中国农业科学

油菜株高QTL定位、整合和候选基因鉴定

张江江，詹杰鹏，刘清云，师家勤，王新发，刘贵华，王汉中

中国农业科学. 2017, 50(17): 3247-3258. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.001

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【目的】通过对油菜株高进行多环境QTL定位并与已报道的油菜株高QTL和植物株高基因分别进行整合和比对分析，揭示油菜株高的遗传结构和候选基因并为其分子改良提供依据。【方法】以油菜优良品种中双11（测序）和No.73290（重测序）衍生的含184个单株的BnaZNF₂群体为试验材料。首先，对BnaZNF₂群体进行基因型分析，利用Joinmap 4.0软件构建了一张含803个分子标记的高密度遗传图谱。其次，对F_2:3和F_2:4家系进行连续两年（2010—2011）两点（武汉和西宁）田间试验和表型鉴定。然后，利用BnaZNF₂群体的基因型数据和F_2:3以及F_2:4家系的株高表型数据，采用WinQTLCart 2.5软件的复合区间作图法进行QTL检测。最后，利用元分析的方法采用BioMercator软件对不同环境中检测到的株高QTL进行整合。【结果】对两年两点环境下分别检测到的株高QTL进行整合总共得到5个株高QTL的位点：qPH.A2-1、qPH.A2-2、qPH.C2-1、qPH.C3-1和qPH.C3-2，分布于A2、C2和C3染色体上，解释2.6%—55.6%的表型方差。其中，qPH.A2-1和qPH.A2-2只在武汉检测到，而qPH.C2-1、qPH.C3-1和qPH.C3-2只在西宁检测到。位于C2连锁群的主效QTL-qPH.C2-1只在西宁被重复检测到，而且LOD值、加性效应和贡献率（分别为23.4、-16.0和55.6%）均高于前人报道，是目前发现的效应最大的一个油菜株高QTL。基于油菜基因组物理图谱对本研究和已报道的油菜株高QTL和植物株高基因分别进行整合和比对分析，获得了一个由183个QTL和287个候选基因组成的相对完整的油菜株高遗传结构图。其中，有18个株高QTL簇能在不同研究中被共同检测到，分布在A1、A2、A3、A6、A7、A9、C6和C7染色体上。另外，本研究定位到的5个油菜株高QTL的物理位置和已报道的油菜株高QTL均不重叠，因而是新的株高QTL位点。其中，qPH.A2-2、qPH.C3-1和qPH.C3-2物理区间内总共找到了15个株高同源基因，而11个在2个亲本中存在序列变异，被选作候选基因进行进一步研究。【结论】QTL定位和整合获得5个油菜株高QTL，均为首次报道而且都只在武汉或西宁被检测到。其中位于C2连锁群的主效QTL效应值超过以往报道，表现出极强的QTL与环境的互作。通过与已报道的油菜株高QTL和植物株高基因分别进行整合和比对分析，较为全面地揭示了油菜株高的遗传结构和候选基因，生物信息学分析还鉴定到11个位于本研究定位到的3个株高QTL区间内的候选基因。

甜菜WRKY转录因子全基因组鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析

孔维龙，于坤，但乃震，杨绍宗，包满珠，黄向荣，傅小鹏

中国农业科学. 2017, 50(17): 3259-3273. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.002

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【目的】WRKY转录因子是一类植物响应生物、非生物胁迫，对生长发育都起重要调控作用的转录因子。在甜菜全基因组信息分析的基础上，鉴定WRKY家族基因（BvWRKYs），解析其组织特异性及盐、热胁迫下的表达情况，为该类基因的功能研究提供参考，为观赏甜菜和石竹目其他观赏植物的基因工程打下基础。【方法】以75条拟南芥WRKY蛋白为参考，根据WRKY保守蛋白序列（PF03106）利用hmm和BLAST同源性搜索对甜菜WRKY家族基因进行鉴定。利用MapInspect、GSDS2.0、MEGA5.0、DNAMAN5.0、WebLogo 3、MEME生物信息学工具对甜菜WRKY家族基因染色体定位、系统发生关系、基因结构、蛋白质保守结构域、保守元件进行预测和分析。利用RNA-seq和qRT-PCR分析甜菜WRKY组织表达特异性，盐胁迫、热胁迫条件下WRKY表达情况。【结果】甜菜WRKY家族基因包含40个成员，其中39条不均匀地分布在9条染色体上，另外1条定位到随机片段上。根据WRKY保守域特征并与拟南芥WRKY蛋白进化分析，可将40个成员分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3类，Ⅰ类有9个成员，Ⅱ类有26个成员，Ⅲ类有5个成员。根据进化关系Ⅱ类可进一步分为Ⅱa（1个）、Ⅱb（4个）、Ⅱc（9个）、Ⅱd（5个）和Ⅱe（7个）5个亚类。基因结构分析发现，甜菜WRKY外显子和内含子数目具有高变异性（2—7个外显子），即使同一亚类内也都差异较大。保守元件分析显示同一类或亚类内成员具有相同的保守元件。WRKY保守域分析发现2个WRKY七肽域变型：WRKYGKK和WRKYGEK。每个WRKY至少在2个组织中表达，30个WRKY在叶中表达，40个WRKY在花序中均有表达，36个WRKY在幼叶中有表达，38个WRKY在直根中有表达，39个WRKY在幼苗中有表达，36个WRKY在种子中有表达。各WRKY表达量差异较大，可分为低表达、高表达基因两类，如BvWRKY23、BvWRKY3、BvWRKY11、BvWRKY7、BvWRKY6、BvWRKY26、BvWRKY4、BvWRKY40、BvWRKY24、BvWRKY2和BvWRKY28在各组织中均有较高表达，而BvWRKY38、BvWRKY13、BvWRKY36、BvWRKY35、BvWRKY5和BvWRKY34在各组织中均表达较低。热胁迫条件下BvWRKY16、BvWRKY21、BvWRKY20、BvWRKY22、BvWRKY32、BvWRKY33和BvWRKY34上调表达；盐胁迫条件下BvWRKY1、BvWRKY6、BvWRKY19、BvWRKY31和BvWRKY33呈现不同程度上调表达；BvWRKY33对热、盐2种胁迫均有明显响应。【结论】甜菜WRKY蛋白结构高度保守，基因序列长度和内含子数量变化很大，在不同组织中呈现出多种表达模式，部分WRKY响应热或盐胁迫，对甜菜逆境生理调控起重要作用。

拟南芥仅含START结构域亚家族基因特性与功能分析

闫青地，赵亚林，张昊，高静，高梦烛，王倩，王蕊，王凤茹，董金皋

中国农业科学. 2017, 50(17): 3274-3285. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.003

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【目的】分析拟南芥中仅含START结构域（the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains）亚家族成员的启动子元件及表达特性，阐明启动子元件与表达特性的相互关系，为明确仅含START结构域亚家族的生物学功能，解析植物生长发育机理、更好地促控植物生长提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析仅含START结构域亚家族6个成员的亲缘关系及各自启动子区所包含的所有元件，对启动子元件的功能进行分析和分类；利用real-time PCR方法研究亚家族成员的表达特性；用突变体分析确认基因的功能；分析通过启动子元件分析预测的基因功能与通过突变体分析确认的基因功能间的相关性，为基因的功能和作用机制分析提供科研思路和方法。【结果】生物信息学分析表明，拟南芥中仅含START结构域亚家族成员共6个，分为3个分支，每个分支一对基因，每一对基因中均有一个基因的启动子中含有高转录水平元件5′ UTR Py-rich stretch，6个亚家族成员的启动子区均含有多个光、激素和逆境响应元件，也存在各自特异的响应元件；用real-time PCR分析基因的表达量，结果与生物信息学预测结果一致：At3g13062的表达量明显高于同分支的At1g55960，At3g23080的表达量明显高于同分支的At4g14500，At1g64720的表达量明显高于同分支的At5g54170。组织定位分析表明亚家族成员有特异的时空表达特性：At3g13062和At1g55960在幼苗期就有明显表达，但At3g13062主要在子叶、下胚轴和根中表达，而At1g55960主要在根中表达量较多；在成苗期拟南芥中，At3g13062主要在叶片中表达，在根中表达量较少；而At1g55960在成苗期拟南芥的叶片和根系的表达量均较多；At3g23080和At4g14500在幼苗期表达量较少，而在成苗期表达量增加，At3g23080主要分布于莲座叶中，At4g14500主要分布于莲座叶叶柄部。上述结果表明仅含START结构域亚家族成员可能在拟南芥不同时期和不同的部位分别行使着功能。利用生物信息学对启动子元件分析发现，各个基因均具有胚乳特意表达的Skn-1 motif元件，暗示着该家族基因可能参与调控胚乳的发育，进而影响种子的活力和萌发；通过对At3g23080和At4g14500的T-DNA插入突变体种子的分析表明，At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率的下降，这与生物信息学预测结果一致。【结论】拟南芥中仅含START结构域的亚家族有6个成员；6个亚家族成员可能在光、激素和逆境调控的发育过程中具有重要的作用；含START结构域的亚家族6个成员虽然同源关系较近，但具有各自的时空表达特性，在拟南芥的不同组织和不同发育时期执行着各自的功能。基因启动子元件与基因功能有直接关系，启动子区具有胚乳特意表达Skn-1 motif元件的At3g23080和At4g14500表达量下降均会导致种子活力和萌发率下降。

AquaCrop作物模型应用研究进展

孙仕军，张琳琳，陈志君，孙娟

中国农业科学. 2017, 50(17): 3286-3299. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.004

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AquaCrop是FAO于2009年研发的一款新型作物模型，它以输入参数少、界面简单等优点被广泛应用于生产实践中。论文基于AquaCrop模型原理和特点，深入探讨了AquaCrop模型国内外应用研究进展。当前，AquaCrop模型在灌溉策略、气候变化下的情景模拟以及与其他模型联合应用等方面取得了显著进展。但是，该模型在应用过程中还存在若干缺陷。一是模型在保守参数缺少验证的情况下，会使得模拟精度不稳定；二是由于土壤空间变异性的客观存在，模型在由点位向面上扩展时应用效果不佳；三是当前对雨养区作物生长模拟研究还很少，且其非保守参数难以准确确定；四是目前该模型生理、养分和水养互作模块尚不够完善，未考虑作物病虫害和品种遗传差异，当作物生长遭受水分、盐分或温度等严重胁迫时会导致模拟精度下降。今后在模型应用时，可利用多年数据对保守参数进行校正，将区域同一站点多年数据和多站点相关数据相结合调试模型非保守参数；其次，应加强雨养地区模拟研究，从而扩大模型应用范围。开发者应进一步完善AquaCrop模型子模块，为提高模拟精度和拓宽应用范围提供支撑。

持续淹水对水稻镉吸收的影响及其调控机理

陈江民，杨永杰，黄奇娜，胡培松，唐绍清，吴立群，王建龙，邵国胜

中国农业科学. 2017, 50(17): 3300-3310. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.005

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【目的】研究持续淹水对不同镉（Cadmium，Cd）积累水稻品种Cd 含量的影响，通过分析持续淹水条件下土壤有效性Cd、植株Cd含量以及水稻根系Cd吸收转运关键基因表达，揭示持续淹水对水稻Cd积累的作用及其调控机制。【方法】采用水稻品种辐品36（FP36，Cd高积累品种）和中嘉早17（ZJZ17，Cd低积累品种），盆栽条件下（外源加入1.5 mg·kg^-1CdCl₂）于水稻分蘖始期开始持续淹水处理，分蘖盛期取样分析植株Cd 含量及Cd 转运相关基因表达情况，测定土壤中有效性Cd、Fe、Mn含量和根膜Cd、Fe和Mn含量。相同处理继续培养至水稻完熟期，收获植株和稻米并测定Cd含量和产量。【结果】在Cd污染土壤条件下，与正常灌溉处理相比，持续淹水显著降低了分蘖盛期水稻FP36和ZJZ17的Cd含量，根部降幅分别为39.5%和33.9%，地上部降幅分别为62.1%和71.7%。在完熟期也表现相同作用效果，持续淹水显著降低完熟期水稻FP36和ZJZ17根部、地上部和稻米中Cd含量，FP36根部、地上部和稻米分别降低36.4%、43.7%和36.8%，ZJZ17分别降低62.5%、61.5%和55.4%。研究发现，持续淹水显著降低了两个水稻品种的土壤有效性Cd含量（降幅分别为12.1%和17.7%）和根膜中Cd 的含量（降幅分别为52.2%和43.1%）。Cd胁迫下，持续淹水增加了土壤有效性Fe（增幅分别为23.7%和10.3%）和有效性Mn含量（增幅分别为24.5%和43.9%），也使根膜中Fe（增幅分别为83.1%和81.5%）和Mn含量（增幅分别为41.5%和27.7%）显著增加。更为重要的是，持续淹水显著下调了两个水稻品种根部OsNramp1（58.3%和58.0%）和OsLCD （21.6%和17.8%）基因的相对表达量。【结论】持续淹水通过降低土壤有效性Cd含量和抑制Cd吸收基因表达（OsNramp1和OsLCD）的双重调控作用，降低了水稻对Cd的吸收和积累。

不同基因型苦荞苗期抗旱性综合评价及指标筛选

路之娟，张永清，张楚，刘丽琴，杨春婷

中国农业科学. 2017, 50(17): 3311-3322. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.006

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【目的】苦荞不仅具有丰富的营养价值和药用价值且具有耐冷凉、耐瘠薄、适应性强等生理特性，不同苦荞品种间的抗旱性差异显著，探讨苦荞苗期耐旱特性，筛选耐旱基因型材料及耐旱性鉴定指标并建立耐旱性数学评价模型，不仅能够为品种耐旱性评价与品种筛选奠定基础，更为黄土高原冷凉地区的种质选育提供理论依据。【方法】采用苗期沙培方式，设置正常供水CK和干旱胁迫DS两个处理，对9份不同苦荞品种在不同处理下的株高、茎粗、叶面积等农艺性状及根系活力、根系酶活性等生理指标进行测定。利用隶属函数法、主成分分析与聚类分析对各苦荞品种耐旱能力进行综合评价，并用逐步回归分析建立最优回归方程进而实现对苦荞耐旱能力的预测与鉴定。【结果】干旱胁迫对苦荞各指标均有显著影响，差异性分析结果表明，苦荞苗期地上部指标、根系干重、根系活力、根系形态指标、可溶性蛋白含量、相对含水量、叶绿素含量、Fm 和 Fv/Fm等指标与对照相比均明显下降；而根系酶活性、MDA含量、可溶性糖、游离脯氨酸含量、Fo与对照相比，表现为升高，且耐旱型品种的根冠比也表现为升高，中间型和不耐旱品种则表现为下降。主成分分析将21个单项指标转化为3个相互独立的综合指标（累计贡献率达87.30%），且第1主成分主要反映的是生物量、根系形态、叶片荧光参数等信息；第2主成分反映的是植株根系活力、根系酶活性和根系渗透调节物质等信息；第3主成分反映的是植株地上部形态及部分叶片和根系生理特性的相关信息。聚类分析将9个苦荞基因型划分为3类，分别为耐旱型、中间型和不耐旱型。为了对各基因型的耐旱能力进行预测并建立数学评价模型，将D值作因变量，各指标耐旱系数作自变量进行逐步回归分析。结果分析表明，通过建立最优回归方程，筛选出株高、茎粗、根冠比、根系活力、最大根长、MDA、Fo及水势等8项对苦荞耐旱能力有影响的指标，并且9个苦荞基因型的苗期耐旱能力预测值与D值极显著相关（R²=0.988**），表明用此方程对苦荞抗旱特性进行预测具有一定的准确性及高效性，进而在苦荞抗旱特性的鉴定工作中如果有选择的测定上述指标，可使鉴定工作简单化。【结论】干旱胁迫对苦荞苗期各指标均有显著影响。通过聚类分析图得出参试品种分为3大类型，即迪庆苦荞、西农9909和奇台农家品种为耐旱型品种；广苦1号、黔苦6号、云荞1号为中间型品种；多元苦荞、黑丰1号和西荞1号为不耐旱品种。确定了苗期耐旱能力预测值与D值极显著相关（R²=0.988**），筛选出株高、茎粗、根冠比、根系活力、最大根长、MDA、Fo及水势等指标，可作为苦荞抗旱特性快速鉴定的指标。

匍匐翦股颖接种立枯丝核菌后基因表达变化的转录组学分析

史毅，牛奎举，马晖玲

中国农业科学. 2017, 50(17): 3323-3336. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.007

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【目的】确定匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）接种立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）后基因种类和表达量在转录水平的变化规律，明确草坪草病原菌侵染响应的关键基因。【方法】匍匐翦股颖生长14 d后采用麦粒培养物接种立枯丝核菌，接种3 d后选取感病叶片和未接种叶片提取RNA，进行转录组高通量测序，然后利用生物信息学分析，用Trinity组装匍匐翦股颖转录组，以组装子为参考，以|log₂(fold change)|＞1，q-value＜0.005为阈值选取感病和健康匍匐翦股颖叶片转录组的差异表达基因，并用iTAK软件分析其转录因子家族及表达变化，与植物R基因库进行blast分析R蛋白分类、利用Mapman软件分析生物胁迫信号通路相关基因的表达变化。【结果】高通量测序得到125 253 092条高质量待分析reads。经Trinity从头组装后，得到466 761条转录本。过半数的转录本长度为700 bp以上，组装结果N₅₀=1 100 bp。使用CD-HIT选择334 212条转录本（所有转录本的71.60%）作为Unigene，平均长度573 bp，N₅₀=791 bp。接种后植物比接种前植物基因有7 937个上调表达，1 570个下调表达。上调基因中296个，下调基因有142个都可被定义为转录因子，分布在58个转录因子家族中，其中锌指蛋白包含转录因子C2H2最多，有54个，C3H次之，为22个。差异基因中451个可定义为植物R蛋白表达基因，可分为33类，其中包含NBS-LRR结构域的抗病蛋白、LRR受体蛋白激酶、ABC-2类型的转运蛋白、U-box结构域蛋白激酶和热激蛋白这5类基因变化最显著。差异基因中大量上调表达基因可富集在病原识别、活性氧消除、信号传导、细胞凋亡、病程相关蛋白等生物胁迫相关基因类别，下调基因显著富集在植物生长发育相关类别和通路。qRT-PCR验证了随机挑选差异基因的表达量变化，均与RNA-seq分析结果一致，其中包括12个C2H2转录因子基因，10个C3H转录因子基因，以及12个R蛋白基因。【结论】病原菌侵染后，引起匍匐翦股颖大量基因表达变化，其中转录因子、R蛋白以及抗性相关基因多为上调表达，作用为抑制病原菌扩散，而生长发育相关基因表达下调，这些进程共同使匍匐翦股颖产生对立枯丝核菌的先天基础抗性。

小麦矮缩病毒引起的植株矮化与赤霉素代谢的相关性分析

吴慧娟，刘艳，王锡锋

中国农业科学. 2017, 50(17): 3337-3343. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.008

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【目的】由异沙叶蝉（Psammotettix alienus）传播的小麦矮缩病毒病是近年来中国西北部麦区严重发生的小麦病毒病害之一。受侵染的小麦植株严重矮化，有效分蘖减少，产量损失严重。论文旨在明确小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus，WDV）侵染小麦植株后矮化症状形成与赤霉素代谢调控的关系，为该病害的防治打下基础。【方法】以小麦品种扬麦12为试验材料，以异沙叶蝉为传毒介体饲毒后转移到1叶期的健康幼苗（3头/株）上进行传毒，同时以无毒异沙叶蝉取食健康幼苗为对照。根据试验需要，不同时间取样备用。为保证试验的准确性，经PCR检测为阳性的作为处理组试验材料；采用间接酶联免疫吸附（ELISA）法，利用植物赤霉素（GA3）试剂盒测定分析侵染第21天取样的小麦叶片赤霉素含量；将带毒条沙叶蝉接种的小麦苗分为两个平行处理组，接种后第7天分别用GA3（浓度为50 mg·L-1）和H2O进行叶面喷施处理，每隔一周处理一次。以无毒叶蝉接种后长势一致的小麦苗作为对照组，根据株高统计结果分析外施赤霉素对受侵染小麦植株的表型变化；以山羊草（Aegilops tauschii）的内根-贝壳杉烯合成酶（ent-kaurene synthase-like 3，KSL3）的基因编码区序列为参考基因设计引物（KSL3-F：5′-ATGATGGTGAATCCGCCGC-3′；KSL3-R：5′-TTAATGGTTGATCTTTGTTT-3′），对扬麦12的KSL3进行克隆和序列分析；分别取接种后7、14和21 d的小麦植株叶片，提取RNA后反转录，以克隆得到的TaKSL3基因序列设计引物（TaKSL3-F：5′-GAGACATGTGCCATGGCGTTC-3′；TaKSL3-R：5′-CGTGTCACTCAGATCGGTGGAG-3′），选择小麦翻译延伸因子1A（EF-1α）作为内参基因，利用荧光定量PCR方法分析赤霉素代谢相关基因的转录水平。【结果】经ELISA检测发现，接种21 d的发病植株赤霉素含量与健康植株相比降低了28.9%；通过施用浓度为50 mg·L^-1的赤霉素后，发病植株的平均株高相比对照组显著增加35.9%；采用同源克隆得到了完整的小麦赤霉素合成途径关键酶KSL3的编码区序列，长度为1 827 bp，编码608个氨基酸，BLAST比对分析发现该DNA序列与山羊草KSL3编码区序列相似度为85.2%。经荧光定量检测发现受小麦矮缩病毒侵染后小麦KSL3表达量显著下降，接种14 d降低为对照组的35.7%，21 d降低为对照组的9.6%。【结论】小麦矮缩病毒的侵染导致赤霉素合成途径关键酶的表达量降低，可能使赤霉素合成受阻，赤霉素含量降低引发受赤霉素调节的细胞生物学过程异常，从而诱导矮化症状形成。研究结果为揭示小麦矮缩病毒侵染的致病机理和病害防控打下了基础。

ToMV外壳蛋白互作IP-L蛋白的亚细胞定位及表达分析

彭浩然，蒲运丹，张永至，薛杨，武改霞，青玲，孙现超

中国农业科学. 2017, 50(17): 3344-3351. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.009

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【目的】前期研究显示ToMV外壳蛋白（coat protein，CP）可以与烟草蛋白L（CP-interacting protein-L，IP-L）相互作用，本研究旨在明确ToMV CP与IP-L的共定位情况、IP-L的组织表达和在ToMV侵染条件下烟草IP-L及其编码蛋白的表达变化情况，为进一步明确IP-L的功能提供依据。【方法】通过双酶切法从笔者实验室构建保存的pGBKT7-CP和pGADT7-IP-L重组载体上切下ToMV CP和IP-L目的片段，构建融合蛋白植物表达载体pPZP-IP-L-N-EGFP和pPZP-CP-N-DsRed及原核表达载体pEGX-IP-L。通过热激法将融合表达的植物表达载体转化至农杆菌EHA105，在烟草表皮细胞瞬时表达IP-L-N-EGFP和CP-N-DsRed，共聚焦荧光显微镜下观察IP-L和ToMV CP共定位情况。用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析IP-L在本氏烟各组织部位的表达量。原核表达载体pEGX-IP-L，转化原核表达菌BL21，优化GST-IP-L可溶性表达条件后大量表达该蛋白，用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-IP-L蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价，Western印迹法明确抗体的特异性后，利用该抗体分析ToMV侵染条件下番茄IP-L蛋白表达情况，用qRT-PCR检测IP-L表达变化与蛋白水平是否一致。【结果】ToMV CP在本氏烟叶片表皮细胞的细胞质和细胞质膜以及叶绿体均有分布，而IP-L只在本氏烟叶片表皮细胞质膜表达，二者共定位在细胞质膜。IP-L在本氏烟叶片中特异高表达，显著高于茎、根和花中的相对表达量。在温度为30℃，IPTG诱导浓度为0.3 mmol·L^-1条件下表达出大小为42.8 kD的可溶性GST-IP-L融合蛋白。纯化获得约4.2 mg可溶性蛋白，免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明，该抗体可以与IP-L的原核产物特异性结合。在ToMV侵染本氏烟1、3、7 d后，Western印迹分析表明IP-L在叶片内表达量随接种时间呈明显上调趋势。qRT-PCR检测结果与Western印迹结果一致，显示IP-L在ToMV侵染本氏烟第7天后的叶片内表达量是健康对照的3倍多，差异达到显著水平。【结论】ToMV CP和IP-L共定位于本氏烟表皮细胞质膜，IP-L在本氏烟叶片内特异高表达。制备的IP-L多克隆抗体具有良好的免疫反应活性，可以用于IP-L表达量检测；ToMV侵染烟草可诱导IP-L及其编码蛋白表达量显著上调。

氮肥用量对小麦开花后根际土壤特性和产量的影响

安婷婷，侯小畔，周亚男，刘卫玲，王群，李潮海，张学林

中国农业科学. 2017, 50(17): 3352-3364. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.010

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【目的】明确小麦开花后根际土壤特性动态特征及其与产量和籽粒氮素积累量之间的关系，能够为生产上合理施肥、提高氮肥利用效率和减轻环境污染提供理论依据。【方法】2014—2015和2015—2016年在小麦季设置4个氮肥水平（0，CK；150 kg N·hm^-2，N150；240 kg N·hm^-2，N240和300 kg N·hm^-2，N300）并于小麦开花期、灌浆中期和成熟期分层（0—20 cm和20—40 cm）测定小麦根际和非根际土壤铵态氮、硝态氮、蔗糖酶、脲酶，同时测定根、茎、叶和穗生物量及其氮素含量；重点分析根际土壤特性与小麦籽粒产量和氮素积累量之间的关系。【结果】（1）与CK相比，N150、N240和N300处理2年小麦籽粒产量的平均值分别增加99%、130%和107%，且处理之间差异显著。随施氮量的增加小麦根、茎、叶、穗生物量和地上部氮素积累量均呈增加趋势；氮肥回收率呈下降趋势，且处理之间差异显著。（2）从开花到成熟期，0—20 cm和20—40 cm土层小麦根际和非根际土壤铵态氮、硝态氮含量、土壤蔗糖酶和脲酶（0—20 cm除外）活性均呈下降趋势。处理CK、N150、N240和N300根际土壤铵态氮和硝态氮含量显著低于非根际土壤。4个处理2年0—20 cm根际土壤铵态氮含量平均值比非根际土壤降低29%，硝态氮含量降低22%；20—40 cm根际土壤铵态氮含量比非根际土降低34%，硝态氮含量降低14%。而根际土壤蔗糖酶和脲酶活性显著高于非根际土。4个处理2年0—20 cm根际土壤蔗糖酶活性比非根际土壤提高29%，脲酶活性提高15%；20—40 cm根际土壤蔗糖酶活性比非根际土壤提高33%，脲酶活性提高13%。（3）相关分析结果表明，小麦籽粒产量和籽粒氮素积累量均与0—20 cm和20—40 cm根际和非根际土壤无机氮（铵态氮+硝态氮）、脲酶和蔗糖酶（2016年籽粒氮素积累量除外）呈显著正相关。【结论】小麦根际土壤可利用性氮素含量小于非根际土壤，而酶活性高于非根际土；根际和非根际土壤与籽粒产量和籽粒氮素积累量呈显著正相关。根际和非根际土壤特性显著影响小麦籽粒产量。

基于GIS的吉林省水稻种植区施氮效果及减排潜力分析

焉莉，冯国忠，兰唱，高强

中国农业科学. 2017, 50(17): 3365-3374. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.011

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【目的】研究不同水稻种植区施氮效果差异，旨在加强氮肥精准养分管理，提高作物产量和肥料效率，从而减少农田氮排放。【方法】通过对2005—2013年吉林省测土配方施肥田间试验中不施氮肥处理（N₀P₂K₂）及3个氮梯度（0.5N₂P₂K₂）、（N₂P₂K₂）、（1.5N₂P₂K₂）处理进行分析，研究不同水稻种植区的产量、氮肥施用效果及氮肥农学利用率，探讨各区域施氮效果及减排潜力。【结果】吉林省各地区水稻产量差异显著，西部地区最高，东部地区最低。在不施氮肥条件下西部地区平均产量可达7.6 t·hm^-2，其与中部地区和东部地区的平均产量差可达到2.1和2.2 t·hm^-2。施用氮肥后，中部和东部地区最低增产率29.8%（最高59.5%）显著高于西部地区12.6%（最高29.4%）。中部和东部的氮肥利用效率分别为12.2—19.7和12.5—19.5 kg·kg^-1，远高于西部地区的8.8—13.1 kg·kg^-1。采用最大经济收益法MRTN方法建立氮肥用量与净收益间的函数关系，从而计算各地区最佳施氮量。西部地区、中部地区和东部地区的最佳施氮量分别为114.9、128.9和134.1 kg·hm^-2，与推荐施肥相比可减少25.6、18.3和5.3 kg·hm^-2。在产量没有显著差异的条件下，各地区均可减少氮肥施用量，尤其是西部和中部地区。通过节氮成本和粮食收入核算发现，各地区均可增加经济效益，其中中部地区农民增收显著。在保证产量条件下，采用最佳施肥量，吉林省西部、中部和东部每年可减少氮投入量分别为4 378、7 064 和604 t；减少氮排放98.2、158.6和13.6 t。【结论】吉林省西部地区应控制氮肥施用；中部地区为全省减排重点区域；东部地区目前施肥量适中，可以配合其他管理模式消减自然因素的限制，从而提高水稻产量。

白菜类作物开花时间的全基因组关联分析

高宝祯，刘博，李石开，梁建丽，程锋，王晓武，武剑

中国农业科学. 2017, 50(17): 3375-3385. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.012

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【目的】解析白菜类作物开花时间的调控位点，定位白菜类作物开花时间相关的候选基因，为白菜类作物抽薹开花时间的遗传改良提供依据。【方法】以116份白菜类作物组成的自然群体作为研究材料，分别种植在温室与露地2个独立的环境中，进行开花时间调查。同时，提取试验材料的DNA样品进行深度为1.2x的重测序，对测序数据用Pooled Mapping法进行过滤、与参考基因组比对，获得全基因组高密度SNP集合。经过条件过滤后，对高质量的SNP集合进行生物信息分析，包括试验材料的群体结构分析和全基因组连锁不平衡分析。从高质量的SNP集合中，随机挑选出2 000个变异位点，用PhyML软件以最大似然法对116份试验材料进行系统发育树分析。用全部的高质量SNP集合位点通过软件Haploview进行全基因组连锁不平衡分析。最后，将高质量的SNP集合与开花时间数据结合，通过TASSEL和GAPIT软件包以及R程序语言进行全基因组关联分析。根据强关联峰值信号点位置和连锁不平衡区间定位开花时间候选位点，再通过白菜与同源物种拟南芥的基因共线性关系以及基因功能注释分析来预测白菜类作物开花时间相关的候选基因。【结果】不同种植条件下、不同类型的白菜类作物在开花时间上存在广泛差异。试验材料在露地环境下的开花时间高峰期明显早于温室环境下的材料；试验材料在露地环境下的开花时间总体表现出偏正态分布，而在温室环境下，开花时间各个阶段呈现出较为均衡的分布。温室与露地环境下的开花时间呈显著正相关。通过生物信息学分析最终得到的高质量SNP位点共103万个。试验材料的群体结构分析表明在系统发育树上各亚群内部分布较为集中，不同亚群之间的分布与材料的地理起源密切相关。全基因组衰减平均LD为2.3 kb，表明在116份白菜类作物构建的群体内存在较为频繁的重组和突变。对不同条件下的开花时间进行全基因组关联分析，用复合模型检测到54个（P＞4）强关联峰值信号点，一般模型检测到87个（P＞5）。通过进一步分析强关联信号点的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）区段，得到存在强连锁关系（r²＞0.33）的峰值信号点共33个（温室环境下27个，露地环境下19个）。其中，在温室与露地环境下的共定位位点13个。根据33个关联候选位点，再通过白菜与同源物种拟南芥的基因共线性关系以及基因功能注释分析筛选出白菜类作物开花时间相关的候选基因14个，其中温室与露地环境下共定位候选基因3个（FUL、PHYB和FPF1）。在露地条件下定位到开花关键基因FT1。【结论】不同条件下开花时间的相关性分析表明，遗传效应在开花早晚中起着决定性作用。全基因组关联分析共鉴定出33个与开花时间相关的显著关联信号。通过连锁不平衡分析、白菜与同源物种拟南芥的基因共线性关系以及基因功能注释分析初步鉴定出14个白菜类作物开花时间相关的候选基因。

丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析

朱海生，刘建汀，陈敏氡，李永平，王彬，张前荣，叶新如，林珲，温庆放

中国农业科学. 2017, 50(17): 3386-3399. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.013

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【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族，并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用，为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据，为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的cDNA序列，采用生物信息学方法分析氨基酸序列，利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定总超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族cDNA序列，依次命名为LcCu/Zn-SOD1（GenBank登录号：KP178922）、LcCu/Zn-SOD2 （GenBank登录号：KX092445）和LcCu/Zn-SOD3（GenBank登录号：KX092446）。LcCu/Zn-SOD1全长758 bp，包含一个456 bp的开放读码框（ORF），编码152个氨基酸；LcCu/Zn-SOD2全长799 bp，ORF为471 bp，编码157个氨基酸；LcCu/Zn-SOD3全长1 011 bp，ORF为663 bp，编码221个氨基酸；编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽，无跨膜结构域，为亲水性稳定蛋白，Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高，在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间，LcCu/Zn-SOD1和LcCu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时（0 d）上调，后期表达量受到抑制；在丝瓜鲜切条件下，3个基因表达量在鲜切后较采后当时（0 h）总体呈下降趋势。相关性分析显示，在采后储藏和鲜切条件下，LcCu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关，LcCu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关，SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关，LcCu/Zn-SOD1和LcCu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用，LcCu/Zn-SOD1和LcCu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性，并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个，其中LcCu/Zn-SOD1和LcCu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。

梨不同品种果实冻藏品质性状分析与适宜品种筛选

王阳，王文辉，贾晓辉，佟伟，王志华，杨晓龙

中国农业科学. 2017, 50(17): 3400-3412. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.014

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【目的】选取梨不同品种果实为研究对象，分析不同品种梨果冻藏后品质指标差异，旨在找出影响冻梨品质的关键指标并筛选出适宜冻藏的梨品种。【方法】分别测定59种梨果实冻藏后的13项品质指标（果皮L*、果肉L*、果肉a*、果肉b*、果肉h值、可溶性固形物（SSC）、可滴定酸（TA）含量、SSC/TA值、出汁率、pH、石细胞含量、乙醇含量、汁液流失率），并进行感官评价。对所测的各项指标进行相关性分析，揭示各指标间的关联程度；运用主成分分析确定影响冻梨品质的关键指标；运用模糊综合评判法中隶属函数值的大小进行排名，筛选适宜冻藏的梨品种。【结果】通过相关性分析得出不同梨品种冻藏后各项指标存在差异，其中果皮L*值与汁液流失率呈显著正相关（P＜0.05），果肉L*值与果肉a*、b*值呈极显著相关（P＜0.01），果肉h值与果肉a*值呈极显著负相关（P＜0.01），SSC、TA、SSC/TA值、出汁率、pH、乙醇含量互相呈显著或极显著相关，石细胞含量与出汁率呈极显著负相关（P＜0.01），在冻梨各项指标中，果肉L*值、TA含量、SSC/TA、石细胞含量、汁液流失率与感官评价呈极显著相关（P＜0.01）。主成分分析结果表明，前4个因子特征值均大于0.9，累积贡献率达74.257%。第1主成分口味因子，包含了原始信息量的37.272%，其大小主要由SSC含量、TA含量、pH决定；第2主成分褐变因子，包含了原始信息的19.687%，其大小主要由果肉a*值、果肉h值决定；第3主成分粗糙度因子，包含了原始信息的10.074%，其大小主要由石细胞含量决定；第4主成分外观因子，其大小主要由果皮L*值决定。13个品质指标中有7个指标对前4个因子贡献率最大，包含了所有指标的信息，因此筛选SSC、TA含量、pH、果肉a*值、果肉h值、石细胞含量、果皮L*值、汁液流失率作为评价冻梨的关键指标。模糊综合评判结果表明，以‘尖把梨’‘砂糖梨’‘软儿梨’‘八里香’‘晚三吉’‘白八里香’‘红南果’‘热梨’等梨品种冻藏最优（剔除了石细胞含量过高的品种黄金对麻）；以‘香黄’‘红麻槎’‘丰水’‘黄花’‘石井早生’‘晚三吉’‘酥木梨’‘早生赤’‘新梨7号’等品种品质较差，其特点是酸度低、糖度低。通过感官评价得出适宜冻藏的梨果应具备高糖高酸、果肉褐变程度低等特点，这与口味因子的特征和优选品种的性状基本一致。【结论】通过对冻梨指标的分析，综合考虑梨果实的价格、市场占有率等因素，以秋子梨系品种更适宜做冻梨（石细胞含量过高、酸度过低的品种除外）。

不同苦瓜品种皂苷含量组成及其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶的抑制活性

刘慧娟，张名位，张瑞芬，张雁，魏振承，马永轩，刘磊，邓媛元

中国农业科学. 2017, 50(17): 3413-3421. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.015

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【目的】比较不同品种苦瓜果肉中皂苷总含量、7种单体组成含量及抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性差异，为明确苦瓜中主要皂苷单体组成含量，筛选高皂苷含量及高活性的苦瓜品种提供科学参考。【方法】采用香草醛-高氯酸法测定13个苦瓜品种皂苷总含量，高效液相法测定7种皂苷单体含量、总抗氧化能力指数（ORAC），并评价其抗氧化活性，采用4-硝基酚-2-D吡喃葡萄糖苷法测定α-葡萄糖苷酶抑制率，同时分析组成含量和活性之间的相关性。【结果】13个不同品种苦瓜果肉皂苷总含量呈显著性差异，含量变幅为（0.52—1.20）g/100g DW，平均值为0.79 g/100g DW，变异系数为21.65%。7种皂苷单体含量的平均值依次为：苦瓜苷A（Momorcharaside A）5.32 μg·g^-1 DW，苦瓜皂苷A（Momordicoside A）25.42 μg·g^-1 DW，Karaviloside XI 3.96 μg·g^-1 DW，苦瓜皂苷F2（Momordicoside F2）66.95 μg·g^-1DW，苦瓜皂苷K（Momordicoside K）183.70 μg·g^-1 DW，(23E)-3β,7β,25-trihydroxycucubita-5,23-dien-19-al 40.13 μg·g^-1 DW，Kuguacin N 3.87 μg·g^-1 DW。不同品种苦瓜总皂苷ORAC指数变幅为2 747.76—15 584.07 μmol Trolox·g^-1，平均值为8 879.48 μmol Trolox·g^-1，变异系数为34.91%；α-葡萄糖苷酶IC₅₀值变幅为1.55—4.96 mg·mL^-1。【结论】不同品种苦瓜果肉皂苷总含量、单体组成含量、抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制率有显著差异。皂苷是苦瓜抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质基础，但并非苦瓜抗氧化活性主要贡献物质。(23E)-3β,7β,25-trihydroxycucubita-5,23-dien-19-al是主要活性单体。

基因工程技术在黄曲霉毒素生物降解中的应用

计成，贾如，赵丽红

中国农业科学. 2017, 50(17): 3422-3428. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.016

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黄曲霉毒素具有强致癌性、致突变性和致畸性，影响动物生产性能，降低饲料转化效率，减少产肉量、产蛋量和产奶量，增加动物发病率和死亡率，给畜牧业造成巨大的经济损失。另外，黄曲霉毒素通过肉、蛋、奶食物链传递给人类，严重威胁人类健康。因此，黄曲霉毒素的防控已经成为全球性高度关注的问题。目前，饲料中黄曲霉毒素的脱毒方法主要采用物理吸附，如蒙脱石、活性炭、酵母细胞壁等，但物理吸附仅是吸附了黄曲霉毒素，并不能减少毒素的量，最终饲料中被吸附的毒素在体内解吸附后排出体外，可造成环境的二次污染。另外吸附剂效果不稳定，可能会吸附饲料中的维生素等营养物质，造成饲料品质下降。其中，生物降解法具有解毒彻底、专一性强，不影响饲料的营养价值且能够避免毒素的重新产生等优点，从而备受研究者的关注。目前，有越来越多的研究报道了真菌、细菌及其代谢产生的酶能够降解黄曲霉毒素，而鲜有关于降解黄曲霉毒素重组酶的报道。基因工程技术在黄曲霉毒素生物降解中的运用，可采用现代分子生物学的方法，从复合解毒酶中分离纯化出特定的蛋白。但因微生物降解酶分离纯化过程复杂、酶活不稳定、酶作用条件苛刻，较难用于实际生产。因此，人们利用基因工程手段将活性高的解毒酶基因进行基因克隆，实现降解酶基因在原核或真核工程菌种的异源高效表达，为酶制剂在降解霉菌毒素的实际生产中作用研究奠定了理论基础。文章就基因工程技术在黄曲霉毒素降解中的运用研究进展及未来发展方向进行综述，为饲料和食品中霉菌毒素生物降解酶的运用提供理论基础和实践依据。

褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响

赵益文，赵佳，庞全海

中国农业科学. 2017, 50(17): 3429-3438. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.17.017

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【目的】研究褪黑素对大鼠胰岛瘤细胞INS-1中胰岛素和Gαi/o蛋白基因表达的影响，探究褪黑素在mRNA水平对Gαi/o和Insulin1调节作用中可能存在的分子机制。褪黑素(melatonin, MT)是松果腺分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，在机体内可调节胰岛素的分泌而使其呈现昼夜节律性分泌，影响葡萄糖昼夜代谢水平的变化进而维持机体血糖的相对恒定，故对于褪黑素影响胰岛素表达的研究可能会对褪黑素在胰岛素昼夜节律性分泌中的调控作用提供依据。【方法】将冻存的INS-1细胞复苏培养至第三代，INS-1细胞传代后,用RPMI1640培养基培养INS-1细胞约24—48 h，当细胞密度达60%—70%时，使用无血清无葡萄糖的RPMI1640洗2次，然后在INS-1细胞培养外液中分别加入不同浓度（0、10、20、30、50 mmol·L^-1）的葡萄糖及100 nmol·L^-1 褪黑素和不同浓度葡萄糖孵育INS-1细胞12 h，观察和统计INS-1细胞的形态学变化。利用EasyPure^® RNA Kit 提取INS-1细胞的总RNA，核酸蛋白测定仪测定细胞总RNA的浓度和纯度，其次利用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测细胞的总RNA质量，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录合成cDNA。利用Primer Premier 5.0引物设计软件，参考GenBank上已登录的基因序列进行Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCα引物的设计。应用qRT-PCR法进行检测处理后的INS-1细胞Insulin1、Gαi1、Gαi2、Gαo、PKA和PKCα mRNA水平的变化。【结果】用含不同浓度葡萄糖培养液孵育INS-1细胞后，观察发现随着培养基中葡萄糖浓度含量的增加INS-1细胞突触的增长呈现先增加后减少的趋势，其中20 mmol·L^-1葡萄糖处理组INS-1细胞突触的增长明显，而20 mmol·L^-1葡萄糖和100 nmol·L^-1褪黑素处理组INS-1细胞表面积增大，但突触增长却不明显；培养基中含不同浓度葡萄糖的处理组中，Insulin1 mRNA水平呈现先升后降的趋势，Gαi1 mRNA水平则呈现先降后升的趋势，其中20 mmol·L^-1葡萄糖处理组，Insulin1 mRNA水平显著增加（P＜0.05），Gαi1 mRNA水平显著减少（P＜0.05），而Gαi2和Gαo则无显著变化（P＞0.05），因而Gαi1表现出与Insulin1 mRNA水平呈现负相关性而非Gαi2、Gαo与Insulin1 mRNA水平呈现负相关性；20 mmol·L^-1葡萄糖和褪黑素处理组和20 mmol·L^-1葡萄糖处理组相比，20 mmol·L^-1葡萄糖和褪黑素处理组的Gαi1 mRNA水平显著增高（P＜0.05），且Insulin1和PKCα mRNA水平显著减少（P＜0.05），PKA mRNA水平则减少不显著（P＞0.05）。【结论】褪黑素能够抑制INS-1细胞Insulin1的表达，减少胰岛素的分泌导致INS-1细胞适应性增生。褪黑素与其受体结合后可促进Gαi1 mRNA水平增高而抑制PKCα的表达，使得Insulin1的表达受到抑制，胰岛素分泌减少，使血糖在夜间得以维持相对恒定。

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