分等中正在使用的生产潜力值和DEM数据生成的地形因子做回归分析，其中，参与修正光温生产潜力的样点共3 779个,参与修正气候生产潜力的样点共2 765个。回归分析结果表明，坡度和坡向与光温生产潜力的相关系数分别为0.0008和0.0002，说明在国家级尺度上，以900 m×900 m的DEM数据对坡度、坡向和生产潜力进行回归分析时，这两者与生产潜力的相关性过小，故暂不列为修正生产潜力的因子；海拔与光温生产潜力的相关系数达到0.835，与气候生产潜力的相关系数达到0.721，说明海拔与生产潜力具有高度相关性。根据海拔与生产潜力的回归方程得出，海拔对光温生产潜力的影响系数为1.479，对气候生产潜力的影响系数为1.095。论文以四川省长宁县为例进行了实例验证，结果表明，修正后的生产潜力值与海拔的趋势相同，体现出地势差异对光温条件的影响，并且海拔偏离县平均海拔越大的地区，生产潜力修正后偏离潜力的平均值越多。【结论】国家尺度范围内，海拔对于生产潜力具有重要的影响作用，并且海拔对于光温生产潜力的影响程度高于对气候生产潜力的影响程度，而坡度、坡向在该尺度内与生产潜力不具有明显的相关性。基于数据的限制，论文旨在侧重数学模型方法和修正思想的论述，与实际应用还有一定的距离，在未来研究中可探索利用国家级控制可比性、分区域利用更加精细的数据进行局部修正的方法进一步分析坡度、坡向对生产潜力的影响。

植物青枯菌LAMP检测方法的建立

黄雯，徐进，张昊，许景升，丁伟，冯洁

中国农业科学. 2016, 49(11): 2093-2102. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.006

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【目的】由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，简称青枯菌）引起的青枯病（bacterial wilt of plants）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一，严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术，是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP），实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpxC基因序列，并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物，F3（5′- CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化，设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃，设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L^-1，设置内外引物浓度比为2﹕1、4﹕1、6﹕1、8﹕1、10﹕1、12﹕1，确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象，5个非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）为对照，验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释，以原液和10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测，比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合，以LAMP检测方法对混合物进行检测，并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。反应结果直接通过观察产生的白色焦磷酸镁沉淀情况进行判定，或通过加入1 μL SYBR GreenⅠ荧光染料进行观察，阳性样品为绿色，阴性样品为橙色。【结果】建立了特异性检测青枯菌的LAMP方法，优化后确立了检测体系中FIP/BIP与F3/B3的浓度比为8﹕1（1.6﹕0.2 μmol·L^-1），镁离子浓度为6 mmol·L^-1，反应温度为63℃。特异性检测结果显示，仅参试青枯菌反应管中的反应液呈现绿色，表明建立的检测体系具有高度特异性。以青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及不同梯度的稀释液为模板进行的LAMP和普通PCR检测结果显示，LAMP的检测灵敏度为1.42 pg，比普通PCR高10倍。能够快速准确地从植物组织悬浮液、罹病番茄植物组织及田间罹病样品中检测到青枯菌。【结论】建立的青枯菌LAMP检测方法，高效特异，操作简单，无需复杂仪器，肉眼可直接观察检测结果，适合基层和现场检测。

灵芝多糖对番茄抗灰霉病的诱导效应

宁玉波，王红艳，乔康，刘秀梅，王开运

中国农业科学. 2016, 49(11): 2103-2112. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.007

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【目的】诱导抗病剂可以诱导寄主植株产生系统抗病性，具有持效性和广谱性的特点。论文以番茄植株为模式植物，番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）为目标菌，进行温室盆栽试验，以期明确灵芝多糖诱导剂对番茄灰霉病的诱导抗性。【方法】用一定质量浓度的灵芝多糖溶液（50、100、200和400 mg·L^-1）喷雾处理盆栽番茄植株第1、2片真叶（正反面），每2 d喷施1次，共诱导3次，最后一次诱导2 d后全株喷雾接种供试菌孢子悬浮液（（1—2）×10⁶个孢子/mL），对照组施用等量清水代替灵芝多糖溶液，与各处理平行喷雾接种番茄灰霉菌孢子悬浮液。在接种孢子悬浮液之前用注射器将番茄苗茎基部刺伤，注意伤口不能太大。然后再罩上塑料薄膜保湿24 h，接种孢子悬浮液2 d内植株遮阴处理，并用加湿器提高温室内的相对湿度，相对湿度控制在不低于90%，温度控制在（15±5）℃，接种后第3 天正常光照。通过调查植株病情指数，计算相对防治效果以评价灵芝多糖对番茄抗灰霉病的诱导效果，并且从防御酶活性、丙二醛（MDA）和叶绿素含量的变化角度评价其诱导抗性的作用机制。同时用一定质量浓度的灵芝多糖溶液（50、100、200和400 mg·L^-1）处理番茄种子并育苗，20 d后测定番茄幼苗株高、鲜重等多项生长指标。【结果】与直接施用等量清水后挑战接菌的对照组病情指数49.25相比，灵芝多糖处理组的番茄植株病情指数明显下降，在32.96—43.85。其中经400 mg·L^-1灵芝多糖处理的番茄植株病情指数最低为32.96，相对防效达到33.07%。经灵芝多糖处理的番茄植株，其体内与抗病有关的防御酶活性也发生显著变化，过氧化氢酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）的活性在多糖诱导第3天达到最高，分别达到162和98 U·min^-1·g^-1 FW，是对照组的2.13和1.71倍；过氧化物酶（POD）的活性在诱导后第4天达到最高值434 U·min^-1·g^-1 FW，是对照处理组的3.29倍。灵芝多糖能够系统地诱导番茄体内 CAT、POD 及 PPO 活性，显著抑制了感染灰霉菌后番茄植株叶片叶绿素含量的下降。灵芝多糖处理组的MDA含量与对照组相比有所下降，对照处理组在取样期间内MDA含量持续上升，而灵芝多糖处理组在取样期间内MDA含量呈先上升后趋于平稳的变化趋势。各质量浓度灵芝多糖对番茄种子的发芽率、芽长和幼苗株高、植株的鲜重均有不同程度的促进作用。其中200 mg·L^-1灵芝多糖浸泡的番茄种子发芽率最高，达87.3%，比对照组的发芽率77.3%提高了10.0%；且该处理对番茄幼苗的株高和地上部分鲜重的促进作用也最大，分别较对照增加了12.9%和33.3%；经100 mg·L^-1灵芝多糖处理后番茄幼苗的芽长和地下部分鲜重变化最大，与对照组相比分别提高了0.16 cm和0.33 g。【结论】灵芝多糖能够诱导番茄植株对灰霉病产生系统抗病性，同时对番茄种子发芽和番茄植株幼苗生长具有一定的促进作用。

26年来东北黑土区土壤养分演变特征

康日峰，任意，吴会军，张淑香

中国农业科学. 2016, 49(11): 2113-2125. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.008

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【目的】东北黑土区土壤肥沃，是中国重要的粮食主产区之一。对东北黑土区20世纪80年代以来国家级耕地质量长期监测数据进行整理和分析，以明确中国东北黑土区农业生产实践中土壤养分状况和肥力水平，为农田土壤培肥提供科学指导依据。【方法】利用时间趋势分析法探讨17个国家级黑土耕地质量长期监测点26年来土壤养分随时间的变化趋势，分别总结土壤有机质（SOM）、全氮（TN）、碱解氮（AN）、有效磷（AP）和速效钾（AK）含量在监测初期（1988—1997年）、监测中期（1998—2003年）和监测后期（2004—2013年）的变化规律及其总体变化趋势；在分析土壤全氮和有机碳含量变化特征以及碳氮比（C/N）演变规律的基础上，进一步分析碳和氮之间的养分平衡关系；运用主成分分析方法分析不同监测时期上述5大肥力指标对黑土区土壤综合肥力的影响，得出该区综合肥力主要贡献因子，并分别计算3个不同监测时期黑土区土壤综合肥力属性得分。【结果】黑土区农田土壤经过10—26年的演变，土壤有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾含量整体呈上升趋势。与监测初期相比，监测后期土壤养分含量均显著提高（P＜0.05），土壤有机质、全氮、碱解氮、有效磷和速效钾分别提高了33.9%、43.9%、27.6%、90.3%和11.8%，有效磷提升效果最为显著。进一步分析土壤有效磷含量发现，监测后期71.4%的监测点土壤有效磷含量维持在15.0—50.0 mg·kg^-1，既能满足作物生长需求，又不至于引发地下水环境污染，而28.6%的监测点土壤有效磷含量已超过50.0 mg·kg^-1的环境阈值，应及时控制磷素的输入。分析主要肥力因素有机碳和全氮之间的关系表明，黑土区土壤C/N略有下降趋势，从1988年的10.3降至2013年的9.6，下降了6.8%。黑土区5个肥力指标得分系数由大到小的顺序为：SOM＞TN＞AN＞AP＞AK，说明黑土区土壤有机质和全氮是影响土壤综合肥力的关键因素；监测初期和监测中期土壤综合肥力属性得分平均值分别为-1.099和-0.541，而监测后期土壤综合肥力属性的得分增加到了0.5888，监测后期土壤综合肥力得到显著提升。【结论】在农民常规施肥条件下，经过10—26年的长期耕作，黑土区土壤肥力在监测后期得到显著改善，但28.6%的监测点应注意控制磷肥用量，以免引起水体污染；而监测区黑土C/N呈逐年下降趋势，应该加大有机物料的投入，以维持土壤碳氮的养分平衡。

黄土高原煤矿区复垦农田土壤有机质含量的高光谱预测

南锋，朱洪芬，毕如田

中国农业科学. 2016, 49(11): 2126-2135. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.009

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【目的】针对黄土高原丘陵地多、地形复杂、有机质含量低、采样困难以及因采煤活动引起大面积土地损毁等问题，在土地复垦与综合整治过程中，为快速定量监测与评估复垦农田土壤质量提供一种新的方法。【方法】以山西省襄垣县复垦农田土壤为研究对象，选取由北向南土地损毁中间条带状区域采集样品152个，进行室内土壤农化分析、光谱测定，运用ParLes 3.1软件对光谱曲线进行多元散射校正（multipication scatter correction，MSC）、基线偏移（baseline offset correction，BOC）和Savitzky-Golay filter平滑去噪预处理。对土壤原始光谱反射率（raw spectral reflectance，R）作一阶微分（first order differential reflectance，D（R））和倒数的对数变换（inverse-lg reflectance ，lg（1/R）），分析3种不同变换形式的光谱数据与土壤有机质含量的相关性，相关系数通过P=0.01水平显著性检验来确定显著性波段的范围。基于全波段（400—2400 nm）和显著性波段利用偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析方法建立该区域土壤有机质含量高光谱预测模型，通过模型精度评价指标：决定系数（coefficient of determination，R²）、均方根误差（root mean square error，RMSE）和相对预测偏差（residual prediction deviation，PRD）确定最优模型。【结果】通过P=0.01水平显著性检验的波段范围为：R的400—1 800、1880—2 400 nm；D（R）的420—790、1 020—1 040、2 150—2 200 nm；lg（1/R）的400—1 830、1 860—2 400 nm。光谱与有机质含量的相关系数绝对值最大的波段是R的800 nm；D（R）的600 nm；lg（1/R）的760 nm。进行D（R）变换，光谱曲线的吸收特征更加明显，相关系数在可见光（400—800 nm）波段范围内有所增加，其最大值由0.72提高到了0.82；基于显著性波段的PLSR建模效果优于全波段，其中lg（1/R）变换的预测精度为最佳，具有很好的预测能力，其校正模型的R²和RMSE分别为0.95、7.64，预测模型的R²、RMSE和RPD分别为0.85、3.00、2.56；基于全波段的R-PLSR和lg（1/R）-PLSR模型具有较好的预测能力，其预测模型的R²、RMSE和RPD分别为0.79、3.64、2.10和0.79、3.53、2.17，而D（R）-PLSR模型只能进行粗略估测，其预测模型的R²、RMSE和RPD分别为0.61、5.43、1.41。综合分析全波段和显著性波段3种光谱数据的预测精度，发现基于显著性波段的R-PLSR、D（R）-PLSR、lg（1/R）-PLSR模型均取得了显著的预测效果。【结论】研究区土壤光谱反射率与土壤有机质含量具有高度的相关性，应用偏最小二乘回归分析方法可以很好地建立土壤有机质含量反演模型。

免耕条件下秸秆还田对冬小麦-夏玉米轮作系统土壤呼吸及土壤水热状况的影响

王维钰，乔博，Kashif AKHTAR，袁率，任广鑫，冯永忠

中国农业科学. 2016, 49(11): 2136-2152. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.010

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【目的】研究免耕条件下秸秆还田对旱地冬小麦-夏玉米轮作系统土壤呼吸及土壤水热状况的影响。【方法】2011年10月至2014年9月，在陕西杨凌设置秸秆全量还田+施肥（S1F1）、秸秆全量还田+不施肥（S1F0）、秸秆半量还田+施肥（S1/2F1）、秸秆半量还田+不施肥（S1/2F0）、秸秆不还田+施肥（S0F1）、秸秆不还田+不施肥（S0F0）6 种不同耕作处理的3年定位试验，测定并分析不同耕作处理下土壤呼吸、土壤水热状况、作物产量、土壤耕作层有机碳含量的差异。【结果】在冬小麦生育期内，各处理土壤呼吸速率均呈先下降后升高再下降的趋势；在夏玉米生育期内，各处理土壤呼吸速率均表现为先升高后下降的趋势。同一生育期内各处理土壤呼吸平均速率及呼吸总量依次为S1F1＞S1/2F1＞S1/2F0＞S0F1＞S1F0＞CK，同种作物不同生育期之间，各处理土壤生育期呼吸总量有逐年降低的趋势。整个研究周期内，土壤温度的变化趋势与每月平均气温的变化趋势相似，不同处理在同一生育期内的土壤温度变化趋势相近，且各处理生育期土壤平均温度均随土壤深度的增加而降低；不同秸秆还田处理冬季土壤温度均高于对照，但生育期土壤平均温度均低于对照。土壤含水量随土壤深度的增加而降低，但受降雨影响，不同轮作周期之间的土壤含水量波动较大，各处理同一生育期的土壤平均含水量均表现为S1F0＞S1F1＞S1/2F0＞S1/2F1＞CK＞S0F1，且不同秸秆还田处理的土壤含水量与对照间的差异均显著（P＜0.05）；土壤温度能够解释土壤呼吸速率变化的32.5%—60.4%，土壤含水量能够解释土壤呼吸速率变化的38.4%—82.5%，不同土层深度间，5 cm土层的温度与土壤呼吸的拟合度性最高，而10—20 cm土层的含水量与土壤呼吸的拟合度最高。相同年份内，不同处理冬小麦和夏玉米产量均表现为S1F1＞S1F0＞S1/2F1＞S0F1＞S1/2F0＞CK，这个研究周期内，冬小麦产量逐年增加，夏玉米在前两季表现为增产，但受极端炎热天气的影响，第三季的产量明显降低。单季作物收获后，各处理同一土层深度的有机碳含量均表现为S1F1＞S1/2F1＞S1F0＞S1/2F0＞S0F1＞CK。且不同秸秆还田处理的土壤有机碳含量逐年升高。【结论】长期免耕秸秆还田能够有效降低农田土壤碳排放、提高农田土壤水分利用率及冬季土壤温度、提高作物产量及土壤有机碳含量。不同秸秆还田处理间以S1F0处理的效果最优。

接种枯萎病菌对甜瓜木质素合成相关酶活性及CmCADs表达的影响

刘贺娟，李悦鹏，刘威，邵琪，齐红岩

中国农业科学. 2016, 49(11): 2153-2163. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.011

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【目的】明确接种枯萎病菌对甜瓜幼苗植株表型、木质素含量、木质素合成相关酶活性及肉桂醇脱氢酶（cinnamy alcohol dehydrogenase，CAD）基因表达的影响，找出响应枯萎病菌的CmCADs成员。【方法】选用抗枯萎病品种薄皮甜瓜‘彩虹7号’为试验材料。在甜瓜幼苗长至“三叶一心”时接种枯萎病菌-尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. melonis)。以长势相同的健康植株浇灌等量无菌水为对照。在接种后0、1、3、5、7和9 d观察甜瓜植株表型变化，并测定其营养器官中的木质素含量、木质素合成关键酶（苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和CAD）活性及CmCADs的表达量。【结果】接种枯萎病菌后，甜瓜植株表型发生明显变化。在接种枯萎病菌后5 d甜瓜植株叶片出现轻微萎蔫，接种后9 d植株全部叶片均已萎蔫。甜瓜营养器官中木质素含量及木质素合成相关酶PAL、POD和CAD活性在接种枯萎病菌后与对照相比均有不同程度的升高。其中木质素含量在根、茎和叶中呈现出一致的变化趋势，即木质素含量均随着接种枯萎病菌后天数的延长而增加，且显著高于对照。PAL活性在甜瓜根和茎中呈现先升高后下降的变化趋势,在叶片中整体呈现升高的趋势且显著高于对照。POD活性在各时期均高于对照并呈现出不同的变化趋势。CAD活性在甜瓜根、茎、叶中变化趋势一致，均呈现先升高后下降的趋势。接种枯萎病菌后，CmCADs各成员在甜瓜营养器官中的表达表现出组织特异性。根中除CmCAD4外，其他4个成员均在接种后7 d受强烈诱导。茎中各成员均无表达，而叶中CmCAD2和CmCAD5在接种后5 d受到强烈诱导。【结论】与对照相比，甜瓜营养器官中木质素含量及木质素合成相关酶PAL、POD和CAD活性在接种后均升高，表明木质素合成途径可能在甜瓜抵御枯萎病中起重要作用，根和叶中均受枯萎病菌诱导表达的CmCAD2和CmCAD5可能是响应枯萎病菌的CmCADs成员，并在甜瓜抗枯萎病中起一定作用。

滴灌施肥条件下砂田设施甜瓜的水肥耦合效应

马忠明，杜少平，薛亮

中国农业科学. 2016, 49(11): 2164-2173. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.012

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【目的】传统水肥管理是限制砂田设施甜瓜产业发展的主要因素。研究滴灌施肥条件下砂田设施甜瓜的水肥耦合效应，为该产业的可持续发展提供技术支撑。【方法】在滴灌施肥条件下，采用“311-B”D饱和最优设计，建立甜瓜产量、品质与水肥的回归模型，分析各因素的单因素效应、交互效应和边际效应，确定砂田设施甜瓜滴灌高产优质栽培的适宜施用量。【结果】建立了甜瓜产量、品质与灌水、氮肥、钾肥的回归模型；因素效应分析结果表明，影响甜瓜产量的主要因素是氮肥用量，其次是灌水量和钾肥用量；影响甜瓜品质的主要因素是钾肥用量，再其次是灌水量和氮肥用量；甜瓜产量、品质均随着水、肥用量的增加而先增加后降低。水、氮、钾相对于甜瓜产量与品质的交互效应也存在差异，在产量影响方面，对水而言，氮的交互效应大于钾；对氮而言，水的交互效应大于钾；对钾而言，氮的交互效应大于水。而在品质方面，对水而言，钾的交互效应大于氮，对氮而言，钾的交互效应大于水，对钾而言，氮的交互效应大于水。某一单一因子投入量偏高或偏低均不利于甜瓜产量和品质的形成，而由于水肥间的交互作用，两者配施则对产量和品质的提高具有较强的促进作用。【结论】综合考虑水、氮、钾对甜瓜产量、品质的影响，滴灌条件下，砂田设施甜瓜高产优质的水肥方案为：灌溉定额为786—796 m³·hm^-2、施肥量N为170—227kg·hm^-2、K₂O为227—246 kg·hm^-2，可作为砂田设施滴灌条件下的灌溉施肥优化方案。

大豆和膨化大豆主要抗营养因子分析

姚怡莎，谷旭，商方方，邱静，李军国，李俊

中国农业科学. 2016, 49(11): 2174-2182. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.013

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【目的】大豆含有丰富的营养物质，除了作为食品原料外也是重要的饲料原料，但大豆所含抗营养因子限制了其在食品及饲料行业中的应用。挤压膨化工艺能够在基本保持大豆营养成分的基础上，降低其抗营养因子的含量，从而减小对人和动物健康的负面作用。调查分析市售大豆和膨化大豆中主要几种抗营养因子的差异，分析挤压膨化加工工艺对大豆中主要抗营养因子的消除降解作用，并对这几种主要抗营养因子的含量及活性给出置信范围，为膨化企业实际生产应用中选择优质原料及优化加工工艺提供参考，并对动物饲料的配方设计提供指导。【方法】采集市场上不同地区及厂家的大豆20批次和膨化大豆19批次，检测其中胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白（包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白）、低聚糖（包括水苏糖和棉籽糖）等抗营养因子的含量和脲酶活性，并与在膨化加工企业采集的2批次大豆原料和在不同加工条件下制备的8批次膨化大豆中相应抗营养因子的含量进行比较分析。其中胰蛋白酶抑制因子和抗原蛋白采用酶联免疫法测定；低聚糖采用高效液相色谱法（HPLC）测定，示差检测器检测。同时通过提取方式、活性炭用量、提取液浓度、料液比单因素试验，对苏糖和棉籽糖两种低聚糖的提取方法进行优化。综合分析检测结果，研究挤压膨化工艺对大豆主要抗营养因子含量或活性的影响。【结果】优化后的提取方法如下：称取一定质量的样品以料液比1﹕25加入体积分数为70%乙醇水溶液，微波辅助提取，离心浓缩，定容至25 mL，涡旋混匀，取2 mL离心检测。膨化大豆中胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白的含量及脲酶活性均显著低于大豆原料，而大豆和膨化大豆中的低聚糖含量没有显著差异。膨化大豆中脲酶活性基本为0，比大豆的脲酶活性低99%以上，胰蛋白酶抑制因子含量比大豆约降低66%，大豆球蛋白的含量约降低67%，β-伴大豆球蛋白含量降低90%以上，水苏糖和棉籽糖的总含量基本保持不变。推断市场上大豆原料中的胰蛋白酶抑制因子的含量范围为32.5—89.6 mg·g^-1，大豆球蛋白含量范围为91.0—143.1 mg·g^-1，β-伴大豆球蛋白的含量范围为161.1—268.7 mg·g^-1，棉籽糖含量范围为3.3—8.78 mg·g^-1，水苏糖的含量范围在21.4—34.16 mg·g^-1，脲酶活性范围为3.6—9.42 U·g^-1；膨化大豆样品中胰蛋白酶抑制因子含量范围为10.7—31.1 mg·g^-1，大豆球蛋白含量范围为17.7—64.5 mg·g^-1，β-伴大豆球蛋白含量范围为9.3—57.5 mg·g^-1，棉籽糖含量范围为4.25—10.21 mg·g^-1，水苏糖的含量范围为17.68—34.15 mg·g^-1，脲酶活性范围为0.00—0.02 U·g^-1。【结论】挤压膨化过程能显著降低大豆中主要抗营养因子的含量，从而减少这些因子带来的不良反应，并能提高大豆营养物质的利用率。

黄油的短程分子蒸馏及其分馏物组成与物化特性

高希西，张书文，芦晶，刘鹭，逄晓阳，岳喜庆，吕加平

中国农业科学. 2016, 49(11): 2183-2193. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.014

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【目的】黄油复杂的组成、结构及加工特性使其在一些食品加工领域中的应用受到了限制。采用不同的蒸馏温度对黄油进行短程分子蒸馏，分析黄油及其分馏物的化学组成和物化特性的变化及相关性，为黄油的分馏及应用提供理论参考和技术方法。【方法】以市售黄油为试验材料，分别采用150、165、180、190、200、210、225和240℃ 8个蒸馏温度对黄油进行短程分子蒸馏，分析轻相分馏物得率与蒸馏温度的关系；利用气相色谱测定黄油及其分馏物中脂肪酸的种类及含量，并通过测定酸值、碘值、过氧化值、滑动熔点、DSC熔化曲线和结晶曲线等理化指标，以及在偏振光显微镜下观测其结晶形态，探究不同蒸馏温度对分馏物的化学组成和物化特性的影响。【结果】从165℃开始黄油得到分馏分离，轻相分馏物得率随蒸馏温度的升高而增加，从165℃时的1.19%增加至240℃时的36.89%。经过短程分子蒸馏后，分馏物的酸值和过氧化值发生不同程度的变化，但不具规律性；碘值呈现出重相分馏物普遍大于轻相分馏物的规律。短程分子蒸馏没有改变分馏物中脂肪酸的种类，但使其含量发生了一定规律的变化：轻相分馏物富含短中链脂肪酸（40%—60%），重相分馏物富含长链脂肪酸（65%—75%）和不饱和脂肪酸（约30%），与重相分馏物的碘值普遍大于轻相的测定结果吻合；蒸馏温度对分馏物中各类脂肪酸的组成比例有显著影响，随着蒸馏温度的升高，分馏物中各类脂肪酸的含量接近黄油原样。滑动熔点方面，重相分馏物＞黄油原样＞轻相分馏物，且分馏物的滑动熔点随蒸馏温度的升高而升高；长链脂肪酸（LCFA）的含量与滑动熔点之间存在极显著的正相关关系（P＜0.01），相关系数r=0.977。DSC测定结果表明，随着蒸馏温度的升高，分馏物的熔化峰和结晶峰均向高温区域偏移，表现出不同但有规律的熔化特性和结晶特性。轻相分馏物与重相分馏物具有不同的结晶形态（5℃、24 h），前者为针状结晶，后者为密集的晶体颗粒，且随着蒸馏温度的升高，晶体逐渐变大。【结论】短程分子蒸馏能够对黄油进行有效的分馏分离，蒸馏温度对分馏效果影响显著，通过改变蒸馏温度可以使分馏物具有不同于黄油原样的化学组成和物化特性，进而具有不同的加工特性。

中国荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP突变对乳中脂肪酸组成的影响

徐晨希，王梦琦，朱小瑞，张玉锋，夏海磊，刘贤慧，王小龙，张慧敏，杨章平，毛永江

中国农业科学. 2016, 49(11): 2194-2202. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.015

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【目的】FADS2是多不饱和脂肪酸合成中关键的限速酶之一，可催化食物中亚油酸（LNA, C18:2n6）合成γ-亚麻酸(GLA, C18:3n6)、二十碳五烯酸(EPA, C20:5n3)、二十二碳六烯酸(DHA, C22:6n3)等长链脂肪酸。试验旨在探讨中国荷斯坦牛FADS2基因3′端非编码区SNP突变对乳中脂肪酸含量的影响。【方法】随机选择20头无亲缘关系的中国荷斯坦牛样本，用直接测序列法检测FADS2基因3′端非编码区SNP突变位点。再以江苏某大型奶牛场551头中国荷斯坦牛为材料，用飞行时间质谱法对前期发现的2个SNP位点进行检测，同时利用最小二乘模型分析了SNP突变及其单倍型对乳中脂肪酸含量及其不饱和指数的影响。【结果】中国荷斯坦牛FADS2基因3′端非编码区存在3个SNP突变位点：c.1571 A＞G、c.2743 A＞G、c.2776 A＞G。c.1571 A＞G位点GG型为优势基因型，基因型频率为0.800，G为优势等位基因，基因频率为0.887。c.2776 A＞G位点AA为优势基因型，基因型频率为0.673，A为优势等位基因，基因频率为0.819。χ² 检验表明：c.2776 A＞G位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P＞0.05) ，而c.1571 A＞G位点基因型分布均偏离Hardy-Weinberg 平衡(P＜0.05)。FADS2基因c.1571 A＞G位点与c.2776 A＞G位点间连锁不平衡系数r²为0.028，未达到显著水平（P＞0.05）。c.1571 A＞G位点与c.2776 A＞G位点有3种单倍型，GA、GG和AA频率分别为0.705、0.181和0.114。多因素方差分析表明：FADS2-1571对C14:1含量、C14和C18不饱和指数的影响达到极显著水平（P＜0.01），对C18:0、SFA和MUFA含量的影响达到显著水平（P＜0.05）。GG型个体乳中C14:1含量、C14和C18不饱和指数显著高于AG型（P＜0.05）。FADS2-2776位点对C16:1含量、 C16和C20不饱和指数的影响达到极显著水平（P＜0.01），对C14:1含量的影响达到显著水平（P＜0.05），GG型个体乳中C16:1含量、C16和C20不饱和指数显著高于AG型和AA型（P＜0.05）。同时，FDAS2-1571-2776单倍型对C16:1含量和C20不饱和指数的影响达到显著水平（P＜0.05），单倍型GG型个体乳中C16:1含量和C20不饱和指数显著高于GA型和AA型（P＜0.05）。【结论】FADS2基因3′端非编码区SNP突变对中国荷斯坦牛乳中脂肪酸组成有重要影响。在进一步验证其功能情况下，可作为影响中国荷斯坦奶牛乳脂肪酸组成的主效基因加以利用。

Smads与Hippo通道中YAP1基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析

鲍建军，苏锐，王庆增，吕晓阳，高雯，于嘉瑞，王利宏，陈玲，吴文忠，盛水兴，周洪，孙伟，戴国俊

中国农业科学. 2016, 49(11): 2203-2213. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.016

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【目的】通过在mRNA表达水平检测TGF-β/smad信号通路基因在湖羊肌肉组织中时空表达，来探究各基因的表达规律及内在联系。【方法】利用荧光定量PCR技术对湖羊Smads基因在出生后不同生长阶段（2日龄，2月龄和6月龄）不同性别的两种不同骨骼肌（腓肠肌、趾长伸肌）的相对表达进行分析，以及对湖羊Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）基因、YAP1基因的表达相关性分析。【结果】湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads基因时空表达规律研究发现：Smads在不同肌肉组织的表达分析中，Smads在腓肠肌中的表达高于趾长伸肌，可能与这两种骨骼肌分属不同部位有关；Smads在不同月龄的表达分析中，Smad2、Smad3、Smad4在2日龄的表达量均高于其它月龄，而Smad7在2日龄的表达量低于6月龄，2月龄时表达量最低；在不同性别的表达分析中，Smads在2日龄公羊中的表达量高于母羊，Smad2、Smad4、Smad7在2月龄和6月龄则低于母羊；Smad3在不同生长阶段中公羊表达量高于母羊。湖羊肌肉TGF-β/smad信号通路中Smads、YAP1基因表达相关性研究发现：在2日龄腓肠肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）；在2月龄腓肠肌中，Smad2的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05），Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）；在6月龄腓肠肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）；在腓肠肌的不同生长阶段中，Smad3的表达YAP1存在极显著负相关（P＜0.01），Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）。在2日龄趾长伸肌中，Smad3的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01），Smad2、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在显著正相关（P＜0.05）；在2月龄趾长伸肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）；在6月龄趾长伸肌中， Smad7与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4的表达与YAP1相关不显著（P＞0.05）；在趾长伸肌的不同生长阶段中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达与YAP1存在极显著正相关（P＜0.01）。【结论】由此推断不同组织、生长阶段以及性别等因素均可影响Smads在肌肉中的表达；在湖羊这两种不同肌肉组织中，Hippo通道中YAP1基因可通过参与调控TGF-β/smad信号通路而参与肌肉的增殖和分化过程。

黑色素细胞中过量表达Pax6^10Neu基因对MITF和TYR的影响

聂瑞强，杨玉静，谢建山，范瑞文，高文俊，董常生

中国农业科学. 2016, 49(11): 2214-2221. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.017

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【目的】 MITF和β-catenin是黑色素生成通路中重要的调节基因，而Pax6通过调控MITF和β-catenin来调控黑色素细胞的黑色素生成，通过对只含有正常Pax6 paird domain 的前102个氨基酸的Pax6^10Neu的研究，来探究Pax6^10Neu是否还有生物学功能，以及Pax6对其下游基因的作用机理。【方法】根据NCBI查找到的Pax6^10Neu基因序列设计PCR引物，克隆Pax6^10Neu，收集所得基因片段送华大基因测序确认。后通过对Pax6^10Neu和慢病毒表达载体的序列分析来筛选合适的酶切位点，通过分析选取Sal I和Xba I作为酶切位点，设计含有Sal I和Xba I酶切位点的PCR引物，大量克隆Pax6^10Neu基因，从而通过胶回收得到含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6^10Neu基因。将含有酶切位点的目的片段与T载体相连，并送华大基因测序。将与T载体连接成功的质粒导入感受态细胞使其大量扩增，提取质粒，双酶切后，胶回收，得到大量含有Sal I和Xba I酶切位点的Pax6^10Neu基因片段，将其与含有小鼠tyrp2特异性启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接，送华大基因测序确认。将连接好的慢病毒表达载体导入感受态细胞使其大量扩增，通过质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的Pax6^10Neu慢病毒真核表达载体。将慢病毒真核表达载体通过细胞转染导入到培养的绵羊黑色素细胞中，使其过量表达。收集细胞，分别通过观察绿色荧光蛋白和使用RT-PCR来检测转染效率，使用RT-PCR和Western blot来检测MITF和TYR在mRNA和蛋白水平的变化，同时检测黑色素细胞中黑色素生成量的变化。【结果】与正常组相比，在mRNA水平，MITF显著升高3.2倍（P＜0.05），TYR升高1.31倍，由此得出，Pax6^10Neu可以有效促进MITF mRNA 的产生，对TYR mRNA产生的影响不是太显著；在蛋白质水平，MITF显著升高8.24倍(P＜0.001)，TYR显著升高2.09倍(P＜0.001)，由此得出，Pax6^10Neu可以显著提高MITF 、TYR 蛋白的产生；同时黑色素细胞产生黑色素的量显著升高1.22倍(P＜0.05)，由此得出Pax6^10Neu可以有效促进黑色素细胞黑色素的生成。【结论】只含有正常Pax6 paird domain前102个氨基酸的Pax6^10Neu，仍然可以在黑色素细胞中与MITF相互作用，同时间接调控TYR的表达，从而使黑色素细胞黑色素的生成量发生改变。

施硫对不结球白菜硝酸盐累积及氮硫同化关键基因表达的影响

徐瑶，牟建梅，张国芹，马佳佳，徐君，李军，刘凤军，佘旭东

中国农业科学. 2016, 49(11): 2222-2233. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.018

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【目的】确定降低不结球白菜硝酸盐累积效果最佳的硫素形态，从转录水平筛选影响不结球白菜硝酸盐累积的关键基因，为完善不结球白菜科学施硫技术及进一步揭示硝酸盐累积分子调控机制、指导分子育种奠定基础。【方法】选取4种硫素形态及3个施用浓度处理不结球白菜，测定其对植株叶片及叶柄中硝酸盐含量的影响；利用半定量PCR技术从转录水平分析施硫对氮及硫代谢同化网络中30个基因表达的影响。【结果】不同形态硫处理均显著增加了不结球白菜的地上生物量，其中30 mg·kg^-1 Na₂SO₄处理的增幅最大，比对照增加49.76%，以Na₂SO₄处理的增幅最大。在降低小白菜硝酸盐含量中，以Na₂SO₄、Na₂S₂O₃处理效果相对显著，其中Na₂SO₄降低叶片中硝酸盐12.23%—23.55%，叶柄中33.08%—41.98%，降幅与浓度呈正相关，30 mg·kg^-1 Na₂SO₄处理的降幅最大；Na₂S₂O₃处理降低植株叶片中硝酸盐15.34%—33.08%，叶柄中11.95%—19.68%。硫处理在一定程度上促进氮同化，对照叶片中NR-1、NADH-GOGAT-1、NADH-GOGAT-2、Cytoplasm-GS-4、Cytoplasm-GS-5、GDH-3表达量低于其他处理，对照叶柄中NR-1、NADH-GOGAT-2、Cytoplasm-GS-1、GDH-2表达量低于其他处理，其中，各处理NADH-GOGAT-2表达量与叶片及叶柄中硝酸盐含量变化呈现一定规律性。硫处理对植株硫同化基因也产生一定影响，对照叶片中ATPS-2、ATPS-3、ATPS-4、APSR-3、SIR、SAT1.1、SAT2.1表达量较低，而对照叶柄中仅SIR、OASTL-A表达量明显低于其他处理。【结论】Na₂SO₄是降低不结球白菜硝酸盐效果较为显著的硫素，且能够显著提高产量，30 mg·kg^-1的Na₂SO₄为较优处理。NADH-GOGAT-2表达量与不结球白菜内硝酸盐含量呈负相关，推测其可能是影响氮同化的关键基因。

6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用

金修哲，何雷，程相朝，张春杰，余祖华，韩海锋，杨丹芳，梅京京，李银聚

中国农业科学. 2016, 49(11): 2234-2244. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.11.019

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【目的】为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的作用机制，明确其体外抗病毒作用效果，为抗TGEV的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术，采用MTT比色法和细胞病变(CPE)观察法相结合，测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞（ST）的毒性作用，通过观察细胞CPE情况，确定药物对细胞作用的最大安全浓度；同时测定病毒的TCID₅₀，用细胞维持液配成100·TCID₅₀病毒悬液备用；将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后，分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验，各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组，每组设置3个重复，通过酶标仪测得630 nm处OD值，计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率，筛选出抗TGEV活性较好的中药成分，并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度；6n>种中药成分与病毒作用后，测定TGEVRT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况，进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用。【结果】连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、100、200 μmol·L^-1；抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为：160、100、20、62.5、25、100 μmol·L^-1。根据Karber法计算出初始TGEV的TCID₅₀为10^-6.25/0.1 mL；6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用，其中咖啡酸浓度为62.5 μmol·L^-1时与100·TCID₅₀病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好，相互作用72 h时，细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整，且细胞间轮廓清晰，仅有少量细胞脱落、死亡；此时测上清病毒的TCID₅₀为10^-3.75/0.1 mL，结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10^-6.45/0.1 mL差异极显著（P＜0.01）；通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4%，咖啡酸直接灭活病毒作用极其显著。其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚，其病毒滴度分别为：10^-4.75、10^-5.55、10^-5.55、10^-5.65、10^-5.75/0.1 mL，但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显著，抑制率大多在50%以下。另外，各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好，其次为对TGEV吸附阻断作用，最后为对TGEV的复制阻断作用。RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用，结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗，病毒效价较低，对病毒抑制作用效果显著；其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚。【结论】6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用，其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显著，有望被开发成抗病毒药物。

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