中国农业科学

小麦转录因子基因W16的功能标记作图和关联分析

雷梦林, 李昂, 昌小平, 徐兆师, 马有志, 刘惠民, 景蕊莲

中国农业科学. 2012, 45(9): 1667-1675. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.001

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【目的】开发小麦DREB转录因子基因W16的功能标记，进行遗传作图，并结合表型性状关联分析，为利用分子标记进行小麦遗传改良提供依据。【方法】以六倍体普通小麦及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料，克隆W16的DNA序列；根据序列多态性设计分子标记；利用中国春缺四体材料对基因进行染色体定位，用DH群体（旱选10号×鲁麦14）进行精细定位并作图；以154份六倍体普通小麦材料构成的自然群体分析表型性状与基因单倍型的关联特性。【结果】利用中国春缺四体材料先将W16定位在1A染色体上。后利用DH群体将W16定位于染色体1A的CWM517和WMC20标记之间，距左、右标记的遗传距离分别为7.8 cM和19.4 cM。在小麦自然群体中共检测到W16的3种单倍型，分别与单株穗数、穗粒数、每穗小穗数和籽粒饱满度关联。【结论】确定了W16所在的染色体位置，鉴定出HapⅡ为增加单株穗数和籽粒饱满度的优良单倍型，HapⅢ为提高穗粒数的优良单倍型，该基因的功能标记和关联分析结果为小麦分子育种提供了重要信息。

一个玉米细胞质雄性不育系的鉴定及遗传分析

祝丽英, 陈景堂, 黄亚群, 赵永锋, 宋占权

中国农业科学. 2012, 45(9): 1676-1684. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.002

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【目的】阐明新育成的雄性不育系农系928cms-Q1261的胞质类型、败育时期和遗传机制，为其育种应用提供依据。【方法】将不育系在不同年份、不同地点种植，鉴定育性表现，通过测交、姊妹交、反交对不育性的遗传进行分析，利用特异引物进行PCR扩增鉴定胞质类型，通过石蜡切片法在光学显微镜下观察小孢子发育过程。【结果】农系928cms-Q1261雄穗无花药外露，花粉败育彻底，不育性表现稳定；质不育基因来自自交系Q1261，为S型；核不育基因来自农系928，由1对隐性基因控制；小孢子从单核晚期开始自溶，成熟期完全降解；自交系郑58能保持其不育性。【结论】农系928cms-Q1261属于S型不育胞质，是一种无花粉型的细胞质雄性不育系，其恢复系广泛。

花生2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因VTE3的克隆及多态性分析

郭安强, 万勇善, 刘风珍

中国农业科学. 2012, 45(9): 1685-1695. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.003

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【目的】分离花生2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ MT）基因VTE3，揭示其分子生物学特征及遗传多态性。【方法】利用EST拼接、RT-PCR以及以DNA为模板的PCR扩增技术，从花生属栽培种中分离VTE3 全长cDNA；从不同类型栽培品种和花生属花生区组二倍体野生种（Arachis duranensis 和A. ipaensis ）中分离VTE3全长DNA，进行VTE3序列多态性分析，并构建VTE3的进化树。【结果】从3个栽培品种中分别克隆得到2条VTE3 cDNA序列（命名为rVTE3-1和rVTE3-2），rVTE3-1和rVTE3-2的编码区长均为1 059 bp，二者同源性97.8%，存在10个变异位点，其中8个为SNP变异；二者均编码351个氨基酸，氨基酸序列同源性98.6%，存在5个氨基酸差异。从13个栽培品种分别克隆得到2条VTE3 DNA序列（命名为gVTE3-1和gVTE3-2），13个品种间gVTE3-1的同源性为99.9%，gVTE3-2的同源性为100%。其中丰花2号gVTE3-1序列长2 710 bp，存在3个内含子，分别位于44—163、772—1 295和1 603—2 437 bp处；gVTE3-2序列长2 706 bp，也存在3个内含子，分别位于44—169、778—1 291和1 599—2 433 bp处。丰花2号gVTE3-1和gVTE3-2同源性96.6%，内含子区域存在36个SNP位点和3个限制性内切酶识别的多态性位点。从A. duranensis分离的VTE3 DNA序列命名为gVTE3-A，从A. ipaensis分离的VTE3 DNA序列命名为gVTE3-B。利用栽培种丰花2号gVTE3-1和gVTE3-2以及野生种gVTE3-A和gVTE3-B 4条DNA序列进行进化分析，推测序列gVTE3-1和gVTE3-2分别来自丰花2号的A、B染色体组。花生MPBQ MT氨基酸序列与其它物种的同源性较高，具有很强的保守性。【结论】本研究克隆了花生VTE3的全长cDNA和DNA；推断栽培品种的gVTE3-1和gVTE3-2分别来自A、B染色体组，不同染色体组的VTE3多态性位点丰富；不同栽培品种间等位基因核苷酸序列差异很小，所检测13个栽培品种的gVTE3-1以及野生种的gVTE3-A间存在等位变异，13个栽培品种的gVTE3-2以及野生种gVTE3-B间未发现等位变异。

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

龚达平, 解敏敏, 孙玉合

中国农业科学. 2012, 45(9): 1696-1702. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.004

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【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序，发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因，为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料，利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列，采用生物信息分析手段，对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库，该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1，平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆，获得5 233条高质量表达序列标签（EST），序列拼接出3 922个单一基因；同源比对分析表明，89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性，这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能；并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库；大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。

不同棉花基因型幼苗耐寒性分析及其鉴定指标筛选

武辉, 侯丽丽, 周艳飞, 范志超, 石俊毅, 阿丽艳?肉孜, 张巨松

中国农业科学. 2012, 45(9): 1703-1713. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.005

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【目的】研究不同基因型棉花幼苗耐寒特性，筛选耐低温鉴定指标，建立可靠的棉花耐寒性数学评价模型，为棉花耐寒新品种选育、推广及大规模品种耐寒性评价奠定基础。【方法】以15个棉花品种（系）为试验材料，对其在低温胁迫（5℃、12 h）及恢复处理（25℃、24 h）下幼苗叶片的光合气体交换参数、叶绿素荧光动力学参数、叶绿素含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、游离脯氨酸含量和相对电导率等12个生理指标进行测定，以各单项指标的耐寒系数作为衡量耐寒性的依据，运用主成分分析、聚类分析和逐步回归等方法对其耐寒性进行综合评价。【结果】通过主成分分析将12个单项生理指标转换为7个相互独立的综合指标；通过隶属函数法和聚类分析将15个棉花品种（系）按耐寒性强弱划分为3类；通过逐步回归建立棉花幼苗耐寒性评价数学模型，D=0.275-0.244Fo1+0.206Fv/Fm1+0.326gs2-0.056SS+0.225MDA+0.038REC（R2=0.995），估计精度大于94.25%，并筛选出6个耐寒性鉴定指标，分别是Fo1、Fv/Fm1、gs2、SS、MDA和REC。【结论】耐寒性强的棉花品种(系)幼苗叶片在低温胁迫下受到伤害较轻，能保持较高的光合电子传递能力，经常温恢复后叶片气孔导度较高，便于光合气体交换，有助于光合能力的恢复；在相同逆境下，通过测定Fo1、Fv/Fm1、gs2、SS、MDA和REC等6个鉴定指标，可进行棉花品种耐寒性强弱的快速鉴定和预测。

高粱品种萌发期耐盐性筛选与鉴定

孙璐, 周宇飞, 汪澈, 肖木辑, 陶冶, 许文娟, 黄瑞冬

中国农业科学. 2012, 45(9): 1714-1722. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.006

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【目的】根据不同高粱品种萌发期对盐胁迫的响应，筛选出适合在盐渍土壤上种植的高粱品种及为耐盐胁迫人工调控提供依据。【方法】采用人工气候箱内培养皿培养，用150 mmol•L-1NaCl对42个高粱品种进行胁迫处理，蒸馏水处理为对照，每培养皿放30粒种子。人工气候箱内湿度60%，光照/黑暗时间为12h/12h，光照强度为134 μmol•m-2•s-1，昼/夜温度为28℃/25℃。培养第4天测定发芽势，第10天测定发芽率、根长、叶长、根重、叶重。通过主成分分析、聚类分析和对各品种的表现综合评定，对高粱品种进行耐盐性强弱的分类。【结果】多项萌发和生长参数的相对值之间存在着极显著或显著的正相关。主成分分析结果表明，根长、叶重和发芽率分别在根部、叶部和萌发因子中的负荷量最大，可作为萌发期高粱耐盐性筛选的主要鉴定指标。42个高粱品种的耐盐性存在很大差异，其中辽杂15等5个品种为高度耐盐品种，沈试104等14个品种为耐盐品种，敖杂1等12个品种为中等耐盐品种，铁杂17等8个品种为盐敏感品种，龙杂10等3个品种为高度盐敏感品种。【结论】150 mmol•L-1NaCl可作为高粱萌发期耐盐性鉴定的适宜盐浓度，根长、叶重和发芽率等指标可用于大批量高粱品种耐盐性的评价。

大草蛉预蛹耐寒性的季节性变化

于令媛, 时爱菊, 郑方强, 卢虹, 张帆, 许永玉

中国农业科学. 2012, 45(9): 1723-1730. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.007

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【目的】了解大草蛉自然种群预蛹耐寒性的季节性变化及机制。【方法】测定大草蛉自然种群预蛹的蛹重、过冷却点（SCP）和结冰点（FP）、体内含水量、脂肪含量、蛋白质和可溶性糖含量等耐寒性指标。【结果】大草蛉预蛹的SCP和FP在2010年1月（越冬中期）达到最低值为-17.53和-7.14℃，在2010年7月（生长期）达到最高值为-8.21和-3.65℃；2009年9、10月（越冬前期）的SCP和FP均低于2010年4、5月（越冬后期），SCP和FP值在2009年9月至2010年7月间呈先减后增的趋势。体内水分、蛋白质和可溶性糖含量变化与SCP的变化相似，也呈先减后增的趋势，而脂肪含量在越冬初期即达到最高，为46.81%，越冬期间逐渐减少，但仍高于其它时期，2010年7月（生长期）降到最低，为31.07 %。【结论】大草蛉预蛹的耐寒性呈现出明显的季节性变化特点，越冬预蛹的耐寒性显著高于夏季和越冬后预蛹，自然种群预蛹耐寒能力的变化规律与预蛹体内的水分和主要生化物质的含量变化具有相关性。

常用农药在水稻叶片上的润湿能力分析

徐广春, 顾中言, 徐德进, 许小龙, 董玉轩

中国农业科学. 2012, 45(9): 1731-1740. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.008

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【目的】研究稻田常用农药大容量喷雾和弥雾浓度下药液在稻叶上的润湿性能。【方法】采用Zisman图法测定稻叶的临界表面张力，并将其与采用国家标准GB 5549-90的方法测定的52种农药田间使用浓度下药液的表面张力值进行比较分析；采用表面张力法测定药液中表面活性剂的临界胶束浓度，并借助5种制剂来分析说明药液在稻叶上的润湿性。【结果】南粳44、南京11和武香糯8333 3种稻叶正、反面的临界表面张力估值介于29.90—32.88 mN•m-1。大容量喷雾和弥雾时，药液的表面张力小于稻叶临界表面张力的农药分别为21和23种，其中药液中表面活性剂浓度高于临界胶束浓度的农药分别为19和21种；其余农药的药液表面张力则大于稻叶的临界表面张力或药液中的表面活性剂浓度低于临界胶束浓度。大容量喷雾和弥雾时，5%井冈霉素AS、70%吡虫啉WDG 2种农药药液的表面张力分别为46.84和46.53 mN•m-1、49.48和40.24 mN•m-1，在稻叶上的接触角均大于100°，润湿性差；50%甲基硫菌灵SC 药液的表面张力均为35.89 mN•m-1，在稻叶上的接触角介于98.59°—53.76°，润湿性较差至好；4%阿维菌素ME、1.8%阿维菌素EC 2种农药的药液表面张力分别为29.98和29.13 mN•m-1、27.67和27.67 mN•m-1，在稻叶上的接触角均小于60°，润湿性好。【结论】稻田常用农药中多数在大容量喷雾和弥雾浓度下药液的润湿性较差。

连续秸秆覆盖对土壤无机氮供应特征和作物产量的影响

武际, 郭熙盛, 鲁剑巍, 王允青, 张晓玲, 许征宇

中国农业科学. 2012, 45(9): 1741-1749. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.009

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【目的】采用田间定位试验研究方法，于2008—2010年研究了水旱轮作制下连续秸秆覆盖对土壤无机氮供应特征和作物产量的影响。【结果】连续秸秆覆盖还田可以显著提高0—5 cm、5—15 cm和15—25 cm土层土壤NH4+-N、NO3--N含量，并且随着秸秆覆盖还田年限的延长和用量的提高，3个土层土壤的NH4+-N、NO3--N含量的增幅也随之增加。第5季水稻收获后，秸秆覆盖处理NH4＋-N、NO3--N含量的增幅分别达到了18.83%—36.70%和12.04%—37.70%。秸秆覆盖还田使水稻生育前期土壤NH4+-N、NO3--N含量降低，有利于减少NO3--N的淋失。而后期氮素得到释放满足作物生殖生长的需要，则有利于作物产量的提高。秸秆覆盖还田后，可以提高作物产量。其中旱季作物（小麦、油菜）的增产效应要高于水稻，并且作物的增产幅度随着秸秆还田年限和用量的增加而提高。起主要作用的产量构成因素是小麦、水稻的有效穗数以及油菜单株角果数和每角粒数。【结论】连续秸秆覆盖还田促进了土壤无机氮的供应，从而提高了作物产量。

氮肥及其与秸秆配施在不同肥力土壤的固持及供应

梁斌, 赵伟, 杨学云, 周建斌

中国农业科学. 2012, 45(9): 1750-1757. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.010

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【目的】在有机物料和无机氮肥的配施条件下，研究氮素在土壤中的固持与释放过程，以期达到土壤供氮与作物需氮相一致的目的。【方法】以长期定位试验不同施肥处理土壤（不施肥，NF；施用氮磷钾化肥，NPK；厩肥与化肥配施，MNPK）为研究对象，采用盆栽试验研究化学氮肥及其与秸秆配施在不同肥力土壤中的固持与供应。【结果】与未施氮肥（对照）相比，单施尿素对NF处理土壤小麦籽粒产量无显著影响，而显著提高了NPK和MNPK处理土壤小麦籽粒产量；MNPK处理土壤氮肥利用率（67%）显著高于NPK（56%）和NF（19%）处理土壤。与施用氮肥处理相比，秸秆与尿素配施显著降低了小麦产量和氮素利用率，但MNPK处理土壤小麦产量及氮肥利用率（11%）仍显著高于NPK处理（7%）；秸秆与尿素配施降低了当季小麦对施入氮素的吸收利用，小麦收获时不同施肥处理土壤有79%—88%施入的氮素未被吸收利用。【结论】有机肥与化肥长期配施在协调土壤氮素供应，提高作物产量及氮肥利用率方面具有突出作用。

‘湖景蜜露’桃果实酰基辅酶A氧化酶编码基因的克隆及表达分析

齐玉洁, 张鑫, 杨夏, 高中山, 贾惠娟

中国农业科学. 2012, 45(9): 1758-1765. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.011

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【目的】根据国际桃基因组序列信息，进行克隆和表达分析与桃果实内酯类合成相关的果肉组织酰基辅酶A氧化酶(Acyl-CoA oxidase，ACX)的5个候选基因，为进一步开展桃香气物质代谢分子机理的研究提供新的研究方向。【方法】根据Phytozome(www.phytozome.org/peach)发布的桃ACX全基因组序列设计特异引物对5个基因全长进行克隆测序，与参考编码序列进行比对和编码蛋白性质进行分析，并对这些成员进行组织特异性表达分析。【结果】获得了桃果肉组织中表达的5个ACX编码基因全长序列，PpACX1、PpACX3的CDS区没有突变，PpACX2核苷酸序列871位处A突变为G，导致氨基酸序列中谷氨酰胺变异为精氨酸；PpACX4的核苷酸序列在80位和368位存在两处同义突变；PpACX5在475位处A突变为C，导致蛋氨酸突变为亮氨酸。同源性分析结果显示，这些基因的氨基酸序列与番茄、南瓜、大麦、葡萄等高等植物的氨基酸序列同源性很高。系统进化树分析表明，5个基因家族成员中，除PpACX4外其余4个成员处在同一个进化分支上，且与南瓜、葡萄、番茄、大豆等的亲缘关系较近。在根、茎、叶、果实表达证明，PpACX1是果实中主要大量表达成员。【结论】‘湖景蜜露’桃果实中表达的5个桃ACX编码基因全长与基因组数据数据库有一定差异，PpACX1为5个成员中较为关键的基因成员。

不同砧木嫁接对薄皮甜瓜成熟期品质、香气合成相关酶活性及基因表达的影响

田晓彬, 齐红岩, 李岩, 靳亚忠, 刘文玮, 徐晓飞

中国农业科学. 2012, 45(9): 1766-1774. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.012

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【目的】明确不同砧木嫁接对薄皮甜瓜成熟期品质、主要香气组分和含量及相关酶活性与基因表达的影响。【方法】以薄皮甜瓜‘玉美人’为接穗，白籽南瓜‘圣砧1号’(G1)、‘甜砧2号’(G2) 和厚皮甜瓜‘PG22HF1’(G3) 为砧木，测定成熟果实的相关品质及香气合成关键酶活性，并对醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase, ADH）和醇酰基转移酶（alcohol acyltransferase, AAT）的基因表达进行实时荧光定量PCR分析。【结果】3种砧木嫁接不同程度地延迟了果实成熟，表现为果实硬度大，果皮颜色退绿慢，可溶性固形物含量低，G2比自根果实延后2 d，而G1和G3延后程度更大。G2砧木嫁接后显著提高了成熟甜瓜果实中非乙酸酯类种类和含量以及乙酸乙酯等主要酯类的含量，其非乙酸酯类含量是花后相同天数自根果实的1.5倍；而其它两个砧木嫁接后显著降低了主要酯类的含量，且3种砧木嫁接果实中均检测到自根果实中没有的草酸烯丙基异己酯。对于成熟一致的果实，嫁接没有显著降低香气合成相关酶活性，而且G2还提高了脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）、ADH和AAT的活性，但是，嫁接抑制了香气合成关键酶的基因表达。【结论】不同砧木对成熟果实品质影响不同。‘甜砧2号’利于提高果实品质，其它两个砧木降低了相关品质。嫁接一方面是通过延迟果实成熟而影响果实品质和香气合成相关酶的活性，另一方面，从转录水平降低了香气合成相关酶基因的表达，最终影响果实的香气成分和品质。

龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组学

赖呈纯, 赖钟雄, 方智振, 何园, 姜顺日

中国农业科学. 2012, 45(9): 1775-1790. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.013

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【目的】通过龙眼（Dimocarpus longan Lour.）体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质组学研究，为植物胚胎发育相关蛋白基因分离和植物体细胞胚发生相关机制等的深入研究奠定基础。【方法】利用已建立的龙眼体细胞胚发生再生系统，经同步化培养获得龙眼体细胞胚发生早期5个阶段胚性培养物，并采用双向电泳和质谱技术对龙眼体细胞胚发生早期的蛋白质组变化进行分析。【结果】龙眼体细胞胚发生早期5个阶段的蛋白质2D表达谱可检测到1 203—1 798个蛋白点，其在龙眼体细胞胚发生早期各阶段大部分具有阶段差异表达特性，有小部分是阶段特异表达，根据其蛋白数目、表达丰度、分子量和等电点等变化，确定了龙眼体细胞胚发生早期的ECII到CpECGE阶段是体细胞胚发生早期的关键性阶段。成功鉴定45个差异蛋白，成功率为37%，其中以能量、碳水化合物代谢相关蛋白和氧化胁迫反应相关蛋白占多数，分别为22%和27%；通过其功能分析可以推断出，龙眼体细胞胚发生早期，能量和糖代谢是体细胞胚发生的基础，而氧化胁迫反应是体细胞胚发生的先决条件，并通过参与细胞骨架的稳定、氮代谢、信号转导、基因调控、蛋白质的翻译加工修饰和定位等功能的蛋白，构成一个庞大的龙眼体细胞胚发生蛋白质调控网络系统，保证体细胞胚的正常发育。【结论】对龙眼体细胞胚发生早期过程的蛋白质表达变化有了较全面的了解，蛋白质表达数量呈先减低后升高再减低的趋势，龙眼体细胞胚发生早期能量和糖代谢旺盛，氧化胁迫反应相关蛋白对体细胞胚早期的发生和发育有重要的调控作用。

玫瑰花柱提取液对玫瑰及月季花粉管离体生长的影响

丁一鸣, 赵兰勇, 张玲, 孙华彩, 王新刚

中国农业科学. 2012, 45(9): 1791-1797. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.014

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【目的】观察玫瑰（Rosa rugosa）花柱提取液对玫瑰及月季（R. chinensis）花粉管离体生长的影响，探讨玫瑰与月季种间杂交不亲和性机理。【方法】使用玫瑰花柱提取液对玫瑰及月季花粉进行培养，花粉管顶端囊泡采用FM4-64标记，花粉管顶端钙离子采用Fluo-3AM标记，在激光共聚焦显微镜下观测。花粉管形态变化采用光学显微镜观测。【结果】经玫瑰花柱提取液处理，玫瑰花粉管形态正常，而月季花粉管在生长过程中发生扭曲、开裂等现象，花粉管顶端囊泡区域化分布不明显，钙离子浓度下降，钙梯度消失，钙波微弱，花粉管顶端有部分细胞壁增厚，产生胼胝质。【结论】玫瑰花柱提取液影响月季花粉管顶端囊泡分泌、钙离子分布，使花粉管生长停止，并在花粉管顶端产生大量胼胝质。由此推测玫瑰与月季种间杂交不亲和的原因之一可能是玫瑰花柱通过影响月季花粉管顶端囊泡分泌、钙离子分布抑制花粉管生长，并且在生长停止的花粉管顶端产生胼胝质沉积。

改性甘薯果胶对癌细胞增殖的影响

张燕燕, 木泰华, 张苗

中国农业科学. 2012, 45(9): 1798-1806. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.015

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【目的】探讨pH改性和热改性甘薯果胶对结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞Bcap-37和肝癌细胞SMMC- 7721增殖的影响。【方法】分别对改性前后甘薯果胶的半乳糖醛酸含量、酯化度、分子量、微观结构及癌细胞增殖抑制活性进行测定。【结果】果胶改性后半乳糖醛酸含量显著提高（P＜0.05），而酯化度和分子量降低，微观结构发生明显变化。未改性、pH改性和热改性甘薯果胶对3种癌细胞均有抑制作用，并呈浓度和时间依赖性；改性后甘薯果胶对3种癌细胞增殖抑制效果均有显著提高（P＜0.05），且改性甘薯果胶对HT-29和Bcap-37的抑制效果更显著。【结论】改性甘薯果胶对HT-29和Bcap-37的增殖抑制效果较好，具有潜在的抗结肠癌和乳腺癌作用。

运输前后奶牛血清蛋白质组的变化

袁廷杰, 王加启, 杨永新, 卜登攀, 杨晋辉, 周凌云

中国农业科学. 2012, 45(9): 1807-1813. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.016

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【目的】从血清蛋白组研究运输对奶牛机体的影响，充分理解运输对奶牛的生理病理影响及其潜在的作用机制提供理论依据。【方法】采用二维凝胶电泳（2-DE）结合MADIL-TOF-TOF串联质谱的方法对运输前第7天、运输后3 h和第7天奶牛的血清进行蛋白质组分析鉴定。【结果】运输可引起奶牛血清中14个蛋白点的表达丰度发生变化，有12个蛋白点得到有效鉴定。与运输前第7天相比，血清白蛋白、IgG1 重链恒定区、类型II细胞骨架I和转甲状腺素蛋白在运输后3 h表达量降低，而α1-酸性糖蛋白、结合珠蛋白、nesprin-2、微管微丝交联因子1、酪氨酸蛋白激酶Fps85D、输出蛋白5和一个未知蛋白点在运输后3 h的表达量升高；在运输后第7天，除α1 酸性糖蛋白外，上述蛋白的表达量与运输前第7天无显著差异。【结论】运输引起变化的蛋白主要涉及机体急性期应答和免疫反应、物质运输以及细胞内多个代谢途径，表明运输引起了奶牛应激。

绵羊Myostatin基因5′调控区的生物信息学分析及孕激素对调控区活性的影响

秦健, 杜娟, 杨亚群, 杜荣

中国农业科学. 2012, 45(9): 1814-1825. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.017

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【目的】克隆并分析绵羊Myostatin基因5′调控区，并在细胞水平研究孕激素对该调控区活性的影响。【方法】利用PCR方法扩增绵羊Myostatin基因5′调控区，采用MatInspector等软件分析并比较其和牛、猪调控区的调控元件和转录因子。以EGFP为报告基因，构建表达载体，转染C2C12细胞，同时添加不同剂量的孕激素（0、10、100和1 000 nmol•L-1），然后通过RT-PCR方法检测报告基因EGFP和内源性Myostatin的mRNA水平。【结果】获得绵羊约3.2 kb Myostatin基因5′调控区（MSTN5′regu），预测了两个对双肌性状可能存在贡献的位点。在绵羊、牛和猪的相应调控区发现了许多可能对该基因转录调控起重要作用的调控元件和相应转录因子，包括E-box、MEF2、MTATA、MTBF、HOMF、PRE、ARE和GRE等。各种元件在不同动物间基本都有，但具体的序列、位置以及数量有所差异。成功构建了绵羊pMSTN5′regu-EGFP表达载体，且转染后100 nmol•L-1孕激素明显抑制了内源性Myostatin mRNA和报告基因EGFP mRNA的表达。【结论】绵羊Myostatin基因的转录受多种转录因子和相应调控元件的调控，适量孕激素可通过下调Myostatin基因5′调控区的活性而抑制该基因的转录。

鸡miR-181a组织的表达谱及其转录调控区域

孙桂荣, 李明, 康相涛, 李国喜, 田亚东, 韩瑞丽, 白义春

中国农业科学. 2012, 45(9): 1826-1832. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.018

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【目的】分析鸡miR-181a的转录起始位点，并分析其在1日龄和成年鸡不同组织中的表达谱，以期为研究miR-181a的功能奠定基础。【方法】采用qPCR技术构建miR-181a 在1日龄和成年鸡肝脏、脾脏、肺、小肠、大脑、小脑、下丘脑、脑干、胸腺、心脏和肾脏组织中的表达谱。用version(1.83)分析miR-181a的保守性，并采用ENCODE数据库进行miR-181a转录起始位点和启动子区域的分析。【结果】①采用qPCR检测miR-181a在鸡下丘脑中的表达量和高通量测序的结果一致，1日龄下丘脑中的表达量显著低于成年鸡的表达量（P＜0.05）；②miR-181a 在11个组织中均有表达，且在1日龄和成年鸡脾脏、肺、小肠、大脑、小脑、下丘脑、脑干、胸腺、心脏和肾脏组织的表达量差异显著（P＜0.05），而在肝脏中表达量的差异不显著（P＞0.05）；③miR-181a的前体miR-181a-1上游区域有一个启动子区和一个潜在的转录起始位点；④miR-181a-1的转录调控区域内存在的多个转录因子，转录因子主要有NFKB,c-Fos等。【结论】鸡miR-181a的表达有组织和时序差异，其成熟序列在脊椎动物中十分保守，上游有一个转录起始位点及启动子区。

家蚕幼虫期和蛹期马氏管差异蛋白质组学分析

邹勇, 钟晓武, 张利平, 赵萍, 夏庆友

中国农业科学. 2012, 45(9): 1833-1839. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.019

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【目的】深入了解家蚕幼虫期与蛹期马氏管蛋白质组的变化，为马氏管在不同发育时期的功能研究提供蛋白质水平上的依据。【方法】利用蛋白质双向电泳技术对家蚕5龄第5天及化蛹第1天的马氏管组织进行比较，并采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对表达量差异较大的蛋白点进行肽指纹图谱鉴定，应用GPMAW 8.00软件对NCBI蛋白质数据库中所有来自于P50/Dazao的蛋白质与家蚕9倍基因组预测蛋白质库共同构建本地数据库，对试验采集到的肽指纹图谱进行分析。【结果】共检测到360—430个蛋白点，主要分布在分子质量15—80 kD、等电点4.0—9.5。2个时期共成功鉴定17个表达量有显著差异的蛋白质，其中包括与能量代谢相关蛋白质、热激蛋白、V型H+ ATP合酶、30K蛋白以及与肾脏功能密切相关的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶 2,3-羟基异丁酸脱氢酶等。【结论】本研究中差异蛋白质的发现和鉴定为完全变态昆虫幼虫期与蛹期马氏管的功能差异提供了蛋白质水平上的理论依据。

猪干扰素α、β和γ的融合表达及活性

郑鸣, 边传周, 王老七, 王永芬

中国农业科学. 2012, 45(9): 1840-1847. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.020

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【目的】研制高效的猪基因工程干扰素制剂用于猪病毒性和肿瘤性疾病的防治。【方法】采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）技术将PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ成熟肽基因进行连接，形成3种融合基因PoIFN-α/β、PoIFN-α/γ和PoIFN-β/γ，并构建到原核表达载体pET30a进行融合表达，用细胞病变抑制试验和淋巴细胞转化试验测定融合蛋白rPoIFN-α/β、rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ的生物学活性，同时与非融合干扰素rPoIFN-α、rPoIFN-β和rPoIFN-γ进行比较分析。【结果】成功构建了3种融合基因，并在大肠杆菌中实现表达，经纯化、复性得到3种具有生物学活性的融合蛋白rPoIFN-α/β、rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ。细胞病变抑制试验结果表明，无论是在Marc-145还是在PK-15细胞上，3种融合蛋白均具有较强的抗病毒活性，其抗PRRSV或VSV活性明显高于非融合的rPoIFN-α、rPoIFN-β和rPoIFN-γ，体现出一定的叠加效应；MTT法检测淋巴细胞转化试验结果显示，rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ能有效刺激淋巴细胞转化，具有良好的免疫学活性；而rPoIFN-α/β效果不明显。说明Ⅰ型与Ⅱ型PoIFN之间能协同调节免疫，而Ⅰ型的不同亚型之间无明显协同作用。【结论】3种融合干扰素具有较强的抗病毒活性，可以用于猪病毒性和肿瘤性疾病的防治，其中rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ还具有较强的免疫增强作用，可被开发成新型的免疫增强剂。

Arkadia和UCH37表达载体的构建及其对TGF-β1/Smads信号通路的影响

廖芳芳, 苑嗣纯, 张中文, 吴国娟

中国农业科学. 2012, 45(9): 1848-1856. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.021

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【目的】构建泛素启动酶Arkadia和泛素羧基末端水解酶-5（亦称UCH37）的表达载体，并探讨Smad7蛋白的泛素化修饰对马兜铃酸肾病中TGF-β1/Smads信号通路的影响。【方法】通过观察绿色荧光的表达量及real-time PCR反应优化转染条件，转染Arkadia和UCH37 siRNA，real-time PCR检测mRNA表达抑制率。分别构建Arkadia和UCH37的表达载体pGPU6/GFP/Neo，经鉴定后转染细胞，real-time PCR和Western blotting检测Arkadia、UCH37和Smad7的表达变化。【结果】①30 pmol siRNA和1.5 μL LipofectamineTM 2000为最佳转染条件；②Arkadia-1490和UCH37-721的干扰效果最明显；③载体的插入序列完全正确，且pGPU6/GFP/Neo-Arkadia能上调马兜铃酸肾病模型中Smad7的表达，而pGPU6/GFP/Neo-UCH37使Smad7表达下降。【结论】成功构建了表达载体pGPU6/GFP/Neo-Arkadia和pGPU6/GFP/Neo-UCH37，且Arkadia和UCH37可分别放大、抑制TGF-β1/Smads信号通路。

橡胶树HbSUT3的分子进化分析

林飞鹏, 范玉洁, 龙翔宇, 胡彦师, 唐朝荣

中国农业科学. 2012, 45(9): 1857-1863. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.022

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【目的】揭示HbSUT3的分子进化特点，及其与产量的相关性。【方法】克隆获得橡胶树5个大规模推广品种、9个1981′IRRDB野生种质和7个橡胶树属其它种或变种共计21份材料的HbSUT3及其同源基因（统称为SUT3）的cDNA序列，以及其中10个材料的基因组序列，利用MEGA软件(版本4.02)对获得的序列进行基因序列分析，并采用NJ法构建分子进化树。【结果】橡胶树属不同材料的SUT3均由4个外显子和3个内含子组成，其cDNA编码区长度均为1 608 bp；不同材料序列的转换/颠换比均小于2.0，Ks值普遍大于Ka值；系统进化分析显示，高产的橡胶树种质趋于聚为一类，但橡胶属不同种的材料也可以聚在一起。【结论】橡胶树HbSUT3是一个进化相对保守的基因，其分子进化与橡胶树产量性状有一定的相关性，橡胶树属内的不同种和变种可能属于一个物种综合。

外源NO对NaCl胁迫下棉苗主要形态和相关生理性状的影响

李翠芳, 刘连涛, 孙红春, 张永江, 朱秀金, 李存东

中国农业科学. 2012, 45(9): 1864-1872. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.023

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【目的】研究不同浓度外源NO供体硝普钠（SNP）对不同NaCl胁迫程度下棉苗生长和叶片生理性状的影响。【方法】采用水培处理，试验设2个NaCl水平（50和100 mmol•L-1），各NaCl水平下设4个SNP浓度（0、50、100和200 μmol•L-1），同时设对照（0 mmol•L-1NaCl，0 μmol•L-1SNP），处理10 d后测定棉苗形态指标和叶片主要生理指标。【结果】NaCl胁迫抑制棉苗生长；外源NO供体SNP进一步抑制NaCl胁迫下棉苗节间伸长，显著降低植株含水量，尤其是根和茎的含水量；SNP处理显著增加轻度盐胁迫（50 mmol•L-1 NaCl）下棉苗比叶重，50—200 μmol•L-1SNP处理下比叶重增加10%—18%；SNP处理提高了高盐（100 mmol•L-1NaCl）胁迫下棉苗叶片可溶性蛋白含量和叶绿素a/b值，显著提高了叶绿素a、b含量，以50 μmol•L-1SNP处理效果最显著，叶绿素a、b分别增加10.9%和9.8%；SNP显著提高了NaCl胁迫下叶片SOD活性和POD活性，降低了CAT活性。【结论】外源NO能够抑制棉苗节间伸长，缓解高浓度NaCl胁迫下棉苗叶绿素的降解，增强叶片抗氧化能力，改善叶质。本试验条件下，SNP对棉苗盐胁迫的缓解作用以50—100 μmol•L-1为宜，高浓度（200 μmol•L-1）SNP处理加剧了盐胁迫对棉苗的伤害。

食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法

何玮玲, 张驰, 杨静, 黄明, 杨军

中国农业科学. 2012, 45(9): 1873-1880. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.024

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【目的】建立快速可靠的用于食品中4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）成分快速鉴别的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR，UP-M-PCR）方法。【方法】使用DNeasy试剂盒提取法、SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法分别提取肉类中总DNA，通过比较提取效率和纯度，确定提取肉类中总DNA的方法；基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，设计两组各5条长度不同的多重PCR引物，建立并优化多重PCR反应体系，通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别；应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测，验证鉴别方法的准确性。【结果】SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒提取法的DNA效率显著优于CTAB-蛋白酶K法；在优化的反应条件下，选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊和鸡源性成分的快速鉴定，检测灵敏度达到皮克级DNA；对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】多重PCR方法精确稳定，可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。

乳酸菌对Caco-2细胞分泌APRIL和IL-10的影响

黄怡, 黄琴, 李雅丽, 崔志文, 李卫芬, 余东游

中国农业科学. 2012, 45(9): 1881-1886. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.09.025

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【目的】通过检测促炎细胞因子APRIL和抗炎细胞因子IL-10的分泌水平来观察屎肠球菌和乳酸乳球菌对肠上皮细胞先天性免疫应答的调节作用。【方法】Caco-2细胞分别和PBS（CT组，阴性对照组）、Escherichia coli K88（EC组，阳性对照组），Enterococcus faecium（EF组）或Lactococcus lactis（LL组）共孵育2 h，以及先分别和Enterococcus faecium或Lactococcus lactis共孵育1 h，再和Escherichia coli K88共孵育2 h（EF-EC组和LL-EC组）。试验结束时，用ELISA方法检测细胞培养上清中APRIL和IL-10的含量。【结果】结果表明，2株乳酸菌都促进正常状态下的肠上皮细胞分泌促炎细胞因子APRIL和抗炎细胞因子IL-10，抑制Escherichia coli K88对APRIL分泌的诱导作用，促进Escherichia coli K88感染的肠上皮细胞分泌IL-10。【结论】体外试验条件下，屎肠球菌和乳酸乳球菌能够诱导肠上皮细胞产生先天免疫应答，分泌APRIL和IL-10，抑制大肠杆菌K88引起的促炎反应，表现出抗炎作用。

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