中国农业科学

水稻短穗小粒突变体sps1的鉴定与基因精细定位

谢佳，张孝波，陶怡然，熊毓贞，周倩，孙莹，杨正林，钟秉强，桑贤春

中国农业科学. 2018, 51(9): 1617-1626. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.001

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【目的】通过对一个水稻短穗小粒突变体的鉴定与基因精细定位，为水稻等禾本科作物的籽粒发育及分子改良奠定基础。【方法】在水稻EMS诱变体库中鉴定到一个短穗小粒突变体，暂命名为sps1（shorten panicle and seed 1）。成熟期观察野生型和sps1的形态变化，考察株高、节间长、穗实粒数、结实率和千粒重等农艺性状；对野生型和sps1籽粒外稃内外表皮中部进行扫描电镜观察，并利用石蜡切片进一步分析野生型和sps1籽粒的形态变化；配制缙恢10号/sps1杂交组合进行遗传分析，并利用其F₂群体进行基因精细定位；对野生型和sps1两叶一心期的叶鞘进行油菜素内酯（brassinolide，BR）敏感性试验；抽穗期分析SPS1在水稻根、茎、叶、鞘和穗中的表达，并对籽粒发育相关基因和BR相关基因进行qPCR分析。【结果】sps1穗和倒1、2、3的节间长度均极显著短于野生型，导致株高半矮化；此外，sps1穗枝梗数、结实率和千粒重也显著降低；扫描电镜观察发现sps1外稃中部内外表皮细胞长度极显著小于野生型，宽度则极显著变大，石蜡切片观察进一步证实了sps1籽粒宽短是由细胞变短、变宽造成的；籽粒发育相关基因qPCR分析发现，部分通过调控细胞分裂和扩展进而影响水稻籽粒发育的基因表达量发生了显著变化，在sps1中，AFD1、SLG、HGW和GS3的表达量显著上调，GW7和GID1显著下调；选取符合3﹕1分离比例的F₂代分离群体中的突变单株进行基因定位，最终将调控基因精细定位在第7染色体上标记sps1-3和sps1-2之间134 kb的物理范围内，包含19个注释基因；经测序，与野生型相比，发现sps1中的Os07g0616000在编码区有一个A-T的碱基替换，致使编码的赖氨酸变成了终止密码子，导致蛋白翻译提前终止，初步确定为候选基因。qPCR分析发现SPS1在水稻的根、茎、叶、鞘和穗中均有表达，且在茎秆中的表达量最高；生物信息学分析发现，SPS1是DEP2的一个新等位基因。sps1对外源BR的敏感性降低，BR钝感基因D1的表达极显著下调；推测SPS1/DEP2可能通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。【结论】sps1是一个水稻短穗小粒突变体，SPS1编码一个表达蛋白，是DEP2的新等位基因，通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。

谷子穗顶端败育突变体sipaa1的表型分析和基因定位

薛红丽，杨军军，汤沙，智慧，王蕊，贾冠清，乔治军，刁现民

中国农业科学. 2018, 51(9): 1627-1640. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.002

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【目的】穗发育对于农作物产量至关重要，而穗顶端败育谷子产量下降的重要原因之一。通过挖掘谷子穗顶端败育的相关基因，探求谷子穗顶端发育的生物学通路，以期为谷子穗发育遗传机理研究提供理论基础。【方法】利用化学诱变剂甲基硫酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）对野生型豫谷一号（Yugu1）进行诱变，在其后代中发现了一个可以稳定遗传的穗顶端败育的突变体，命名为sipaa1，同时对该突变体的农艺性状进行鉴定。以突变体sipaa1母本，SSR41父本构建的F₂定位群体为材料进行遗传分析及图位克隆，确定基因所属染色体以及在该染色体上的位置。对突变体sipaa1和野生型Yugu1的BC₁F₂进行高通量测序，挖掘定位区间内的候选基因，根据候选基因在谷子不同组织部位表达量的差异，找出在穗部高表达的候选基因。对孕穗期的Yugu1和sipaa1进行转录组测序，寻找差异表达基因并分析差异表达基因富集的生物学通路。【结果】与Yugu1相比，突变体sipaa1的平均株高略有增高，增幅不显著，叶长、叶宽分别降低了10.66%和5.08%。突变体的表型变异主要集中在穗部，最突出的表现是穗顶端小花发育异常，谷穗长和谷穗粗分别降低了11.36%和16.12%，单株穗重、谷码数、单穗粒重及千粒重分别降低了30.02%、32.58%、30.55%和18.18%。通过对sipaa1×SSR41的F₂代群体中正常株与突变株的遗传分析表明该突变为隐性单基因控制。经图位克隆将突变基因定位于第1染色体Indel标记1-9.23与1-9.333之间约100 kb的范围内。结合高通量测序数据库，在该定位区间筛选到6个在穗部高表达的候选基因。转录组测序发现，在突变体与野生型之间存在2 768个上调表达基因，507个下调表达基因，且定位区间内有2个差异表达基因主要与激素信号转导、外界胁迫响应、植物-病原互作等生物学通路有关。【结论】谷子穗顶端败育突变体sipaa1由隐性单基因控制,突变基因位于第1染色体Indel标记1-9.23与1-9.333之间，转录组测序与基因功能分析发现了2个在穗部高表达且与植物花器官发育及胁迫响应密切相关的候选基因，候选基因可能通过对激素、胁迫响应，以及细胞程序性死亡等相关通路调控谷子穗顶端败育。

利用回交和标记辅助选择快速培育高油酸花生品种及其评价

张照华，王志慧，淮东欣，谭家壮，陈剑洪，晏立英，王晓军，万丽云，陈傲，康彦平，姜慧芳，雷永，廖伯寿

中国农业科学. 2018, 51(9): 1641-1652. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.003

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【目的】高油酸育种是花生品质改良的重要方向，利用回交育种结合标记选择可快速实现现有推广品种的高油酸化改良，探讨利用这一技术体系进行花生高油酸遗传改良的实践和效率。【方法】以目前推广的优质高产抗病品种中花16、中花21、泉花551、徐花13为轮回亲本（母本，基因型AABB），以高油酸材料冀花13为非轮回亲本（父本，基因型aabb）配制4个杂交组合，一年种植两季并进行人工杂交或自交，夏季在武汉种植，冬季在湛江南繁基地种植，通过1次杂交、4次回交和1次自交得到BC₄F₂后代。利用PCR产物测序方法，鉴定杂交和回交后代的基因型：根据回交后代基因型分离规律及ahFAD2A与ahFAD2B序列高度同源性的特点，用引物F0.7/R3在一个PCR反应内同时高效扩增F₁和回交后代（BC₁F₁-BC₄F₁）的ahFAD2A和ahFAD2B片段，并利用R3作为测序引物进行反向测序，读取测序峰图判别基因型，在回交后代中筛选基因型AaBb的后代作为下代回交父本。自交后代（BC₄F₂-BC₄F₃）基因型鉴定采用KASP分型，获得高油酸（基因型aabb）后代。对获得的基因型为aabb的高油酸后代与其对应轮回亲本进行重要农艺性状、品质和重要抗病性的调查和SSR标记检测。【结果】在3年时间内，4个组合分别获得10、5、6、8株BC₄F₂高油酸纯合隐性基因型（aabb）单株，通过一代自交获得相应的BC₄F₃株系，对获得的高油酸株系与轮回亲本进行植物学、农艺性状、品质和青枯病抗性的考察，最终，4个组合均获得了与轮回亲本综合性状最接近的株系，分别为ZJ019、ZJ109、ZJ160和ZJ805，其油酸含量为82.54%、79.85%、79.22%、和78.94%，可作为轮回亲本对应的高油酸新品种。另外，本研究还对中花16回交组合中获得的高油酸株系的遗传背景进行了SSR分子检测，发现ZJ019株系的回复率达94.8%，在该组合中回复率最高，这一结果与植物学、农艺性状鉴定的结果一致。【结论】利用连续回交、南繁加代和分子标记辅助选择等技术可在3年内快速实现现有推广花生品种的高油酸化改良。

水稻根际和非根际土磷酸酶活性对碳、磷添加的响应

刘玉槐，魏晓梦，魏亮，祝贞科，葛体达，张艳杰，鲁顺保，吴金水

中国农业科学. 2018, 51(9): 1653-1663. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.004

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【目的】研究外源养分添加对稻田土壤磷酸酶活性影响的特征，明确水稻根际和非根际土壤胞外磷酸酶活性对碳、磷添加的响应过程，为稻田土壤水肥管理，实现农业可持续利用提供理论指导。【方法】选取湖南长期种植水稻的典型缺磷水稻土，进行盆栽试验。试验设置4个处理，分别为不添加碳磷（CK）、添加碳（C）、添加磷（P）和添加碳磷（CP）。采用96微孔荧光法测定根际土与非根际土的酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）活性，同时基于生物可利用性的磷分级方法（BBP法）测量4种磷组分（CaCl₂-P、Citrate-P、Enzyme-P和HCl-P），探讨碳、磷添加对4种生物有效性的磷组分的影响和土壤磷酸酶活性的响应特征。【结果】与CK相比，C、P添加和CP配施处理水稻地上部分生物量分别增加29.76%、84.03%和87.94%（P＜0.05），地下部分生物量分别减少20.13%、增加57.49%和56.53%（P＜0.05）；植物全磷（TP）含量与生物量变化规律一致，C、P和CP添加处理地上部分TP含量比CK分别增加57.23%、95.21%和95.91%（P＜0.05），地下部分TP含量比CK分别减少26.12%、增加45.45%和38.01%（P＜0.05）。根际土pH、NH₄⁺-N和Olsen-P的含量低于非根际土，CP配施处理中根际土微生物量磷（MBP）含量高于非根际土；碳、磷添加对4种基于生物有效性磷组分具有显著调控作用（P＜0.05）；Olsen-P和MBP与ALP呈极显著负相关（P＜0.05），与ACP无显著相关性，表明微生物对速效养分利用明显。冗余分析表明非根际土壤中的酶活性变化主要受Olsen-P、MBP、CaCl₂-P和Citrate-P含量影响；而土壤中含水量、pH、NH₄⁺-N、根系生物量、HCl-P和Enzyme-P含量主要影响水稻根际土壤中的酶活性。【结论】P和CP配施处理能提高缺磷水稻土微生物活性，显著增加水稻生物量，提升根际微生物效应，改善土壤环境，有利于稻田生态系统的健康。

麦玉复种体系下秸秆还田与施氮对作物水氮利用及产量的效应研究

杨晨璐，刘兰清，王维钰，任广鑫，冯永忠，杨改河

中国农业科学. 2018, 51(9): 1664-1680. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.005

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【目的】探究陕西关中地区麦玉复种体系下作物生产过程对秸秆还田与氮肥合理配施的响应，为实现当地粮食作物增产及资源高效利用提供理论依据。【方法】本研究于2011年10月至2016年10月，在陕西杨凌地区设置连续5年的定位试验。采用二因素裂区设计，主区为秸秆还田，设秸秆还田（S）和秸秆不还田（S0）2个水平；副区为施氮量，设常规施氮（F1）、减量施氮（F0.8）、不施氮（F0）3个水平，对冬小麦与夏玉米籽粒产量及水肥利用状况进行测定分析。【结果】秸秆还田与施氮及二者交互作用对麦玉两作物产量及其构成因素、水肥利用效率等方面有显著或极显著影响。秸秆还田较不还田处理显著提高土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量，分别达6%—14%、8%—34%、3%—5%、3%—10%；同时显著提高麦玉播种前及收获后0—100 cm土层的储水量，播种前及收获后5季均值分别增加5%—11%、12%—15%（麦）和4%—9%、11%—17%（玉）。与不施氮处理相比，施氮显著提高土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量；并显著提高了秸秆还田水平下麦玉播前及收后土壤储水量。在产量和水氮利用方面，秸秆还田较不还田处理分别显著提高了2012—2016 4季冬小麦和5季夏玉米产量，其中，冬小麦每年依次提高4%—6%、5%—10%、7%—10%、8%—12%，夏玉米依次为1%—2%、3%—6%、4%—7%、5%—8%、3%—7%；秸秆还田显著提高麦玉水分利用率WUE，5季均值分别增加4%—7%和8%—11%；并显著提高2012—2016 4季麦玉氮肥偏生产力PEPN、2012—2016 4季冬小麦和5季夏玉米农学利用率AEN。施氮较不施氮处理显著提高麦玉产量，且均以F1处理最高，冬小麦F1处理在两秸秆还田水平下分别较F0处理显著增产30%—38%（S）和29%—33%（S0），夏玉米为21%—25%（S）和19%—22%（S0）；施氮显著提高了两作物WUE，S0水平下F1处理WUE均值最高，S水平下F0.8处理WUE均值最高；F0.8较F1处理在5季中均显著提高作物PEP_N和AE_N，5季均值最高的SF0.8处理较最低的S0F1处理分别增加31%和30%（麦）、30%和31%（玉）。经济效益方面，秸秆还田较不还田处理提高了麦玉净收益均值，分别为808—1 258元和733—1 212元；施氮较不施氮处理提高两作物净收益，施氮处理中以F0.8处理获得收益最大。麦玉5年净收益均呈现出SF0.8＞SF1＞S0F0.8＞S0F1＞SF0＞S0F0的趋势，其中SF0.8处理下净收益均值较CK分别增加3 052元和2 145元。【结论】长期秸秆还田配减量施氮在保证冬小麦及夏玉米维持较高产量的情况下，显著改善作物水肥利用情况。综合考虑作物产量、水肥利用效率及经济效益，不同处理间以秸秆全量还田配施减量氮肥处理效果最优。

耕地复种指数研究的关键科学问题

吴文斌，余强毅，陆苗，项铭涛，谢安坤，杨鹏，唐华俊

中国农业科学. 2018, 51(9): 1681-1694. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.006

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在当前耕地外延式扩展难以满足、粮食单产提升难度加大的新形势下，提升耕地复种指数、走耕地内涵式集约利用模式，是确保未来我国粮食增产和国家粮食安全的重要途径。本文从农业土地系统科学视角出发，系统总结了耕地复种指数研究的总体研究框架和核心研究内容，全面梳理了国内外该领域的研究现状、进展及存在的问题。研究认为，第一，格局与过程探测是耕地复种指数研究的重要基础。不仅要关注耕地潜在或实际复种指数的数量、空间分布、区域差异及其时空变化过程，更要关注耕地复种指数的提升空间，科学描述可挖掘的复种潜力。第二，功能与效应分析是耕地复种指数研究的核心内容。现有研究多聚焦耕地复种指数提升对粮食产量增加的贡献作用，复种指数变化的生态环境效应研究以微观试验性研究为主；迫切需要建立综合效应分析框架，从不同的学科、视角和尺度揭示耕地复种指数对区域资源配置、社会经济和生态环境等的影响和反馈机制。第三，优化调控是耕地复种指数研究的关键任务。科学提出可持续挖掘和提升耕地复种潜力的策略，重点强化可持续性评估、障碍性因子分析和系统性优化调控等方面的研究，追求粮食安全、资源安全和生态安全的权衡协调，以建立人地和谐、可持续的农业土地利用模式。耕地复种本质上反映了复杂的“人-地”耦合关系，多数据、多尺度、多模型和多方法的综合研究将是未来耕地复种指数研究的重要发展方向，将会促进自然科学、工程科学和社会科学等多个学科门类的综合、交叉和集成研究。

利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆

崔甜甜，晏建红，宾羽，李中安，周常勇，宋震

中国农业科学. 2018, 51(9): 1695-1705. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.007

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【目的】构建柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）中国分离株的侵染性克隆，为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】以GeneArt® pYES1L Vector为模板，PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117，利用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体DK1317-2并回收其大片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117，得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制的三元穿梭载体pCY。以马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)全长cDNA侵染性克隆为模板，pCY-PVX-F、pCY-PVX-R为引物扩增PVX全长，采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY，采用醋酸锂转化法将获得的PVX基因组全长cDNA与线性化的pCY载体共转化酵母菌YPH501，通过同源重组获得PVX基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导接种本生烟验证所构建克隆的侵染性，从而建立基于酵母同源重组的病毒侵染性克隆快速构建体系。在此基础上，以CLBV中国分离物（CLBV-HBYD）全长cDNA为模板，分段扩增其基因组，得到片段CLBV-1、CLBV-2；利用所建体系对CLBV-1、CLBV-2及pCY载体片段进行同源重组。得到重组质粒pCY-CLBV后,经农杆菌介导接种本生烟和锦橙幼苗，并利用RT-PCR和Northern blot检测其侵染性。【结果】建立了酵母-大肠杆菌-农杆菌的三元穿梭载体PCY，该载体全长10 347 bp,含有酵母、农杆菌、大肠杆菌的复制位点，能在酵母-农杆菌-大肠杆菌稳定复制，可用于在酵母中通过同源重组快速构建病毒基因组全长cDNA克隆，也可用于通过农杆菌介导直接接种植物寄主。利用该体系获得了CLBV中国分离株的基因组全长cDNA克隆16个。随机选取1个克隆进行了序列测定（GenBank登录号：MG572236），其基因组全长8 747 nt，包含3个开放阅读框(open reading frame，ORF)，ORF1为5 889 nt、ORF2为1 089 nt、ORF3为1 092 nt。全基因组序列比对显示，CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性为79％—98％，其中与柑橘来源的EU857540一致性最高，为98%，与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在利用MEGA6 软件构建的系统发育树上，CLBV-HBYD与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇，而猕猴桃来源的CLBV分离株聚为另一簇。将所获16个CLBV全长cDNA克隆转化农杆菌，以pCY空载体为阴性对照注射接种本生烟。接种20 d后，抽提RNA进行RT-PCR检测，结果表明11个克隆的接种植株检测出CLBV特异性条带；随机选取5个阳性克隆进一步进行了Northern blot杂交，结果显示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接种的本生烟可以检测到CLBV特异性条带，而对照样本未检测到任何条带，表明这些克隆均为侵染性克隆。【结论】构建了基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系，利用该体系获得了中国CLBV分离株的适于农杆菌介导接种的基因组全长cDNA侵染性克隆。

苹果褪绿叶斑病毒RT-LAMP检测方法的建立

张双纳，李正男，范旭东，张尊平，任芳，胡国君，董雅凤

中国农业科学. 2018, 51(9): 1706-1716. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.008

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【目的】建立一种利用反转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）技术简便、快速检测苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）的方法。【方法】在ACLSV基因组序列的3个保守区域设计3组引物，每组引物包括一对外引物（F3/B3）和一对内引物（FIP/BIP），从3组引物中筛选出一组效果最好的引物。对RT-LAMP反应体系，即Mg²⁺、dNTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3浓度进行优化，Mg²⁺浓度梯度设置为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L^-1，dNTPs浓度为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1，Betaine浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1，FIP/BIP浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 µmol·L^-1，F3/B3浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4 µmol·L^-1；优化RT-LAMP反应条件，采用已优化的反应体系，设置65、63、61、59、57℃ 5个不同的反应温度，反应时间设定为90 min。在引物筛选和反应体系反应条件优化过程中，使用荧光定量PCR仪，在反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个反应过程，根据扩增曲线判断反应结果。以携带苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)、苹果花叶病毒 (Apple mosaic virus , ApMV)的植株叶片中提取的总RNA为模板测试RT-LAMP检测方法的特异性。将含ACLSV的叶片总RNA原液进行10倍梯度稀释，以RNA原液和10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释液作为模板，进行RT-LAMP反应，测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。随机采集23株苹果树的叶片，同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测，加入SYBR GreenⅠ进行可视化检测。【结果】建立了ACLSV RT-LAMP检测方法，优化的检测体系为：6.0 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、0.2 mol·L^-1 Betaine、1.6 µmol·L^-1 FIP/BIP和0.2 µmol·L^-1 F3/B3引物，最佳反应条件为59℃，60 min。特异性检测中，仅ACLSV检测结果为阳性，对照组均为阴性。灵敏性检测中，RT-LAMP方法最低可检测到10^-3 RNA稀释液,灵敏度是RT-PCR方法的100倍。随机采取的23株苹果叶片样品RT-PCR阳性检出率为52.2%，RT-LAMP阳性检出率为65.2%，RT-LAMP的检出率高于RT-PCR。【结论】建立的ACLSV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏性高、成本低等特点，可满足基层、科研部门在田间调查、种苗繁育和海关检疫中快速检测ACLSV。

农田不同粒级土壤含水量光谱特征及定量预测

卢艳丽，白由路，王磊，杨俐苹

中国农业科学. 2018, 51(9): 1717-1724. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.009

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【目的】土壤含水量是土壤属性的关键参数。摸清不同机械组成条件下土壤水分的光谱变化并实现土壤含水量的定量预测，为农田水分的快速监测及土壤其他属性的定量获取提供依据。【方法】通过人为控制获得不同粒级和不同含水量的土壤样品，确定室内土壤光谱测定的几何条件，采集不同土样的光谱特征并进行比较，按粒径等级利用最小二乘法（PLSR）建立农田土壤含水量的光谱定量预测模型。【结果】土壤光谱反射率总体趋势是随含水量增加而降低，其差异随着波长的增加和含水量的降低而增加，在1 400 nm和1 900 nm的水分敏感波段随含水量增加光谱吸收深度也增加。但当含水量大于40%时，通过孔径为0.15 mm 筛子的土壤样品（处理D-1），在350—1 240 nm光谱反射率随含水量增加而升高，而1 240 nm以后随含水量增加而降低。相对于将所有样本数据混合建立模型，分粒级建立的模型在细颗粒土壤中预测效果得到了明显改善，并且样品越细模型在预测效果和稳定性也越好：最优模型均方根误差RMSE=4.13%，决定系数R2=0.90。同时，数据归一化处理后所建立的模型在一定程度上降低了噪声的影响，从而在预测效果和稳定性上也有所改善。【结论】土壤光谱随含水量的变化而变化，但并不都表现随含水量增加光谱反射率降低的特点，当含水量大于40%时，细颗粒土壤样本表现为在350—1 240 nm波段光谱反射率随含水量增加而升高；土壤含水量预测模型的精度和稳定性随着土壤粒径变小、样本量增大以及光谱数据归一化预处理而得到改善。

氮肥与双氰胺配施对温室番茄生产及活性氮排放的影响

尹兴，张丽娟，李博文，刘文菊，郭艳杰，李玉涛

中国农业科学. 2018, 51(9): 1725-1734. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.010

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【目的】研究田间条件下氮肥与硝化抑制剂双氰胺（dicyandiamide，DCD）配施对温室番茄产量、品质及活性氮损失的影响，明确DCD在棚室蔬菜生产体系中的作用及其硝化抑制效果，为氮肥减施增效提供依据。【方法】试验在河北省永清县番茄主产区北岔口村进行，供试作物为番茄。试验设5个处理，分别为不施氮对照（N0）、传统施氮（Con）、传统施氮+双氰胺（Con+DCD）、减量施氮（Opt）和减量施氮+双氰胺（Opt+DCD），定期对温室番茄追肥期间土壤无机氮、N₂O排放量和NH₃挥发损失量等指标进行测定。利用流动分析仪测定土壤无机氮含量，气相色谱仪测定N₂O排放量，硼酸吸收-标准稀酸滴定法测定NH₃挥发量。应用SAS软件对不同处理的产量、品质和各个指标进行方差分析。【结果】氮肥与DCD配施可以提高番茄产量，Con+DCD较Con、Opt+DCD较Opt处理分别提高了20.2%和2.4%，其中Con+DCD产量显著高于Con；同时，Con+DCD和Opt+DCD的氮肥农学效率（NAE）和氮肥偏生产力（PFP）均显著高于Con和Opt，其中Con+DCD较Con、Opt+DCD较Opt处理的NAE分别提高了176.7%和22.3%；此外，配施DCD显著降低了棚室番茄果实的硝酸盐含量，Con+DCD较Con、Opt+DCD较Opt处理分别降低了28.6%和19.3%，其他品质指标处理间差异不显著。氮肥与DCD配施显著降低了NO3--N在0—100 cm土层的累积，Con+DCD和Opt+DCD的NO3--N累积量分别为607.1和441.8 kg·hm^-2，较Con（708.4 kg·hm^-2）和Opt（524.2 kg·hm^-2）降低了14.3%和15.7%。各处理N₂O排放通量和NH₃挥发速率的峰值分别出现在施肥后第3天和第2天，总体来看，DCD能有效降低N₂O排放和NH₃挥发损失，Con+DCD较Con、Opt+DCD较Opt处理的N₂O累积排放量和NH₃挥发累积量分别降低了51.2%、75.4%和17.2%、21.9%。【结论】在本试验条件下，氮肥与DCD配施提高了温室番茄的产量、氮肥农学效率和氮肥偏生产力，减少了土壤NO3--N在0—100 cm土层的累积，降低了N₂O排放量和NH₃挥发损失量，且以减氮50%并配施DCD（Opt+DCD）的效果最好。因此，在温室番茄生产中，适当减氮并配施DCD是一种科学有效的施肥管理方式。

香草酸对花生种子萌发、幼苗生长及根际微生物区系的影响

黄玉茜，杨劲峰，梁春浩，陈堔平一，刘欣宇，耿坷睿，姚玉晨，张宇，韩晓日

中国农业科学. 2018, 51(9): 1735-1745. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.011

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【目的】探讨酚酸类自毒物质香草酸的自毒作用，研究其对花生种子萌发和幼苗生长的影响，揭示根际土壤微生物在花生生育期内对自毒物质的响应规律。【方法】以花生品种阜花12号150GY为试材，培养皿培养试验设6个处理：0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mmol·L^-1香草酸溶液；营养钵种植试验设5个处理：0、0.01、0.03、0.05、0.07 mmol·L^-1香草酸溶液；盆栽试验设5个处理：香草酸用量分别为0、0.01、0.03、0.05、0.07 mg·kg^-1干土。分别研究外源添加香草酸对花生种子萌发、幼苗生长及根际微生物区系的影响。【结果】（1）经不同浓度香草酸溶液处理后，花生种子的发芽率、发芽势和发芽指数均低于CK，与对照存在显著性差异。当香草酸溶液浓度为0.09 mmol·L^-1时，发芽率、发芽势和发芽指数与对CK相比分别降低39%、66.3%和55.9%，自毒效应响应指数达到最大值。（2）经不同浓度香草酸溶液处理后，花生幼苗的主根长、单株干重、叶绿素含量、净光合速率和气孔导度均低于CK，与对照存在显著性差异，当香草酸溶液浓度为0.07 mmol·L^-1时，各指标与对CK相比分别降低37.3%、40.0%、19.0%、53.9%和49.1%，自毒效应响应指数达到最大值。胞间CO₂浓度变化趋势与以上指标相反，随香草酸浓度的增大而呈现上升趋势，当香草酸溶液浓度为0.07 mmol·L^-1时，胞间CO₂浓度比对照提高46.1%。（3）香草酸浓度≥0.03 mmol·L^-1时，花生根系总吸收面积、活跃吸收面积和根系活力（活跃吸收面积/总吸收面积）低于CK，叶片的MDA含量高于对照，均与对照存在显著性差异，当香草酸溶液浓度为0.07 mmol·L^-1时，各指标与对照相比分别降低22.4%，54.2%和40.6%，MDA含量提高43.3%。（4）根际放线菌数量在花生生育前期随着香草酸浓度的增大而显著降低，进入结荚期后各处理间差异不显著。根际细菌数量在花生生育前期时各处理间差异不显著，而进入结荚期后随着香草酸浓度的增大而显著降低。高浓度的香草酸（0.07 mg·kg^-1干土）对根际真菌生长具有抑制作用，而低浓度的香草酸（0.01 mg·kg^-1干土）对根际真菌生长具有促进作用。【结论】香草酸对花生种子萌发和幼苗生长存在一定的抑制作用，香草酸亦会抑制花生幼苗的光合作用，降低根系活力，促进幼苗叶片产生丙二醛。此外，不同浓度的香草酸溶液均会使花生根际细菌和放线菌的数量降低，抑制根际土壤中细菌和放线菌的生长繁殖，而对土壤真菌的影响呈现低促高抑的现象，即低浓度的香草酸溶液促进花生根际土壤中真菌的生长；而高浓度则对真菌生长具有一定的抑制作用。

芥蓝BC₃代Ogura CMS育性恢复材料的创制及Rfo基因传递和背景分析

于海龙，李志远，杨丽梅，刘玉梅，庄木，吕红豪，李占省，方智远，张扬勇

中国农业科学. 2018, 51(9): 1746-1757. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.012

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【目的】创制Ogura细胞质不育（Ogura CMS）的恢复系是利用Ogura CMS种质资源的有效途径。本研究基于已获得的BC₂代育性恢复单株15Q23，继续用芥蓝进行回交，通过分析育性恢复基因Rfo的传递效率，及BC₃代Rfo阳性株的遗传背景、育性表现、结实性和倍性，从而加速甘蓝类蔬菜Ogura CMS恢复材料的创制，获得甘蓝类蔬菜Ogura CMS恢复系。【方法】以BC₂代育性较好的单株15Q23为父本，Ogura CMS芥蓝15Y102为母本进一步回交，利用Rfo特异分子标记对所有回交后代进行筛选，计算BC₃代Rfo传递效率，并调查BC₃代Rfo阳性单株的形态特征、育性恢复情况、结实性、倍性；选取遗传背景近于芥蓝、结实较好的重点单株继续回交获得BC₄代，分析BC₄代Rfo传递效率和阳性单株倍性。【结果】在开花的不同时期，单株15Q23花粉活力差异明显，以不同时期的花粉进行回交的结实性也存在极显著差异（P＜0.01），平均结实率为0.07粒/授粉花蕾（7%）。利用Rfo特异标记对获得的BC₃代单株进行苗期筛选，结果表明，Rfo可稳定传递，遗传背景分析结果表明，BC₃代单株与芥蓝15Y102遗传相似系数在0.81—0.92，遗传背景比BC₂代单株15Q23（0.73）更近于芥蓝，形态标记聚类结果与遗传背景标记聚类结果一致。形态观察发现，BC₃单株形态特征都近于芥蓝，但生长势较亲本芥蓝更强；倍性鉴定结果表明，多数BC₃后代接近于四倍体。开花后观察34个BC₃后代单株的育性，有Rfo标记的单株育性均得到恢复。但不同单株间花粉活力存在差异，单株16Q1-4、16Q1-7、16Q1-10在整个花期花粉活力一直在75%以上。利用亲本芥蓝对花粉活力较好的Rfo阳性单株（花粉活力＞50%）进行回交，以单株16Q1-4和单株16Q1-10当父本时结实性最好，结实率分别为15%和9%，显著高于BC₂代阳性单株15Q23（7%，P＜0.05）。BC₄代单株中Rfo可以稳定传递，Rfo传递效率接近33%；对以16Q1-4为父本回交获得的24株阳性株进行倍性检测，不同单株间倍性差异较大，其中3株的荧光峰值和亲本芥蓝相近，倍性近于芥蓝。【结论】利用芥蓝对种间杂交六倍体Rfo阳性株进行第3、第4代回交，Rfo可稳定传递，成功获得了遗传背景、形态特征近于亲本芥蓝，结实性较BC₂代单株15Q23显著提升的BC₃代Ogura CMS育性恢复材料16Q1-4和16Q1-10。

不同氮、钾肥施用量对甜瓜养分吸收、分配及产量的影响

康利允，常高正，高宁宁，李晓慧，李海伦，梁慎，徐小利，赵卫星

中国农业科学. 2018, 51(9): 1758-1770. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.013

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【目的】通过研究中等肥力土壤条件下不同氮、钾肥施用量对大棚甜瓜养分吸收、分配及产量的影响，为连栋棚加地膜覆盖高产栽培条件下合理施用氮、钾肥提供理论依据。【方法】采用连栋棚加地膜覆盖栽培，试验设重氮重钾（N2K2）、重氮轻钾（N2K1）、轻氮重钾（N1K2）、轻氮轻钾（N1K1）、中氮中钾（NK）5个处理。以早熟厚皮甜瓜品种‘RX8’（TC620-8-56×TA11-1）为试验材料，在孕穗期、坐果期及成熟期测定不同器官干物质积累量及氮、磷、钾养分累积吸收量，并结合成熟期产量，分析不同氮、钾肥施用量对甜瓜养分吸收、分配及产量的影响。【结果】不同氮、钾肥施用量对甜瓜干物质积累量及氮、磷、钾养分累积吸收量的变化趋势相似，均表现为随生育期的推进而呈上升趋势，不同氮、钾肥施用量只改变不同生育时期干物质积累量及氮、磷、钾累积吸收量，并不改变其累积趋势。从干物质积累及分配特性看，伸蔓期，甜瓜以营养生长为主，NK处理根、茎、叶干物质积累量一直呈较高水平，且茎、叶干物质积累量显著高于其他处理（P＜0.05），平均分别增加17.8%、16.0%。随着果实发育，干物质积累逐渐转向果实，不同氮钾处理下果实干物质积累分配系数增加，至成熟期果实干物质积累分配系数高达0.62—0.66，NK处理果实干物质积累量及分配系数均显著高于其他处理（P＜0.05），平均分别增加31.9%、4.27%。从养分积累及分配特性看，甜瓜对钾需求量最大，氮次之，磷最少，成熟期甜瓜氮、磷、钾累积吸收量分别高达4 160.4、1 394.8、7 874.2 mg/株。NK处理氮、磷、钾累积吸收量在伸蔓期、坐果期、成熟期一直呈较高水平，与其他处理相比，NK处理氮、磷、钾累积吸收量均显著增加（P＜0.05）。NK处理坐果期、成熟期果实氮、磷、钾分配系数也一直呈较高水平，且成熟期果实氮、钾分配系数显著高于其他处理（P＜0.05），分别平均增加9.10%、9.81%。从产量及产量构成因素看，同一供氮水平下，高钾、低钾处理间甜瓜纵径、横径、果形指数、单瓜重及产量差异均未达5%显著水平；同一供钾水平下，高氮处理甜瓜纵径、横径、单瓜重及产量均高于低氮处理，平均分别增加4.81%、6.04%、19.8%及20.5%，且除纵径外，上述指标差异均达5%显著水平；从整体看，NK处理甜瓜纵径、横径、单瓜重、产量均最高，且单瓜重和产量显著高于其他处理（P＜0.05），平均分别增加21.6%和22.1%。【结论】土壤中等肥力水平及连栋棚加地膜覆盖高产栽培条件下，氮、钾施肥量分别以200 kg·hm^-2、300 kg·hm^-2较为适宜，有利于甜瓜最大限度的提高养分的吸收利用能力，促进养分吸收及营养物质向果实的分配转移，从而得到高产。

菊花AINTEGUMENTA克隆与功能分析

温立柱，孙霞，樊红梅，郭芸珲，于媛媛，任红，王文莉，郑成淑

中国农业科学. 2018, 51(9): 1771-1782. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.014

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【目的】从菊花中分离克隆AINTEGUMENTA，分析其序列特征和在菊花中的时空表达特性，通过基因沉默研究其对菊花花序发育的影响，分析可能的调控方式和潜在机理，为菊花花序大小的调控奠定理论基础。【方法】使用RACE方法从菊花中克隆AINTEGUMENTA全长，通过DNAMAN等软件对其序列进行分析。采用荧光定量的方式检测其在菊花不同器官和发育时期的表达。构建35S::CmANT-GFP融合蛋白载体进行亚细胞定位，构建TRV2-CmANT沉默表达载体侵染菊花。使用SPSS软件统计分析CmANT沉默系菊花表型变化，通过光学显微镜观察舌状花花瓣表皮细胞变化，使用荧光定量方式检测CmANT相关基因在沉默系中的表达。【结果】从菊花中克隆了CmANT全长，其编码的氨基酸序列长度为540，理论等电点为7.39，蛋白质的理论分子量为60.4 kD，含有两个AP2保守功能区域和VYL修饰位点。在与其他物种的ANT蛋白构建的系统进化树中，CmANT与AtANT聚在一起。荧光定量结果表明：（1）CmANT在花蕾中的表达量最高，其次是根>茎>叶。（2）在花序不同部位的比较中，舌状花中的表达量最高，其次是筒状花，在花萼中的表达量最低。（3）CmANT在舌状花中的表达随着发育时期的延续而降低。（4）CmANT在2,4-D诱导下的3—6 h内表达量持续上升。WoLF PSORT软件预测和35S::CmANT-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的定位结果显示，CmANT蛋白定位在植物细胞核中。TRV-CmANT-1和TRV-CmANT-2沉默系的平均花径相比对照分别减小18.93%和27.47%，舌状花的数目分别减少11.39%和14.66%，其中TRV-CmANT-2与对照差异显著（P<0.05），筒状花数目分别减少14.55%和36.56%。顶端花序的舌状花平均长度分别减少34.17%和54.68%，舌状花的宽度分别比对照减小24.05%和10.13%。叶片平均鲜重分别比对照组减小13.19%和21.98%，叶片鲜重与筒状花数目显著相关（P<0.05）。舌状花花瓣表皮细胞显微观察发现，沉默系舌状花花瓣表皮细胞长度和宽度与对照差异不明显。CmLAX3在两沉默系中的表达明显上升，在小花原基分化期时分别是对照中的1.8和1.78倍，同期CmCYCD3的表达分别下降了32.28%和38.19%，CmXTH4和CmEXPA1的表达量在多个时期也明显降低。【结论】根据沉默系表型与相关基因的表达，推测CmANT的沉默可能解除了对CmLAX3抑制，促进了生长素的转运和过量积累，间接抑制了CmCYCD3的活性，限制了细胞的分裂增殖，引发细胞数目变少，导致沉默系器官变小。

绿豆萌发过程中蛋白组分及亚基变化

赵天瑶，张亚宏，金涛，康玉凡

中国农业科学. 2018, 51(9): 1783-1794. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.015

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【目的】探索不同萌发时期绿豆分离蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量的动态变化规律，以及蛋白质组分（分离蛋白、球蛋白和清蛋白）的亚基组成及含量变化，为绿豆蛋白的加工利用提供科学依据。【方法】采用等电点沉淀法提取绿豆分离蛋白，并根据Osborne分类法制备绿豆清蛋白、谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，比较分析萌发前后绿豆分离蛋白及各蛋白组分含量的变化，同时通过SDS-PAGE电泳进一步分析萌发前后蛋白亚基组成及数量的变化。【结果】随着萌发时间的延长，绿豆分离蛋白的含量呈现先增高后下降的趋势，萌发36 h时与未萌发的绿豆相比提高了9.4%。绿豆清蛋白含量随着萌发时间的延长呈逐渐下降的趋势，萌发84 h时含量最小，为20.47 mg·g^-1。球蛋白随着萌发时间的延长呈现先升高后下降的趋势，萌发48 h时其含量最大，且比未萌发时提高了3.47倍。萌发对绿豆醇溶蛋白的含量变化影响不大。绿豆谷蛋白含量在萌发12—36 h和48—72 h变化无明显差异，但相对于未萌发的绿豆仍有一定程度的提高。绿豆蛋白酶活性在萌发36 h后不断上升，变化相对较大，72 h时开始下降。SDS-PAGE电泳图及光密度扫描分析结果发现，绿豆分离蛋白主要由7条条带组成（Ⅰ—Ⅶ），萌发过程中各条带相对含量不断减少，随着萌发时间的延长，分子量在25—66 kD的条带含量逐渐降低，分子量在18—25 kD的亚基条带含量在萌发的前72 h有所增加，萌发至96 h时几乎只剩下Ⅳ条带。绿豆清蛋白主要由4条条带组成（Ⅰ—Ⅳ），分子量分别为61.56、48.99、29.88和20.42 kD，萌发过程中条带Ⅰ相对含量从0 h的18.4%降至60 h的16.4%，萌发72 h后条带Ⅰ消失；条带Ⅱ在萌发过程中始终存在，但是含量不断减少；条带Ⅲ和条带Ⅳ也在萌发过程中不断减少，萌发72 h后消失。同时，分子量为18—25 kD的亚基条带相对含量在24—60 h增加，萌发至72 h逐渐消失，几乎只剩下条带Ⅱ。绿豆球蛋白主要由5条条带组成（Ⅰ—Ⅴ），分子量分别为66、61、50、32和26 kD。萌发过程中亚基条带Ⅰ和Ⅱ都在萌发96 h时消失；而条带Ⅲ在萌发过程前期（0—60 h）相对含量逐渐增大，为34.4%—41.8%，萌发72 h后条带Ⅲ含量迅速下降，萌发至96 h时仅为10.8%；亚基条带Ⅳ和Ⅴ萌发至84 h后消失。分子量在18—25 kD的亚基条带在萌发24—60 h时有所增加，随着萌发时间的延长，出现降解甚至消失。【结论】适当萌发能提高蛋白的含量，促进大分子亚基发生水解，同时有利于小分子亚基或多肽生成，但萌发时间过长并不完全利于蛋白的利用。

蓝塘猪和长白猪骨骼肌差异表达cis-NATs基因鉴定

许月园，齐晓龙，侯晔，赵云霞，栾宇，周焕焕，赵书红，李新云

中国农业科学. 2018, 51(9): 1795-1805. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.016

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【目的】通过分析蓝塘猪和长白猪生长发育过程中品种间骨骼肌组织差异表达基因及顺式天然反义转录本（cis-natural antisense transcripts, cis-NATs），并以此为基础进行整合分析，探索cis-NATs调控猪骨骼肌生长发育的分子机理。【方法】使用差异表达分析鉴定蓝塘猪和长白猪胚胎期35 d至出生后180 d共10个时间点品种间差异表达基因及cis-NATs（|log₂FC|≥1且 FDR＜0.01）；然后通过功能富集分析注释出差异表达基因及cis-NATs对应的正义基因主要参与的GO生物学过程（P＜0.01）及KEGG通路(P＜0.05)；再根据与cis-NATs相关表达的基因数目筛选出cis-NATs主要参与的GO生物学过程和KEGG通路，并根据通路间的相同基因数目对所有KEGG通路进行整合；最后基于通路内cis-NATs及其正义基因在品种间的差异表达倍数进行通路可视化分析。【结果】在蓝塘和长白猪骨骼肌发育的10个时间点共鉴定出5 350个品种间差异表达基因和738个差异表达cis-NATs；GO分析结果显示品种间骨骼肌组织差异表达cis-NATs主要与肌肉发育及能量代谢等GO生物学过程中的基因相关表达；KEGG通路整合分析发现能量代谢通路之间关联性最强；其中线粒体三羧酸循环通路中基因及其相关表达的cis-NATs在仔猪出生后早期表达量较高；通路可视化分析发现在肌纤维生长的两个关键时间点即胚胎期49 d和77 d，蓝塘猪能量代谢相关通路中基因及其相关表达的cis-NATs显著高表达于长白猪，而出生后品种间表达模式的变化则主要集中在出生后2—90 d的出生后早期阶段。【结论】在蓝塘猪和长白猪骨骼肌发育的10个时间点，共鉴定出738个品种间差异表达的cis-NATs，功能注释结果表明这些cis-NATs主要通过与能量代谢通路中的基因相关表达从而参与影响蓝塘猪和长白猪品种间骨骼肌纤维发育差异。

超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的二氢吡啶

肖志明，王峻，索德成，魏书林，贾铮，刘成新，樊霞

中国农业科学. 2018, 51(9): 1806-1814. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.017

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【目的】二氢吡啶是一种新型的饲料添加剂，具有促进动物生长、提高饲料利用率、改善肉质等功效，目前已在畜牧生产中得到广泛应用。然而，二氢吡啶并不是允许使用的药物饲料添加剂，其在饲料中高水平添加所带来的畜产品中二氢吡啶残留可引起敏感人群严重的低血压反应。央视3.15晚会曝光了部分饲料企业违规使用二氢吡啶、硫酸黏杆菌素、喹乙醇等兽药，引起社会的广泛关注和政府的高度重视，因而亟需建立饲料中二氢吡啶的检测方法，为饲料企业合理用药和政府监管提供必要的技术支撑。【方法】采用UPLC上常用的BEH C₁₈色谱柱，分别使用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作为流动相，优化了不同组成和比例流动相对色谱分离和质谱电离的影响。在正离子模式下进行母离子扫描，确定准分子离子，优化仪器毛细管电压、锥孔电压、雾化气流速等参数；然后进行子离子扫描，优化碰撞能量、驻留时间等参数，以确定丰度较高的两个子离子作为定性离子，并选择其中丰度最高的作为定量离子。比较甲醇、乙腈等不同溶剂对提取效率的影响，以及C₁₈、HLB、MCX和碱性氧化铝等固相萃取柱（SPE）对净化效果的影响，确定较优的样品前处理方法。【结果】优化确定了较佳的前处理方法：采用乙腈超声提取，提取液在60℃下氮气吹干，残余物用乙腈﹕水（1﹕9，v/v）复溶，过HLB固相萃取柱净化，用乙腈﹕水（9﹕1，v/v）洗脱，洗脱液过0.22 μm有机滤膜后上超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）测定。采用电喷雾离子源，在多反应监测（MRM）模式下，二氢吡啶的[M+H]⁺为m/z 254，失去乙氧基（CH₃-CH₂-O⁺，46 Da）后产生主要的碎片离子m/z 208，m/z 208脱掉羰基（C=O，28 Da）产生碎片离子m/z 180，m/z 180进一步脱去乙酯基（CO-O-CH₂-CH₃，73 Da）后得到碎片离子m/z 108，因此本研究以离子对m/z 254＞208为定量离子，m/z 254＞180为定性离子。以0.1%的甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，在10 min内完成了二氢吡啶的分离，且峰形尖锐，灵敏度高。二氢吡啶在0—500 μg·L^-1浓度范围内呈现良好的线性关系（R² ≥ 0.9992），根据20个空白样品的基线噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3为检出限（LOD），S/N=10为定量限（LOQ），二氢吡啶的LOD、LOQ分别为10和50μg·kg^-1。在10、50和100 μg·kg^-1三个添加水平下，二氢吡啶的平均回收率为82.6%—101.0%，日内变异系数为0.8%—6.7%，日间变异系数为4.7%—9.2%。【结论】该方法操作简便、快速、稳定，适用于饲料中二氢吡啶的日常监测。

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