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    2021年 第54卷 第20期 刊出日期:2021-10-16
      
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    中国农业科学. 2021, 54(20):  0. 
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    作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
    重要育种亲本川麦44对衍生品种的遗传贡献
    罗江陶,郑建敏,邓清燕,刘培勋,蒲宗君
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4255-4264.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.001
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    【目的】小麦品种川麦44不仅本身具有高产、稳产、广适等特性,而且以其为亲本已选育审定新品种11个,是小麦育种的一个重要亲本。明确川麦44的遗传特性,鉴定其含有的重要基因或QTL位点,为更好地利用川麦44选育新品种提供理论支撑。【方法】利用荧光原位杂交明确小麦-外源易位对川麦44及其衍生品种的影响以及川麦44及其衍生品种在染色体层面的遗传规律。利用660K SNP芯片数据分析川麦44对其衍生品种的遗传贡献,明确衍生品种中来源于川麦44的高传递率区段。利用已知的小麦基因功能标记及QTL连锁标记,对川麦44中有利于育种的重要基因位点进行鉴定。【结果】细胞学鉴定表明川麦44不含四川小麦品种中常见的2条易位染色体6VS/6AL和1RS/1BL。其衍生品种中,仅昌麦32和昌麦34含1对1RS/1BL易位染色体,其余品种不含有小麦-外源易位染色体。系谱分析表明,昌麦32和昌麦34的易位染色体遗传自另外一个杂交亲本——昌麦19。1RS/1BL易位的导入可能是昌麦32和昌麦34表现为弱筋的原因之一。除了小麦-外源易位染色体,多个染色体的核型在川麦44及其10个衍生品种中表现出多态性。其中,4A染色体有2种类型,80%的衍生品种与川麦44相同核型相同;5A染色体有4种类型,与川麦44相同的频率为40%;6B染色体有2种类型,与川麦44相同的频率为40%,7B染色体有2种类型,与川麦44相同的频率为40%。660K SNP芯片分析共鉴定到1 106个分布于川麦44所有染色体上的高遗传率区段,平均长度为1.57 Mb。从基因组层面来看,B基因组的区段总长度和总数均最大。从不同染色体来看,区段最长的3条为别为4A、2B和5B,区段数最多的3条染色体分别为4A、2B和3B。利用61个已知的小麦基因功能标记及13个产量相关QTL连锁SNP标记分析川麦44及其衍生品种,再与之前获得的川麦44高传递率区段对比,发现有9个基因的标记和3个QTL位点标记锚定在川麦44高传递率区段内,这些基因被认为是潜在的川麦44高被选择基因。依据功能标记或连锁标记的等位类型推断,其中2个功能基因TaSdrNAM-A1和3个QTL位点QTKW.sicau-2AS.1QTKW.Sicau-4ALQSL.sicau-5AL.2可能是川麦44携带的重要优势等位基因或位点,在培育衍生品种过程中被优先选择保留。5个基因或QTL位点分别对穗发芽、有效分蘖数、千粒重和穗长4个性状具有正向效应。【结论】重要育种亲本川麦44基因组片段在衍生品种中的长度短,具有较高的遗传配合力,易于与不同的同源染色体重组,不易导致连锁累赘问题。TaSdNAM-A1QTKW.sicau-2AS.1QTKW.Sicau-4ALQSL.sicau-5AL.2是利用川麦44育种的5个重要靶基因位点,可加强对其在分子标记辅助育种中应用。

    甘薯丝裂原活化蛋白激酶MPK6对低温胁迫的响应
    靳容,刘明,赵鹏,张强强,张爱君,唐忠厚
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4265-4273.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.002
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    【目的】研究甘薯丝裂原活化蛋白激酶MPK6在抵御低温胁迫过程中的功能,为解析甘薯耐低温机制和遗传改良提供参考。【方法】采用农杆菌介导法,将35S::IbMPK6-GFP重组表达载体和对照载体质粒pDMC83转化甘薯愈伤组织,根据载体上特有的GFP序列设计引物对甘薯拟转基因材料进行分子鉴定,并通过qRT-PCR筛选表达量高的转基因株系。对非转基因植株(WT)和转基因株系进行低温胁迫和恢复处理,观察处理后及恢复后的表型变化;检测叶绿素荧光参数Fv/Fm、丙二醛(MDA)含量和过氧化氢(H2O2)含量等生理指标;利用二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四唑(NBT)染色法观察活性氧的积累情况;分析低温信号转导途径中关键转录因子基因IbCBF3和下游基因IbCOR27的表达水平。【结果】共获得12株IbMPK6过表达甘薯株系,筛选IbMPK6表达量最高的3个过表达株系(L3、L8和L11)用作低温胁迫分析材料。低温胁迫下WT的Fv/Fm为0.50,而转基因株系L3、L8和L11的Fv/Fm分别为0.79、0.79和0.80,与WT呈现极显著差异水平。温度恢复后,转基因植株中Fv/Fm恢复至低温处理前水平,而WT中Fv/Fm仅为0.70,极显著低于转基因植株。低温胁迫下,WT的丙二醛含量为0.05 μmol·g-1,而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量分别为0.02、0.04和0.02 μmol·g -1,显著低于WT。温度恢复正常后,WT中的丙二醛含量为0.03 μmol·g -1,而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量均为0.01 μmol·g -1。DAB和NBT染色结果显示,低温胁迫下,WT叶片与转基因株系叶片相比,染色较深,说明WT比转基因植株积累了更多的过氧化氢和超氧阴离子。过氧化氢含量测定结果显示,低温胁迫下和温度恢复后,转基因植株中过氧化氢的含量均显著低于WT。qRT-PCR结果表明IbCBF3IbCOR27受低温诱导表达,且在WT和转基因株系之间差异显著。【结论】过表达IbMPK6甘薯植株通过缓解光合系统和膜系统的损伤、减少活性氧的积累,提高了对低温胁迫的耐受性。IbMPK6通过调控低温通路中相关基因IbCBF3IbCOR27的表达,参与甘薯低温信号转导途径。

    PvEG261对普通菜豆镰孢菌枯萎病抗性和抗旱性的影响
    薛仁风,丰明,黄宇宁,Matthew BLAIR,Walter MESSIER,葛维德
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4274-4285.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.003
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    【目的】分析普通菜豆PvEG261的序列及表达模式特征,并研究其抗枯萎病和抗旱功能,为普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病和抗旱信号调控网络解析及分子育种奠定基础。【方法】对PvEG261开放读码框(open reading frame,ORF)进行生物信息学分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、二级结构、信号肽序列,在NCBI中通过BLASTP检索高同源性蛋白序列进行序列比对并构建系统发育进化树;利用qRT-PCR技术分析PvEG261组织表达特异性及响应枯萎病原菌、干旱胁迫的表达模式;构建PvEG261过表达载体,转化发根农杆菌K599菌株,诱导普通菜豆产生转基因不定根系,同时构建PvEG261沉默载体,其体外转录产物接种普通菜豆,干扰PvEG261的表达,通过接种镰孢菌枯萎病原菌和干旱处理,观察对照、过表达和基因沉默菜豆植株的表型,进行抗病性和抗旱性鉴定,并测定过氧化氢(H2O2)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性等生理生化指标。【结果】PvEG261的cDNA序列长471 bp,编码156个氨基酸组成的蛋白质。结构预测其含有10个strand结构,基因编码产物预测分子质量为38.89 kD,理论pI为5.21。PvEG261属于Dirigent超家族成员,包含10个氨基酸的信号肽序列,属于外分泌蛋白。PvEG261与豇豆DIR22蛋白亲缘关系最近,达到91.61%。qRT-PCR结果显示,接种枯萎病原菌和干旱胁迫后,该基因的在菜豆根组织中表达量明显上升,而且该基因具有明显的组织表达特异性,在根中的表达量最高。接种病原菌和干旱胁迫后,与对照相比,过表达植株的抗病性和抗旱性水平明显提高,植株枯萎病发病程度及缺水造成的萎蔫程度均显著降低,根中H2O2含量、POD活性、SOD活性均显著高于对照植株,而MDA含量显著低于对照植株,而基因沉默植株发病程度及萎蔫程度均显著升高,根中H2O2含量、POD活性、SOD活性均显著低于对照植株,MDA含量则显著高于对照植株。【结论】PvEG261响应枯萎病原菌侵染和干旱胁迫,并且正向调控普通菜豆镰孢菌枯萎病抗性和抗旱性水平。

    耕作栽培·生理生化·农业信息技术
    我国现代植棉理论与技术的新发展——棉花集中成熟栽培
    聂军军,代建龙,杜明伟,张艳军,田晓莉,李召虎,董合忠
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4286-4298.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.004
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    集中成熟是棉花机械收获的基本要求,系指整株棉花的棉铃集中在一个较短的时间段内成熟吐絮的现象,而集中成熟栽培则是指实现棉花优化成铃、集中吐絮的栽培管理技术和方法。经过多年研究和实践,我国棉花集中成熟栽培的理论和技术业已形成,成为现代植棉理论与技术的重要内容。本文对棉花集中成熟的概念与内涵、关键栽培技术及其生理生态学机理进行了创新性总结。棉花集中成熟栽培要从播种开始,通过单粒精播技术实现一播全苗、壮苗,为集中成熟创造稳健的基础群体;在全苗壮苗基础上,以集中成熟为目标,根据当地的生态条件和生产条件,综合运用水、肥、药调控棉花个体和群体生长发育,构建集中结铃的株型和集中成熟的高效群体结构,实现优化成铃、集中吐絮。单粒精播能够创造适宜的顶土压力和出苗前的黑暗环境,诱导棉苗顶端弯钩形成和下胚轴增粗关键基因表达,促进弯钩形成、下胚轴稳健生长和顶土出苗;出苗后具有独立的生长空间,相互影响小,形成壮苗。密植与化控降低了叶枝叶的光合作用,诱导激素代谢关键基因表达,改变了内源激素含量和分布,抑制了叶枝和主茎顶端生长,实现了免整枝并促进了集中结铃;分区灌溉诱导叶片合成大量茉莉酸,其作为信号分子通过韧皮部运输到灌水区根系,促进水孔蛋白基因表达,提高了根系吸水能力和水分利用率;膜下分区滴灌、水肥协同管理,进一步提高了棉花光合产物向产品形成器官的分配比例和棉株化学脱叶率,促进了集中成熟和高效脱叶,在节水减肥的前提下,产量不减,机采籽棉含杂率显著降低。棉花集中成熟栽培理论与技术是新时代棉花栽培学研究的新成果,是现代棉业发展的重要科技支撑。展望未来,应在深入研究棉花集中成熟栽培生理生态学机制的基础上,选用更加配套的棉花新品种,创新关键栽培技术,研制新的配套物质装备,促进良种良法配套、农艺农机高度融合。同时,还应加强农艺技术与现代智慧植棉技术的有机结合,进一步提高棉花集中成熟栽培的科学性和有效性,为轻简高效植棉提供更加有力的理论和技术支撑。

    基于参数化和非参数化法的棉花生物量高光谱遥感估算
    周萌,韩晓旭,郑恒彪,程涛,田永超,朱艳,曹卫星,姚霞
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4299-4311.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.005
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    【目的】利用高光谱遥感数据快速、无损地估算棉花生物量,评估参数化与非参数化方法在棉花上的表现差异。【方法】本研究以4个棉花品种在2个年份(2004和2005年)的试验资料为基础,将2年数据分别进行建模和验证,采用参数化算法(植被指数法、连续小波变换)与非参数化算法(偏最小二乘回归、随机森林、人工神经网络、回归树、袋装树和增强树、支持向量机和高斯过程回归)分别构建吐絮前和吐絮后的生物量估算模型。【结果】近红外与红边波段仍然是棉花生物量遥感监测中最有效的波段区间。参数化方法运算简单,效率高,其中,CIred edge证明是棉花生物量估算上表现最好的植被指数,具有较高的独立验证结果(吐絮前:RMSE=27.23 g·m-2;吐絮后:RMSE=48.81 g·m-2)。基于连续小波变换的方法缓解了植被指数的低估现象,尤其是吐絮后(吐絮前:RMSE=31.54 g·m-2;吐絮后:RMSE=37.57 g·m-2);在非参数化法中,随机森林是棉花生物量估算的最优算法(吐絮前:RMSE=20.48 g·m-2;吐絮后:RMSE=30.28 g·m-2)。吐絮后的估算精度都显著低于吐絮前,表明两类算法的估算精度都受到棉絮的影响。【结论】本研究评估了基于参数化和非参数化算法构建的棉花生物量估算模型,证明了非参数化方法可以作为棉花生物量无损监测的重要研究方法,该结论也为棉花其他生长参数的估测提供了技术支撑。

    不同降雨年型黑膜垄作对土壤水肥环境及马铃薯产量和效益的影响
    杨封科,何宝林,董博,王立明
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4312-4325.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.006
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    【目的】探索降水年型与垄型互作对黑膜垄作土壤水肥环境及马铃薯产量和效益的影响,解析水肥互作促进作物增产、高效用水机制,为深挖覆膜垄作技术增产潜力提供理论依据。【方法】2016—2018年布置大田试验,以当地推广应用的白膜覆盖双垄集雨耕作(WRF,垄高16 cm,垄宽60cm,沟宽40 cm)为对照,基于垄上微沟集雨耕作技术,设置由黑膜覆盖低垄(垄高16 cm,垄宽 60cm)、中垄(垄高24 cm,垄宽 60 cm)、高垄(垄高32 cm, 垄宽60 cm)+垄上微集水沟(宽20 cm,深10 cm)+垄间小集水沟(沟宽 40cm)组成的3种黑色地膜覆盖垄上微沟集雨土壤水肥调控耕作处理(BLRF,BMRF 和BHRF),测定了马铃薯播种、出苗、现蕾、开花、结薯、成熟6个生育关键时期0—200 cm土层土壤含水量和研究期末0—30 cm土层土壤有机碳及氮磷钾养分含量,计算土壤贮水量、水分利用效率,分析土壤水、肥与马铃薯产量的相关关系。【结果】不同降水年型,黑、白地膜覆盖垄作都显著增加了马铃薯生长发育期对40—120 cm土层土壤水分的消耗。BHRF,BMRF和BLRF处理马铃薯6个生育关键时期0—200 cm土层土壤含水量和贮水量(SWS)都显著高于WRF处理(P<0.05)。较高的降水量以及黑膜覆盖集蓄增加的土壤水对120—200 cm土层的土壤水具有明显的补充作用。在干旱年(2016)和平水年(2017),BLRF和BMRF处理的集水和保水效应较好,BHRF处理次之,都显著优于WRF处理;在丰水年(2018)三者无显著差异,也都显著优于WRF处理。研究期末(2018)黑膜垄作0—30 cm 土层的全氮全钾(TN 和TK)及速效氮磷钾(AN,AP和AK)含量均显著高于白膜垄作(P<0.05),分别增加了4.5%—5.6%、3.6%—5.9%、8.4%—18.4%、15.3%—22.3% 和7.1%—13.3%。归因于显著增加了大薯结薯个数和结薯重,黑膜垄作马铃薯产量、WUE、纯收益和产投比均显著高于白膜垄作,3年平均分别提高了16.9%—19.0%、15.5%—19.2%、23.3%—27.3% 和12.1%—18.2%。这4个效益参数在干旱年和平水年以BLRF和BMRF处理较好、BHRF处理次之,丰水年三者都优于WRF处理,且无显著差异。相关分析表明,3年马铃薯平均产量与研究期末平均土壤氮磷钾养分含量呈显著正相关关系,与作物平均耗水量(ET)呈显著负相关关系(P<0.05)。通径分析表明,土壤AP、AK、AN含量,马铃薯生育期平均耗水量(ET)和平均降水量(GPR)解释了99.4%的产量变化。【结论】黑膜覆盖垄沟与垄上微沟的叠加集水效应显著改善土壤水分状况;水分条件的改善促进了马铃薯旺盛生长,使更多的根茎(茎叶、根等)类有机物归还土壤,其腐解释放的养分与施肥结合提高了土壤养分含量。良好的土壤水肥条件有效改善了土壤水肥互作关系,增加了作物水肥供应而显著提高马铃薯产量、WUE、纯收入和产投比。BLRF和BMRF处理在干旱年和平水年表现较好,BLRF、BMRF和BHRF处理在丰水年表现较好,BLRF和BMRF处理在各种年型都有良好的表现。因此,黑膜覆盖低、中垄垄上微沟集雨耕作(BLRF和BMRF)是继白膜覆盖双垄集雨耕作(WRF)之后最适用于半干旱区的马铃薯高产高效栽培模式。

    植物保护
    苹果锈果类病毒在7个品种苹果上的分子变异及系统发育关系
    李紫腾,曹钰晗,李楠,孟祥龙,胡同乐,王树桐,王亚南,曹克强
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4326-4336.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.007
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    【目的】探究不同品种苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)的分子变异及系统发育关系,为进一步揭示ASSVd分子变异机制打下基础。【方法】以富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信侬红和信侬黄7个品种的染病苹果组织为材料,通过特异性引物对ASSVd全基因组序列进行扩增,然后进行分子克隆和序列测定,利用生物学软件DNAMAN对变异序列一致性进行分析并利用生物学软件MEGA构建系统发育树。【结果】共获得210个ASSVd的基因组序列,共计17种变体,大小为325—333 nt。将不同苹果品种获得的17种变体与其他已发表代表性分离物进行分析发现,所有变体被分为3组,组Ⅰ包括10种变体,同已报道的保定富士分离物(KR264032.1)亲缘关系较近;组Ⅱ包括6种变体单独聚类;组Ⅲ包括1种变体,与新疆红富士苹果上的分离物(EU031455.1)亲缘关系较近。进一步根据基因组0—3、221、251、284、302这8个位点的碱基变异,将17种变体分为6种类型:1、nt 0—3(GGTA)+ nt 41—46(TAAAAT)+ nt 221(T)+ nt 251(T)+ nt 284(G)+ nt 302(T);2、nt 0—3(XGGT)+ nt 41—46(AGATAX)+ nt 221(T)+ nt 251(X)+ nt 284(A)+ nt 302(A);3、nt 0—3(XGGT)+ nt 41—46(AGATAX)+ nt 221(X)+ nt 251(T)+ nt 284(A)+ nt 302(A);4、nt 0—3(XGGT/GGTA)+ nt 41—46(AGATAX)+ nt 221(T)+ nt 251(T)+ nt 284(A)+ nt 302(A);5、nt 0—3(GGTA)+ nt 41—46(TAAAAT)+ nt 221(X)+ nt 251(G)+ nt 284(G)+nt 302(T);6、nt 0—3(GGTA)+ nt 41—46(TAAAAT)+ nt 221(T)+ nt 251(G)+ nt 284(G)+ nt 302(T)。其中X表示缺失。富士品种包含6种变体,以类型4为主(47.5%);王林品种包含3种变体,以类型5为主(43%);金冠包含3种变体,以类型4为主(60%);斗南品种只有1种变体,为类型5,占比100%;中秋王品种只有1种变体,为类型4,占比100%;信侬红包含2种变体,以类型1为主(83.3%);信侬黄包含3种变体,以类型1为主(62.5%)。【结论】根据ASSVd nt 0—3、221、251、284、302这8个位点的碱基变异,将富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信侬红、信侬黄品种中17种变体分为6种类型,不同苹果品种携带的ASSVd种群结构、病毒变体类型及占比均不同。

    TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测西瓜潜隐病毒
    赵立群,邱艳红,张晓飞,刘慧,杨静静,张建,张海军,徐秀兰,温常龙
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4337-4347.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.008
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    【目的】西瓜潜隐病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)是近年来新发生的一种重要种传病害,研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes,TaqMan-qPCR)检测技术,为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV,并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列,设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottled mosaic virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、甜瓜内源病毒(Cucumis melo endornavirus)、瓜类褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus)8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析;利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价;进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据,发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长(分别为1 603和1 466 nt),发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%(GenBank number KY081285、KY081284)。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带;建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度,且能够检测到最低拷贝数为2×103的病毒,灵敏度是RT-PCR的100倍。同时,发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV,而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗均未检出该病毒,表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。【结论】建立的TaqMan-qPCR检测CiLCV技术特异性强、灵敏度高,适用于口岸和实验室开展CiLCV快速检测和精准鉴定。鉴于CiLCV可以通过种子、种苗等传播方式快速扩散,我国应重视种子、种苗的带毒检测,防止带毒种子、种苗流入生产环节进而调运扩散至全国,给产业造成重大经济损失。

    番茄SlN-like的克隆、表达与抗病毒功能
    刘昌云,李欣羽,田绍锐,王靖,裴悦宏,马小舟,樊光进,汪代斌,孙现超
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4348-4357.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.009
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    【目的】番茄(Solanum lycopersicum)作为重要的蔬菜作物,其生长受到包括害虫、真菌、细菌和病毒等各种生物因素的危害。明确番茄抗性基因SlN-like的抗病毒功能与机制,为番茄的抗病毒育种与抗病毒药剂的靶向开发提供理论依据。【方法】从茄科植物基因组数据库Solanaceae Genomics Network中获得SlN-like的全长,并将其分为4段,利用融合聚合酶链式反应(fusion PCR)扩增获得SlN-like的序列全长;通过生物信息学分析SlN-like的进化关系、蛋白特征、保守结构域、亚细胞定位以及互作关系;通过实时荧光定量PCR分析SlN-like在番茄根、茎、叶、花和果实中的表达情况及其在烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)侵染后的叶片表达量;借助烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)沉默番茄内源SlN-like,摩擦接种TMV-GFP于沉默植株,明确SlN-like对病毒侵染的影响。实时荧光定量PCR分析沉默植株中脱落酸(abscisic acid)、茉莉酸(jasmonic acid)和乙烯(ethylene)激素相关基因的表达量及SlN-like在外施乙烯利(ethephon,ETH)3、6、12、24 h后的表达情况,最终明确SlN-like调控激素途径响应病毒侵染的机制。【结果】通过分子克隆与融合PCR技术,从番茄品种Micro-Tom中克隆获得全长3 444 bp 的SlN-like,上传至NCBI获得序列号MW792493。通过生物信息学分析发现SlN-like含有TIR、NB-ARC和NACHT结构域,并与马铃薯(Solanum tuberosum)N-like(AAP44394.1)亲缘关系最近。SlN-like在番茄各组织中均有表达,在茎中的表达量最高,其次是根、花,叶和果实中的表达量最低。TMV-GFP侵染番茄后第5、7天SlN-like的表达显著高于PBS处理,分别是PBS处理的1.6和2.2倍,并且TMV-GFP侵染会使SlN-like的表达持续升高。TRV载体介导沉默番茄的SlN-like,发现沉默78.3%的SlN-like不会影响番茄生长表型,但可促进TMV-GFP侵染;实时荧光定量PCR分析发现沉默植株中ERF1的表达显著降低,仅为对照组的12.5%;外施乙烯利处理番茄3 h后SlN-like表达量升高,并在12 h达到最高峰,是对照组的2.71倍,24 h后恢复正常。【结论】番茄SlN-like属NBS-LRR类抗病蛋白,其表达受TMV侵染诱导,沉默SlN-like促进TMV-GFP侵染,降低乙烯相关基因ERF1的表达,而外施乙烯利导致SlN-like的差异表达,揭示了SlN-like作为正调控因子可能影响乙烯途径介导的番茄抗病毒防御。

    土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境
    绿色发展背景下农业生态补偿理论内涵与定价机制
    周颖,梅旭荣,杨鹏,刘静
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4358-4369.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.010
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    【目的】绿色发展背景下的农业生态补偿机制研究已成为我国农业功能区生态环境保护的一项极为迫切的战略任务。生态补偿标准直接影响政策内部化外部效应的实际效果,重新界定农业生态补偿的理论内涵,确定补偿定价的思路及依据,是提高补贴政策准确性和指向性有效途径。【方法】综合运用规范分析及归纳和演绎法,重新定位以绿色发展为导向的农业生态补偿政策边界,系统划分农业生态补偿的类型与内容,尝试构建以外部效应测度为重点的定价机制,科学回答农业生态补偿“为什么补”及“补什么”等核心问题。【结果】一是科学解析农业绿色发展生态补偿的内涵:农业生态补偿是在对农业资源和环境保护中产生外溢效益(成本)内部化的环境经济手段,补偿核心内容包含对农业资源资产保护补偿和对于农业绿色生产行为补偿两大部分。二是重建绿色生产技术产生的外溢效益与外溢成本价值,根据技术作用于生态系统的环境影响,将补偿内容划分为4种类型:①资源开发建设补偿,针对环境正外部性减少和私人利益损失进行补偿;②资源保护利用补偿,针对生态资本保值和增殖行为进行合理回报;③环境污染治理补偿,针对降低环境负外部性的成本投入及损失给予报酬;④环境质量提升补偿,针对提升环境正外部性的投入及收益损失给予补偿。三是探明4种补偿类型的补偿标准核算依据,其中:资源开发建设补偿应以资源生产或维护的重置成本、资源资产预期收益及发展机会成本为依据;资源保护利用补偿应以资源保护者直接投入、发展机会成本及资源保护的生态服务价值为依据;环境污染治理与质量提升都属于绿色技术应用补偿,其补偿定价主要考虑额外生产成本、环境成本、发展机会成本及技术外溢效益价值等指标因素。【结论】我国以绿色发展为导向的农业生态补偿制度创新,一要从绿色生产的环境贡献视角,划分农业生态补偿政策边界:针对降低环境负外部性和提升环境正外部性生产行为的成本投入及个人利益损失进行补偿;二要从外部性双边界视角,确立补偿定价思路及原则:从理论研究的纵向边界和实践应用的横向边界两个方向,并结合政府财政支付能力确定补偿标准。

    陕西省小农户作物生产的减肥潜力及经济效益评价
    米晓田,石磊,何刚,王朝辉
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4370-4384.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.011
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    【目的】小农户在农业生产中投入的生产资料普遍过高,随种植业结构演变,肥料投入也势必会发生变化。明确小农户经营模式下粮食、油料和经济作物的施肥现状和经济效益,能为小农户作物生产的养分管理、肥料减施和经济效益提高提供参考。【方法】2018年对陕西省的主要农作物生产情况进行问卷调查,以粮食(小麦、玉米、水稻、谷子、马铃薯)、油料(油菜、大豆)、经济(苹果、西红柿、烤烟)作物为研究对象,共获得1 709份调研问卷。基于此调研结果,以产量水平为分类依据,分析小农户的施肥现状、减肥潜力和经济效益。【结果】小麦、玉米、水稻、谷子和马铃薯的平均产量分别为4.6、7.3、8.3、3.7和19.8 t·hm-2,氮肥用量分别为177、247、186、255和209 kg N·hm-2,磷肥用量分别为102、103、88、142和125 kg P2O5·hm-2,钾肥用量分别为37、47、64、53和110 kg K2O·hm-2。油菜和大豆的平均产量分别为2.4和2.7 t·hm-2,氮肥用量分别为156和99 kg N·hm-2,磷肥用量分别为80和63 kg P2O5·hm-2,钾肥用量分别为56和26 kg K2O·hm-2。苹果、西红柿和烤烟的平均产量分别为23.8、93.5和2.7 t·hm-2,氮肥用量分别为731、471和108 kg N·hm-2,磷肥用量分别为482、387和118 kg P2O5·hm-2,钾肥用量分别为535、447和132 kg K2O·hm-2。对大多数作物,氮磷肥普遍过量施用、钾肥施用过量与不足并存。粮食作物氮磷钾减肥潜力分别为28%—60%、52%—66%和11%—51%。油料作物油菜可减少氮磷钾肥料用量33%、37%和46%,然而大豆需增加磷钾肥用量11%、28%。苹果和西红柿等高产经济作物的氮磷钾减肥潜力分别为41%—67%、65%—70%和49%—64%。烤烟生产需减少磷肥53%,然而中、高产农户氮肥施用不足,分别需增施22%、11%。复合肥和单质肥是作物氮素的主要来源,复合肥是作物磷钾的主要来源。氮以基施为主、追施为辅,磷钾肥几乎全部作为基肥一次施用,鲜有追施。粮食、油料和经济作物的平均净经济效益分别0.44×104—1.63×104、0.75×104—0.84×104和4.19×104—15.05×104元/hm2,肥料占总投入比例分别为31%—52%、57%—59%和48%—65%。苹果、西红柿等高产经济作物的净经济效益远高于粮食和油料作物,成为小农户经营者的首选。然而,在经济作物生产中过量的肥料施用产生了巨大的环境风险。【结论】低中产组小农户是化肥减量和收益提升的主要对象,苹果、西红柿等经济作物的净经济效益高,但单位面积施肥量大、减肥潜力大。值得注意的是,农作物生产中也存在施肥不足的现象,例如大豆和烤烟。由此可见,小农户作物生产的肥料管理变异大,提高小农户的肥料管理水平有利于增加作物产量和经济效益、助力农业可持续发展。

    深翻、有机无机肥配施对稻田水分渗漏和氮素淋溶的影响
    王瑾瑜,程文龙,槐圣昌,武红亮,邢婷婷,于伟家,武际,李敏,卢昌艾
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4385-4395.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.012
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    【目的】针对我国长江中下游地区稻麦轮作区常年浅耕与不合理施肥导致的土壤犁底层增厚与土壤板结的问题,研究深耕(打破部分犁底层)与施肥方式对稻田土壤容重、土壤紧实度、土壤水分渗漏量、氮素淋溶量及氮素形态的影响,阐明稻田氮素淋溶量与耕作、施肥方式的响应机制,为稻田合理耕层构建提供理论依据。【方法】(1)基于2015年安徽省舒城县设置两种耕作方式(旋耕12 cm、深翻20 cm)、3种等氮量施肥方式(仅施化肥处理T1、秸秆还田配施化肥处理T2、有机与无机肥配施处理T3)的田间定位试验,2019—2020年监测土壤容重与紧实度以及稻季水分渗漏与氮素淋溶量。(2)通过原状土柱模拟试验,研究深翻30 cm(打破犁底层)对稻田水分渗漏量的影响。【结果】(1)田间试验结果表明,深翻20 cm较旋耕12 cm降低了耕层土壤容重与紧实度,但没有显著增加水稻生育期的水分渗漏量,仅在分蘖期增加7.4%,孕穗期之后无显著影响。(2)土柱试验结果显示,深翻30 cm(打破犁底层)水分渗漏量较旋耕12 cm和深翻20 cm显著增加,淹水时分别增加19.0%与11.0%,非淹水时分别增加23.0%与21.5%。(3)田间试验水分渗漏液中的氮素主要以硝态氮的形式存在,T3较T1和T2处理在水稻进入孕穗期后显著降低渗漏液中硝态氮的浓度;各施肥处理间铵态氮浓度差异不显著。(4)从整个水稻生育期看,两种耕作方式对氮素淋溶量影响不显著,而3种施肥方式下氮素淋溶量存在明显差异,T3处理降低了氮素淋溶量。深翻条件下T1、T2与T3处理氮素淋溶量分别为10.69、11.74和9.14 kg N·hm-2,旋耕条件下分别为9.83、11.21和8.58 kg N·hm-2。【结论】深翻20 cm可以改善土壤物理性状,但不会增加土壤水分渗漏及氮素淋溶;相同耕作方式下,有机与无机肥配施不会增加土壤水分渗漏与氮素淋溶。因此,在长江中下游黏质且犁底层厚(如红黄壤型)的水稻土区,部分打破犁底层,有机与无机肥配施,可构建深厚肥沃的耕作层,且不会增加水分渗漏和氮素的淋溶。

    园艺
    控制桃粘/离核PG基因的BAC克隆筛选与序列分析
    孟君仁,牛良,邓丽,潘磊,鲁振华,崔国朝,王志强,曾文芳
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4396-4404.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.013
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    【目的】控制桃果实粘/离核性状的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因存在串联重复和大片段的缺失。本研究对粘核桃所处的F-M基因座序列特征进行分析,为开发相关分子标记提供依据。【方法】本研究利用构建的粘核桃单株‘87-7-1’基因组的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库,通过PCR筛选出含F-M基因座的阳性克隆,利用单分子纳米孔技术进行全长测序,并对BAC克隆中的插入片段进行基因注释、序列比对和生物信息学分析。【结果】利用已有桃品种的基因组重测序数据设计PCR引物,以BAC文库为模板,扩增F-M基因座上/下游稳定共有的序列,获得了扩增产物上/下游条带均为阳性的目标单克隆46-B-10。全长测序结果表明,BAC克隆的插入片段全长为111 612 bp,GC含量为37.03%。利用基因同源共线性方法对Prunus_persica_v2.0桃参考基因组和BAC克隆之间的同源信息进行比对分析,确定了同源区域。而与已知的桃参考基因组(测序品种为‘Lovell’,离核)序列进行比对,发现只有5个基因(Prupe.4G261700、Prupe.4G261800、Prupe.4G261900、Prupe.4G262000、Prupe.4G262500)序列能比对到该单克隆全长的区域,而‘87-7-1’在相应位置缺失了4个基因共34 kb,其中包括控制桃粘/离核的EndoPGF(Prupe.4G262200)。【结论】与桃参考基因组测序品种‘Lovell’相比,粘核桃单株‘87-7-1’的F-M基因座缺失了EndoPGF,只有EndoPGM,本研究明确了粘核桃F-M基因座的结构变异情况,为粘/离核性状分子标记的开发奠定了基础。

    不同砧木对鲜食葡萄生长和香气品质的影响
    孙磊,王晓玥,王慧玲,闫爱玲,张国军,任建成,徐海英
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4405-4420.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.014
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    【目的】研究葡萄玫瑰香味性状,为生产中筛选合适的砧木以及相关配套栽培技术提供依据。【方法】将早熟玫瑰香味葡萄品种‘瑞都香玉’和‘瑞都红玉’嫁接在5种砧木(110R、1103P、SO4、3309M、5BB)上,以自根苗为对照,形成10个砧穗组合。以成熟期果实为试材,采用顶空固相微萃取的方法,借助气相色谱-质谱联用仪检测果实中挥发性香气化合物和糖苷结合态化合物的种类和含量,依据NIST11谱库和化合物保留指数进行化合物定性,建立标准曲线进行化合物的定量和半定量。比较不同砧穗组合葡萄果实香气含量的差异,并进行主成分分析、回归分析和香气轮廓分析。【结果】就香气化合物种类而言,各种组合一共检测到56种游离态化合物和33种糖苷结合态化合物。其中,5BB对两个品种的游离态香气化合物种类没有影响,瑞都香玉/3309M中未检测到2-甲基-3-丁烯-2-醇、庚醛和3-甲基丁醛,瑞都红玉/3309M中未检测到1-己醇和β-大马士酮。此外,就香气化合物含量而言,1103P、110R和SO4可显著增加‘瑞都香玉’果实中游离态萜烯化合物总量,而5BB对‘瑞都香玉’各类游离态化合物的浓度表现出显著的抑制作用。5种砧木都可以提高‘瑞都红玉’果实中游离态萜烯化合物总量,但对两个品种果实中糖苷结合态化合物的影响都不显著。利用主成分分析可以明显将两个品种区分开。回归分析表明,1-己醇、香叶酸和里那醇是‘瑞都红玉’各种砧穗组合中共有的特征化合物。从香气轮廓上看,110R、1103P、SO4和3309M对‘瑞都香玉’果实中柑橘香和其他花香的贡献显著高于自根苗,而5BB则对‘瑞都红玉’果实中的花香贡献最大。【结论】为充分发挥香气品质,推荐使用110R、1103P和SO4作为‘瑞都香玉’的砧木,不建议使用5BB作为‘瑞都香玉’的砧木;110R、1103P、SO4、5BB和3309M都适合用作‘瑞都红玉’的砧木。

    ‘融安金柑’‘滑皮金柑’及‘脆蜜金柑’贮藏期品质、贮藏特性及果皮转录组分析
    刘恋,唐志鹏,李菲菲,熊江,吕壁纹,马小川,唐超兰,李泽航,周铁,盛玲,卢晓鹏
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4421-4433.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.015
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    【目的】金柑是带皮食用的柑橘类水果,果皮性状不仅关系到消费者口感,也对金柑采后贮藏保鲜产生一定影响。同一遗传背景下的3个金柑品种—‘融安金柑’‘滑皮金柑’及‘脆蜜金柑’果皮差异大。比较3个品种贮藏过程中的内在品质和贮藏特性,并对其果皮进行转录组分析,探讨3个品种金柑果皮差异对其采后特性的影响,旨在为金柑品质调控及采后贮藏保鲜提供新思路新方法。【方法】在商业成熟度采收‘融安金柑’‘滑皮金柑’及‘脆蜜金柑’果实进行贮藏试验,测定贮藏期间果实失水率、可溶性固形物、酸、硬度、剪切力、果皮木质素及纤维素,并对3个品种成熟果皮组织材料进行转录组测序并验证。【结果】采后贮藏分析表明,‘滑皮金柑’失水率高于‘融安金柑’及‘脆蜜金柑’,最早出现果皮皱缩现象,贮藏第99天时,滑皮金柑失水率达38.6%,显著高于‘融安金柑’的5.8%和‘脆蜜金柑’的14.3%。3个品种可溶性固形物和酸含量在贮藏期总体呈上升趋势,‘脆蜜金柑’可溶性固形物含量始终高于其他两者,贮藏22 d后,‘滑皮金柑’酸含量迅速下降并持续低于‘脆蜜金柑’和‘融安金柑’。‘脆蜜金柑’和‘滑皮金柑’内在品质优于‘融安金柑’。从结构上来看,‘融安金柑’贮藏过程中变化较大,贮藏第44天时细胞已破损明显。‘滑皮金柑’‘脆蜜金柑’果实硬度、剪切力显著强于‘融安金柑’;‘滑皮金柑’‘脆蜜金柑’果皮木质素含量(A280·g-1)分别为1.41和1.31,显著高于‘融安金柑’木质素含量(1.12),两者在纤维素含量上也显著高于‘融安金柑’。针对果皮的转录组分析表明,‘融安金柑’‘滑皮金柑’及‘脆蜜金柑’果皮在苯丙烷生物合成途径上存在显著差异,‘滑皮金柑’与‘脆蜜金柑’差异较小,‘融安金柑’与二者差异均较大。基因表达分析显示,‘滑皮金柑’及‘脆蜜金柑’9个木质素合成相关基因表达量均显著高于‘融安金柑’。【结论】3个金柑品种常温条件下可短期贮藏,采后一个月内销售完较为适宜。采后贮藏过程中‘滑皮金柑’因水分散失过快最早失去商品价值,‘脆蜜金柑’外观和内在品质最好。‘脆蜜金柑’果实硬度、剪切力、贮藏性较强与果皮木质素和纤维素含量较高、有色层和白皮层细胞排列紧密密切相关。苯丙烷生物合成代谢较弱引起木质素含量差异与‘融安金柑’果皮韧性差密切相关。

    食品科学与工程
    p-香豆酸通过加速伤口处聚酚软木脂和木质素的沉积促进马铃薯块茎愈伤
    梁伟,朱亚同,柴秀伟,孔蕊,李斌山,李永才,毕阳,DOV Prusky
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4434-4445.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.016
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    【目的】研究p-香豆酸(p-Coumaric acid,p-CA)处理对马铃薯块茎伤口处聚酚软木脂和木质素积累的影响及相关机理。【方法】用0.5 mmol∙L-1 p-CA浸泡切半‘大西洋’马铃薯块茎10 min,以蒸馏水处理作为对照,于室温条件下避光贮存进行愈伤。测定损伤块茎在愈伤期间的失重率以及损伤接种硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)块茎的病情指数,观察伤口处聚酚软木脂和木质素的积累,测定伤口处苯丙烷代谢关键酶和过氧化物酶活性,以及苯丙烷代谢产物和H2O2含量。【结果】p-CA处理显著降低了损伤块茎的失重率和损伤接种块茎的病情指数,14 d时,处理块茎的失重率和病情指数分别比对照低38.46%和43.18%。p-CA处理加速了块茎伤口处聚酚软木脂和木质素的积累,14 d时,处理块茎的聚酚软木脂和木质素的细胞层厚度分别比对照高26.43%和30.26%。p-CA处理还明显提高了块茎伤口处苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酰辅酶A连接酶和肉桂醇脱氢酶的活性,7 d时,处理块茎的酶活性分别比对照高32.17%、23.51%、25.09%和23.08%。14 d时,p-CA处理块茎的肉桂酸、p-香豆酸、咖啡酸和总酚含量分别比对照高34.26、38.29%、19.31%和41.04%;21 d时,处理块茎的阿魏酸、芥子酸含量分别比对照高38.33%和20.47%。此外,p-CA处理促进了块茎伤口处肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木质素的积累,14 d时,处理块茎的肉桂醇和木质素含量分别高于对照36.93%和31.66%;21 d时,处理块茎的松柏醇和芥子醇含量分别高于对照41.43%和34.05%。p-CA处理还提高了块茎伤口处H2O2含量和过氧化物酶活性,7 d时,处理块茎的H2O2含量和过氧化物酶活性分别高于对照40.25%和27.01%。【结论】p-CA处理可通过激活苯丙烷代谢,提高H2O2含量和过氧化物酶活性,促进马铃薯块茎伤口处聚酚软木脂和木质素的积累,从而加速块茎愈伤。

    添加山茶油对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响
    韩柯颖,冯潇,杨玉玲,李珊珊,魏苏萌,陈玉敏
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4446-4455.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.017
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    【目的】研究山茶油添加对凝胶中肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)特性的影响以及结构与凝胶特性间的关系,为其在鸡肉糜类制品中的应用提供理论依据。【方法】取鸡胸肉于4℃下提取MP,在添加山茶油条件下测定其流变特性,水浴加热制成凝胶后测定其硬度、保水性和水分布特性的变化;通过扫描电镜、激光拉曼光谱、表面疏水性(S0-ANS)、总巯基含量、差示扫描量热法(DSC)等分析,探讨山茶油对MP凝胶微观结构、二级和三级结构以及热变性的影响,并分析山茶油添加量、凝胶特性和MP结构之间的相关性,揭示山茶油添加促使凝胶特性改变的原因。【结果】MP凝胶的硬度、保水性和束缚水的百分比(PT21)随着山茶油添加量的增加而显著提高(P<0.05),在4%时分别达到最大值116.60 g、95.77%和80.05%,5%时有所下降。山茶油添加量为4%时,MP加热过程中的储能模量(G')最高,凝胶弹性最大,此时扫描电镜下的MP混合凝胶网络结构均匀、致密,表面粗糙度最低。山茶油的添加(0–5%)影响MP的二级结构,其α-螺旋含量从39.94%显著降低至26.07%(P<0.05),β-折叠含量从22.04%显著升高至27.40%(P<0.05),β-转角和无规则卷曲含量呈上升趋势。山茶油添加量增加到4%时,MP凝胶的表面疏水性达到最高水平,总巯基含量最低。结果表明山茶油的添加促进MP分子内部疏水性氨基酸残基暴露和分子间二硫键的生成,三级结构发生变化,更高的β-折叠含量和疏水相互作用增强MP分子间的聚集和交联。相关性分析表明,山茶油添加量与MP凝胶特性及蛋白质构象的变化显著相关(P<0.05)。DSC结果表明添加的山茶油能与MP相互作用,降低MP的变性热焓。【结论】添加山茶油对MP凝胶特性和结构有显著影响。添加山茶油改变MP的微环境并与MP发生作用,使MP更容易变性并导致其二级结构展开以及三级结构改变,进而改善MP凝胶特性。当山茶油添加量为4%时,混合凝胶特性和三维网状结构最佳。

    畜牧·兽医·资源昆虫
    转录因子TEAD4对猪早期胚胎发育的调控
    张丹丹,许腾腾,高迪,齐昕,宁伟,汝振远,张翔栋,郭腾龙,申屠璐燕,于童,马洋洋,李运生,张运海,曹祖兵
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4456-4465.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.018
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    【背景】众所周知TEA结构域转录因子4(TEA domain transcription factor 4,TEAD4)是TEAD转录因子家族中的一员,在决定啮齿类动物着床前胚胎的特性中发挥关键作用。在小鼠胚胎中发现,可以通过促进Cdx2表达来参与调控着床前胚胎滋养层细胞的谱系分化。若当小鼠胚胎中缺乏TEAD4时可导致小鼠囊胚形成失败。然而,TEAD4在猪早期胚胎发育中的作用尚不清楚。【目的】通过初步阐明TEAD4对猪早期胚胎发育的影响,以期为进一步探索转录因子对猪早期胚胎发育的分子机制奠定理论基础。【方法】利用网页版工具对猪TEAD4进行生物信息学分析,主要包括对猪TEAD4序列的分析,猪与人、小鼠之间同源性的比较,以及TEAD4在不同物种之间进化关系的比较。再通过试验检测TEAD4在猪早期胚胎发育中的作用。首先采用荧光定量PCR技术检测TEAD4在猪卵母细胞和早期胚胎中mRNA表达水平,再通过设计靶向TEAD4的siRNA,采用显微注射技术注入成熟卵母细胞中,降低卵胞质内源性的TEAD4水平,并确定TEAD4 siRNA仅作用于TEAD4,以期确定TEAD4在猪早期胚胎发育中的作用。【结果】 序列分析结果显示:猪TEAD4包含11个外显子,定位于5号染色体上,跨越长度37.188 kb,mRNA全长1 473 bp,编码区全长1 305 bp,编码434个氨基酸;与人、小鼠的同源性分析揭示TEAD4在不同物种中的保守性较高;且在猪和牛上的亲缘关系最近。荧光定量PCR检测基因表达水平结果显示:TEAD4 mRNA在猪卵母细胞和早期胚胎中均有表达,且以GV期卵母细胞为参照时比较发现,MII期卵母细胞表达量最低,并保持较低水平直至4-细胞时期,但到8-细胞时期表达量达到最高,而到桑椹胚和囊胚时期又逐渐下降。通过显微注射靶向TEAD4的siRNA发现:TEAD4 siRNA仅作用于卵母细胞中内源性的TEAD4,而对TEAD1TEAD3不发挥作用;并与对照组和阴性对照siRNA组相比,注射TEAD4 siRNA显著降低8-细胞和桑椹胚时期TEAD4 mRNA表达量,敲低效率达到80%。当敲低TEAD4表达时观察猪孤雌激活和体外受精胚胎的发育效率表明,与对照组和阴性对照siRNA组相比,显著降低TEAD4 siRNA敲低组从8-细胞至囊胚阶段的发育效率。【结论】TEAD4在各物种间保守性高,在猪和牛上的亲缘性最近,TEDA4可参与调控猪早期胚胎的发育。

    山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用
    陈媛,蔡禾,李利,王林杰,仲涛,张红平
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4466-4477.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.019
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    【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T(fast skeletal troponin T3,TNNT3)作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因(NM_001314210.1)和牛TNNT3基因(XM_010821200)mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量(real-time PCR,RT-qPCR)及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织(背最长肌(longissimus dorsi muscle,LD)、半膜肌(semimembranosus muscle,SM)、心、肝、脾、肺、肾)和7个发育阶段(胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300)肌肉组织(背最长肌和半膜肌)中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells,MuSCs)中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3(NM_001314210.1)CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本(TNNT3_15),其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌(P<0.05);出生后则背最长肌中高于半膜肌(P<0.05)。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11(138bp),体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符(37 kD);相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因MyomakerMyoGMyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织(背最长肌和半膜肌)中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。

    基于SodC单克隆抗体的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法的建立及应用
    李敏雪,李剑男,周红,肖宁,蔺辉星,马喆,范红结
    中国农业科学. 2021, 54(20):  4478-4486.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.20.020
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    【目的】胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)是引起猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis, PPE)的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光(IFA)鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示:1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1 024 000;1F7单抗效价为1﹕1 024 000;间接免疫荧光(IFA)结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Cholerasuis,S. Cholerasuis)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为:一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2 500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S. Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2(PCV2)均为阴性;最低检测限为103个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。