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2017年 第50卷 第1期 刊出日期：2017-01-01

  

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2017年第50卷第1期目次

中国农业科学. 2017, 50(1):  0-1. 

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作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

中国玉米审定品种标准SSR指纹库的构建

王凤格, 杨扬, 易红梅, 赵久然, 任洁, 王璐, 葛建镕, 江彬, 张宪晨, 田红丽, 侯振华

中国农业科学. 2017, 50(1):  1-14.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.001

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【目的】对数量庞大的已知玉米品种构建可共享的作物品种标准DNA指纹库。【方法】基于荧光毛细管电泳检测平台和植物品种DNA指纹库管理系统，利用筛选的40对SSR核心引物对3 998份中国玉米审定品种标准样品进行建库，通过多实验室、多检测平台进行建库数据的质量评估。【结果】绘制了40个玉米建库引物的等位基因频率分布图作为每个引物的特征图谱，在建库试验中发挥了相当于参照样品的作用。形成了一套十重荧光毛细管电泳组合，并在SSR指纹分析器中建立了一套系统默认PANEL作为不同实验室建库时的标准PANEL。统计玉米审定品种指纹库构建的试验情况，每份样品具有2—5套原始试验数据及对应的指纹图谱，其中61%的样品做了2组独立试验，33%的样品做了3组独立试验，最终建成的标准指纹库累计缺失和差异位点仅占0.2%，数据完整性达到99.8%。在不同实验室、不同电泳检测平台的评估结果表明，同一荧光电泳检测平台上获得SSR指纹数据一致性高，而不同的电泳检测平台获得的数据存在一定偏差，为实现不同实验室的SSR指纹数据共享，需要统一荧光引物、分析软件及电泳检测平台。对所有审定品种指纹数据进行整体两两比较，表明中国玉米审定品种之间差异比较大，品种间差异位点百分比集中在80%—95%（占78.28%），品种间差异位点百分比在50%以上的已达到99.21%，而低于20%的只有0.09%；对玉米审定品种杂合率水平进行分析，平均品种杂合率达到64%，主要集中在50%—80%（占89%）。通过玉米品种标准指纹比对服务平台（网址：http://www.maizedna.org/）实现了指纹库的共享。【结论】形成了构建作物品种SSR指纹库的标准化程序，构建了3 998份玉米审定品种的SSR指纹库，通过多实验室联合比较试验，保证建库数据的准确性和数据库的可共享性；建立了玉米品种标准指纹比对服务平台网站，实现玉米审定品种指纹库在全国种子检验系统的共享。

盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴和根长的全基因组关联分析

张蕊，邓文亚，杨柳，王亚萍，肖芳枝，禾健，卢坤

中国农业科学. 2017, 50(1):  15-27.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.002

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【目的】解析甘蓝型油菜发芽期根和下胚轴发育及耐盐性的调控位点，筛选油菜耐盐性相关的候选基因，可为油菜耐盐性改良提供依据。【方法】以317份具有代表性的甘蓝型油菜自交系为材料，在正常生长和盐胁迫条件下进行沙培鉴定，利用芸薹属60K SNP芯片和全基因组关联分析鉴定正常生长与盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期根和下胚轴长度显著关联的SNP，并确定其连锁不平衡区间。通过区间内基因的功能注释及盐胁迫下油菜幼苗根和叶片转录组差异表达基因筛选连锁不平衡区间内的重要候选基因，并以实时荧光定量PCR分析候选基因的组织特异性和盐胁迫诱导表达模式，提高候选基因筛选的准确性。【结果】正常生长和盐胁迫下甘蓝型油菜发芽期下胚轴和根长在不同材料间变异较大，频次分布表明目标性状均为数量性状，受多基因调控。全基因组关联分析模型比较表明，MLM+P+K模型为最优模型。以此模型对目标性状进行全基因组关联分析，检测到45个显著关联SNP，其中40个与下胚轴长度显著关联，5个与根长显著关联，单个SNP解释的表型变异分别为9.12%—14.46%和7.67%—8.93%。重复检测的显著相关SNP中，值得注意的是C04染色体的rs8970，同时与4个性状显著关联，表型贡献率为7.67%—12.35%，是唯一在下胚轴长和根长间重复检测到的显著关联SNP。11个重要关联SNP中有6个位于10—442 kb的连锁不平衡区块中。转录组分析表明，11个连锁不平衡区间共包含447个基因，其中15个受盐胁迫诱导表达。转录组和基因功能注释综合分析表明，BnaSRO1、BnaPAGR2、BnaNPH3、BnaMYB124、BnaSAM-Mtase、BnaBIN2、BnaUMAMIT11、BnaEXPA7、BnaRPT3、BnaEF-hand和BnaF3H很可能为各自区间的候选基因。实时荧光定量PCR结果证实除BnaNPH3外，其他基因均在根或下胚轴中受盐胁迫诱导上调表达。组织特异性分析还发现BnaUMAMIT11、BnaPAGR2和BnaEXPA7主要在萌发的根和下胚轴中特异表达，BnaRPT3、BnaBIN2和BnaMYB124虽然呈组成型表达，但在萌发阶段的下胚轴中表达量最高，证实这些基因很可能参与油菜发芽期根和下胚轴生长发育及耐盐性的调节。【结论】全基因组关联分析共鉴定出45个控制油菜发芽期根和下胚轴发育及耐盐性的显著关联SNP。连锁不平衡、转录组和基因功能注释综合分析初步鉴定出11个重要候选基因。

干旱胁迫对甘蔗4个生理指标遗传变异的影响

赵培方，赵俊，刘家勇，昝逢刚，夏红明，P.A. Jackson, J. Basnayake, N.G. Inman-Bamber, 杨昆，赵丽萍，覃伟，陈学宽，赵兴东，范源洪

中国农业科学. 2017, 50(1):  28-37.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.003

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【目的】研究干旱胁迫对气孔导度（Gs）、PSⅡ原初光能转化效率（Fv/Fm）、叶片伸长速率（leaf elongation，LE）和叶片相对含水量（relative water content，RWC）4个甘蔗生理指标遗传变异的影响，为其在甘蔗育种程序早期阶段的应用提供参考。【方法】采用裂区设计，以自然干旱和人工灌溉为主区，不同甘蔗基因型为副区，在云南省红河州开远市和玉溪市元江县2个试验点先后对22个和18个甘蔗基因型同时开展田间试验，主要在2个生长季甘蔗拔节前期先后13次、18次、15次和10次分别对4个生理指标Gs、Fv/Fm、LE、RWC进行测量。采用软件GenStat计算各指标各次测量的遗传方差分量（s_g²）和环境方差分量（s_e²），并计算广义遗传力（h_b²），采用SAS9.1对每次测量干旱和灌溉处理下获得遗传方法分量和广义遗传力进行成对t测验。【结果】四项生理指标受干旱影响极显著，13次Gs、18次Fv/Fm、15次LE和10次RWC处理间差异均为极显著。在干旱和灌溉处理下，13次Gs基因型间分别10次和11次差异显著，广义遗传力范围分别为0.19—0.68和0.19—0.82，13次平均分别为0.49和0.53，灌溉条件下的遗传方差显著高于干旱胁迫下的遗传方差；18次Fv/Fm基因型间分别17次和16次差异显著，广义遗传力范围分别为0.26—0.83和0.16—0.85，平均值分别为0.64和0.58，干旱条件下的遗传方差极显著高于灌溉条件下的遗传方差；15次LE基因型间分别14次和10次差异显著，广义遗传力范围分别为0.09—0.89和0.09—0.81，平均值分别为0.58和0.50，干旱处理下平均遗传方差和遗传力较高；10次RWC基因型间分别8次和6次差异显著，广义遗传力范围分别为0.10—0.76和0.16—0.77，平均值分别为0.57和0.47，干旱条件下平均遗传方差和广义遗传力较高。总之，除Gs，其他3个指标在干旱条件下获得广义遗传力均高于灌溉条件下的广义遗传力。【结论】干旱胁迫影响Gs、Fv/Fm、LE和RWC的遗传变异和广义遗传力，在灌溉条件下测量Gs和在干旱条件下测量其他3个指标更易获得较高的遗传变异和广义遗传力，但所有4个生理指标均能在灌溉条件下获得较高的广义遗传力。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

新疆棉花高产简化栽培技术评述与展望

白岩，毛树春，田立文，李莉，董合忠

中国农业科学. 2017, 50(1):  38-50.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.004

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近20年来，新疆产棉区采取“促早栽培，向‘温’要棉；密植矮化，向‘光’要棉；水肥一体化，向‘水肥’要棉；农机农艺融合，向‘轻简化’要效益”的技术途径，通过机械代替人工大幅度减少人工投入，膜上精量播种免除放苗、定苗，合理密植配合化学调控实现简化整枝与集中收花，节水灌溉与水肥一体化实现节本增产增效，关键农艺技术与物质装备有机结合和综合运用，既保证了高产甚至超高产，又实现了轻简化，较好地解决了高产与简化的矛盾，使得以新疆为主的西北内陆棉区成为全国平均单产最高的优势棉花产区。展望未来，为保障棉花持续高产高效，今后新疆棉花栽培的技术途径须与时俱进，一方面由“向温、向水要产量、要效益”，转变为“向光、向水肥一体化、向农艺技术与物质装备高度融合要产量、要品质、要效益”；另一方面棉花栽培管理要改过去“三分种、七分管”为“七分种、三分管”。要通过棉田综合调控建立棉花高光效群体，提高群体光能利用率，协同提高棉花产量和品质；重视种子品质、提高播种质量，在“种”的环节多下功夫，减少管理环节，进一步节本增效；加强新疆棉花高效轻简化栽培的基础理论创新，为新疆棉花可持续发展提供理论支撑。

外源硒对谷子生理特性、硒含量及其产量和品质的影响

穆婷婷，杜慧玲，张福耀，景小兰，郭琦，李志华，刘璋，田岗

中国农业科学. 2017, 50(1):  51-63.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.005

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【目的】探索不同生育期喷施不同浓度硒对谷子产量、品质、保护酶活性及籽粒硒含量的变化规律，明确谷子外源硒的最佳施用量和最佳施用期，为富硒谷子的生产管理提供科学依据。【方法】以春谷长农35、夏谷冀谷20、抗除草剂杂交谷晋谷50为试验材料，采用田间试验，设置6个供硒水平（清水对照（T0）、16.96 g·hm^-2 Na₂SeO₃（T1）、33.92 g·hm^-2 Na₂SeO₃（T2）、67.84 g·hm^-2 Na₂SeO₃（T3）、135.68 g·hm^-2 Na₂SeO₃（T4）、271.36 g·hm^-2 Na₂SeO₃（T5）），在苗期、抽穗期、灌浆期叶面喷施，研究不同生育期不同供硒水平对不同品种谷子生理生化指标、产量、品质及硒含量的影响。【结果】不同浓度外源硒叶面处理谷子，不同生育期SPAD、POD、SOD、MDA、GSH和GSH-Px等6个生理生化指标，品种间达极显著差异水平（P＜0.01），并且除MDA外，其他均主要表现为随着硒浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，T3处理达到最大，抽穗期SOD、POD、GSH-Px的活性、GSH含量和SPAD分别比对照增加18%、44%、94%、97.4%和9%。外源硒能够显著提高谷子籽粒硒含量，并且不同喷施时期、不同品种均随着喷施硒浓度的增加而增加，喷施时间对籽粒硒含量的影响为灌浆期＞抽穗期＞苗期，不同品种同一时期表现为晋谷50 ＞长农35＞冀谷20。在摄入硒的安全范围内，灌浆期T3处理，晋谷50籽粒硒含量达到0.297 mg·kg^-1，比对照增加8.6倍。叶面喷施硒可以提高谷子粗蛋白、脂肪、赖氨酸和叶酸等营养品质的含量，不同喷施时期不同品种谷子粗蛋白、赖氨酸和叶酸含量与对照相比，均表现为T3处理增加最多，最高增加了13.9%、17.9%和7.5%。与对照相比，不同浓度硒可以提高谷子产量，具体表现为随着硒浓度的增加先增加后减小，以T3处理达到最大，之后为减小趋势。抽穗期T3处理晋谷50、冀谷20、长农35产量与对照相比分别增加4.9%、4.7%和1.2%。【结论】适量的外源硒对谷子生理特性提升、营养品质改善和产量提高具有促进作用，也有利于富硒功能食品谷子的生产。综合分析，抽穗期喷施亚硒酸钠67.84 g·hm^-2为谷子叶面喷施硒的最佳施用期和最佳施用量。

基于EFAST方法的AquaCrop作物模型参数全局敏感性分析

邢会敏，相诗尧，徐新刚，陈宜金，冯海宽，杨贵军，陈召霞

中国农业科学. 2017, 50(1):  64-76.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.006

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【目的】敏感性分析是作物模型本地化过程中的重要环节，对作物模型的校正与应用有重要的意义。【方法】本研究以国家精准农业示范研究基地2012—2013、2013—2014和2014—2015年冬小麦试验为研究对象，采用全局敏感性分析方法扩展傅里叶幅度检验法（Extended Fourier Amplitude Sensitivity Test，EFAST）对AquaCrop模型42个作物参数进行敏感性分析，以评估模型在北京地区的敏感参数。【结果】（1）对干生物量敏感作物参数是：水分和温度胁迫参数（生物量生产的最小生长度（stbio）, 引起冠层早衰的土壤水分消耗上限（psen））、生物量和产量参数（归一化水分生产力（wp））、蒸散参数（作物冠层形成后到衰老之前的作物系数（kcb））、作物冠层和物候发展参数（冠层生长系数（cgc），从播种到出苗时长（eme），最大冠层覆盖度（mcc），冠层衰老系数（cdc），从播种到成熟的时长（mat），产量形成过程中收获指数的建立长度（hilen））。其中stbio，kcb，wp和cgc 4个作物参数敏感性指数最大；（2）对冠层覆盖度最敏感的参数是：作物冠层和物候发展参数（cgc，mcc，每公顷株数（den），出苗率达到90%时的土壤覆盖度（ccs），mat和cdc）、根区发展参数（最大有效根深（rtx））、水分和温度胁迫参数（psen）、蒸散参数（kcb）；（3）对产量最敏感的参数是作物冠层和物候发展参数（从播种到开花时长（flo），mat，cdc，hilen和从播种到开始衰老时长（sen））、水分和温度胁迫参数（psen）、生物量和产量参数（参考收获指数（hi）和wp）、蒸散参数（kcb）。【结论】利用EFAST方法对AquaCrop模型中的作物参数进行一阶和全局敏感分析，最大干物量的敏感性分析结果以及干生物量随时间变化的敏感性分析结果显示，敏感性参数的选择上差异不大，但排序上存在较大的差异，最大干生物量的敏感性分析不能分析作物参数对干生物量在整个生育期的影响，结果不全面；冠层覆盖度随时间变化的一阶和全局敏感性分析结果显示，在敏感参数的选择和排序上均有较好的一致性，全局敏感性分析中作物参数的敏感性指数更高，对冠层覆盖度的影响表现得更明显。本研究结果用于AquaCrop模型本地化，可提高该模型在北京地区的模拟效率和模拟精度。

植物保护

橡胶树白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

冯霞，林春花，康迅，金洋，刘晓，何其光，刘文波，缪卫国，郑服丛

中国农业科学. 2017, 50(1):  77-85.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.007

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【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一，在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌（Oidium heveae）是专性寄生菌，论文借助橡胶树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides），研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法，分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和cDNA为模板，PCR扩增OhPbs2；利用生物信息学分析该基因的结构域，对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析，并利用MEGA6中最大简约法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因；利用同源重组和原生质体转化技术，将OhPbs2转化到缺失Pbs2的橡胶树炭疽菌突变体ΔCgPbs2中；在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上筛选转化子，同时提取转化子的基因组作为模板，用橡胶树白粉病菌OhPbs2的引物对进行PCR鉴定，选择正确的转化子ΔCgPbs2+OhPbs2进行后续表型测定；在不同培养条件下，比较ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和野生型菌株生长状态，并在橡胶树叶片接菌检测3个菌株致病力。【结果】OhPbs2基因序列全长1 927 bp，cDNA序列全长1 860 bp，含有一个内含子，编码一个619个氨基酸的蛋白；生物信息学分析表明该蛋白具有与CgPbs2相同的S_TKc功能域，构建系统进化树发现橡胶树白粉病菌Pbs2蛋白与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）Pbs2蛋白亲缘关系最近，相似度为55%，与橡胶树炭疽病菌的相似度为49%，与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa)、稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、禾谷镰孢（Fusarium graminearum）的Pbs2蛋白具有较近的亲缘关系， 相似度分别为54%、53%、53%、50%；ΔCgPbs2+ OhPbs2菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培养基上长出白色菌落，ΔCgPbs2菌株不能生长，并且测序结果显示OhPbs2已成功转入ΔCgPbs2；ΔCgPbs2+OhPbs2在MM培养基上菌落呈白色，气生菌丝较短，不同于wild type菌株。在含有不同浓度NaCl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培养基上，ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type菌株随着浓度增加，菌落生长速度逐渐降低，OhPbs2不仅能恢复橡胶树炭疽菌菌株耐渗透压尤其耐受山梨醇的能力以及对咯菌腈的敏感性，甚至具有增强的能力，OhPbs2互补改变了橡胶树炭疽病菌颜色，抑制了气生菌丝生长；CgPbs2可能参与了橡胶树炭疽病菌致病性，但OhPbs2互补没有恢复其致病性。【结论】 OhPbs2可能参与调控病菌的营养生长、氧化应激反应、渗透压响应及细胞壁形成等，并能增强橡胶树炭疽病菌相应功能，但与CgPbs2调控病菌致病力的机制可能存在不同。

绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答

谭永安，肖留斌，郝德君，赵静，孙洋，柏立新

中国农业科学. 2017, 50(1):  86-93.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.008

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【目的】获得绿盲蝽（Apolygus lucorum）蜕皮激素受体（AlEcR-A）原核表达的重组蛋白，制备单克隆抗体，分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势，为进一步研究EcR的功能奠定前期基础，同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上，将含有其基因的T载体经Nde I和XbaI双酶切，构建AlEcR-A原核表达载体（pCzn1-AlEcR-A），将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化，以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应，取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体，通过抗体纯化，Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白，从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法，进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫，分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化，明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应。【结果】 经Nde I和XbaI双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白，且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在；经Ni-IDA亲和层析后，pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带，说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备，获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株，命名为8H7；Western blot分析表明，该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合，还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应，且条带大小一致，说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效；RT-PCR及Western blot结果表明，与注射蒸馏水相比，20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高，且随着处理时间的延长，其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的能稳定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株，20E有诱导AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

长期施用不同肥料塿土PLFA指纹特征

郭芸，孙本华，王颖，魏静，高明霞，张树兰，杨学云

中国农业科学. 2017, 50(1):  94-103.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.009

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【目的】土壤微生物群落结构的组成与活性的变化是衡量土壤肥力的重要指标，研究长期不同施肥和土壤管理方式对塿土微生物群落结构的影响，对于指导塿土施肥和土壤管理，实现农田可持续利用具有重要意义。【方法】以陕西杨凌“国家黄土肥力与肥料效益监测基地”长期肥料定位试验为基础，运用磷脂脂肪酸标记法（PLFA），研究了塿土长期不同施肥及土地利用方式下土壤微生物群落结构及其与土壤理化性质的关系。处理包括：长期不施肥（CK）、单施氮肥（N）、长期配合施用氮钾（NK）、磷钾（PK）、氮磷（NP）、有机肥和氮磷钾（MNPK）以及长期休闲（FL）和撂荒（AB）。【结果】与对照相比，MNPK、NP和撂荒处理土壤总PLFA分别增加218.8%、73.9%和74.3%，细菌分别增加188.3%、80.8%和82.6%，真菌分别增加了315.8%、111.5%和167.0%，放线菌分别增加了23.7%、21.3%和16.3%，同时也显著增加了真菌/细菌比；N、NK和PK土壤总PLFA、细菌、真菌差异不显著，但PK显著降低放线菌的含量；与农田施肥相比，休闲和撂荒显著降低G+和G-含量。多样性指数结果表明，长期有机无机配施明显提高土壤微生物群落的Shannon-Winner多样性指数、Simpson优势度和Pielou均匀度指数，撂荒和NP也能显著增加Shannon-Winner多样性指数和Pielou均匀度指数，而长期休闲处理均明显降低了这些指数。主成分分析表明，MNPK、NP、撂荒和休闲土壤微生物群落结构发生较大变化；MNPK显著提高G-（18:1ω5c，cy19:0ω7c）、细菌（16:0，10Me22:0饱和脂肪酸）及真核生物（18:3ω6c，16:3ω6c，22:2ω6c）的多度值，撂荒（AB）和NP显著提高细菌（15﹕0，18﹕0，22﹕0，17﹕0饱和脂肪酸）的多度值。RDA分析表明，土壤理化性质对微生物菌群影响的重要性依次为有机质＞全氮＞含水量＞速效磷＞pH＞容重＞速效钾，这些理化因子均是微生物生长的关键因子。【结论】长期有机无机肥配施、氮磷配施和撂荒提高了土壤微生物群落结构多样性，从而改善了土壤生态环境，而长期休闲不利于土壤生态系统的稳定和健康。

块根块茎类作物内生固氮菌分离鉴定、系统发育与促生特性

李艳星，郭平毅，孙建光

中国农业科学. 2017, 50(1):  104-122.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.010

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【目的】分离鉴定块根块茎类作物内生固氮菌，研究块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育，分析测定块根块茎类作物内生固氮菌的促生特性，探讨块根块茎类作物内生固氮菌的种群特点及其随寄主植物的分布特征。【方法】表面消毒块根块茎样品后采用低氮培养法分离内生细菌；通过对菌株nifH的PCR扩增、测序确认分离细菌是固氮菌；通过16S rRNA基因测序、比对初步鉴定菌株，分析菌株的系统发育；通过测定菌株产生ACC脱氨酶、植物激素IAA，拮抗病原真菌研究菌株的促生特性。【结果】从胡萝卜、白萝卜、马铃薯、紫甘蓝、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜等14个块根块茎类作物的块根、块茎中共分离到内生固氮菌219株。基于16S rRNA序列，这些菌株在系统发育上分别属于Acinetobacter、Arthrobacter、Bacillus、Brevibacillus、Brevibacterium、Chryseobacterium、Citrobacter、Delftia、Domibacillus、Enterobacter、Fictibacillus、Flavimonas、Flavobacterium、Microbacterium、Micrococcus、Paenibacillus、Pantoea、Pseudomonas、Rahnella、Rhizobium、 Sphingobacterium、Staphylococcus、Stenotrophomonas、Variovorax，共计24属79种，显示了块根块茎内生固氮菌丰富的种群多样性。鉴定结果显示，219株新分离菌株中有77株系统发育地位属于Bacillus属的23个种，29株属于Pseudomonas属的10个种，二者合计为33种106株，分别占系统发育种数和新分离菌株数的41.77%和48.40％，说明Bacillus和Pseudomonas属是新分离块根块茎类作物内生固氮菌的优势种群。从219株新分离菌株中选取了79株代表菌株进行促生特性研究，结果显示8.86%菌株检测到了ACC脱氨酶活性（0.026—13.76 µmol α-丁酮酸·mg^-1蛋白·h^-1），64.56%菌株检测到了产IAA（0.34—28.99 µg·mL^-1），6.33%—13.92%菌株具有拮抗病原真菌能力（抑菌率41%—63%）。【结论】在正常生长的块根块茎类作物的块根块茎内栖息着大量内生固氮菌；块根块茎类作物内生固氮菌在科学分类地位上分布广泛，达到24属79种，显示出巨大的生物多样性；Bacillus和Pseudomonas是块根块茎类作物内生固氮菌优势种群；大约10%—60%的块根块茎类作物内生固氮菌显示出产生ACC脱氨酶、产生植物激素IAA、拮抗病原真菌等促进植物生长特性，这可能是内生固氮菌有益于植物生长的内在原因。

园艺

六倍体（AⁿAⁿCⁿCⁿC^oC^o）与白菜型油菜杂交可交配性及后代菌核病抗性

李勤菲，陈致富，刘瑶，梅家琴，钱伟

中国农业科学. 2017, 50(1):  123-130.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.011

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【目的】利用亲本种遗传资源是改良甘蓝型油菜的重要手段。以甘蓝型油菜与菌核病抗性甘蓝杂交合成的六倍体为桥梁，与大量的白菜型油菜杂交，合成杂种，探索改良甘蓝型油菜菌核病抗性的策略。【方法】采用菌核病抗病甘蓝（C01）与甘蓝型油菜（中双9号）杂交合成六倍体，通过分析六倍体的育性、菌病抗性和减数分裂行为来分析其作为桥梁材料转移菌核病抗性的可能性；将六倍体与110份白菜型油菜杂交，通过考察杂种发育和可交配性来分析六倍体与白菜型油菜杂交的可行性；通过鉴定杂种的苗期表型特征、自交结实率及离体茎秆的菌核病抗性来分析杂种在改良甘蓝型油菜遗传背景上的利用潜力。【结果】该六倍体的花粉育性为90.6%—92.7%，自交结实率为3—7粒/角果；菌核病抗性显著高于对照品种（中双9号）；处于减数分裂后期I的花粉母细胞中，68.80%（86/125）的染色体分离比为28﹕28。110份春性、冬性和半冬性的白菜型油菜与六倍体杂交，授粉15 d后的胚珠发育正常，并且都能收获成熟种子，平均可交配性为（4.25±3.91）粒/角果。尽管不同基因型之间的可交配性存在显著差异，但是不同生态型的白菜型油菜与六倍体杂交的可交配性无显著差异（半冬性：（4.35±3.77）粒/角果，春性：（4.34±4.51）粒/角果，冬性：（4.01±3.43）粒/角果；P=0.44）。六倍体作为母本或者父本与白菜型油菜杂交都能结籽，而且没有显著性差异（六倍体为母本：平均结实率为4.27粒/角果；六倍体为父本：平均结实率为3.95粒/角果；P=0.69）。六倍体与白菜型油菜杂交创建的杂种，苗期形态似甘蓝型油菜，但是表型变异丰富；杂种都能自交结籽，平均自交结实率为（7.72±4.45）粒/角果；来自不同生态型的白菜型油菜与六倍体合成的杂种自交结实率无显著性差异（冬性白菜型油菜合成的杂种平均自交结实率：（8.07±3.43）粒/角果，半冬性：（7.88±4.64）粒/角果，春性：（6.41±3.00）粒/角果，P=0.95）。经过两年的离体茎秆菌核病抗性鉴定，6份杂种的菌核病发病程度两年均显著低于中双9号（P＜0.05）。【结论】以六倍体为桥梁能有效地将甘蓝型油菜亲本种的优良性状导入到甘蓝型油菜中。

西瓜枯萎病生理小种1抗性QTL精细定位与InDel标记开发

李娜，王吉明，尚建立，李楠楠，徐永阳，马双武

中国农业科学. 2017, 50(1):  131-141.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.012

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【目的】通过QTL初定位检测栽培西瓜枯萎病生理小种1抗性的主效QTL，验证枯萎病抗性基因Fon-1的存在，结合亲本重测序信息开发紧密连锁易于检测的InDel (insertion/deletion)分子标记，为西瓜枯萎病分子标记辅助育种提供技术支撑，并实现该QTL的精细定位，加速Fon-1的克隆和功能验证进程。【方法】以高抗枯萎病的栽培西瓜‘ZXG01478’和高感病的栽培西瓜‘14CB11’为亲本构建的F₂群体为试验材料，利用WinQTL cartographer 2.5软件基于复合区间作图法对枯萎病生理小种1抗性进行QTL定位。依据两个亲本材料进行高通量的重测序，并利用重测序信息，获取位于QTL置信区间的InDel信息，利用自编的Perl程序提取参考基因组中插入缺失相应位置前后500 bp的序列，并利用Primer 5.0软件设计对应的InDel引物对，开发InDel标记。利用开发的InDel标记进行精细定位（根据基因型鉴定结果找到群体中的交换单株，逐步缩小QTL区间）、图谱（利用JoinMap 4.0计算标记的连锁关系）和QTL的重新分析。并利用具有广泛代表性的130份不同抗性的西瓜种质资源的基因型和表型鉴定结果进行验证分析。【结果】F₂群体的病株率频率分布呈现明显的双峰分布且抗病和感病两种类型的株系分离比基本符合3﹕1的分离比（c²=0.52，P=0.47），表明西瓜枯萎病生理小种1抗性主要受一个主效QTL控制。F₂群体的QTL初定位在LG1鉴定到一个枯萎病抗性相关的主效QTL（fon1），其LOD峰值为26.05，解释80.18%的表型变异，置信区间对应的物理位置为1号染色体的193 333—2 775 577 bp。通过两个亲本重测序在QTL置信区间发现19个插入缺失片段大于20 bp的InDels，经引物设计与亲本筛选，获得理想引物12对，根据位于端点位置的插入缺失选取了6对InDel引物利用F₂群体进行验证。初步的精细定位利用群体中的5个交换单株将QTL的置信区间锁定到InDel2_fon1的上游区域，连锁和QTL的重新分析结果显示新开发的一个分子标记InDel1_fon1出现在该QTL的峰值，LOD值为31.65，解释91.46%的表型变异。新开发的分子标记InDel1_fon1与已应用于枯萎病抗性研究的CAPS标记7716_fon在130份不同抗性的西瓜种质资源中的基因型鉴定结果完全一致，且基因型鉴定结果与田间抗病表型性状的符合率达70.8%。利用QTL峰值附近的SNP和InDel标记与群体中的9个交换单株最终将fon1精细定位至246 kb的物理区间。【结论】主效QTL（fon1）验证了1号染色体上Fon-1的存在，并实现了精细定位。新开发的标记InDel1_fon1与Fon-1紧密连锁，且检测简单，成本低廉，能够更好的用于栽培西瓜枯萎病的分子标记辅助育种。

贮藏·保鲜·加工

基于E-NOSE与SPME-GC/MS技术分析温湿度动态变化过程中稻谷的挥发性成分

曹俊，刘欣，陈文若，戴炳业，董文，陈银基

中国农业科学. 2017, 50(1):  142-160.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.013

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【目的】明确稻谷在温湿度动态变化过程中挥发性物质的组成和差异，找出与稻谷品质密切相关的特征性挥发物，为更好地安全运输稻谷提供参考。【方法】根据粮食实际运输条件对稻谷进行实验室动态温湿度模拟试验，稻谷样品以14%、16%、18%、20%、22%五种不同梯度的初始水分含量进行为期2个月的动态低温、中温和高温（分别是10℃左右波动、20℃左右波动和30℃左右波动，湿度均在80%左右波动）模拟试验，应用顶空固相微萃取-气质联用分析（SPME-GC/MS）和电子鼻技术（E-NOSE）对温湿度动态条件下不同初始水分含量和时间的稻谷每15 d进行挥发性成分检测，结合主成分分析法（PCA）对其检测结果进行分析。【结果】在不同试验温度条件下，不同水分含量稻谷在不同时间的特性雷达图均有不同变化，在15 d时，同一水分不同温度稻谷的响应值差异最大，而随着模拟试验时间的延长，14%—18%水分稻谷样品在不同温度条件下差异减小；电子鼻主成分分析能明显区别不同水分含量、不同温度、不同时间的稻谷样品。在低温、中温和高温试验条件下，稻谷的挥发性物质（含烃类、苯环类、醛类、酮类、醇醚类、酸酯类和杂环类等化合物）分别检测出275种、262种、215种，而原样品中仅有46种，其中烷烃类物质在低温条件下差异较大，中温、高温次之；烯炔烃类、苯环类、醇醚类、杂环类挥发性物质随温度上升而差异越大；醛类、酮类、酸酯类挥发性物质在中温时差异最大，低温低水分稻谷中烷烃类特征性挥发物质随时间延长由直链烷烃转变为环烷烃；试验后期烯炔烃特征物质主要为含氧或环状物质；苯环类物质2,6-二叔丁基对甲酚、辛基酚、肉桂腈是新鲜稻谷中的特征性挥发性物质，随着稻谷品质劣变，苯环类特征物质多为含甲氧基或者萘环物质；醇醚类、醛类、酮类特征性物质多为2-甲基-1-十六醇、苄醇、癸醛、胡椒酮等具有果香味或者刺激性特殊气味的物质；在低温或试验早期的稻谷酸酯类挥发性物质多为氨茴酸甲酯、水杨酸甲酯、二氢猕猴桃内酯等具有香甜味物质，试验后期酸酯类特征物质出现肉豆蔻酸、癸酸等无味或有刺激性气味的物质；杂环类特征性物质多为呋喃、喹啉等具有特殊味道的物质。【结论】电子鼻能快速、有效地对不同水分含量、温度的样品进行区分，各类挥发性物质种类和含量受水分含量、温度等条件影响较大。低水分含量（14%—16%）稻谷样品在30 d以内有利于控制挥发性成分变化，高水分含量（20%—22%）加快稻谷中挥发性成分变化。

电子鼻和电子舌结合模糊数学感官评价优化培根烟熏工艺

王琼，徐宝才，于海，李聪

中国农业科学. 2017, 50(1):  161-170.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.014

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【目的】采用电子鼻嗅问指纹分析、电子舌滋味指纹分析及模糊数学感官评价，选出一种烟熏液使其在合适的添加量下制作的培根能够达到传统木屑烟熏培根的风味，同时探寻利用电子鼻和电子舌法优化培根烟熏工艺的可行性和准确性。【方法】采用电子鼻和电子舌法，通过主成分分析图对3种不同浓度烟熏液制作的培根与传统木屑烟熏的培根从整体气味和滋味上进行对比分析，结合模糊数学感官评价分析并验证电子鼻和电子舌的结果。【结果】对电子鼻数据进行主成分分析，主成分1和2的累积贡献率为99.760%，大于85%，说明主成分1和主成分2已经包含了很大的信息量，能够反映样品的整体信息。4号（3‰名花MH-SO152）样品的分布区域与1号（木屑烟熏）样品的分布区域分离较远，在气味上差别明显。5号（1‰名花SY-SO968）、7号（3‰名花SY-SO968）、9号（2‰金牛山Ⅱ号）和10号（3‰金牛山Ⅱ号）样品的分布区域与1号样品的分布区域分离较近，在气味上它们与1号样品比较接近。6号（2‰名花SY-SO968）样品的分布区域与1号样品的分布区域有部分重叠，说明6号样品在气味上与1号样品基本一致，即添加2‰的广州名花SY-SO968烟熏液制作的培根与传统木屑烟熏的培根在气味上基本一致。对电子舌数据进行主成分分析，主成分1和2的累积贡献率为88.903%，大于85%，能够反映样品的整体信息。2号（1‰名花MH-SO152）、3号（2‰名花MH-SO152）和4号样品的分布区域与1号样品的分布区域分离较远，在滋味上与1号样品差别明显。8号（1‰金牛山Ⅱ号）、9号、10号样品的分布区域与1号样品的分布区域分离较近，在滋味上它们与1号样品比较接近。5号、6号、7号样品的分布区域与1号样品的分布区域分离最近，说明在滋味上它们与1号样品最接近，即添加广州名花SY-SO968烟熏液制作的培根与传统木屑烟熏的培根在滋味上最接近。在培根模糊数学感官评价的综合得分和烟熏风味描述中，1号、6号、7号和10号样品的综合得分比较接近，分值都大于8，评价等级为很好，风味描述都为烟熏味浓郁，口感好。其中，6号样品与1号样品的模糊数学感官评价的综合得分最接近，仅相差0.05，与电子鼻和电子舌法的分析结果基本一致。【结论】通过电子鼻和电子舌法的主成分分析，得出添加2‰广州名花SY-SO968烟熏液制作的培根与木屑烟熏培根在气味上基本一致，在滋味上最接近，可以用来代替传统的木屑烟熏培根。其模糊数学感官评价法的综合得分与木屑烟熏培根最接近，与电子鼻、电子舌法结果基本一致，验证了电子鼻和电子舌法优化培根烟熏工艺的可行性和准确性，从整体风味上为肉制品的生产工艺优化提供了参考。

畜牧·兽医·资源昆虫

不同品种猪PPARγ和C/EBPα基因表达规律与肌内脂肪含量的相关

盘道兴，王振，杨茂林，廖乔平，杨昌平，吴宇萍，王金洲，刘若余

中国农业科学. 2017, 50(1):  171-182.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.015

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【目的】研究PPARγ和C/EBPα基因在猪不同组织、月龄和品种中mRNA的表达规律，结合屠宰试验分析PPARγ和C/EBPα mRNA表达水平对肌内脂肪沉积的影响。【方法】选取3—7月龄的江口萝卜猪、从江香猪和大白猪为试验材料，提取心、肝、脾、肺、肾、小肠、背最长肌和皮下脂肪的总RNA，应用实时荧光定量PCR技术检测PPARγ和C/EBPα基因在3个品种不同月龄各组织中mRNA的相对表达量，同时测定背最长肌中的肌内脂肪含量。【结果】PPARγ、C/EBPα在大白猪3—7月龄各组织中均有表达，其中肝、小肠、背最长肌、皮下脂肪的表达水平较高，心、脾、肺、肾的表达水平较低。其中PPARγ在小肠、背最长肌、皮下脂肪中3、4月龄分别与6、7月龄的表达量差异极显著（P＜0.01）。C/EBPα在肝、肺、小肠、皮下脂肪中3月龄与6、7月龄均差异极显著（P＜0.01）；PPARγ、C/EBPα在江口萝卜猪心、脾、肺、肾、背最长肌的表达量最低，在皮下脂肪中最高，具有组织特异性。其表达量随月龄递增而上升，皮下脂肪的增加幅度最大。其中PPARγ在小肠、背最长肌、皮下脂肪中3、4月龄与6、7月龄的表达量差异极显著（P＜0.01）。C/EBPα在小肠、皮下脂肪中3月龄与5、6、7月龄的表达量均差异极显著（P＜0.01）；PPARγ、C/EBPα在从江香猪心、肝、脾、肺、肾、小肠、背最长肌的表达量较低，在皮下脂肪的表达量最高，PPARγ的表达量随月龄增加而上升的幅度较小， C/EBPα的表达量在各组织中的表达量随时间增加而上升。其在小肠、皮下脂肪、背最长肌中3、4月龄与6、7月龄的表达量差异极显著（P＜0.01）；PPARγ和C/EBPα基因在各组织均有表达，组织间的表达量存在差异，其中在肝、小肠、皮下脂肪中为高丰度表达。随着月龄的增加，PPARγ和C/EBPα基因mRNA的表达模式基本相同，总体呈现上升趋势，6、7月龄的表达水平较高，即随着月龄的增加而逐渐上升，到生长后期维持一个相对稳定水平。总体上皮下脂肪的表达量最高，其次肝、肺、小肠、背最长肌中较高，心、脾、肾中的表达量最低; 不同品种间PPARγ、C/EBPα在相同月龄各组织中的表达量存在差异，总体上大白猪中肝、小肠、皮下脂肪中PPARγ和C/EBPα mRNA的表达量分别与江口萝卜猪、从江香猪差异显著；肌内脂肪含量随着月龄的增加持续上升，不同品种间肌内脂肪含量存在差异，其中江口萝卜猪和从江香猪较高。不同品种猪PPARγ和C/EBPα基因的表达量与肌内脂肪含量的相关性分析表明，不同时期基因的表达量与肌内脂肪含量呈不同程度正相关。【结论】猪PPARγ和C/EBPα基因在不同组织、时期和品种中的表达差异可能与脂质代谢和脂肪沉积有关。

三江黄牛全基因组数据分析

宋娜娜，钟金城，柴志欣，汪琦，何世明，吴锦波，蹇尚林，冉强，蒙欣，胡红春

中国农业科学. 2017, 50(1):  183-194.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.016

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【目的】研究三江黄牛群体遗传多样性，从基因组层面讨论其群体遗传变异情况。【方法】提取50个体基因组总DNA，等浓度等体积混合，构建混合样本DNA池，利用CovarisS2进行随机打断基因组DNA，电泳回收长度500 bp的DNA片段，构建DNA文库。应用Illumina HiSeq 2000测序，最终得到测序数据。利用BWA软件将短序列比对到牛参考基因组（UMD 3.1），来检测三江黄牛基因组突变情况。SAMtools、Picard-tools、GATK、Reseqtools对重测序数据进行分析，Ensembl、DAVID、dbSNP数据库对SNPs和indels进行注释。【结果】全基因组重测序分析共计得到77.8 Gb序列数据，测序深度为25.32×，覆盖率为99.31%。测序得到778 403 444个reads和77 840 344 400个碱基，比对到参考基因组（UMD 3.1）的reads为673 670 505，碱基为67 341 451 555，匹配率分别为86.55%和86.51%，成对比对上的reads数为635 242 898（81.61%），成对比对上的碱基数为63 512 636 924（81.59%）；共确定了20 477 130个SNPs位点和1 355 308个indels，其中2 147 988个SNPs（2.4%）和90 180个indels（6.7%）是新发现的。总SNPs中，鉴定出纯合SNPs989 686（4.83%），杂合SNPs19 487 444（95.17%），纯合/杂合SNP比为1﹕19.7。转换数为14 800 438个，颠换为6 680 058个，转换/颠换（TS/TV）为2.215。剪切位点突变SNP727个，开始密码子变非开始密码子SNP117个，提前终止密码子的SNP530个，终止密码子变非终止密码子SNP88个。检测到非同义突变数为57 621，同义突变为83 797，非同义/同义比率为0.69。检测到非同义SNPs分布在9 017个基因上，其中发现567个基因与已报道的重要经济性状相符，肉质、抗病、产奶、生长性状、生殖等相关基因的数量分别为471、77、21、10、8个，其中包括功能相重叠的基因；indels数据中，缺失数量为693 180（51.15%），插入数量为662 148（48.85%），纯合indels数量为161 198（11.89%），杂合indels数量1 194 110（88.11%），大部分的变异都位于基因间隔区和内含子区；三江黄牛全基因组杂合度（H）、核苷酸多样性（Pi）及theta W分别为7.6×10^-3、0.0 039、0.0 040，说明其遗传多样性较为丰富。三江黄牛群体Tajima'D为-0.06 832，推测可能由于群体内存在不平衡选择所致。【结论】本研究为进一步分析与经济性状相关的遗传学机制和保护三江黄牛品种遗传多样性提供了基因组数据支持。

分子连锁分析探讨家蚕高抗BmNPV品系的抗性遗传基础

高瑞，李春林，童晓玲，曹明亚，石美宁，徐安英，鲁成，代方银

中国农业科学. 2017, 50(1):  195-204.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.017

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【目的】家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）所引发的血液型脓病是一种传染性强的蚕病，极大地影响蚕业生产。本研究旨在定位对BmNPV高抗的家蚕品系中控制其抗性的基因，进而解析其抗性遗传机制，为培育抗性素材和品系提供理论支持。【方法】以BmNPV高抗家蚕品系99R和较感品系Dazao-N为亲本，配制连锁分析（BC₁F）和定位分析（BC₁M）回交群体。首先对两个亲本品系进行浓度梯度添毒，统计感病死亡的家蚕头数，运用SPSS 17.0软件，计算其半致死剂量（LD₅₀），在此基础上确定BC1分离群体的攻毒剂量，并通过单头定量攻毒，选取感病个体作为连锁定位分析材料；利用筛选得到的覆盖家蚕全套常染色体的多态性标记进行分型，并通过T检验计算各标记与抗性的连锁显著性水平（P值），筛选出与抗性相连锁的标记。在这些标记所在的染色体上加密标记，检测各标记在定位分析群体中的基因型，定位抗性基因。【结果】LD₅₀(99R)=2.92×10⁶个多角体/头,LD₅₀(Dazao-N)=9.78×10⁵个多角体/头，基于双亲的半致死剂量，选择介于两者之间且略高于其均值的剂量——2×10⁶个多角体/头作为BC1分离群体的攻毒剂量；先后于2014年秋季和2015年春季处理并检测连锁分析群体，前后两次所进行的连锁分析结果有较大差异，其中第一次找到Chr22上的多态性标记S2205与99R抗性连锁，而第二次的连锁分析显示标记S2205与抗性不连锁，也没有找到其他的连锁关系。通过与前人对BmNPV抗性的连锁定位分析结果进行对比，发现连锁定位分析结果的不可重复性是一个普遍的问题。AY380833是GenBank中已公布的在家蚕高抗品系NB和871C中与其抗性位点紧密连锁的分子标记，本研究调查发现其与99R和871C的抗性位点均不连锁。【结论】分子连锁分析结果证明，家蚕对BmNPV的抗性在不同抗性品系中遗传基础有很大的差异性，同一品系可能具有多个抗性位点；家蚕对BmNPV的抗性是一种复杂性状，在符合“质量-数量性状”结论的同时，其数量性状特征突出。