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2020年 第53卷 第15期 刊出日期：2020-08-01

  

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中国农业科学. 2020, 53(15):  0. 

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作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

靶向测序基因型检测（GBTS）技术及其应用

徐云碧,杨泉女,郑洪建,许彦芬,桑志勤,郭子锋,彭海,张丛,蓝昊发,王蕴波,吴坤生,陶家军,张嘉楠

中国农业科学. 2020, 53(15):  2983-3004.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.001

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借助于分子标记进行基因型检测的技术在生物遗传改良等领域发挥着重要的作用。国际跨国种业公司凭借其高通量、自动化、大规模的共享检测平台,基因型检测技术得到广泛应用。随着从3G时代的高成本固相芯片和随机测序式基因型检测（genotyping by sequencing,GBS）发展到成本低、对检测平台要求较低、基于靶向测序基因型检测（genotyping by target sequencing,GBTS）的液相芯片,基因型检测技术完成了向4G时代的转变。在本文中首先介绍了两项最新的GBTS技术（基于多重PCR的GenoPlexs和基于液相探针捕获的GenoBaits）及其原理。同时,发展了可以在单个扩增子内检测多个SNP,称之为多聚单核苷酸多态性（multiple single-nucleotide-polymorphism cluster,mSNP或multiple dispersed nucleotide polymorphism,MNP）的技术,极大地提高了目标位点（扩增子）内变异的检测效率。与GBS和固相芯片相比,GBTS技术具有平台广适性、标记灵活性、检测高效性、信息可加性、支撑便捷性和应用广谱性。同一款标记集（例如玉米40K mSNP）,可以获得3种不同的标记形式（40K mSNP、260K SNP和754K单倍型）;并可以根据应用场景的需求,通过控制测序深度获得多种不同的标记密度（1—40K mSNP）。GenoPlexs和GenoBaits 2种技术相结合,可广泛应用于生物进化、遗传图谱构建、基因定位克隆、标记性状关联检测（全基因组关联分析——GWAS和混合样本分析——BSA）、后裔鉴定、基因渐渗、基因累加、品种权保护、品种质量监测、转基因成分/基因编辑/伴生生物检测等领域。目前,已经在20余种主要农作物、蔬菜以及部分动物和微生物中开发了GBTS标记50余套,并已广泛应用于上述领域。最后,展望了与未来GBTS应用相关的几个问题,包括便携式、自动化、高通量、智能化检测平台;根据用户需求定制的可变密度、多功能分子检测;GBTS与其他技术（KASP、高密度芯片、BSA策略等）的整合;基于资源共享的开源育种等。这些将推动GBTS技术在动物、植物和微生物遗传改良等领域的广泛应用。

谷子萌发吸水期关键代谢途径的筛选与分析

余爱丽,赵晋锋,成锴,王振华,张鹏,刘鑫,田岗,赵太存,王玉文

中国农业科学. 2020, 53(15):  3005-3019.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.002

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【目的】谷子适应性强,抗旱耐瘠,是起源于中国的重要作物。通过转录组测序技术分析谷子萌发不同吸水期的转录组差异,以期获得谷子萌发过程中的差异表达基因,寻找调控谷子萌发的重要代谢途径和代谢物。【方法】以晋谷20为材料,构建谷子萌发过程中开始快速吸水期、滞缓吸水期和重新大量吸水期的cDNA文库,进行转录组分析;采用K-Means开展基因表达聚类分析;利用DESeq筛选差异表达基因;通过COG、GO、KEGG等对差异表达基因进行功能注释;利用KEGG富集挖掘不同吸水期调控种子萌发的关键代谢途径和关键基因;并采用qRT-PCR验证其可靠性;用HPLC分析关键代谢物含量。【结果】转录物测序分析获得谷子萌发开始快速吸水期、滞缓吸水期和重新大量吸水期覆盖整个基因组的基因表达谱,共获得33 643个基因,识别9个具有不同表达模式的共表达基因簇。比较种子萌发的开始快速吸水期与滞缓吸水期、滞缓吸水期与重新大量吸水期、开始快速吸水期与重新大量吸水期,分别筛选出3 893、4 612和8 472个差异表达基因。KEGG富集分析表明,3个比较的差异表达基因都显著富集到phenylpropanoid biosynthesis、phenylalanine metabolism、starch and sucrose metabolism代谢途径;开始快速吸水期与滞缓吸水期、开始快速吸水期与重新大量吸水期的差异表达基因还显著富集到plant hormone signal transduction途径。并且3个比较中富集到phenylpropanoid biosynthesis和phenylalanine metabolism代谢途径的差异表达基因数都最多,其中过氧化物酶基因（peroxidase）比例最高。通过qRT-PCR对4个苯丙烷生物合成途径相关基因的分析表明,其表达趋势与转录组分析结果基本一致,其中,4-香豆酸-CoA连接酶3（4-coumarate-CoA ligase 3）在谷子种子中存在已形成mRNA,萌发吸水过程中呈先下调后上调再下调的表达趋势。苯丙烷类相关代谢物含量分析显示,芥子酸在种子中大量储备,在萌发过程中呈下调趋势;阿魏酸、对香豆酸和咖啡酸呈先上调后下调趋势。【结论】谷子萌发过程中,不同吸水期的差异表达基因显著与苯丙烷生物合成途径和苯丙氨酸代谢途径相关;其上游基因4-香豆酰-辅酶A连接酶和下游基因过氧化物酶家族成员在谷子萌发响应水分过程中发挥调控作用;中间产物芥子酸可能参与种子的休眠与萌发。

专题：综合农艺管理与春玉米缩差增效

综合农艺管理推动玉米缩差增效

李从锋,王志刚,王永军,齐华,顾万荣,张仁和,周文彬,赵明

中国农业科学. 2020, 53(15):  3020-3023.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.003

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主要栽培措施对北方春玉米产量贡献的定量评估

杨哲,于胜男,高聚林,田甜,孙继颖,魏淑丽,胡树平,李荣发,李从锋,王志刚

中国农业科学. 2020, 53(15):  3024-3035.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.004

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【目的】定量化解析主要栽培措施对春玉米产量的贡献,探索北方春玉米缩差增产增效技术途径。【方法】通过综合分析2000年以来我国北方春玉米在品种耐密性、种植密度、耕作方式、养分管理、病害防治等114篇论文数据,同时结合大田栽培措施因子替换试验,定量解析主要栽培措施对春玉米产量的贡献及其优先序。【结果】文献统计分析结果与大田栽培因子替换试验结果基本一致,当前生产主要应用的5项主要栽培措施对春玉米产量贡献的优先序为种植密度、养分管理、品种耐密性、防病（兼化控）、耕作方式,对产量的贡献率分别为12.6%、9.2%、6.7%、6.3%和5.5%,对氮肥偏生产力（PFP_N）的贡献分别为16.7%、4.1%、3.4%、3.8%和3.3%。各措施因子对玉米产量差的影响主要通过影响群体物质生产能力和群体库容量实现,当群体LAI饱和后,如何优化群体同化性能、提高光能利用效率和单位叶面积籽粒生产效率是缩差增产的关键。【结论】产量和资源效率协同提高15%—20%的高产高效目标,通过密度和养分管理这2项措施的优化即可实现,若要使产量和资源效率均增加30%—50%,则需要综合优化至少4个因子甚至全部5个因子。

不同栽培技术因子对雨养春玉米产量与氮素效率差异的影响

曹玉军,姚凡云,王丹,吕艳杰,刘小丹,王立春,王永军,李从锋

中国农业科学. 2020, 53(15):  3036-3047.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.005

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【目的】探明不同产量水平模式中增（减）技术因子对玉米产量、养分效率的影响并明确其优先序,以期为不同生产水平玉米产量及氮素效率缩差增效提供理论依据。【方法】通过调研农户、高产高效和超高产3个产量水平的生产模式,确定了种植密度、耕作方式、氮素管理、品种是不同生产模式玉米产量与氮素效率提升的主要技术因子,在此基础上设置了超高产（SH）、高产高效（HH）和农户（FP）3个不同产量水平的综合管理技术模式,针对不同模式中的技术因子设计了裂区试验,以耕作方式为主区、品种为副区,氮肥管理为副副区、密度为副副副区,分析增（减）技术因子对不同生产模式玉米产量及氮素效率的技术贡献率。【结果】FP模式中技术因子对产量贡献率的大小依次为氮素管理、种植密度、土壤耕作、品种,贡献率分别为9.9%、6.0%、4.4%和2.5%;HH模式中栽培措施对产量贡献率的大小依次为种植密度、氮素管理、土壤耕作、品种,贡献率分别为7.7%、5.2%、4.5%和3.5%;SH模式中栽培措施对产量贡献率大小依次为种植密度、土壤耕作、氮素管理、品种,贡献率分别为8.9%、7.3%、6.5%和4.3%。而3种模式中,栽培技术因子对氮素效率贡献率从高到低依次均为氮素管理、种植密度、土壤耕作、品种。其中,FP模式的氮素管理、种植密度、土壤耕作、品种对氮素效率的贡献率分别为30.5%、6.0%、4.4%和2.5%,HH模式分别为19.7%、7.7%、4.7%和4.5%,SH模式分别为25.4%、8.3%、6.5%和4.5%。【结论】技术因子对产量的贡献在不同模式中的优先序不同,不同管理水平下产量差由多因素共同作用形成,技术因子间具有协同效应。当前农户水平下氮素管理方式对产量的贡献率居首位,高产水平下种植密度和土壤耕作对产量贡献较大,而不同产量水平下氮素效率差异主要取决于氮肥管理方式。

优化栽培措施对春玉米密植群体冠层结构及产量形成的调控效应

朴琳,李波,陈喜昌,丁在松,张宇,赵明,李从锋

中国农业科学. 2020, 53(15):  3048-3058.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.006

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【目的】研究春玉米密植群体优化栽培模式下冠层结构特征,并探索其对冠层生产的调控机制及对产量提高的贡献。【方法】以耐密高产品种“中单909”为试验材料,设置105 000 株/hm²种植密度,采用深松（S）、宽窄行（W）及化控（C）的组合,形成4种根-冠优化栽培模式：（1）传统模式（旋耕20 cm,60 cm等行距,RU）,（2）耕层优化模式（深松耕作35 cm,60 cm等行距,SU）,（3）冠层优化模式（传统旋耕20 cm,80 cm+40 cm宽窄行,叶面喷施磷酸胆碱合剂ECK,RWC）,（4）综合优化模式（深松耕作35 cm,80 cm+40 cm宽窄行,叶面喷施磷酸胆碱合剂ECK,SWC）。比较不同栽培模式下冠层大田切片（垂直）、群体光分布、光合性能、蔗糖合成酶活性及籽粒灌浆的差异。【结果】相较于常规栽培模式（RU）,耕层优化模式（SU）的玉米冠层叶片干物质增加,冠层优化模式（RWC,SWC）下密植群体株高和穗位高降低30 cm以上,但群体整齐度下降明显;RWC和SWC处理,叶片垂直分布似“纺锤型”更为均匀,垂直高度180—240 cm的光能截获相比传统模式显著降低8%—37%,而穗位以下（120—180 cm）相比传统模式提高44%—129%;RU和SU处理呈现“漏斗型”株型特征,叶片集中分布在冠层顶部。根-冠协同优化可改良高密玉米群体冠层垂直结构,显著提高穗位及穗下叶片的叶绿素含量、净光合速率,增加穗位叶蔗糖磷酸合酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性,维持生育后期冠层叶片的生理活性,延长干物质活跃积累期10 d以上。【结论】综合优化模式（SWC）改变冠层干物质空间分布,增加了密植群体中下部光能截获和光合碳代谢能力,促进了花后冠层物质生产及籽粒灌浆,显著增加玉米籽粒产量。

不同株型玉米冠层光氮分布、衰老特征及光能利用对增密的响应

柏延文,张宏军,朱亚利,郑学慧,杨梅,李从锋,张仁和

中国农业科学. 2020, 53(15):  3059-3070.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.007

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【目的】探究增密对不同株型玉米冠层光氮分布、衰老特征、及其对光能利用及产量的影响,为陕西春玉米高产高效栽培提供支撑。【方法】于2017—2018年以陕单609（紧凑型）和陕单8806（平展型）为试验材料,设置4个种植密度（45 000、60 000、75 000和90 000株/hm²）,测定了冠层光氮分布、叶片衰老、物质生产、光能利用及产量构成等指标。【结果】陕单609和陕单8806分别在90 000株/hm²（13 824 kg·hm^-2）和60 000株/hm²（9 566 kg·hm^-2）达到了最高产量,与45 000株/hm²相比,90 000株/hm²下陕单609和陕单8806的穗粒数（17.8%和30.1%）和百粒重（15.2%和19.6%）均降低。同一密度下,2个品种的冠层光能截获率和叶片氮素浓度表现为上层>中层>下层,随着密度的增加,2个品种冠层上部光能截获率和叶片氮素浓度不断增加,中层和下层的光能截获率和叶片氮素浓度不断下降,当密度增至90 000株/hm²时,陕单8806冠层中部和下部的光能截获率分别较陕单609低8.8%和70.6%,且陕单609中层和下层的叶片氮素浓度较陕单8806高16.0%和40.5%。当密度从45 000株/hm²增至90 000株/hm²,陕单609和陕单8806成熟期相对绿叶面积分别降低36.4%和63.3%,叶片平均衰老速率分别增加40.2%和34.6%,冠层不同层次叶片衰老启动的时间顺序为下层>上层>中层,与陕单8806相比,90 000株/hm²下陕单609生育后期冠层中上部的绿叶面积较高,且下层维持较高的绿叶面积。随种植密度的增加,吐丝前后的氮素吸收量和氮收获指数显著增加,当密度增至90 000株/hm²时,陕单609吐丝前后的氮素吸收量、氮收获指数分别较陕单8806高23.5%、43.9%、12.7%。增密后生物产量、收获指数、冠层光能截获量和光能利用率显著增加,密度增至90 000株/hm²时,陕单609的生物产量、冠层的光合有效辐射、光能利用率和收获指数分别较陕单8806高26.1%、10.2%、9.1%和14.8%。【结论】与陕单8806比,紧凑玉米陕单609密植下较好协同优化冠层光氮空间分布,增加了群体花后中下部光能截获量,延缓群体冠层花后中下层叶片衰老,促进群体花后干物质和氮素积累,获得更高的籽粒产量和光能利用率。

耕作和秸秆还田方式对东北春玉米吐丝期根系特征及产量的影响

姜英,王峥宇,廉宏利,王美佳,苏业涵,田平,隋鹏祥,马梓淇,王英俨,孟广鑫,孙悦,李从锋,齐华

中国农业科学. 2020, 53(15):  3071-3082.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.008

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【目的】针对东北春玉米主产区秸秆处理的突出矛盾,优化秸秆还田方式对促进该区农业绿色可持续发展意义深远。本文研究了耕作和秸秆还田方式对春玉米根系形态及分布特征、干物积累和产量的影响,旨在为该区域耕作措施调整、实现秸秆还田维持耕地农业生产提供理论依据。【方法】2017—2018年在辽宁沈阳进行田间试验,采用二因素随机区组设计,分别设置秸秆全层翻耕还田（PTS）、秸秆条带翻耕还田（PSS）、秸秆全层旋耕还田（RTS）和秸秆条带旋耕还田（RSS）4个处理。分析不同耕作和秸秆还田方式下春玉米根长、根干重及其空间分布、植株地上部干物质积累动态和产量性状的差异。【结果】耕作和秸秆还田方式对吐丝期春玉米根长及其分布、根干重和比根长影响显著。在0—30 cm垂直土层,PTS处理根长2017年和2018年分别高出其他处理7.9%—43.2%和17.3%—41.5%;在30—60 cm垂直土层,秸秆条带还田（PSS和RSS处理）根长较秸秆全层还田（PTS和RTS处理）平均高出20.1%和20.3%;以植株为中心,PTS处理距植株0—10 cm的根长分布最高,RTS处理最低。根干重在0—10 cm土层表现为RTS处理最低,PTS、PSS、RSS处理2年平均高出36.5%、59.6%和17.3%。PTS处理在0—20 cm土层2年均具有最高比根长,2017年和2018年较其他处理分别高出8.7%—73.8%和14.3%—44.7%。不同处理根表面积的空间分布差异明显,PTS和RSS处理在0—30 cm土层具有较高的根表面积,在水平和垂直方向具有更广的根表面分布。耕作和秸秆还田方式对拔节期、吐丝期和成熟期春玉米地上部干物质积累的影响差异显著,RTS处理较其他处理降低了拔节期茎鞘和地上部总干物重,平均达15.5%—19.2%;PTS处理成熟期果穗和地上总干物重比其他处理提高3.6%—12.3%和2.7%—12.4%,其次为PSS和RSS处理,RTS处理最低。耕作和秸秆还田方式处理显著影响春玉米穗数和籽粒产量,与RTS处理相比,PTS、PSS和RSS处理2年产量平均高出8.3%、7.9%和5.8%;RTS穗数2017年和2018年较其他处理显著降低2.9%—9.1%和7.0%—9.7%。【结论】适当的耕作和秸秆还田方式有利于促进作物根系形态发育及耕层空间分布,促进干物质积累和分配特征优化及成熟期干物质向果穗的分配,达到提高春玉米产量的目的,在本研究区域中推荐秸秆条带翻耕还田方式。

化学调控和氮肥对高密度下春玉米光热水利用效率和产量的影响

刘笑鸣,顾万荣,李从锋,张立国,王明泉,龚士琛,陈喜昌,李彩凤,魏湜,李文华

中国农业科学. 2020, 53(15):  3083-3094.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.009

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【目的】探讨高密度下化学调控和氮肥对玉米光合特性、籽粒灌浆及光热水利用效率的影响,为玉米密植抗逆高产高效栽培提供依据。【方法】于2017—2018年哈尔滨区域玉米生长季,在大田高密度种植下（90 000株/hm²）,设置3个不同氮肥水平N100（100 kg·hm^-2）、N200（200 kg·hm^-2）和N300（300 kg·hm^-2）,7叶期喷施化控剂（玉黄金,30%胺鲜酯·乙烯利水剂）,研究化控和氮肥对高密度种植下玉米生长发育和光热水利用效率的影响。【结果】随氮肥施用量的增加,玉米叶片净光合速率（P_n）、最大光化学效率（F_v/F_m）、籽粒内源激素含量、灌浆速率、光热水利用效率（RUE、HUE和WUE）及产量均呈先升高后降低趋势,在施氮量200 kg·hm^-2下达到最大。与单施氮肥处理相比,化控和氮肥共同作用显著提高了叶片P_n和F_v/F_m,提高了籽粒内源激素含量和灌浆速率,RUE、HUE和WUE显著提高,使产量得到进一步增加。相关分析表明,灌浆速率与籽粒内源激素生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）含量极显著正相关,产量与RUE、HUE和WUE显著正相关。【结论】高种植密度下,200 kg·hm^-2施氮量和化控显著改善玉米的光合特性,促进了籽粒灌浆进程,提高了光热水利用效率,显著提高了产量。

植物保护

小麦、玉米两熟秸秆还田土壤中6种有机酸对小麦纹枯病的化感作用

赵绪生,齐永志,闫翠梅,甄文超

中国农业科学. 2020, 53(15):  3095-3107.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.010

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【目的】冬小麦、夏玉米一年两熟是中国北方最广泛的农作制度,中国北方小麦、玉米生产普遍采用秸秆还田的耕作方式,关于秸秆还田对小麦土传病害的影响一直存在争议。通过分析不同秸秆还田年限地块耕层土壤中的主要有机酸对小麦幼苗生长、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）及纹枯病发生的化感作用,明确我国北方冬小麦、夏玉米一年两熟种植体系下秸秆还田对小麦纹枯病发生的影响。【方法】利用GC-MS技术分析玉米秸秆还田地块耕层土壤乙酸乙酯提取物中化学物质的种类与含量,并分别用氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法、电导率法、氮蓝四唑光化（NBT）还原法和愈创木酚比色法测定含量较高的6种有机酸对小麦幼苗根系活力、根系细胞膜透性、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性的影响,用常规方法测定其对禾谷丝核菌和纹枯病发生的影响。【结果】秸秆还田地块耕层土壤中含有机酸、烷烃、醇、酰胺及醛类等化学物质,相对含量分别为45.45%、17.70%、17.08%、6.12%和5.44%;含量较高的有机酸类物质包括邻羟基苯甲酸（9.24%）、3-苯基-2-丙烯酸（4.12%）、对羟基苯甲酸（3.21%）、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸（2.26%）、二十一烷酸（1.88%）、4-甲氧基邻氨基苯甲酸（1.73%）、8-十八碳烯酸（0.76%）和3-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-2-丙烯酸（0.52%）。0.08—10.0 μg·mL^-1浓度的4-甲氧基邻氨基苯甲酸和3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸对禾谷丝核菌的菌丝生长（10.0 μg·mL^-14-甲氧基邻氨基苯甲酸除外）、菌丝干重和菌核数量均表现明显促进作用,且2种物质在土壤中的含量均随秸秆还田年限延长呈增多趋势。0.4和0.08 μg·mL^-1邻羟基苯甲酸对禾谷丝核菌的菌丝生长和菌核形成有明显促进作用;而50.0 μg·mL^-1邻羟基苯甲酸和4-羟基-3-甲氧基-苯甲酸,以及0.4—50.0 μg·mL^-1苯甲酸均表现为抑制作用。在2.0—50.0 μg·mL^-1浓度范围内,随着6种有机酸浓度的提高,其对小麦幼苗生长的抑制作用越强,对羟基苯甲酸抑制作用最强,其次是邻羟基苯甲酸,4-甲氧基邻氨基苯甲酸最弱。0.4—50.0 μg·mL^-1浓度的3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸、4-甲氧基邻氨基苯甲酸、邻羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸均加重小麦纹枯病发生,其中,3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸助长作用最强,发病率和病情指数最高增幅分别达49.0%和46.7%;而苯甲酸和4-羟基-3-甲氧基-苯甲酸对小麦纹枯病发生无显著影响。【结论】冬小麦、夏玉米一年两熟秸秆还田土壤中含有机酸、酯、烃、酰胺及醛类等化学物质,有机酸类物质相对含量最高。3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸、4-甲氧基邻氨基苯甲酸、邻羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸在一定浓度下均可助长小麦纹枯病的发生,其中3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸助长作用最强,而苯甲酸和4-羟基-3-甲氧基-苯甲酸对纹枯病发生无明显影响。还田秸秆在土壤中腐解产生的有机酸类物质促进病原菌生长、抑制小麦根系生理活性和生长的化感作用,可能是中国北方小麦、玉米两熟秸秆还田条件下小麦纹枯病加重发生的主要原因之一。

白背飞虱酚氧化酶原PPO基因特性及其免疫应答

张道伟,康奎,余亚娅,匡富萍,潘碧莹,陈静,唐斌

中国农业科学. 2020, 53(15):  3108-3119.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.011

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【目的】酚氧化酶（phenoloxidase,PO）是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原（prophenoloxidase,PPO）形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱（Sogatella furcifera）3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的dsRNA作为对照组,通过注射合成的dsSfPPO后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的开放阅读框长度分别为2 079、999、2 070 bp,分别编码692、332、689个氨基酸,预测蛋白分子量分别为79.84、37.67、79.53 kD,等电点分别为6.43、9.56、6.20。生物信息学分析表明,白背飞虱的3个PPO蛋白具有较高的同源性,且与褐飞虱（Nilaparvata lugens）的亲缘关系最近;SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2均在成虫第3天表达量最高,其中SfPPO2-1和SfPPO2-2的发育表达模式相似;SfPPO1和SfPPO2-1在表皮和脂肪体内表达量较高,而SfPPO2-2在翅和脂肪体内表达量较高,在头、足、中肠、马氏管中表达量相对较低;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后都能够显著沉默目的基因的表达,而且当SfPPO2-1表达被沉默后,SfPPO1出现显著高表达,说明不同的PPO之间可能具有补偿功能;大肠杆菌诱导后12 h,SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量显著升高,SfPPO1表达量则在诱导24 h后显著升高;枯草芽胞杆菌诱导24 h后,SfPPO1、SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量均显著升高。【结论】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的表达存在组织和龄期特异性,且在不同菌诱导情况下存在免疫应答差异性。研究结果有助于更加全面、深入地探索白背飞虱酚氧化酶在调控昆虫发育及免疫中的潜在分子机理。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

中国玉米主产区土壤养分的空间变异及影响因素分析

赵晴月,许世杰,张务帅,张哲,姚智,陈新平,邹春琴

中国农业科学. 2020, 53(15):  3120-3133.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.012

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【目的】分析中国玉米主产区耕层土壤养分含量现状、区域空间变异规律及其影响因素,以期为各地玉米田土壤养分调控和合理施肥提供指导。【方法】以全国玉米主产区为研究区,于2017年玉米收获季开展大规模土壤采集和农户调研工作。结合地统计学和地理信息系统（GIS）,探究土壤养分的区域变异特征和分布格局;根据相关分级标准,评价玉米主产区当前土壤肥力现状;并通过相关性分析和方差分析,对引起土壤养分变异的主要影响因素（土壤质地、气候和肥料施用）进行探讨。【结果】中国玉米主产区耕层土壤pH中值为 6.9,养分含量的中值分别为有机质21.0 g·kg^-1、全氮1.5 g·kg^-1、有效磷22.4 mg·kg^-1和速效钾164.5 mg·kg^-1,上述指标的变异系数分别为12.7%、48.5%、50.0%、83.6%和52.0%,均表现为中等程度变异。土壤有机质、全氮、有效磷和速效钾含量主要集中在中等至极高肥力水平,共占主产区总面积的93.5%。土壤养分存在明显的区域变异性,土壤有机质、全氮和有效磷含量在东北春玉米区最高,分别为32.0 g·kg^-1、2.2 g·kg^-1、32.3 mg·kg^-1,在西北春玉米区最低,分别为17.2 g·kg^-1、1.2 g·kg^-1、16.2 mg·kg^-1;速效钾含量在西南玉米区最低,其他3个区域无显著差异。在国家尺度上,土壤pH值具有强烈的空间自相关性（块基比<25%）,其变异主要受自然因素（土壤质地和降水）影响;有效磷具有较弱的空间自相关性（块基比>75%）,其变异主要受人为因素（肥料施用）影响;有机质、全氮和速效钾具有中等的空间自相关性（块基比25%—75%）,其变异受自然和人为因素共同影响。【结论】东北区土壤肥力高,玉米生产应适量减少施肥量,以节约肥料成本;华北区土壤养分含量适中,应严格控制氮、磷化肥投入,以增加肥料利用率并减少环境污染;西北区土壤养分含量较低,可以适当增加肥料用量进一步实现玉米增产;西南区内土壤肥力变异较大,各亚区应采用适宜的施肥方式,以提高土壤的保肥能力和玉米产量。

畜禽养殖废弃物堆肥过程中微生物除臭研究进展

魏启航,任艳芳,何俊瑜,李兆君

中国农业科学. 2020, 53(15):  3134-3145.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.013

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随着世界各国的畜禽养殖业向着集约化、产业化方向发展,养殖废弃物大量产生,严重影响到生态环境并威胁到人畜健康。目前,畜禽养殖废弃物的资源化利用受到人们的广泛关注,其中好氧堆肥技术是当前最有效的处理方法。然而,堆肥过程中产生的异味气体使好氧堆肥技术的推广面临极大挑战。在堆肥过程中,这些异味气体威胁人类健康的同时,还会带来一系列环境问题。因此,充分、有效的去除堆肥过程中异味气体显得十分重要。本文重点阐述了堆肥过程中异味气体排放特征及其源物质转化特征,分析堆肥过程中影响异味气体产生的因素,并从原位除臭技术和异位除臭技术两个方面对异味气体生物处理技术以及微生物控制机理进行讨论。主要结论：异味气体（NH₃、H₂S和挥发性有机物）主要在堆肥的升温期和高温期产生;控制最佳堆肥温度为55—60℃、水分为50%—60%、pH为7.5—8.5、C/N为25—30、氧气浓度为10%—18%、有机质含量为50%—80%,结合适宜的堆肥方式、翻堆频率以及添加外源微生物,可使异味气体产生量降至最低;一种除臭微生物菌株一般只对一种异味气体具有较高的去除效率,难以同时去除多种成分的异味气体,而复合微生物除臭剂可以同时去除多种异味气体成分,但去除效率相对较低。建议进一步研究有机质转化、微生物群落变化与异味气体产生的规律,从而在堆肥升温期和高温期尽可能地减少异味气体的产生;重点研发复合除臭菌剂,在提高除臭效果的同时探明微生物作用机理。

园艺

应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

原贵波,莫双榕,钱莹,臧栋楠,杨帆,蒋红亮,武媛,丁海东

中国农业科学. 2020, 53(15):  3146-3157.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.014

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【目的】含有VQ基序（VQ）的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交（Y2H）显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白（空GST为阴性对照）,利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B（RACK1B）,通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。

葡萄钾离子通道基因VviSKOR的克隆、表达及电生理功能

沈静沅,唐美玲,杨庆山,高雅超,刘万好,程杰山,张洪霞,宋志忠

中国农业科学. 2020, 53(15):  3158-3168.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.015

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【目的】从葡萄中克隆并鉴定钾离子通道基因VviSKOR,在转录水平分析其组织特异性表达特征及对缺钾、氯化钠（NaCl）与脱落酸（ABA）等胁迫的响应情况,通过膜片钳电生理技术研究其生理学功能。【方法】通过同源克隆法,在葡萄基因组中筛选并鉴定钾离子通道基因VviSKOR;借助多种生物信息学软件分析葡萄SKOR及其编码蛋白的特征;利用MEGA 7.0软件建立葡萄、拟南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、大豆、番茄、黄瓜、白杨、桃、梨、草莓、苹果、木瓜、柑橘、香蕉、凤梨等18种不同科属植物SKOR同源蛋白成员的系统进化树;利用实时荧光定量PCR分析VviSKOR在葡萄不同组织部位的表达模式及对缺钾、NaCl、ABA与sorbitol等胁迫的响应情况;利用膜片钳电生理系统分析葡萄VviSKOR的生理学功能。【结果】在葡萄基因组中克隆获得一个钾离子通道基因VviSKOR,其编码蛋白含有环核苷酸结合域、离子通道跨膜域、Ankyrin repeats和KHA功能结构域,属于典型的Shaker类钾离子通道;18种不同科属植物SKOR蛋白在氨基酸水平具有58.92%的一致性,系统进化树表明葡萄VviSKOR与黄瓜CsaSKOR紧密聚在一起,其遗传进化关系上较近,4种禾本科植物（玉米、水稻、短柄草和高粱）SKOR家族成员在系统进化树上更倾向于聚在一起,而同属蔷薇科植物（草莓、苹果、梨和桃）SKOR在进化关系上紧密聚在一起;亚细胞定位预测表明葡萄VviSKOR蛋白主要定位于细胞质膜,且含有6个跨膜区,其等电点PI为6.24,表明该蛋白含有偏酸性氨基酸残基较多;在VviSKOR启动子区域预测到12种顺式作用元件,主要包括胁迫响应、激素响应和细胞周期调控等不同生命活动相关的调控元件;数据库表达谱分析结果表明葡萄VviSKOR在多种组织或器官中均有表达,在葡萄树根中的表达水平最高,其次是叶和木质部;实时荧光定量PCR分析表明VviSKOR在7年生‘马瑟兰'葡萄树根部和幼苗根部的表达水平均最高;幼苗中,VviSKOR在转录水平对高钾处理没有响应,但对缺钾、ABA和NaCl胁迫处理较为敏感,其在检测幼苗根部、茎部和叶片中的表达量均被缺钾和ABA抑制而降低,却受NaCl胁迫诱导而显著增强;转染pTracer-CMV3-SKOR质粒的HEK293-T细胞记录到外向电流,且随细胞外钾离子浓度的增加而降低,表明VviSKOR为一外流型钾离子通道,此外,记录到的电流随着电压的增加而增加,说明VviSKOR也是电压依赖型钾离子通道。【结论】葡萄VviSKOR与黄瓜CsaSKOR在遗传进化关系上最为相近;VviSKOR主要在葡萄根部（成年树和幼苗）表达,幼苗中VviSKOR在转录水平受缺钾、ABA和NaCl胁迫的调控;VviSKOR是葡萄根部主导钾离子外排的钾离子通道。

畜牧·兽医·资源昆虫

靶向猪内质网应激通路的microRNAs预测与验证

朱静静,周晓龙,汪涵,李向臣,赵阿勇,杨松柏

中国农业科学. 2020, 53(15):  3169-3179.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.016

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【目的】预测并验证靶向猪内质网应激通路中关键基因的microRNAs（miRNAs）,为进一步研究miRNAs对猪内质网应激信号通路调控提供理论基础。【方法】首先利用伪狂犬病毒（PRV）感染猪肾上皮（PK15）细胞,高通量测序检测差异表达的miRNAs。然后通过TargetScan预测靶向内质网应激通路关键基因ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的miRNAs。构建含有候选miRNAs作用位点的双荧光素酶报告基因重组载体,并分别与miRNA-mimics共转染幼仓鼠肾（BHK-21）细胞,通过测定荧光素酶活性来验证内质网应激通路关键基因与候选miRNAs的靶标关系。然后在PK15细胞中分别过表达候选miRNAs,利用qRT-PCR和Western blot检测候选miRNAs对内质网应激通路关键基因mRNA和蛋白表达的影响。【结果】miRNA测序结果显示,PRV感染后共引起35条miRNAs差异表达。TargetScan预测显示,靶向ATF6、IRE1、PERK、GRP78、XBP1的交集miRNAs为miR-142-5p、miR-145-5p、miR-150和miR-199a-5p,并将这些交集miRNAs作为候选miRNAs。随后成功构建psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m145-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m150-3′UTR、psiCHECK-2-ATF6-m199-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1- m150-3′UTR、psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR、psiCHECK-2-PERK-m145/150-3′UTR、psiCHECK- 2-XBP1-m142/ 145/150/199-3′UTR、psiCHECK-2-GRP78-m145/199-3′UTR双荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶检测结果显示,miR-142-5p显著抑制psiCHECK-2-ATF6-m142-3′UTR荧光素酶活性。psiCHECK-2-IRE1-m142/145/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-145-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,以及psiCHECK-2-XBP1-m142/145/ 150/199-3′UTR分别与miR-142-5p mimics、miR-199a-5p mimics共转染,过表达组的荧光素酶活性均极显著低于阴性对照组。同时miR-145-5p能够显著抑制psiCHECK-2-PERK-m145/ 150-3′UTR荧光素酶活性。这些结果表明miR-142-5p、miR-145-5p和miR-199a-5p均有可能分别靶向ATF6、IRE1、XBP1,而其中miR-142-5p可能同时靶向这三个关键基因调控内质网信号通路。通过qRT- PCR和Western blot分析发现,过表达miR-142-5p后显著抑制ATF6的mRNA和蛋白表达,表明miR- 142-5p靶向ATF6参与调控内质网应激信号通路。【结论】验证了靶向内质网应激通路关键基因ATF6的miRNA- miR-142-5p,为进一步研究miR-142-5p通过调控ATF6的表达而影响内质网应激信号通路奠定了基础。

松针多糖对鸡巨噬细胞HD11的天然免疫调节

崔小珍,栾艳,李婷婷,杨裕,关文超,张凯,王福传,宋献艺

中国农业科学. 2020, 53(15):  3180-3186.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.017

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【目的】探讨松针多糖对鸡巨噬细胞HD11的天然免疫功能的影响,以期为松针多糖在肉鸡疾病防治方面应用提供科学依据。【方法】试验采用不同浓度的的松针多糖作用于巨噬细胞HD11,试验分为空白对照组、阳性对照组（终浓度为1 μg·mL^-1的LPS）和松针多糖组（终浓度分别为25、50、100、200、400 μg·mL^-1的松针多糖）。噻唑蓝（MTT）检测巨噬细胞HD11细胞活性、Griess法检测巨噬细胞HD11细胞上清液中一氧化氮（NO）分泌量、中性红吞噬试验检测巨噬细胞HD11吞噬活性,酶联免疫（ELISA）检测巨噬细胞HD11细胞上清液中干扰素-α（IFN-α）、一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-10（IL-10）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量,荧光定量PCR技术检测HD11细胞中iNOS mRNA表达。【结果】 MTT试验结果表明：与空白对照组相比,不同浓度的松针多糖（25、50、100、200、400 μg·mL^-1）对细胞活性没有影响,说明在25-400 μg·mL^-1范围内对巨噬细胞没有毒性,可以进行免疫调节作用实验。免疫调节作用试验结果表明：与空白对照组相比,不同浓度的松针多糖极显著（P<0.01）增加了NO释放量和细胞吞噬活性,极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）提高了细胞因子IFN-α的含量和iNOS的含量及mRNA的表达量,极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）降低了细胞因子IL-10的分泌量。当松针多糖浓度在50、100、200、400 μg·mL^-1浓度时,细胞因子IL-6和TNF-α的含量极显著（P<0.01）高于空白对照组。与阳性对照组相比,不同浓度的松针多糖极显著（P<0.01）降低NO释放量,极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）降低了细胞因子IFN-α的含量、iNOS的含量及mRNA表达量和IL-10含量。当松针多糖浓度在25、50、100 μg·mL^-1浓度时,细胞吞噬活性极显著（P<0.01）低于阳性对照组,细胞因子IL-6的含量极显著（P<0.01）低于阳性对照组。当松针多糖浓度在25、50、100、200 μg·mL^-1浓度时,细胞因子TFN-α的含量极显著（P<0.01）低于阳性对照组。【结论】松针多糖能显著提高巨噬细胞HD11的天然免疫调节能力,且存在剂量依赖效应。

微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制

耿四海,石彩云,范小雪,王杰,祝智威,蒋海宾,范元婵,陈华枝,杜宇,王心蕊,熊翠玲,郑燕珍,付中民,陈大福,郭睿

中国农业科学. 2020, 53(15):  3187-3204.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.018

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【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子与侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂的东方蜜蜂微孢子虫的差异表达miRNA（DEmiRNA）及其靶mRNA进行系统分析,筛选、分析和探讨病原毒力因子和侵染因子相关的DEmiRNA及调控网络,在miRNA组学层面揭示东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫感染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠和东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子（NcCK）进行深度测序,通过连续比对rRNA数据库、西方蜜蜂（Apis mellifera）基因组和东方蜜蜂微孢子虫基因组筛滤出处于侵染过程的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1和NcT2）数据和东方蜜蜂微孢子虫孢子的测序数据。根据P≤0.05,|log₂ fold change|≥1的标准,通过比较分析筛选出各比较组中的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）。通过相关生物信息学软件对DEmiRNA进行表达谱分析,靶mRNA预测及功能和代谢通路注释,以及调控网络的构建与分析。通过Stem-loop RT-qPCR验证DEmiRNA的差异表达趋势及测序数据的可靠性。【结果】NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别包含164、122和60个DEmiRNA。Venn分析结果显示,3个比较组共有的上调和下调miRNA分别为5和6个。上述DEmiRNA分别预测出1 885、1 733和1 524个靶mRNA。这些靶mRNA分别注释到27、25和26个功能条目,其中注释数量最多的是新陈代谢进程、催化活性、细胞进程、结合和细胞。上述靶mRNA可分别注释到84、84和84条代谢通路,其中注释数量最多的是代谢途径、核糖体和次级代谢产物生物合成。此外,对于NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2中的DEmiRNA,分别有35、26和12个靶向结合MAPK信号通路相关靶mRNA,分别有49、40和17个DEmiRNA靶向结合糖酵解/糖异生通路相关靶mRNA。进一步分析发现,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA参与调控蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等病原毒力因子的基因表达,以及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子的基因表达。【结论】通过对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子与侵染意蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫进行深入细致的miRNA组学分析和探讨,解析了病原侵染过程的miRNA差异表达谱,揭示了东方蜜蜂微孢子虫可能通过调节相应miRNA的表达水平对蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等毒力因子及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子基因表达进行调控,从而适应宿主细胞内的环境并促进自身的增殖与侵染。