中国农业科学

中国农业科学. 2020, 53(5): 0.

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脱落酸代谢与信号传递及其调控种子休眠与萌发的分子机制

宋松泉,刘军,徐恒恒,刘旭,黄荟

中国农业科学. 2020, 53(5): 857-873. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.001

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种子休眠是许多植物在长期系统发育进程中获得的一种适应环境变化的特性,是调控种子萌发和幼苗形成的最适时空分布的一种有效方式,也是物种成功繁衍与传播的一种选择性策略。种子休眠与萌发的激素调控可能是一种高度保守的机制,其中脱落酸（ABA）在种子休眠解除与萌发中起关键作用,赤霉素（GA）在休眠被解除后促进种子萌发。ABA在种子休眠与萌发中的作用主要受ABA代谢（生物合成和分解代谢）和信号传递途径的调控。为此,本文在综述ABA代谢和信号传递研究进展的基础上,阐述了ABA在种子发育、休眠与萌发中的作用,以及种子休眠特异性基因DOG1（萌发延迟1）与ABA信号组分的关系。研究表明,C40环氧类胡萝卜素是ABA生物合成的前体,玉米黄质环氧化酶和9-顺式-环氧类胡萝卜素二加氧酶是ABA生物合成的主要调节酶;ABA的分解代谢包括羟基化作用和与葡萄糖结合,CYP707A家族催化ABA C-8'位置上的羟基化作用,这是ABA分解代谢的重要步骤。在核心ABA信号传递途径中,ABA与PYR/PYL/RCAR受体结合并触发受体发生构象变化,从而允许受体-ABA复合物与2C类蛋白磷酸酶（PP2C）结合并抑制其活性,导致激酶如蔗糖非发酵-1相关的蛋白激酶2（SnRK2）的去抑制和活化。然后,这些激酶磷酸化和活化转录因子（transcription factors,TF）,TF与靶启动子结合和诱导下游的ABA反应基因表达。ABA在种子成熟中后期积累,合子组织中合成的ABA诱导初生休眠和促进种子成熟;在发育中积累和在干种子中存留的ABA含量在种子吸胀初期下降。ABA是种子休眠诱导和维持的正调控因子,是萌发的负调控因子。DOG1在种子成熟过程中表达和发挥作用,其表达受可变剪接和可变多腺苷酸化调控。反义DOG1是种子休眠的一种抑制因子,通过干扰转录和转录延伸负调控DOG1的表达和种子休眠。种子的休眠与萌发除了被核心ABA信号途径调控外,也被DOG1-AHG1（ABA过敏感萌发1）/AHG3途径调控。DOG1能与AHG1/AHG3结合,通过结合ABA信号传递的负调控因子和增加对ABA的敏感性而引起种子休眠。最后,提出了该领域需要进一步研究的科学问题,包括ABA代谢中ABA 8'-羟化酶、ABA葡糖基转移酶和β-葡糖苷酶及其基因怎样响应发育和环境的变化以维持正常的ABA水平。ABA的重要调控因子例如Ca ²⁺或者活性氧对核心ABA信号传递途径的影响,核心ABA信号传递途径与DOG1-AHG1/AHG3途径的下游重叠组分PP2C在整合生理条件或者环境信号时优先响应哪一条途径、这两条途径怎样被协调、以及PP2C有哪些新的靶组分。本文将为深入研究ABA调控种子休眠与萌发的分子机理提供参考。

玉米pTAC2影响苗期叶片叶绿素合成的转录组分析

张稳,孟淑君,王琪月,万炯,马拴红,林源,丁冬,汤继华

中国农业科学. 2020, 53(5): 874-889. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.002

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【目的】叶绿素是参与光合途径最为重要的光合色素。叶绿体的发育及叶绿素的合成在很大程度上依赖于质体基因组与核基因组之间的双向信号传导来精确协调基因表达。通过对白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因阳性纯合突变材料进行RNA-seq研究,筛选和鉴定参与叶绿素合成的相关基因,为明确叶绿素的合成途径奠定基础。【方法】以CRISPR/Cas9-ZmpTAC2玉米转基因编辑纯合突变株系为研究材料,使用透射电镜观察叶绿体超微结构和分光光度法测定叶片叶绿素含量,确定叶绿体发育状态及叶绿素合成情况。对转基因阴性材料（CK）和CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因纯合编辑材料（zmptac2）苗期叶片取样进行转录组测序。通过生物信息学分析,寻找CK与zmptac2间差异表达的基因;qRT-PCR对差异表达基因进行验证。通过酵母双杂交筛选与玉米pTAC2互作的蛋白质。【结果】共获得15株T₀转基因植株,包括绿色植株（7株）和白色植株（8株）。绿色幼苗中3株为转基因阴性材料,4株为转基因阳性（2株为未编辑,2株为杂合编辑突变）,白色植株(8株)均为转基因阳性纯合编辑。与CK相比,突变体（zmptac2）叶绿体发异常,叶绿素含量显著降低。RNA-seq的结果显示,CK与zmptac2之间共检测到1 367个基因差异表达,其中618个基因上调表达（zmptac2/CK）,749个基因下调表达（zmptac2/CK）。GO富集分析显示,下调基因显著富集到叶绿体和质体中。KEGG分析表明下调表达基因显著富集在苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和异喹啉生物碱生物合成等途径。选取的15个差异基因表达模式均与测序数据相一致,表明测序结果是可靠的。与CK相比,zmptac2中依赖PEP（plastid-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量显著降低,而依赖NEP（nuclear gene-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量则显著上升。通过对玉米cDNA文库筛选和互作验证,鉴定出ZmpTAC3与ZmpTAC2存在互作。【结论】ZmpTAC2突变会导致叶绿体早期生物合成受阻,该基因参与叶绿体发育及叶绿素合成,且该种作用是由ZmpTAC2调控PEP相关基因表达而实现的。

长江下游稻区不同类型双季晚粳稻产量与生育特性差异

殷敏,刘少文,褚光,徐春梅,王丹英,章秀福,陈松

中国农业科学. 2020, 53(5): 890-903. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.003

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【目的】明确不同类型粳稻在长江下游作双季晚稻种植的产量和生育特性,为筛选适宜长江下游双季晚粳品种提供理论依据。【方法】2017—2018年在浙江省杭州市中国水稻研究所实验农场,以高产晚籼稻品种（IR）为对照,并选择大面积应用的常规粳稻（IJR）、杂交粳稻（HJR）和籼粳杂交稻（IJHR）品种,研究比较晚季温光条件下常规粳稻、杂交粳稻、籼粳杂交稻和晚籼稻在产量、生育期以及温光资源配置上的差异。【结果】（1）籼粳杂交稻产量（8.3—10.0 t·hm ^-2）显著高于其他晚稻类型,分别增产2.9%—29.3%（晚籼稻）,30.9%—35.3%（常规粳稻）和13.4%—14.0%（杂交粳稻）;常规粳稻产量最低,较晚籼稻分别减产24.0%（2017年）和1.2%（2018年）;而杂交粳稻与晚籼稻产量差异随年份不同而不同。与晚籼稻相比,籼粳杂交稻有效穗少、穗型大、库容高、千粒重和结实率相似;而常规/杂交粳稻则表现为有效穗近似,千粒重大,穗型小。全生育期总体上表现为籼粳杂交稻>杂交粳稻>常规粳稻>籼稻。与籼稻相比,粳型（籼粳杂、常规和杂交粳稻）水稻营养生长期变化较小;穗发育期略有缩短（1—6 d）,而灌浆期显著延长（12—22 d）;全生育期温光资源积累量显著提高,其中主要贡献来自灌浆期的延长。（2）利用主成分分析（PCA）,将供试双季晚稻产量构成与生育特性降维为主成分一（穗粒型因子,37.7%）和主成分二（生育期因子,24.7%）。结果表明籼粳杂交稻为少穗多粒、长灌浆期;晚籼稻为穗粒兼顾、短灌浆期;常规和杂交粳稻的品种特征无显著差异,均为多穗少粒、长灌浆期。（3）相关分析表明,双季晚粳稻产量与每穗粒数（R ²=0.607,P<0.001）、库容（R ²=0.779,P<0.001）和灌浆期（R ²=0.505,P<0.001）呈极显著正相关关系。此外,与双季晚籼稻相比,双季晚粳稻产量对环境变化较敏感,品种间、年度间变异系数较大,这就需要品种的属地化和因种栽培。【结论】双季晚稻“籼改粳”最主要的优势在于延长灌浆期,从而提高全生育期温光资源积累量。与其他类型水稻相比,籼粳杂交稻产量高,表现为大穗型、高库容及长灌浆期,更适宜于长江下游双季晚稻种植。选用籼粳杂交稻,对于提高双季晚稻产量和温光资源利用率、保证双季稻生产安全性具有十分重要的意义。

旱地春小麦产量对不同生育阶段温度变化的响应模拟

王钧,李广,闫丽娟,刘强,聂志刚

中国农业科学. 2020, 53(5): 904-916. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.004

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【目的】定量分析陇中黄土丘陵沟壑区旱地春小麦不同生育阶段温度变化对小麦产量的影响,为陇中黄土丘陵沟壑区制定合理种植模式提供理论指导和决策依据。【方法】基于灰色关联度分析不同生育阶段温度与旱地春小麦产量间的关联性,确定影响旱地春小麦产量的关键生育阶段。应用APSIM（Agricultural Production System Simulator）模型模拟不同生育阶段温度变化条件下春小麦的产量,通过二次多项回归分析、单因素边际效应分析方法研究旱地春小麦产量对不同生育阶段温度变化的响应机制。【结果】（1）APSIM模型对模拟陇中黄土丘陵沟壑区不同播种期旱地春小麦的产量和生育期具有较高的适用性,模拟产量和生育期的均方根误差（RMSE）平均值分别为39.95 kg?hm ^-1和2.78 d,归一化均方根误差（NRMSE）平均值分别为1.55%和1.87%,模型有效性指数（M_E）平均值分别为0.73和0.83;（2）陇中黄土丘陵沟壑区旱地春小麦全生育期平均温度总体呈上升趋势,但不同生育阶段的温度增幅各不相同,播种—出苗、出苗—分蘖、分蘖—拔节、拔节—孕穗、孕穗—开花、开花—灌浆和灌浆—成熟阶段的平均气温倾向率分别为0.44℃?（10a） ^-1、0.34℃?（10a） ^-1、0.17℃?（10a） ^-1、0.41℃?（10a） ^-1、0.49℃?（10a） ^-1、0.52℃?（10a） ^-1和0.35℃?（10a） ^-1;（3）不同生育阶段温度变化对旱地春小麦产量的影响大小依次为灌浆—成熟、开花—灌浆、播种—出苗、孕穗—开花、拔节—孕穗、出苗—分蘖、休闲和分蘖—拔节阶段;（4）在其他生育阶段温度不变的条件下,播种—出苗阶段温度每提高0.5℃,春小麦产量平均增加0.45%;孕穗—开花阶段温度每提高0.5℃,春小麦产量平均减少0.34%。开花—灌浆阶段温度每提高0.5℃,春小麦产量平均减少0.65%;灌浆—成熟阶段温度每增加0.5℃,春小麦产量平均减少1.09%。【结论】APSIM模型对陇中黄土丘陵沟壑区不同播种期旱地春小麦的产量和主要生育期有较好的模拟效果。研究区旱地春小麦全生育期平均温度总体呈上升趋势,但不同生育阶段温度增幅不同。不同生育阶段温度变化对春小麦生长和发育影响不同。播种—出苗阶段增温倾向于增产,其他阶段增温倾向于减产。

不同品种谷子愈伤组织对拿捕净胁迫的生理响应

赵娟,尹艺臻,王晓璐,马春英,尹美强,温银元,宋喜娥,董淑琦,杨雪芳,原向阳

中国农业科学. 2020, 53(5): 917-928. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.005

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【目的】研究除草剂拿捕净胁迫对不同抗性谷子品种愈伤组织生理特性的影响,分析不同品种谷子对拿扑净胁迫的生理响应差异,从细胞水平探讨谷子抗除草剂的生理机理,为深入了解谷子除草剂抗性机制和品种改良提供理论参考。【方法】采用植物组织培养法,以敏感品种晋谷21和抗拿捕净品种豫谷35、冀谷42愈伤组织为试验材料,以不同浓度拿捕净附加入培养基中进行胁迫处理后,分别测定3种谷子愈伤组织丙二醛（malondialdehyde,MDA）、膜透性（membrane permeability,MP）、超氧阴离子（superoxide anion,O₂ ^-）、脯氨酸（proline,Pro）、可溶性蛋白（soluble protein,SP）、可溶性糖（soluble sugar,SS）含量,超氧化歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）活性,分析比较拿捕净胁迫下3个谷子品种间生理响应机理的差异。【结果】提高拿捕净胁迫浓度对3个品种谷子愈伤组织的生长影响不同,且对晋谷21的影响要明显大于豫谷35和冀谷42。不同浓度拿捕净胁迫对3个品种谷子愈伤组织各项生理生化指标均有显著影响,但影响趋势和程度也不同。随拿捕净处理浓度提高,尤其在较高浓度时,豫谷35和冀谷42愈伤组织MDA含量、细胞膜相对透性和O₂ ^-含量显著低于晋谷21号,而SOD、POD活性则显著高于晋谷21。SP、SS、Pro含量则在不断变化。相关分析结果显示,不同品种拿捕净抗性与膜脂过氧化伤害物质（MDA和O₂ ^-）含量呈负相关,与部分渗透调节物质和保护酶活性呈正相关。【结论】在拿捕净胁迫下,3个品种谷子愈伤组织所测定的相关生理生化指标变化趋势不尽相同,响应差异较大。细胞保护酶系及渗透调节物质参与了除草剂抗性的调节,且其变化趋势在2个抗性品种之间也不完全相同,因此,谷子除草剂抗性是多方面综合防御的结果。

白菜型冬油菜萌动种子低温春化的生理生化特征

徐春梅,邹娅,刘自刚,米文博,徐明霞,董小云,曹小东,郑国强,方新玲

中国农业科学. 2020, 53(5): 929-941. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.006

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【目的】探讨白菜型冬油菜萌动种子低温春化的可能性,以及萌动种子春化过程其生理生化状态和植株结实性等表型变化特征,为白菜型冬油菜人工加代繁育和加速育种进程提供理论基础。【方法】以3个不同感温性的白菜型冬油菜品种为材料,于4℃对油菜萌动种子进行春化处理,春化处理过程中（0、20、30、40、50和60 d）测定萌动种子的硝酸还原酶、抗氧化物酶活性、渗透调节物、丙二醛含量等生理生化指标;同时播种各春化处理萌动种子,观察记录种子形成植株的生育期进程、测定植株结实性能等。【结果】随着春化处理时间的增加,白菜型冬油菜萌发种子形成的植株春化率、初花期株高、成熟期株高、一次分枝数、单株角果数、角果长、角粒数、单株产量等总体呈逐渐升高趋势;春化处理前期（0—40 d）,植株结实性能在不同品种间表现较明显差异,春化时间增加后（50—60 d）,不同品种结实能力虽略有差异,但均无显著差异水平。回归分析结果显示,在4℃条件下,强冬性冬油菜陇油7号萌动种子完全春化（春化率>95%）需处理76.9 d,陇油9号和天油4号分别为54.0和39.4 d。相关分析结果表明,春化率与株高、结实性能等各表型性状均呈极显著正相关,其中与初花期株高、成熟期株高相关系数最大为0.947和0.985,表明白菜型冬油菜春化程度显著影响着植株株高、结实性能等。随低温春化时间增加,白菜型冬油菜萌动种子硝酸还原酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖呈先升高后降低的趋势,过氧化氢酶活性呈不断降低趋势。与对照（未低温处理的萌动种子）相比,低温春化处理的陇油7号、陇油9号萌动种子GA₃含量均明显降低,春化30 d的天油4号萌动种子GA₃含量明显比对照增加。与对照相比,春化处理的冬油菜萌动种子IAA含量均明显增加（陇油9号春化40 d处理除外）,其中,春化50 d的天油4号萌动种子IAA含量比对照增加197.0%。陇油7号春化处理的萌动种子ABA含量比对照明显增加。【结论】白菜型冬油菜萌动种子可以感受低温使其完成春化作用,品种春化所需低温时间取决于品种冬性强弱;低温春化过程中,白菜型冬油菜萌动种子生理生化状态发生了一些变化,并最终影响植株的生长发育及其结实性能。

花铃期棉花黄萎病抗病与感病品种对土壤细菌群落结构的影响

赵卫松,郭庆港,李社增,王培培,鹿秀云,苏振贺,张晓云,马平

中国农业科学. 2020, 53(5): 942-954. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.007

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【目的】研究花铃期棉花黄萎病抗/感品种土壤细菌群落结构,了解抗/感品种土壤细菌群落结构与土壤理化性质之间的关系,为棉花黄萎病的监测与绿色生态防控打下理论基础。【方法】通过田间小区试验,以感病品种（鄂荆1号,EJ）和抗病品种（冀863,J863）为试验材料,采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）和高通量测序（Illumina MiSeq）技术分别测定花铃期不同阶段（盛花期、开花后期和结铃期）土壤中大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）数量和土壤细菌群落结构,结合冗余分析（RDA）明确细菌群落结构与土壤理化性质的相关性。【结果】棉花黄萎病的发生与土壤中大丽轮枝菌ITS基因拷贝数量存在不同程度的相关性,其中感病品种EJ的发病率和病情指数与土壤中病原菌数量呈正相关,而抗病品种J863的发病率和病情指数与病原菌数量相关性不大。除盛花期外,棉花开花后期和结铃期抗病品种J863土壤中的病原菌数量低于感病品种EJ。高通量测序分析表明,除开花后期,抗病品种J863在盛花期和结铃期的细菌丰富度Chao1和ACE指数均高于感病品种EJ。主成分分析表明,抗/感品种之间及其在花铃期不同阶段的土壤细菌群落结构存在差异。群落组成方面,在门水平上,感病品种EJ的部分优势菌群平均相对丰度低于抗病品种J863,如放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、硝化螺菌门（Nitrospirae）、Patescibacteria和装甲菌门（Armatimonadetes）,降低幅度分别为16.38%、4.05%、2.25%、6.58%、7.10%、20.60%和35.78%;在属水平上,感病品种EJ的部分优势菌群平均相对丰度低于抗病品种J863,包括鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌属（Blastococcus）、红色杆菌属（Rubrobacter）、类诺卡氏属（Nocardioides）、Pontibacter、链霉菌属（Streptomyces）、Gemmatirosa、微单孢菌属（Micromonospora）和Solirubrobacter,下降幅度分别为5.09%、19.41%、13.79%、2.36%、10.78%、34.47%、46.76%、61.84%、52.75%、48.61%、74.79%、9.13%和26.42%。冗余分析（RDA）表明,土壤细菌群落结构受硝态氮（NO₃ ^--N）、速效磷（AP）、铵态氮（NH₄ ⁺-N）、无机磷（IP）、pH和有机质（OM）指标影响。【结论】土壤中大丽轮枝菌的数量与棉花抗/感品种黄萎病发生的相关性存在差异,感病品种黄萎病的发生程度与土壤中病原菌数量呈正相关。抗病品种在盛花期、开花后期和结铃期土壤的细菌群落结构优于感病品种,并且不同生育时期的优势菌群存在一定程度的差异。土壤中细菌多样性、相对丰度和组成受有机质、pH、氮素类型、速效磷等指标影响。同时,棉花不同生育时期对土壤中细菌群落结构有明显影响。

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征及致病性分析

李正刚,农媛,汤亚飞,佘小漫,于琳,蓝国兵,邓铭光,何自福

中国农业科学. 2020, 53(5): 955-964. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.008

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【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。

中德农业源污染管控制度比较研究

张维理,张认连,冀宏杰,KOLBE H,陈印军

中国农业科学. 2020, 53(5): 965-976. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.009

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已有许多研究证实防治农业生产过程中氮磷进入水域以及氮素进入大气环境已成为现代农业面临的最大挑战之一。为分析中国在农业源污染防控中存在问题,本文对中国和德国近年来颁布的相关法律、法规、技术标准和实施效果进行了综述和比较分析。研究显示,与中国相似,德国人均耕地资源比较少,以家庭农场为单元的经营方式是德国农业的主要生产方式。农业存在经营规模相对小而分散,受气象条件和市场影响风险大、利润薄、需要财政补贴才能生存等问题。对于农业源污染治理,既要实现环境目标,也要顾及农民利益、农业发展和粮食安全,难以简单采用关、停、并、转等行政指令和惩罚性措施,主要是建立和实施农业源污染管控制度。为提高农民施肥技术水平,减少农田化肥养分投入量,德国最有效的做法是在长期试验研究基础上,为农民专门设计和制作了一套比较完整的分区、分类、量化施肥技术指标和规程,这些指标简单、易记、易懂,对不同地区土壤和气候条件有良好适用性,易于推广和普及,对于提高农民施肥技术水平,实现减肥增产、减肥高产发挥了重要作用。在防治农业源氮磷进入水环境,化合态氮进入大气环境方面,德国主要做法是研究、建立和实施一系列与经济奖惩措施关联的限定性技术标准,对农田氮素养分投入量、农田氮磷盈余量、施肥期、施肥方法、种植作物类型等给出了明确的规定和技术指标。同时不断探索新的、更有效的监管和监测方法,充分发挥经济杠杆作用,鼓励、帮助和疏导农民广泛采用更先进、更精准和环境友好的替代技术。农业源污染管控制度的实施使得自20世纪80年代以来,德国农田化肥养分投入量减少了一半,以农田面积（耕地面积与长期作物面积之和）计化肥养分量从404 kg·hm ^-2减少到目前的192 kg·hm ^-2,仅为目前中国的53%,同期粮食单产仍提高了56%,从4 779 kg·hm ^-2增加到目前的7 464 kg·hm ^-2,比中国目前粮食单产仍然高37%。中国至今缺少为农民专门设计、适合农民认知和直接采用的量化施肥技术指标。目前也无与国家及地方政府奖惩政策关联的限定性技术标准出台,无论在全国范围,还是在重点流域,至今难以形成有制度性保障的农业源污染管控体系。在占作物总播面23.6%的蔬菜、水果、花卉等高收益作物农田上,农民盲目施肥、过量施肥情形普遍,在这类农田上,氮磷养分盈余量远超过德国肥料法规所规定的环境安全限量（50 kg N·hm ^-2、10 kg P₂O₅·hm ^-2）。比较研究还显示,实施农业源污染管控制度的核心是以创新研究带动法律、法规、相关技术标准和监管方法的出台和广泛实施。而中国近年来公益性土壤肥料专业科研机构的均质化、碎片化,以及科研机构在绩效考核中对SCI论文点数、发文量等量化指标的过分倚重,使得相关研究薄弱,亟需加以改进。

秸秆还田深度对土壤温室气体排放及玉米产量的影响

朱晓晴,安晶,马玲,陈松岭,李嘉琦,邹洪涛,张玉龙

中国农业科学. 2020, 53(5): 977-989. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.010

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【目的】秸秆还田是培肥地力、增加土壤有机质和改善土壤结构的重要技术手段,但以往的研究表明秸秆还田会加速土壤温室气体的排放。本研究通过对秸秆不同还田深度下农田土壤温室气体排放特征和产量的研究,明确降低温室气体排放量的最佳还田深度,以期为合理利用秸秆、提高作物产量,实现农业可持续发展提供科学依据。【方法】采用大田微区试验,以玉米为供试作物,设置4个还田深度,采用静态箱-气相色谱法测定整个玉米生长季不同还田深度下温室气体（CO₂、CH₄、N₂O）的排放特征,产量及产量构成因素。试验共设5个处理,还田深度分别为0—10 cm（T1）、10—20 cm（T2）、20—30 cm（T3）和30—40 cm（T4）,同时以不还田处理作为对照（CK）。【结果】（1）在整个玉米生长季CO₂和N₂O均表现为排放,CH₄表现为吸收。CO₂累积排放量为T3处理最高,较CK显著增加了28.6%,T4处理增加最少,较CK显著增加了17.1%（P<0.05）,但T1与T4处理之间差异不显著;而N₂O的累积排放量T2处理为最高,与CK相比,累积排放量显著增加111.3%,T4处理增加最少,与CK相比显著增加了12.8%（P<0.05）;CH₄则表现为吸收,且秸秆还田后降低了农田土壤对CH₄的吸收能力,吸收量表现为CK处理>T4处理>T3处理>T1处理>T2处理,且各还田处理与CK之间差异显著（P<0.05）。（2）秸秆不同还田深度下,与对照相比,各处理玉米产量均显著增加,增产在5.6%—20.8%（P<0.05）,但各处理之间的穗长、穗粗和行粒数差异不显著。当秸秆还至30—40 cm时,产量最高,较CK增加了20.8%,表明秸秆还田对提升土壤肥力及作物增产有重要作用。（3）从温室气体综合增温潜势（GWP）和温室气体排放强度（GHGI）来看,在100年尺度上,GWP表现为T2处理>T3处理>T1处理>T4处理>CK处理,而GHGI表现为T2处理>T3处理>T1处理>CK处理>T4处理,表明与CK相比,各处理均增加了玉米季温室气体的综合增温潜势,而T4处理则降低了玉米季温室气体排放强度,说明秸秆深还至30—40 cm可在一定程度上缓解全球增温潜势。【结论】秸秆还田会显著增加CO₂和N₂O排放,降低对CH₄的吸收能力;秸秆深还至30—40 cm可相对降低综合增温潜势,降低温室气体排放强度,同时显著增加玉米产量。因此,为实现较高的玉米产量和较低的温室气体排放强度,秸秆深还至30—40 cm是较为合理的土壤改良培肥方式。

滴灌下氮盐交互对加工番茄荧光特性及产量品质的影响

张继峯,王振华,张金珠,窦允清,侯裕生

中国农业科学. 2020, 53(5): 990-1003. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.011

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【目的】新疆有着全中国最大面积的盐碱地和加工番茄的种植基地。在新疆开展两年试验以研究加工番茄在氮盐交互下生长、生理、产量和品质的变化规律,获得适宜新疆盐碱地种植加工番茄的合理施氮量和土壤盐分范围,为新疆扩大加工番茄种植面积和合理施氮提供科学的理论依据及技术途径。【方法】试验于2017和2018年在石河子大学现代节水灌溉兵团重点实验基地进行,以当地主栽品种3166为试验材料,2017年试验共设置4个土壤含盐量水平：1.5、4.0、7.0和10.0 g·kg ^-1及4个氮素水平：201、166、131和96 kg·hm ^-2,2018年在2017年的基础上去除10.0 g·kg ^-1的土壤含盐量,增加5.0 g·kg ^-1的土壤含盐量和不施氮量处理。试验测定和分析加工番茄的荧光叶绿素参数、产量和品质指标。【结果】在氮盐交互下,加工番茄荧光参数及产量等指标均呈现出复杂的变化规律。绝大多数的荧光参数及产量受土壤盐分的主导作用较氮素强,在同等氮素水平下,7.0 g·kg ^-1和10.0 g·kg ^-1的土壤盐分对加工番茄荧光指标抑制程度最大;低盐分水平下,166 kg·hm ^-2的中等偏高的施氮量对加工番茄的荧光指标促进作用最大,其次是施氮201 kg·hm ^-2的处理;在中等偏高的盐分水平下,96 kg·hm ^-2的低氮对加工番茄的最好,其次为不施氮水平。加工番茄的鲜果产量总体上符合“盐高产低”的规律,但低氮高盐处理的产量明显高于其他同盐度的氮素水平下的产量。可溶性固形物、VC、可溶性糖和可滴定酸均随着土壤含盐量的增大逐渐增大,糖酸比的最大值均出现在低盐处理,盐分对加工番茄品质的影响远高于氮素,二者交互对加工番茄的品质并无显著性影响。通过图形叠加分析方法,得出了加工番茄获得相对最优产量和品质的合理施氮范围和土壤含盐量区间。【结论】在盐碱程度偏高的土壤可通过少施氮素来提高加工番茄产量;加工番茄获得相对最优产量和品质的合理施氮范围和土壤含盐量区间为N：98.12—119.60 kg·hm ^-2,S：3.57—5.58 g·kg ^-1。

辣椒HD-Zip基因家族鉴定、系统进化及表达分析

邵晨冰,黄志楠,白雪滢,王云鹏,段伟科

中国农业科学. 2020, 53(5): 1004-1017. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.012

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【目的】鉴定辣椒HD-Zip基因家族,并利用生物信息学方法系统分析其在基因组中的分布、基因结构、进化分化特征及在不同组织中的时空表达特异性,解析该家族的进化特征及生物学功能。【方法】根据已报道及PlantTFDB数据库中的拟南芥HD-Zip序列,利用本地BLAST工具在我国辣椒测序品种‘遵辣1号’基因组中比对,并利用Pfam、SMART工具进一步验证。采用EMBOSS Programs、MEGA、GSDS、MEME、MCScanX、OrthoMCL、Circos等软件预测辣椒HD-Zip基因家族成员蛋白理化性质,构建系统进化树,定位染色体,分析基因结构、基因复制类型及直系、旁系同源基因。基于GEO数据库,运用R软件、本地perl语言及Cytoscape分析辣椒HD-Zip组织表达差异并绘制共表达网络。【结果】本研究在‘遵辣1号’基因组中鉴定获得42条辣椒HD-Zip,命名为CaHDZ01—CaHDZ42。CaHDZs长度跨度较大,70% CaHDZ蛋白的pI小于7.0。除CaHDZ42,其余基因不均匀地分布在12条染色体上,部分基因为片段复制。该基因家族可分为4个亚族,分别含有18、9、5、10个HD-Zip,基因结构及蛋白结构域差别显著。辣椒、番茄和拟南芥3个物种中的直系同源基因对数目大体相同,但同为茄科的辣椒和番茄之间的稍多;辣椒中的旁系同源基因少于番茄和拟南芥,说明辣椒基因组的倍增事件并没有使CaHDZs明显扩增。对无油樟、水稻、玉米、番茄、马铃薯、辣椒‘CM334’、辣椒‘Zunla-1’、毛果杨、葡萄以及拟南芥9个代表物种的HD-Zip进化特征分析结果表明,从被子植物开始,HD-Zip基因家族就稳定存在4个亚族。推测在形成4个亚族前,HD-Zip分为两组,其中一组分化成I和II亚族,而另一组则分化成为III和IV亚族。CaHDZs在根、茎、叶、花芽、花和果实不同发育时期的表达模式分析结果显示,4个亚族具有不同程度的表达趋势。其中I亚族基因在辣椒不同组织中的表达量均较高,且不同成员间表达模式不同,CaHDZ22在茎中的表达最高,表明该基因可能对辣椒茎的生长有重要作用。II、III和IV亚族基因在不同组织中的表达量相对较低,但部分基因在特定组织中具有较大的表达量。如CaHDZ34在辣椒果实成熟后期具有较大高的表达量,CaHDZ02和CaHDZ28在果实膨大时表达较高,CaHDZ04在果实成熟前期具有较高的表达量。CaHDZs表达网络中有33对基因表达趋势的相关系数（PCC）大于0.8,6对大于0.9,表明CaHDZs协同调控了辣椒的生长发育,不同亚族之间也具有协同性。【结论】在‘遵辣1号’基因组中鉴定获得42条CaHDZs,可分为4个亚族,不同亚族的基因结构、蛋白保守结构域及表达模式不同。在进化过程中,辣椒HD-Zip保守性高,数目没有明显扩增,I和II亚族、III和IV亚族关系更近。CaHDZs具有组织表达差异性,协同调控了辣椒的生长发育。

小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌群落结构的影响

田晴,高丹美,李慧,刘守伟,周新刚,吴凤芝

中国农业科学. 2020, 53(5): 1018-1028. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.013

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【目的】研究小麦根系分泌物对西瓜连作土壤中特异性菌群、真菌群落结构和多样性的影响,明确根系分泌物对改善连作土壤微生物环境的作用,为西瓜枯萎病的生态防治和菜田土壤的健康保持提供参考。【方法】本试验以连作3年的西瓜土壤为研究对象,利用土培盆栽试验研究小麦根系分泌物对西瓜连作土壤中真菌群落结构和多样性的影响。【结果】荧光定量结果表明外源添加小麦根系分泌物降低了土壤中总真菌、尖孢镰刀菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群丰度,增加了木霉菌的菌群丰度,且有西瓜苗并添加小麦根系分泌物处理的木霉菌丰度最高,尖孢镰刀菌的丰度最低。无西瓜苗并添加去离子水溶液处理的木霉菌丰度最低,尖孢镰刀菌的丰度最高。在门水平,增加了西瓜连作土壤中壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度,降低了接合菌门（Zygomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度;在属水平,增加了对病原菌有拮抗作用的毛壳菌属（Chaetomium spp.）和顶孢霉属（Acremonium spp.）的相对丰度,同时降低了有致病潜力的尖孢镰刀菌属（Fusarium spp.）和腐生菌（Humicola spp.）物种的相对丰度。【结论】小麦根系分泌物引起的西瓜连作土壤中真菌群落的变化是小麦间作西瓜减缓西瓜病害的原因之一。

葡萄酒中与风味相关4类含硫化合物的研究进展

张清安,陈博宇

中国农业科学. 2020, 53(5): 1029-1045. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.014

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含硫化合物如谷胱甘肽、硫醇、硫化氢、二氧化硫等都是葡萄酒中重要的风味物质,这4类含硫化合物的含量和形态影响着葡萄酒的风味,且两者都与这4类含硫化合物的来源、检测方法及葡萄酒生产工艺有直接或间接的关系,但针对以上方面的结论仍不统一。基于此,本文整理了这4类含硫化合物在葡萄酒中的含量和存在形态、来源、检测方法、贮藏期间的变化及控制方法这5个方面的研究进展。就含量和存在形态而言,谷胱甘肽主要以还原型谷胱甘肽（GSH）的形式存在,含量不高于70 mg?L ^-1;硫醇以游离态存在,或与金属离子结合,硫醇含量与具体种类相关,数量级从ng?L ^-1到μg?L ^-1不等;硫化氢主要以结合态存在,易与金属离子结合,总含量不高于30 μg?L ^-1;二氧化硫常以气体形式或亚硫酸氢根形式存在,或与含羰基化合物结合,总含量为64.8—166.5 mg?L ^-1。在来源方面,这4类含硫化合物都与发酵期间酿酒酵母的代谢活动有关。谷胱甘肽主要来源于未发酵葡萄汁原料,少部分来源于氨基酸的发酵代谢;硫醇来源于含硫氨基酸、谷胱甘肽的发酵代谢及以硫化氢为底物的化学反应;硫化氢主要源于含硫氨基酸、硫酸盐和亚硫酸盐的发酵代谢;二氧化硫主要来源于外源添加剂,也有少部分源自硫酸盐的发酵代谢。检测这4类含硫化合物时,常采用化学检测方法或光谱法,此类方法检测快速但误差较大;色谱法精确度高,但是样品预处理复杂,仪器昂贵。在贮藏期间葡萄酒中的铁、铜等过渡金属离子和氧气引起的Fenton反应和氧化反应显著影响部分硫醇和硫化氢的含量。最后针对部分含硫化合物带来的异味,可以通过优化原料品质、筛选酿酒酵母菌株、改进二氧化硫添加工艺、添加金属盐等方法降低。在今后的研究中,可从优化检测方法、探究发酵和贮藏陈酿期间含硫化合物变化机理、改进葡萄酒生产环节等方面展开工作。

热胁迫对大肠杆菌细胞膜和膜蛋白的影响

张爱静,李琳琼,王鹏杰,高瑀珑

中国农业科学. 2020, 53(5): 1046-1057. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.015

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【目的】以大肠杆菌ATCC43889为试材,研究热胁迫处理对其细胞膜和膜蛋白的影响,为高温杀菌技术在食品工业中的应用奠定理论基础。【方法】研究ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃热胁迫处理15 min并转接10次培养后,获得的3种抗热性ATCC43889菌株的细胞膜和膜蛋白变化。采用扫描电子显微镜分别观察原始对照菌株和3种抗热性菌株个体形态的变化;采用96孔微量酶标板法测定各菌株生物被膜生成能力的强弱;用气相色谱法测定各菌株细胞膜脂肪酸组成的变化及其差异;用差示扫描量热法测定各菌株细胞膜磷脂相变温度的变化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法检测各菌株外膜蛋白表达的变化。【结果】大肠杆菌ATCC43889分别经50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养后,其个体形态变化明显,经50℃热胁迫后,部分菌株由球状体变为长杆状;经60℃热胁迫后的菌株个体形态较50℃热胁迫处理的菌株细长;经70℃热胁迫处理后大部分菌株变成了更细长的杆状,大量的菌株聚集在一起,菌体表面呈凸凹不平的无规则形态。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株的生物被膜生成活力增大,其生物被膜生成能力增强,3种抗热性菌株的生物被膜生成能力与对照组相比差异显著（P<0.05）,60℃和70℃下获得的2种抗热性菌株的生物被膜生成能力差异不显著（P>0.05）。与对照的原始菌株相比,经过50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养的菌株,缺失了3种脂肪酸,分别为C18:1n9c、C18:3n3和C21:0,随着热胁迫温度的提高,热胁迫菌株细胞膜中C13:0、C16:0和C17:0等饱和脂肪酸（SFA）及其总含量升高,而C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n9t和C18:2n6t等不饱和脂肪酸（USFA）及其总含量降低,总SFA/总USFA比值增大,SFA/USFA比值越大,菌体细胞膜流动性越弱。随着热胁迫温度的提高,ATCC43889抗热性菌株细胞膜磷脂的熔点（T_m）升高,表明细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,热胁迫温度越高,细胞膜流动性越低;随着热胁迫温度的提高,分子质量在63 kD和75 kD附近的条带颜色逐渐变深,分别经60℃和70℃各10次热胁迫并转接10次培养获得的2种抗热性菌株,其细胞外膜蛋白分子质量在48—75 kD均增加了特异条带;胁迫温度越高,一些外膜蛋白表达量及其种类增加,ATCC43889的耐热性越强。【结论】随着热胁迫温度的升高,ATCC43889个体形态变长,生物被膜生成能力增强,饱和脂肪酸含量升高,不饱和脂肪酸含量下降,细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低,一些外膜蛋白表达量提高、表达种类增加,菌株耐热性增强,这些变化有利于其适应不利的热胁迫环境,提高生存能力。

梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化及其生物活性的测定

张宇飞,曹满园,王丽英,赵伟刚,李晓霞,常彤,许保增

中国农业科学. 2020, 53(5): 1058-1070. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.016

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【目的】体外真核表达梅花鹿（Cervus nippon）激活素 A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素 A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (Activin βA, ACTBA)亚基基因的cDNA 全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI 数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4 软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot 技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA 亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素 A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素 A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp 的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot 结果显示激活素 A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素 A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素 A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素 A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterol side-chain cleavage enzyme, CYP11A1 or P450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素 A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素 A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素 A重组蛋白,为下一步激活素 A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度玉米赤霉醇单克隆抗体

胡骁飞,李青梅,姚静静,胡思宇,孙亚宁,邢云瑞,邓瑞广,张改平

中国农业科学. 2020, 53(5): 1071-1080. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.05.017

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【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇（zearalanol,ZAL）单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮（zearalanone, ZAN）制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺（EDC）法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50 μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC₅₀)为577 pg?mL ^-1,亲和力常数Ka=6.21×10 ⁷L?mol ^-1,与结构类似物β-玉米赤霉醇（β-zearalanol, β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol, α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol, β-ZEL）、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。

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