当期目录

2016年 第49卷 第21期 刊出日期：2016-11-01

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析

杨占武，杨 君，张 艳，吴金华，李志坤，王省芬，吴立强，张桂寅，马峙英

中国农业科学. 2016, 49(21):  4065-4073.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.001

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【目的】研究棉花NB-LRR家族基因GbRvd的亚细胞定位及超表达烟草的黄萎病抗性，为解析GbRvd介导的植物抗黄萎病机制提供依据。【方法】对真核表达载体pJCV52进行改造，在SpeⅠ酶切位点插入gfp，使其兼具亚细胞定位的功能，命名为GPJCV52。应用Gateway技术构建GbRvd的亚细胞定位和超表达载体，并分别转化农杆菌GV3101。利用生物信息学和农杆菌介导的烟草瞬时表达技术对GbRvd分别进行亚细胞定位预测与观察。采用农杆菌介导法转化烟草，并通过组织培养技术获得转基因植株。运用PCR对超表达GbRvd的烟草进行阳性植株筛选，且利用半定量RT-PCR对阳性转基因植株进行表达检测。制备棉花黄萎病菌孢子悬浮液，通过灌根法对T3代转基因烟草株系进行接种，利用5级标准统计发病情况并计算病情指数。【结果】利用在线分析软件ProtComp预测GbRvd为一种胞外（分泌）蛋白；GbRvd的跨膜预测结果显示其包含3个跨膜域；在线分析软件WoLF PSORT预测结果显示GbRvd在细胞膜、内质网及叶绿体的预测分值分别为7、3和1，表明GbRvd主要存在于植物细胞膜上。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术进一步对GbRvd的亚细胞定位进行观察，结果显示在单独表达GFP蛋白的烟草细胞中，荧光信号在细胞核、细胞质和细胞膜均有分布；而GbRvd与GFP融合表达后的荧光信号主要分布于烟草表皮细胞质和细胞膜。综合生物信息学分析和亚细胞定位观察结果，表明细胞膜和细胞质是GbRvd的主要分布位置。利用农杆菌介导和组织培养获得了转基因烟草植株，通过对转基因烟草植株的PCR检测显示，阳性转基因烟草植株能够通过PCR扩增出与预期大小一致的目的条带，而野生型植株未出现相应条带；阳性转基因烟草植株半定量RT-PCR同样能够检测出与预期大小一致的目的条带，由此表明GbRvd成功整合于烟草基因组并能够进行正常转录。对3个T3代超表达烟草株系的黄萎病抗性进行分析，结果显示超表达GbRvd的烟草植株病情指数显著低于野生型对照植株，表明过表达GbRvd可有效提高植株对黄萎病的抗性。【结论】GbRvd主要存在于植物细胞质和细胞膜，其超表达可显著提高烟草对黄萎病的抗性。

马铃薯块茎蒸煮品质、质构特性及加工型品系筛选

刘 娟，梁延超，隋景航，余 斌，王润润，张小微，程李香，王玉萍，张 峰

中国农业科学. 2016, 49(21):  4074-4084.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.002

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【目的】蒸煮是马铃薯食用最主要的加工方式，马铃薯商业化加工过程中需要对蒸煮加工的品质性状进行定量化分析和分类。根据商业化加工的需求在品种选育中进行蒸煮品质性状的早期选择和筛选，确定蒸煮加工型品种的品质性状特征和相关参数，同时从现有品种和品系中根据商业化加工参数筛选适合不同用途需求的蒸煮品种，是提高蒸煮加工型品种选育效率和方法的有效手段，为制定蒸煮加工型品种选育目标提供基础。【方法】在对马铃薯品种和品系的块茎产量、块茎大小、薯型、薯肉颜色、芽眼深度、抗病性和商品率的初步选择基础上，筛选14个品种和品系进行蒸煮试验，在普通蒸锅中放入块茎蒸煮25 min，蒸熟后，在室温环境冷却20 min，7 d后，分别对蒸煮前后块茎色泽变化、蒸煮前后块茎硬度、蒸煮前后软化度进行测定。同时测定这些品种和品系的干物质含量、淀粉含量、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量、游离氨基酸含量、绿原酸含量、柠檬酸含量、抗坏血酸含量，分析以上成分在蒸煮加工过程中变化对品种和品系块茎的风味、色泽和质构特性的影响，确定蒸煮加工型品种的加工参数。【结果】选育蒸煮加工型马铃薯品种，首先考虑田间综合农艺性状要能够满足商业化生产与加工过程工艺流程和加工机械要求。块茎还原糖含量是影响蒸煮风味中甜度的主要因素，含量应控制在0.4%以下。游离氨基酸含量与蒸煮风味中鲜味有关，14个品种和品系的氨基酸含量差别还不能构成显著的风味差别，所有品种和品系的氨基酸含量介于30—70 µmol。块茎品种风味构成中的苦味来源主要是糖苷碱含量，蒸煮加工型品种的糖苷碱含量应控制在150 mg·kg^-1以下。蒸煮后冷却20 min块茎色泽变化值和蒸煮后7 d的色泽变化值ΔE差值是衡量蒸煮加工型品种色泽变化的重要参数。块茎蒸煮前后的软化度是衡量蒸煮加工型品种质地变化的重要参数。【结论】14个品种和品系块茎蒸煮后的风味、色泽变化、质构特性变化是判定蒸煮加工型品种的重要参数，通过对这些参数的全面分析表明，品种Burbank、Shepody和品系0724-58、0712-66是蒸煮后软化度比较高的品种和品系，而0744-8和0722-26是蒸煮后软化度比较低的品系。

白菜型冬油菜抗寒相关性状的遗传分析

刘林波，孙万仓，刘自刚，武军艳，方 彦，李学才，曾秀存，杨 刚，董 云，陈 奇，方 园，袁金海

中国农业科学. 2016, 49(21):  4085-4095.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.003

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【目的】了解白菜型冬油菜抗寒相关性状的遗传方式，为油菜抗寒性的遗传育种提供一定的理论依据。【方法】以6个抗寒性不同的白菜型冬油菜品种(系)为亲本材料，按照GriffingⅠ配制完全双列杂交组合，将亲本和F1种植后测定抗寒性相关的性状以获得试验数据。采用QGAStation软件中的加性-显性遗传模型和MINQUE（1）法，对白菜型冬油菜越冬率及11个理化性状的遗传方差分量比率、遗传相关性、亲本加性效应、组合显性效应和遗传率以及杂种优势进行分析。【结果】越冬率、POD活性、SOD活性、可溶性糖含量、相对电导率、叶绿素含量、蒸腾速率和气孔导度的遗传主要以加性效应为主，显性效应影响较小；CAT活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量和净光合速率则主要以显性效应为主。在基因型和表现型的相关分析上，越冬率与CAT活性、POD活性、SOD活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、叶绿素含量、蒸腾速率、气孔导度和净光合速率呈极显著正相关，与丙二醛含量和相对电导率则呈极显著负相关。陇油7号和陇油8号在越冬率、CAT活性、POD活性、SOD活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、叶绿素含量、蒸腾速率、气孔导度和净光合速率上的加性效应均呈正值，表明陇油7号和陇油8号可用作提高后代抗寒性的亲本。显性效应分析表明，陇油7号×GY和陇油7号×陇油8号是抗寒性强的组合。狭义遗传率以SOD活性、相对电导率、蒸腾速率和越冬率的表现最好，分别为74.63%、59.06%、57.49%和56.87%，CAT活性最低，为2.83%。CAT活性、可溶性蛋白含量和净光合速率3个抗寒相关性状具有很强的群体平均优势和群体超亲优势。【结论】越冬率、SOD活性、相对电导率和蒸腾速率适宜在早代选择，亲本评价分析指出，陇油7号的一般配合力高, 可作为冬油菜抗寒性改良的首选亲本。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

多年紫云英-双季稻下不同施肥水平对两类水稻土有机质及可溶性有机质的影响

周国朋，曹卫东，白金顺，聂 军，徐昌旭，曾闹华，高嵩涓，王艳秋，志水胜好

中国农业科学. 2016, 49(21):  4096-4106.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.004

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【目的】综合评价中国南方不同水稻土多年冬种紫云英配施化肥的培肥效应。【方法】在湖南紫潮泥、江西黄泥田双季稻区设置了连续7年的田间定位试验，比较冬闲（CK）、紫云英（MV）、紫云英+40%化肥（MV+40F）、紫云英+60%化肥（MV+60F）、紫云英+80%化肥（MV+80F）、紫云英+全量100%化肥（MV+100F）、单施全量100%化肥（100F）共7个处理的稻田土壤有机质（OM）、可溶性有机质（DOM）含量及其光谱学特性。【结果】湖南紫潮泥土壤OM和可溶性有机碳（DOC）含量、DOM的荧光吸光强度明显高于江西黄泥田，可溶性有机氮（DON）含量、DOM的紫外-可见吸收峰值则相反。土壤OM在两地均表现为MV处理显著高于其他多数处理（黄泥田MV+100F处理除外）；同100F相比，MV+100F处理降低了湖南紫潮泥、但增加了江西黄泥田的土壤有机质；而绿肥种植体系下随着配施化肥量的增加，绿肥对两类土壤OM的贡献降低。种植绿肥配施80%—100%化肥，土壤DOC含量较100F高（黄泥田MV+100F除外），但单种绿肥（MV）以及绿肥配施40%—60%化肥对两地土壤DOC影响不尽一致。单种植绿肥能够降低两类土壤DOC/SOC，其中，在江西黄泥田上显著低于100F处理；两类土壤上种植翻压绿肥，随着配施化肥量的增加，土壤DOC/SOC随之增加（黄泥田MV+100F除外），表明配施化肥量越高其活化土壤碳库的作用越强。种植绿肥较100F能够有效降低土壤DON含量（黄泥田MV+100F处理除外），且在湖南紫潮泥上更为显著。紫外-可见光谱分析发现，绿肥及绿肥配施40%—60%化肥下，两类土壤DOM的紫外-可见吸收峰值较100F低，且E250/E365值随配施化肥量的增加而降低，表明随着配施化肥量的增加，土壤DOM分子量增大，分子结构越稳定。荧光光谱分析发现，两类土壤可溶性有机质均以类富里酸为主；与100F相比，单种绿肥（MV）以及绿肥配施化肥（黄泥田配施40%—60%化肥）能够增加土壤DOM的荧光强度，降低DOM的腐殖化指数（HIX）。【结论】种植紫云英能有效促进稻田土壤有机质积累，配施化肥降低紫云英对土壤有机质积累的贡献。绿肥配施化肥能够提高土壤碳库活性，并且增加可溶性有机质的分子量及腐殖化程度，进一步解释了配施化肥降低紫云英对土壤碳库贡献。

1980—2010年东北地区种植结构时空变化特征

刘珍环，唐鹏钦，范玲玲，杨 鹏，吴文斌

中国农业科学. 2016, 49(21):  4107-4119.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.005

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【目的】探讨过去30年东北地区像元尺度种植结构的时空分布特征和演变规律，为东北地区农业政策的调整提供科学基础。【方法】基于1980—2010年东北三省的玉米、大豆、水稻和小麦种植面积的县级统计数据，利用SPAM-China模型获取10 km像元尺度上种植结构的分布信息，构建以像元内种植面积比例超过30%和占比前三位的种植结构类型的判定方式，利用空间叠加方法分析种植比例及其结构类型的时空变化特征。【结果】运用像元结果初步阐明了东北地区的种植结构变化特征，首先种植规模的优先顺序在2000年左右发生了变化，由玉米＞大豆＞小麦＞水稻变为玉米＞大豆＞水稻＞小麦；其次，30年间共出现14种组合类型，包括6种水稻及其组合类型由1980年的8.30%增至2010年18.64%，主要分布于辽河平原、松嫩平原和三江平原等地；7种玉米及其组合类型占比超过三分之二，累积比例增长3.7%，主要分布在东北的中西部，是该地区的主要种植作物；5种大豆及其组合类型累积比例减少4.2%，空间上发生了显著的置换，由散布在三省的格局迅速北移集中于黑龙江；7种小麦及其组合类型累积比例从26.82%降为3.17%，是变化最为显著的种植结构类型，现有少量集中于黑龙江嫩江附近。再次，3种种植结构类型变化较多，一是由开垦耕地带来的新类型，占所有变化类型比例为20.91%，特别是黑龙江省拓荒带来的大规模水稻种植；二是单一作物型变化为两种或以上作物类型组合，占比为34.90%，组合作物主要为水稻和大豆；三是多种作物组合型变为单一作物型，将种植结构类型集聚，占比为41.36%，主要为玉米种植区的调整。【结论】过去30年种植结构类型变化规律为种植结构类型分布受玉米和大豆主导，其中大豆空间转移至黑龙江，水稻正成为东北地区重要种植类型，而小麦则持续萎缩至局部地区，种植结构类型变化趋势将以玉米、大豆和水稻为主，单一化趋势显著。种植结构调整方向应从减少单一玉米型和增加水稻和大豆组合型入手。

基于多时相HJ-1B CCD影像的玉米倒伏灾情遥感监测

王立志，顾晓鹤，胡圣武，杨贵军，王 磊，范友波，王艳杰

中国农业科学. 2016, 49(21):  4120-4129.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.006

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【目的】通过对倒伏发生前后的多时相HJ-1B卫星CCD多光谱影像植被指数的变化分析，实现区域尺度下的玉米倒伏受灾范围监测和灾情评估。【方法】以2015年8月3日因大风暴雨导致大面积玉米倒伏的河北省藁城市为研究区，提取HJ-1B CCD多光谱影像的多种植被指数，根据多时相植被指数变化量与实测倒伏样本的关联分析，筛选玉米倒伏敏感植被指数，采用正态(偏正态)统计理论的双阈值划分策略划定阈值，构建基于植被指数变化分析的玉米倒伏灾情遥感监测模型，评价玉米倒伏灾情严重程度，并基于野外实测样本进行精度评价。【结果】基于城镇、水体、倒伏与未倒伏玉米的HJ-1B CCD2多光谱反射率曲线可得，玉米与城镇建筑物和水体的光谱反射率存在较大差异，在可见光波段，倒伏玉米要高于未倒伏玉米的反射率，然而在近红外波段（830 nm），未倒伏玉米略高于倒伏玉米的反射率。由已提取出玉米种植区域后的前后两期HJ星的差值影像分析可得其像元整体分布趋势基本符合正态(偏正态)分布。由相关性分析可得，倒伏前后的比值植被指数(RVI)差值与玉米倒伏比例具有最高的相关性(R=0.9377)，而且倒伏越严重，其RVI差值越大；通过野外实测样本与模型验证结果进行混淆矩阵分析，总体分类精度达到85.7%，Kappa系数为0.804；研究区玉米倒伏遥感空间制图结果与当地农业技术推广站监测结果基本一致。【结论】倒伏发生后，其玉米长势以及灾后恢复程度均存在较大差异，因此，基于玉米倒伏前后RVI差值的遥感监测模型能有效反映不同倒伏程度的冠层群体变化信息以及长势恢复情况，能在区域尺度下实现玉米倒伏受灾范围监测和灾情等级评估。

植物保护

玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

马双新，刘 宁，贾 慧，戴冬青，许苗苗，曹志艳，董金皋

中国农业科学. 2016, 49(21):  4130-4139.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.007

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【目的】对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）漆酶基因Stlac2进行生物信息学分析，推测其蛋白功能，探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Stlac2表达的影响，并对其进行克隆及原核表达，以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070 (Stlac2)基因的全序列，通过ClustalX与马尔尼菲青霉菌（Penicillium marneffei）PbrB (PMAA_082060)基因、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）Abr2 (AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌（Aspergillus nidulans）YA (AN6635) 基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对，查看Stlac2中的铜离子结合位点，利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测，通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测，采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响；利用RT-qPCR方法分析小分子物质对Stlac2表达规律的影响；采用原核表达系统，以pET-30a表达载体为框架，对其进行原核表达，并将表达蛋白纯化，以ABTS为底物，420 nm下检测漆酶活性。【结果】Stlac2具有典型的Cu离子结合位点，与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%，分子量为61.64 kD，等电点为5.00，平均疏水性为-0.37，表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L^-1香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时，玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸＞香兰素＞4-羟基苯甲醛＞4-羟基苯甲酸＞丁香醛＞对照。而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时，玉米大斑病菌Stlac2的相对表达量明显升高，约为对照的5—8倍。利用原核表达系统，在67 kD处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带，大量表达纯化后，漆酶活性为（40.7±0.3）U·L^-1。【结论】阐明了Stlac2的生物信息学特性，初步断定其为漆酶基因；4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高Stlac2相对表达量，表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用；该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达，体外漆酶活性可达（40.7±0.3）U·L^-1，该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础。

飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

宋慧芳，李应龙，马恩波，张建珍

中国农业科学. 2016, 49(21):  4140-4148.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.008

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【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（β-N-acetylglucosaminidase，NAG）是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析，探究该酶在飞蝗（Locusta migratoria）生长发育过程中的生物学功能，为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据LmNAG1的cDNA全长序列（GenBank: JX888720.1）设计包含酶切位点BamH I、Hind III和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段，双酶切后连接至pFastBacTM-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上，用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带，挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒（baculovirus plasmid，Bacmid）。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9中，72 h内连续观察细胞形态，当出现感染迹象后收集细胞，离心，取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞，裂解并提取蛋白，Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞，提取蛋白，利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化，取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFastBac-LmNAG1重组质粒，酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中，PCR扩增挑选出纯白斑，成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞，72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大，边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞，72 h后收集细胞，Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带，与LmNAG1的理论分子量一致，获得带6×His标签的融合蛋白。大量感染收集细胞提取蛋白，经Ni-NTA琼脂糖层析纯化，进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化，得到了高纯度的目的蛋白。用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057 µg·µL^-1。体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0，且在pH 6.0—8.0范围内具有较高的稳定性；LmNAG1的最适温度为40℃，在40℃以下具有很高的稳定性，当温度高于45℃时热稳定性迅速下降；采用4MU-GlcNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性，可以释放出4MU，它的动力学参数Km值为（0.28±0.02）mmol·L^-1，Kcat值为(902.88±38.15)s^-1。【结论】成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白，其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖，与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能，即参与几丁质的降解。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

黄土丘陵区典型农耕地土壤临界剪切力季节变化

郁耀闯，王长燕

中国农业科学. 2016, 49(21):  4149-4159.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.009

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【目的】研究黄土丘陵区典型农作物玉米和谷子生育期内土壤临界剪切力的季节变化特征及其影响因素，以期为该区的粮食安全生产和土壤侵蚀过程模型建立提供参考依据。【方法】以黄土丘陵区玉米地和谷子地为研究对象，在6组不同的水流剪切力条件下（τ= 5.71—17.18 Pa），借助坡面径流冲刷试验测定土壤的分离能力，结合土壤侵蚀过程WEPP模型，利用线性回归方法推求土壤临界剪切力（τ_c）,分析了玉米和谷子生育期内土壤临界剪切力的季节变化规律。【结果】黄土丘陵区玉米和谷子生育期内土壤临界剪切力具有明显的季节变化规律（P＜0.05），整体呈上升趋势。玉米地τ_c表现为先降低后升高再降低又升高的季节变化模式，变化范围为1.51—4.89 Pa，平均值为3.0 Pa，最小值（1.51 Pa）出现在五叶期，最大值（4.89 Pa）出现在收获期；谷子地τc表现为先降低后升高的季节变化模式，变化范围为1.06—6.53 Pa，平均值为2.93 Pa，最小值（1.06 Pa）出现在幼苗期，最大值（6.53 Pa）出现在成熟期。玉米地和谷子地土壤临界剪切力的季节变化由土壤黏结力、初始含水量等土壤属性的季节变化和作物根系生长所致。两种作物地的土壤临界剪切力与土壤黏结力、初始含水量和作物根重密度间呈正相关关系。在玉米和谷子生育期内，利用土壤黏结力、初始含水量和作物根重密度可以较好地模拟两种作物地土壤临界剪切力的季节变化（R²＞0.74，NSE＞0.72）。【结论】作物根系、土壤黏结力和初始含水量等的季节变化是影响玉米地和谷子地土壤临界剪切力季节变化的主要因素。土壤临界剪切力与根重密度、土壤黏结力和初始含水量间呈正相关关系。用根重密度、土壤黏结力和初始含水量等参数能够较好地模拟玉米地和谷子地土壤临界剪切力的季节变化。

潮土区小麦、玉米残体对土壤有机碳的贡献——基于改进的RothC模型

赵雅雯，王金洲，王士超，武红亮，黄绍敏，卢昌艾

中国农业科学. 2016, 49(21):  4160-4168.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.010

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【目的】为进一步了解秸秆还田对土壤有机碳（SOC）的提升效果，探究作物残体（根系与秸秆）对潮土区SOC的贡献，为华北冬小麦-夏玉米区SOC提升提供理论依据。【方法】基于腐解试验的有机物料碳残留率数据，获得4种有机物料在RothC-26.3模型最优时对应的DPM/RPM参数值（易分解植物残体和难分解植物残体的比值）。利用修订的DPM/RPM参数，获得了改进的RothC-26.3模型，并用郑州潮土区短期腐解试验（2012年11月至2013年11月）和长期定位试验数据（1990—2008年）进行验证，模拟出郑州潮土区冬小麦-夏玉米轮作系统中小麦、玉米残体在3种不同施肥处理下（不施肥CK，平衡施肥NPK和秸秆还田NPKS）对新形成SOC的贡献。【结果】在模型达到最优时，小麦根系（wheat root，WR）、小麦秸秆（wheat straw，WS）、玉米根系（corn root，CR）和玉米秸秆（corn straw，CS）的DPM/RPM值分别为0.89、3.04、4.35和3.25。模型结果显示，CK处理小麦根系、玉米根系的碳投入占碳投入的比例均为50%，而来源于小麦根系、玉米根系的SOC（0—20 cm）占新形成的SOC比例分别为60%、40%；小麦根和玉米根固碳效率分别为15.5%、10.8%；NPK处理小麦根系、玉米根系的碳投入占碳投入的比例分别为60%、40%，而来源于小麦根系、玉米根系的SOC（0—20 cm）占新形成SOC的比例分别为71%、29%；小麦根和玉米根固碳效率分别为17.5%、11.4%；NPKS处理小麦根系、玉米根系、玉米秸秆的碳投入的比例分别为47%、21%、32%，而小麦根系、玉米根系、玉米秸秆对新形成的SOC（0—20 cm）贡献分别为50%、22%、28%；小麦根系、玉米根系、玉米秸秆的固碳效率分别为16.9%、11.2%、11.4%。总之，冬小麦-夏玉米轮作系统中无论是不施肥、平衡施肥还是秸秆还田处理，小麦根系对新形成SOC的贡献率（50%—71%）大于玉米根系和玉米秸秆对新形成SOC贡献率（22%—40%）。源自小麦的SOC占新形成SOC的比例均分别大于源自小麦的碳投入占总碳投入的比例，而源自玉米的投入及其对新形成SOC的贡献则反之。小麦根系的固碳效率（15.5%—17.5%）大于玉米根系和玉米秸秆的固碳效率（10.8%—11.4%）。【结论】改进后的RothC模型可用来探究潮土区冬小麦-夏玉米轮作系统中小麦、玉米残体对新形成SOC的贡献。郑州潮土区冬小麦-夏玉米轮作系统中小麦根系对新形成SOC的贡献率均大于玉米根系和玉米秸秆的贡献率。根茬还田（尤其是小麦根茬还田）更有利于提升土壤有机碳含量。

连续施肥对不同肥力稻田土壤基础地力和土壤养分变化的影响

鲁艳红，廖育林，聂 军，周 兴，谢 坚，杨曾平

中国农业科学. 2016, 49(21):  4169-4178.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.011

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【目的】研究双季稻种植制度下，连续3年施肥与不施肥对不同肥力土壤基础地力产量、基础地力贡献率、土壤氮磷钾表观平衡和土壤养分变化的影响，为不同肥力土壤基础地力培育及土壤肥力维持和提升提供参考。【方法】从32年长期施用不同肥料定位试验的不施任何肥料（CK）、施氮磷钾肥（NPK）和氮磷钾肥配施稻草（NPKS）处理采取土壤，分别代表3种不同肥力水平，设置连续3年施肥与不施肥处理的盆栽试验，监测双季水稻产量、土壤基础地力产量、基础地力贡献率和土壤氮磷钾养分的变化。【结果】在试验期间，不同肥力土壤的早晚稻基础地力产量、基础地力贡献率均表现为：NPKS处理土壤＞NPK处理土壤＞CK处理土壤，且随着试验年限的延长，不同肥力土壤之间的差异呈逐渐缩小趋势，到试验第3年，不同肥力土壤之间的差异变得不显著。无论施肥或不施肥，初始肥力越高的土壤经3年6季水稻种植，由作物收获带走的氮、磷、钾养分越多。不同肥力土壤在连续施肥条件或不施肥条件下，肥力养分变化规律存在较大差异，这种差异与水稻种植体系中养分输入-输出平衡状况有一定关系。【结论】初始肥力越高的土壤如果连续不施肥，其基础地力下降得越快。因此，对于地力水平较低的土壤应注重合理施肥，培育和提高农田土壤肥力和基础地力；地力水平较高的土壤也应注意高效合理补充养分，以维持土壤较高的肥力水平和持续生产力。

园艺·贮藏·保鲜·加工

沟灌方式和灌水量对温室番茄综合品质与产量的影响

李红峥，曹红霞，郭莉杰，吴宣毅

中国农业科学. 2016, 49(21):  4179-4191.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.012

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【目的】探讨沟灌方式和灌水量对温室番茄综合品质、产量、灌溉水利用效率（IWUE）以及综合效益的影响，优化西北地区温室番茄的沟灌方式和灌水量，为该地区温室番茄产业的可持续发展提供科学依据。【方法】通过田间试验，设置常规沟灌（CFI）和交替隔沟灌溉（AFI）两种沟灌方式，以两次灌水的间隔期Φ20 cm标准蒸发皿的累积蒸发量E为基数，设置0.6E、0.8E、1.0E、1.2E四个灌水量梯度，共8个处理，采用主成分分析法和灰色关联度法对番茄品质进行综合评价，以主成分综合得分和灰色加权关联度量化番茄的品质指标，采用变异系数法对番茄的品质、产量、灌溉水利用效率（IWUE）赋权，通过TOPSIS法对各处理下温室番茄的综合效益进行评价。【结果】沟灌方式和灌水量均对番茄品质产生影响，主成分分析法和灰色关联度法对番茄品质综合评价的结果不完全一致，但两者都得出AFI-0.6E、AFI-0.8E为品质最优的两个处理；AFI-0.6E处理相较于产量最高的AFI-1.2E处理减产达22.56%，而AFI-0.8E处理相较于AFI-1.2E处理仅减产9.42%，且AFI-0.8E与AFI-0.6E的IWUE无显著差异；TOPSIS综合评价的结果表明AFI-0.8E处理为综合效益最高的处理。【结论】采用交替隔沟灌溉，灌水量设为0.8E，在提高番茄的综合品质的同时又可以使产量和IWUE处于较高水平，从而获得最大的综合效益，为温室番茄优质、高产、高效的沟灌方式和灌水量的组合。

芦笋三种花蕾性别分化相关差异蛋白表达分析

刘 孟，乜兰春，王珊珊，胡淑明

中国农业科学. 2016, 49(21):  4192-4202.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.013

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【目的】探究与芦笋性别分化相关的蛋白，为揭示性别分化的分子机制奠定基础。【方法】以芦笋雌株、雄株、雄性两性株两性分化期的花蕾为材料，采用双向电泳、质谱鉴定和生物信息学相结合的方法，对其进行蛋白质差异表达分析。【结果】通过双向电泳3次重复试验发现，雌、雄花蕾相比，雄花蕾特异蛋白点25个，上调蛋白点5个；雌花蕾特异蛋白点13个，上调蛋白点12个；雄性两性花蕾与雄花蕾相比，特异蛋白点19个，上调蛋白点8个。经过质谱鉴定及生物信息学分析，鉴定出雄花蕾特异或上调表达同源蛋白6个，包括1个促进α淀粉酶合成的luminal binding protein（BiP）；3个参与糖代谢的蛋白，分别为β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和胞质磷酸甘油酸激酶；1个与质体相关的脂连接蛋白PAP fibrillin和1个未知功能的Os02g0634900蛋白；雄性两性花蕾和雌花蕾特异或上调表达同源蛋白16个，包括2个参与糖酵解过程的蛋白，即烯醇化酶1和胞质磷酸甘油酸激酶；2个维持细胞结构的蛋白，即肌动蛋白亚型B和肌动蛋白；2个参与能量代谢的蛋白，即ATP合成酶CF1α亚基和ATP合成酶β亚基；2个参与细胞内物质运输的蛋白，即小GTP结合蛋白和GTP结合蛋白，1个抑制蛋白质合成的核糖体失活蛋白，1个参与物质运输和信号转导的蛋白，即ADP核糖激化因子相似蛋白，1个催化磷酸基团转移的蛋白，即核苷二磷酸激酶，1个脂质相关蛋白，1个与光合作用（光系统Ⅱ）有关的蛋白，即放氧增强蛋白1，1个允许离子、糖和氨基酸被动转运穿过外膜的蛋白，即细胞外膜孔道蛋白，2个未知功能的蛋白，即细胞内病程相关蛋白亚型4和假想蛋白。【结论】β淀粉酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、胞质磷酸甘油酸激酶、luminal binding protein (BiP)、PAP fibrillin和Os02g0634900在芦笋上的同源蛋白与芦笋雄性器官发育相关；烯醇化酶1、胞质磷酸甘油酸激酶、肌动蛋白亚型B、肌动蛋白、ATP合成酶CF1α亚基、小GTP结合蛋白、GTP结合蛋白、核糖体失活蛋白、ADP核糖激化因子相似蛋白、核苷二磷酸激酶、脂质相关蛋白、放氧增强蛋白1、细胞外膜孔道蛋白和假想蛋白在芦笋上的同源蛋白，ATP合成酶β亚基、细胞内病程相关蛋白亚型4与芦笋雌性器官发育相关。放氧增强蛋白1和细胞外膜孔道蛋白在芦笋上的同源蛋白可能为雌性器官发育的关键蛋白。

龙眼果肉提取物改善东莨菪碱诱导小鼠学习记忆功能

白亚娟，刘 磊，张瑞芬，邓媛元，黄 菲，张名位

中国农业科学. 2016, 49(21):  4203-4213.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.014

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【目的】比较不同剂量龙眼果肉醇提物和水提物对东莨菪碱所致记忆获得性障碍小鼠学习记忆功能的影响，初步解释龙眼果肉改善学习记忆的作用机制。【方法】分析龙眼果肉醇提物和水提物中主要活性物质含量。将无特定病原体（SPF级）雄性昆明小鼠随机分为空白组、模型组、龙眼果肉醇提物低剂量组/高剂量组（150 mg·kg^-1/300 mg·kg^-1）、龙眼果肉水提物低剂量组/高剂量组（150 mg·kg-1/300 mg·kg^-1），共6组，连续灌胃28 d后，空白组腹腔注射等量生理盐水，各试验组腹腔注射东莨菪碱造模，0.5 h后，以潜伏期和穿梭次数为考察指标，采用避暗试验进行行为学测试，作为习得成绩；24 h后再次进行避暗试验，对小鼠进行记忆保持测试，测试结束后摘眼球取血，脱颈致死，取脑组织进行生化指标检测。测定脑组织的胆碱类（乙酰胆碱转移酶choline acetyltransferase，ChAT和乙酰胆碱酯酶acetylcholinesterase，AChE活力）及抗氧化相关指标（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量），血清中抗氧化相关指标（SOD、GSH-Px活力及MDA含量）。通过综合比较各组间行为学试验指标、脑组织、血清生化指标，判断龙眼果肉改善学习记忆功能的作用效果及作用机制。【结果】分析龙眼果肉提取物成分发现，龙眼果肉水提物主要为多糖及蛋白质，醇提物除含有糖类外，还含有较丰富的酚类、黄酮类和磷脂物质，其中，醇提物中总酚、总黄酮、总磷脂含量显著高于水提物的（P＜0.05）。行为学试验表明，模型组小鼠在避暗试验中5 min内穿梭次数为2.89次，是正常小鼠的6.09倍，高剂量龙眼果肉醇提物和水提物组小鼠穿梭次数分别为0.75次和0.56次，与正常组无显著差异；痴呆小鼠在避暗试验中的潜伏期仅为正常组的0.43倍,与模型组相比，各剂量龙眼果肉醇提物和水提物均能显著增加痴呆小鼠在避暗试验中的潜伏期（P＜0.05），且存在一定剂量效应关系，其中龙眼果肉醇提物和水提物高剂量组小鼠的避暗潜伏期分别为289.18 s、290.80 s，与正常组相比无显著差异（P＞0.05）。生化指标方面，与模型组相比，各剂量龙眼果肉醇提物和水提物均能显著增加痴呆小鼠脑组织中ChAT活力，显著降低AChE活力（P＜0.05），且存在一定的剂量效应关系。相同剂量时，龙眼果肉水提物效果优于醇提物，其中龙眼果肉醇提物高剂量组，龙眼果肉水提物低、高剂量组小鼠脑组织中ChAT活力基本恢复正常水平；在抗氧化水平方面，与模型组相比，龙眼果肉醇提物高剂量组显著增加痴呆小鼠脑组织和血清中SOD、GSH-Px活力，显著降低MDA含量（P＜0.05），基本达到正常水平，效果优于同等剂量的龙眼果肉水提物。【结论】龙眼果肉水提物和醇提物均可改善东莨菪碱诱导记忆获得性障碍小鼠的学习记忆功能，但二者的作用机制可能存在差异，龙眼果肉水提物主要通过调节胆碱能神经系统改善学习记忆功能，其主要作用的物质基础可能为多糖或糖蛋白；醇提物则主要通过提高机体抗氧化活力改善学习记忆功能，其主要作用物质可能为多酚、黄酮、磷脂等。

畜牧·兽医·资源昆虫

绵羊MITF-M在黑素细胞中过表达后的功能分析

杨玉静，张丹瑾，聂瑞强，谢建山，范瑞文，高文俊，董常生

中国农业科学. 2016, 49(21):  4214-4221.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.015

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【目的】小眼畸形相关转录因子-M型（microphthalmia associated transcription factor M，MITF-M）在动物皮肤和毛发的黑色素合成途径中发挥重要作用，克隆绵羊小眼畸形相关转录因子-M型基因序列，研究在绵羊黑素细胞中过表达绵羊MITF-M是否影响TYR、TYRP-1和TYRP-2的表达，从而探究对黑色素的生成的影响。【方法】使用试验室冻存的第5代绵羊黑素细胞，通过PCR方法用引物以绵羊黑素细胞cDNA为模板克隆MITF-M基因cDNA序列，构建绵羊MITF-M克隆载体和真核表达载体；通过细胞转染技术在细胞水平过量表达绵羊MITF-M；转染后使用荧光显微镜观察细胞转染效率，采用分光光度计对绵羊黑素细胞中黑色素含量进行测定，并进行Real-time PCR试验检测转染后细胞MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2基因在mRNA水平表达量的变化，Western blot试验检测转染后细胞MITF、TYR蛋白水平的变化。【结果】经测序和拼接，最终获得长度为1 242 bp的绵羊 MITF-M基因的cDNA 序列；成功构建真核表达载体，载体上连有一个启动报告基因绿色荧光蛋白和特异性TYRP-2基因启动子；细胞转染后，在荧光显微镜下可观察到黑素细胞带有绿色荧光说明转染效率明显；分光光度计检测显示，转染后绵羊黑素细胞中黑色素量增加1.15倍（P＜0.05）；荧光定量检测结果显示，绵羊黑素细胞中MITF mRNA表达量增加极显著（P＜0.001），表明绵羊MITF-M转染效率显著，TYR mRNA表达量增加极显著（P＜0.001），TYRP-1 mRNA表达量升高至5.06倍（P＜0.05），TYRP-2 mRNA表达量升高至1.49倍，变化不明显。蛋白免疫印迹结果显示，绵羊黑素细胞中MITF-M转染组MITF蛋白表达量是空载体组的1.65倍（P＜0.001），转染组TYR蛋白表达量是空载体组的2.38倍（P＜0.001），这与荧光定量检测结果一致。【结论】通过PCR和克隆技术及核酸测序技术获得了绵羊MITF-M基因全长1 242 bp的CDS区，过表达绵羊MITF-M会使黑素细胞TYR、TYRP-1的表达量增加，对TYRP-2的表达量变化不明显，从而揭示绵羊MITF-M可以通过调节TYR和TYRP-1的表达量控制绵羊黑素细胞中黑色素的生成。

亚临床型低血钙症奶牛生产性能及粪污排放特性

张子扬，沈泰钰，于洪江，高三思，朱奎玲，黄宝银，徐 闯，杨 威

中国农业科学. 2016, 49(21):  4222-4230.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.016

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【目的】探讨亚临床低血钙症奶牛饲料采食量、泌乳量、粪尿排放量及粪污所产生污染气体排放特征的关系。【方法】黑龙江某集约化奶牛养殖场选取产后7—14 d年龄、体况、胎次相近的奶牛12头，根据血钙指标分为亚临床低血钙症组和健康组奶牛各6头，每头奶牛分别单独饲养，连续饲养4 d。每天采血检测血液中Ca、BHBA、NEFA、CLU、P、Mg指标含量；记录每头牛每天泌乳量、采食量、粪、尿排放量；通过简易动态箱法对试验奶牛粪尿进行混合，检测混合物产生的NH₃、CO₂、CH₄气体排放量并进行分析。【结果】亚临床低血钙症组奶牛血清Ca、P、Mg浓度极显著低于健康组奶牛（P＜0.01），CLU显著低于健康组（P＜0.05），BHBA浓度显著高于健康组（P＜0.05），NEFA浓度极显著高于健康组奶牛（P＜0.01）；亚临床低血钙症组奶牛产奶量和4%能量校正乳（ECM）极显著高于健康组（P＜0.01），排粪量显著高于健康组（P＜0.05）；干物质消化率和尿量的差异虽然不显著但都有升高趋势。亚临床低血钙组奶牛采食1 kg干物质的产奶量极显著升高(P＜0.01)，采食1 kg干物质的排粪量显著升高(P＜0.05)；健康组和亚临床低血钙症组奶牛CH₄的排放曲线无明显差异，两组的产气趋势基本相同，于试验的52 h左右出现峰值，之后下降；总体上看CO₂的排放没有明显变化趋势，无明显规律，健康组和亚临床低血钙症组分别在48和36 h处出现排放高峰，亚临床低血钙症组出现峰值的时间要早于健康组，之后下降随即无规律起伏。亚临床低血钙症组的CO₂累计排放量随时间的推移低于健康组；健康组奶牛NH₃排放浓度在24 h处出现高峰，随后降低，45 h再次出现峰值，之后排放浓度逐渐降低。亚临床低血钙症组奶牛NH₃排放浓度在21 h处出现峰值，之后排放浓度降低，两组试验的折线趋势基本一致，都是出现峰值后浓度降低但都是有起伏的波动。亚临床低血钙症组NH₃的累计排放量低于健康组。【结论】亚临床低血钙症奶牛患病期间由于采食摄取营养物质不能满足泌乳需求而处于能量及钙负平衡状态。同时肠道消化吸收率增加，用于满足泌乳对能量的需求；在相同质量的粪尿混合物检测情况下亚临床低血钙症不会影响CH₄的排放量，但亚临床低血钙奶牛粪尿中NH₃和CO₂排放量低于健康牛，然而降低的温室气体排放是否与肠道消化吸收率的增加促进了饲料能量的吸收有关利用仍需进一步研究。

意大利蜜蜂蜂王与工蜂幼虫甲基供体S-腺苷甲硫氨酸合成与代谢的差异

王 丽，王红芳，胥保华

中国农业科学. 2016, 49(21):  4231-4238.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.017

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【目的】研究意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）蜂王与工蜂幼虫甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）合成与代谢的差异，为探索DNA甲基化与蜜蜂级型分化的关系提供理论依据。【方法】试验选用890只1日龄雌性蜂幼虫，分别来自5群姐妹蜂王群。其中445只进行人工育王（89只/群）；剩余445只培育成工蜂（89只/群）。取3、4、5日龄蜂王和工蜂幼虫，测定其体内SAM合成与代谢关键酶基因表达和酶活性的差异。【结果】蜂王幼虫SAM含量随日龄的增加变化不显著（P＞0.05）；工蜂幼虫SAM含量随日龄增加呈上升趋势（P＜0.05）。蜂王幼虫SAMS基因表达量随日龄增加呈梯度下降的趋势（P＜0.01），而工蜂幼虫SAMS表达随日龄变化不显著（P＞0.05）；3日龄与4日龄时，蜂王幼虫SAMS表达量显著高于工蜂（P＜0.05），5日龄时，工蜂幼虫SAMS表达量显著高于蜂王（P＜0.05）。Dnmt1a与Dnmt3表达在两级型间差异不显著（P＞0.05），其中蜂王幼虫Dnmt1a表达随日龄增加无显著变化（P＞0.05），但其酶活性呈下降趋势（P＜0.05）；工蜂幼虫Dnmt1a表达随日龄增加呈下降趋势（P＞0.05），其酶活性呈上升趋势（P＜0.01），其中3日龄与4日龄时，蜂王幼虫Dnmt1酶活性显著高于工蜂幼虫（P＜0.05），而5日龄时，工蜂幼虫Dnmt1酶活性显著高于蜂王幼虫（P＜0.05）。蜂王Dnmt3表达量随日龄增加呈下降趋势（P＜0.05），工蜂幼虫Dnmt3表达随日龄增加变化不显著（P＞0.05）；蜂王幼虫Dnmt3酶活性随日龄变化不显著（P＞0.05），工蜂幼虫Dnmt3酶活性随日龄变化显著（P＜0.05），但蜂王幼虫Dnmt3酶活性在3、4、5日龄均显著高于工蜂幼虫（P＜0.01）。【结论】3—5日龄意大利蜜蜂蜂王幼虫与工蜂幼虫体内活性甲基供体SAM的合成与代谢存在差异。在4日龄之前，蜂王幼虫SAM的合成比工蜂活跃，4日龄之后，工蜂幼虫的SAM合成与蜂王幼虫相近；在4日龄之前，SAM参与DNA维持甲基化的代谢过程，蜂王幼虫比工蜂活跃，4日龄之后，工蜂幼虫比蜂王幼虫活跃；在3—5日龄，SAM参与DNA从头甲基化的代谢活性，蜂王幼虫始终不低于工蜂幼虫。

研究简报

蝗虫微孢子虫套式PCR检测方法的建立及应用

扈鸿霞，马宇轩，王艳红，林 峻，李占武，季 荣

中国农业科学. 2016, 49(21):  4239-4245.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.018

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【目的】建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）的套式PCR方法，为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持。【方法】以GenBank数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位RNA为目的基因，采用PrimerSelect软件设计两对特异的套式PCR引物P.L.-F1/P.L.-R1和P.L.-F2/P.L.-R2，将微孢子虫液用0.2 mol·L^-1 KOH处理后得到的发芽液作为模板进行PCR扩增，建立以P.L.-F1/P.L.-R1为外侧引物、P.L.-F2/P.L.-R2为内侧引物的套式PCR，扩增产为分别为298和242 bp。对引物浓度、退火温度及循环数进行优化，建立套式PCR方法，以此方法对梯度稀释的微孢子虫液进行灵敏性检测，并对采自哈密地区巴里坤北山的蝗虫样品进行检测。同时对提取的微孢子虫液进行传统的显微镜检测，并比较两种方法的灵敏度。【结果】建立了蝗虫微孢子虫的套式PCR快速特异性检测方法，优化后的PCR反应体系均为20 μL：Buffer（10×）2.0 μL, dNTPs（10 mmol·L^-1）0.3 μL，Taq DNA酶（250 U）0.3 μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）各0.3 μL，微孢子虫发芽液（第2轮以第1轮产物10×稀释液为模板）1 μL，加水补充至20 μL；PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，第1轮60℃退火（第2轮62℃退火）30 s，72℃延伸20 s，共35个循环；72℃延伸10 min，10℃保存。灵敏度试验显示，检测的微孢子虫数量可以达到12.2个孢子/µL（DNA量为1.07 pg·μL^-1）。应用建立的套式PCR方法，对采自新疆哈密地区巴里坤北山的240头蝗虫样品进行了微孢子虫检测，检测结果为23.3%的阳性，而显微镜检测结果阳性仅为3.8%。【结论】 研究建立的套式PCR方法能够快速特异地检测蝗虫微孢子虫的感染，为蝗虫微孢子虫致病性研究及田间应用提供了技术支持。

不同叶幕类型对‘摩尔多瓦’葡萄果穗微域环境及果实品质的影响

刘笑宏，孙永江，孙 红，翟 衡

中国农业科学. 2016, 49(21):  4246-4254.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.019

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【目的】探讨直立叶幕和水平叶幕对‘摩尔多瓦’葡萄果穗微域环境及果实品质的影响，为建立合理的葡萄栽培架式提供参考。【方法】2013年对部分篱架栽培的‘摩尔多瓦’进行架式改造，培养为棚架水平叶幕，与篱架直立叶幕相比较进行研究，其他栽培管理技术一致。2015年6月1日开始，通过温湿度记录仪实时监控直立叶幕和水平叶幕葡萄果穗周围微域环境的温度和湿度，并用光合辐射检测仪实时记录水平叶幕上下及直立叶幕两侧所接受的光合有效辐射。于花后9周开始至果实成熟，每两周采摘两种叶幕类型下的果实，测定发育过程中果实的各项品质指标，分析两种叶幕类型对果穗微域环境和果实品质的影响。【结果】与直立叶幕相比，水平叶幕显著降低了6—9月的果实表面温度、35℃以上高温比例，其中7月份水平叶幕果穗周围35℃以上高温比例比直立叶幕的降低68.97%，8月份水平叶幕未出现35℃以上高温，而直立叶幕高温达41.6℃；同时，水平叶幕增大了果穗微域环境的湿度，减小了其波动，其上部10：00光合有效辐射比直立叶幕东侧低25.8%，而下午14：00比直立叶幕西侧低5.95%，仅中午12：00所受光合有效辐射高于直立叶幕，但水平叶幕下部全天接受光合有效辐射均较低。在果实品质方面，水平叶幕使果实第二次生长量和膨大速率显著增加，其成熟果实纵横径、果形指数及粒重均高于直立叶幕；且水平叶幕提高了成熟果实的糖、酸、总酚及花色苷含量，2015年果实成熟时水平叶幕下果实的还原糖、总酸、总酚及果皮花色苷含量分别比直立叶幕提高了2.40%、4.35%、5.55%及7.04%，同时，水平叶幕使果皮亮度显著提高，红蓝色度加深，即水平叶幕改善了‘摩尔多瓦’的果实色泽。【结论】与直立叶幕相比，水平叶幕改善了‘摩尔多瓦’果实周围的微环境，提高了果实品质。

基于GC-MS技术的蹄叶炎奶牛血浆代谢谱分析

李亚娟，王东升，张世栋，严作廷，杨志强，杜玉兰，董书伟，何宝祥

中国农业科学. 2016, 49(21):  4255-4264.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.020

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【目的】利用气相色谱/质谱联用技术（gas chromatograph tandem mass spectrometer technology, GC-MS）对奶牛血浆进行代谢组学分析，以明确奶牛发生蹄叶炎时血浆中代谢物的变化，进一步揭示其发病机制。【方法】根据蹄叶炎奶牛的临床症状和活动量情况，选取蹄叶炎患病组S和健康对照组C奶牛各10头，采集血浆样品，经衍生化处理后，利用GC-MS方法对两组奶牛的血浆进行全部代谢物检测。用SIMCA-P 11.5软件进行主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘法分析（supervised partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），对蹄叶炎组奶牛和健康组奶牛检测数据进行模式识别分析，筛选差异代谢物,并利用生物信息学方法进行代谢通路富集分析。为进一步验证代谢组学的试验结果，检测了与差异代谢通路相关的脂质代谢指标和抗氧化能力指标。【结果】利用GC-MS方法，在奶牛血浆中共检测到242种代谢物，通过多元统计分析结合t-检验筛选出37种差异代谢物(VIP＞1，P＜0.05)，其中在蹄叶炎奶牛血浆中3种物质含量上调（FC＞1），分别是氨基氧乙酸、油酸、乳糖，34种物质含量下调（FC＜1），包括脂肪酸、氨基酸等。经代谢通路富集分析，发现变化显著(P＜0.05)的代谢通路包括脂肪酸生物合成通路，甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路，不饱和脂肪酸生物合成通路，嘌呤代谢通路，甲烷代谢通路，苯丙氨酸代谢通路和氰基氨基酸代谢通路。在验证试验中，发现两组奶牛血浆中脂质代谢相关指标差异显著，且蹄叶炎患病牛血浆抗氧化能力显著低于健康牛，与代谢组学结果一致。【结论】利用GC-MS技术分析了蹄叶炎患病牛与健康奶牛血浆代谢谱的变化，发现两组间代谢物存在显著差异，并筛选出了37种差异代谢物，而这些差异分子可能成为奶牛蹄叶炎早期诊断或群体监测的潜在生物标记物。本结果全面揭示了奶牛蹄叶炎发生后血浆代谢物的代谢规律，为进一步阐明其发病机制提供理论依据。