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2021年 第54卷 第16期 刊出日期：2021-08-16

  

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中国农业科学. 2021, 54(16):  0. 

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相关文章 | 多维度评价

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

蔗糖转运蛋白OsSUT5在水稻花粉发育及结实中的作用

张雅文, 包淑慧, 唐振家, 王小文, 杨芳, 张德春, 胡一兵

中国农业科学. 2021, 54(16):  3369-3380.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.001

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【目的】蔗糖是植物体内光合产物运输的主要形式。蔗糖-质子同向运输蛋白（sucrose transporter/sucrose carrier,SUT/SUC）在植物细胞之间的蔗糖跨膜运输以及植物组织和器官之间的蔗糖分配中具有重要作用。水稻SUT家族共有5个成员。已有研究表明,敲除OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4对水稻的生长发育产生显著影响,说明这些基因不可替代。然而,OsSUT5的功能还未见报道。阐明OsSUT5在水稻生长发育中的作用,将为全面了解SUT蛋白在模式植物水稻中的生理功能提供新的依据。【方法】通过对水稻OsSUT5的时空表达特性进行实时荧光定量PCR分析,同时利用OsSUT5的推测启动子驱动GUS在水稻体内表达,获得其基因编码蛋白的组织定位信息,以及在烟草叶片表皮细胞内进行OsSUT5-GFP融合蛋白瞬时表达,对蛋白进行亚细胞定位,比较基因编辑技术（CRISPR-Cas9）创制的OsSUT5不同纯合突变株系与野生型对照水稻的形态和生理特征,获得OsSUT5的功能信息。【结果】转录水平上,OsSUT5在水稻茎、叶、花序和颖果中均有表达,并且该基因编码蛋白在营养器官中的表达集中于维管组织。在生殖器官中,OsSUT5的表达主要位于花药及发育的颖果内。该基因编码蛋白在水稻发育的颖果特别是盾片和胚根鞘中高表达。烟草叶片表皮细胞内的瞬时表达显示OsSUT5-GFP融合蛋白定位于细胞质膜。与野生型水稻相比,3个OsSUT5纯合突变株系均表现为花粉活性以及离体萌发率明显降低。与此相吻合的是,OsSUT5突变株系未授粉的小穗比例相对于野生型显著增加,同时突变株系结实率显著下降。通过对OsSUT5突变株系颖果的观察和比较显示,OsSUT5突变体水稻颖果的垩白相对于野生型明显增多,其颖果长度相对于野生型对照也有一定程度的增加,但统计结果表明OsSUT5突变体水稻的千粒重与野生型无显著区别。【结论】OsSUT5在水稻花粉发育甚至受精过程中可能发挥重要作用;敲除OsSUT5对水稻的结实率、籽粒的形态和品质有明显影响。推断OsSUT5在水稻开花结实中的作用（包括对花粉活性和颖果内胚乳发育的影响）与其蔗糖运输功能密切相关。

黄淮海麦区小麦耐热性分析及其鉴定指标的筛选

李敏, 苏慧, 李阳阳, 李金鹏, 李金才, 朱玉磊, 宋有洪

中国农业科学. 2021, 54(16):  3381-3392.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.002

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【目的】分析不同基因型小麦的耐热性,筛选耐热鉴定指标,建立可靠的耐热评价模型,为耐热小麦品种的选育提供理论支撑。【方法】以黄淮海麦区大面积推广的20个小麦品种为试验材料,采用田间试验,设置高温（花后第14—20天,连续7 d高温处理）和自然条件2种处理,在灌浆后期测定小麦穗部冠层温度、旗叶叶绿素相对含量（SPAD）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性;收获晾干后测定单穗粒重、千粒重和产量。根据高温处理和自然条件生长下各项指标的耐热系数,采用主成分分析、隶属函数法、聚类分析和逐步回归分析方法对小麦耐热性进行综合评价。【结果】高温处理下各性状变异幅度为-14.89%—15.09%。通过对9个性状指标的相关分析,发现各指标之间存在显著或极显著相关性。通过主成分分析将9个单项指标转换为3个相互独立的综合指标,其贡献率分别为55.970%、15.530%和12.171%,代表了全部数据83.670%的信息量。利用隶属函数法计算综合耐热评价值（D）,并对其进行聚类分析,按照耐热性强弱将20个小麦品种划分为3类,第一类耐热型8个品种;第二类中等耐热型7个品种;第三类高温敏感型5个品种。通过逐步回归方程建立了小麦耐热性的评价数学模型：D=-4.801+0.834X₄+2.913X₇+0.303X₆+2.937X₈- 1.409X₁-0.524X₃+0.876X₉（R²=0.986）,利用建立的最优回归方程预测供试材料的耐热性,预测值（VP）与D值基本一致,表明SOD活性（X₄）、单穗粒重（X₇）、CAT活性（X₆）、千粒重（X₈）、冠层温度（X₁）、MDA含量（X₃）和产量（X₉）这7个指标可用于小麦耐热性品种的鉴定。【结论】采用多元统计分析方法对小麦耐热性评价是可行的;20个小麦品种被分为3类（耐热型、中等耐热型和高温敏感型）;高温处理下,SOD活性、单穗粒重、CAT活性、千粒重、冠层温度、MDA含量和产量可以作为小麦耐热性的鉴定指标。

中国东北和华北地区紫花苜蓿根瘤菌遗传多样性研究

李昕芫, 娄金秀, 刘清源, 胡健, 张英俊

中国农业科学. 2021, 54(16):  3393-3405.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.003

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【目的】紫花苜蓿（Medicago sativa L.）被誉为牧草之王,近年来,中国东北和华北地区种植面积不断扩大,但紫花苜蓿质量与产量仍不足以满足中国畜牧业发展的需求。本研究旨在分析中国东北和华北地区紫花苜蓿根瘤菌遗传多样性,为紫花苜蓿高效固氮根瘤菌的筛选与应用提供参考。【方法】采用表面消毒和平板划线法从根瘤中分离纯化根瘤菌单菌落;使用BOX-PCR方法对供试菌株进行基因型划分;选取代表菌株进行持家基因（atpD、glnII和rpoB）和共生基因（nifH和nodC）的系统发育分析。【结果】从中国东北和华北19个采样地共分离纯化了499株根瘤菌,BOX-PCR可将供试菌株分为37种BOX型,BOX型存在显著的地理分布现象,同时寄主品种对根瘤菌基因型具有一定的选择作用。97.60%（487/499）的根瘤菌为Sinorhizobium meliloti。其余12株分别为S. adhaerens、Mesorhizobium huakuii、Rhizobium loessense、R. mesosinicum、R. vignae、Mesorhizobium sp.和Phyllobacterium sp.,这12株根瘤菌仅在中国东北地区发现,华北地区根瘤菌均为S. meliloti。3个持家基因在紫花苜蓿根瘤菌种间系统发育分析结果一致,但其揭示优势种S. meliloti的种内多样性存在差异。共生基因系统发育结果显示,在根瘤菌属间和属内发生了共生基因的水平转移现象。nifH在S.meliloti种内显示出比nodC更丰富多样性。【结论】中国东北和华北地区紫花苜蓿根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,且根瘤菌存在显著的地理分布特征和寄主选择现象。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

绿洲灌区免耕一膜两年用玉米密植的水分承载潜力

张展军,杨宏伟,樊志龙,于爱忠,胡发龙,殷文,范虹,郭瑶,柴强,赵财

中国农业科学. 2021, 54(16):  3406-3416.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.004

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【目的】针对绿洲灌区资源性缺水严重,传统玉米生产模式地膜用量和耗水量大等问题,探讨通过免耕一膜两年用集成密植技术提高水分利用效率的可行性,以期为构建试区地膜减量玉米高效生产技术提供理论支撑。【方法】2017—2019年,在河西绿洲灌区设置耕作措施（传统覆膜CT,一膜两年用NT）和密度（78 000株/hm²,低;103 500株/hm²,中;129 000株/hm²,高）两因素田间试验,研究不同处理的水分利用特征和产量表现,以耗水量的多少、产量的高低和水分利用效率的大小为依据,探索在2种耕作措施下可以承载作物最大密度的土壤水分,即水分承载潜力,明确免耕一膜两年用对玉米密植的水分承载潜力。【结果】NT较CT土壤播前含水量和贮水量分别提高11.6%—14.0%和19.4%—26.0%,利于玉米密植。NT与CT相比,中、低密度玉米全生育期总耗水量无显著差异,而高密度玉米全生育期总耗水量增加了4.7%;随玉米密度增加,玉米全生育期总耗水量随之增大,但总棵间蒸发量和蒸散比随之下降;NT和CT条件下,高、中密度较低密度玉米全生育期总耗水量分别增加了10.7%、5.2%和7.4%、4.6%,即从耗水量角度讲,NT支撑玉米高密度的水分承载潜力较CT下降。密度相同时,NT和CT玉米籽粒产量差异不显著;NT条件下高、中密度较低密度产量提高了6.1%—19.0%、10.9—25.0%,CT条件下高、中密度产量较低密度提高了4.8%—5.8%、8.8%—8.9%,中密度利于玉米高产,从产量角度讲,NT较CT支撑高密度的水分承载力未下降。相同密度下,NT和CT玉米水分利用效率无差异;密度对玉米水分利用效率影响显著,NT与CT条件下,中密度较高、低密度水分利用效率分别提高9.8%—10.8%、6.3%—17.8%与5.9%—7.1%、4.3%—4.7%,中密度下水分利用效率最大,从水分利用效率角度讲2种模式都不足以承载高密度。【结论】在绿洲灌区,免耕一膜两年用与传统覆膜具有相同的通过增密获得同等籽粒产量和水分利用效率的潜力,但免耕一膜两年用玉米全生育期总耗水量较大;免耕一膜两年用结合103 500株/hm²的密度可作为绿洲灌区地膜减量和玉米高产、水分高效利用技术推广应用。

基于高光谱遥感和集成学习方法的冬小麦产量估测研究

费帅鹏,禹小龙,兰铭,李雷,夏先春,何中虎,肖永贵

中国农业科学. 2021, 54(16):  3417-3427.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.005

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【目的】利用2种灌溉处理下不同发育阶段的冬小麦冠层高光谱信息,通过机器学习方法对小麦籽粒产量进行估测精度研究,明确产量最佳估测模型,对于育种工作有着重要应用价值。【方法】以黄淮麦区207个主栽小麦品种为材料,于2018—2019和2019—2020年度连续2个生长季在河南省新乡基地的正常灌溉和节水处理下种植,并调查开花期、灌浆前期和灌浆中期的冠层高光谱数据,分别以6种机器学习方法和集成方法建立光谱指数产量估测模型。【结果】2种灌溉处理下,3个生育期各光谱指数均与产量呈极显著相关（P<0.0001）,且表现出较高的遗传力（0.61-0.85）,主要受遗传因素控制。在正常灌溉处理下,与传统机器学习方法表现最佳的模型相比,集成学习方法在3个生育期的平均决定系数(R²) 分别由0.610、0.611和0.640提高至0.649、0.612和0.675,平均均方根误差 (RMSE) 分别降低至0.607、0.612和0.593 t·hm^-2;节水处理下,3个生育期的平均R²分别由0.461、0.408和0.452提高至0.467、0.433和0.498,平均RMSE分别降低至0.519、0.559和0.504 t·hm^-2。【结论】利用集成方法将不同模型估测结果进行结合,能够有效地提高产量估测精度,2种灌溉处理下均在灌浆中期估测精度最佳,可为冬小麦育种工作中产量估测提供参考。

植物保护

假禾谷镰孢转录因子FpAPSES的鉴定与功能分析

赵静雅,夏荟清,彭梦雅,凡卓,殷悦,徐赛博,张楠,陈文波,陈琳琳

中国农业科学. 2021, 54(16):  3428-3439.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.006

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【目的】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）侵染小麦引起的小麦茎基腐病严重影响中国小麦的安全生产。查找假禾谷镰孢中的APSES转录因子,分析其在病原菌致病过程中的作用,为解析假禾谷镰孢的致病机制及小麦茎基腐病的防治提供理论依据。【方法】从GenBank获得物种中已知的APSES氨基酸序列,利用BLASTP方法在假禾谷镰孢中查找APSES同源蛋白,利用Pfam软件预测蛋白结构域,采用MEGA5.05构建APSES蛋白的系统进化树。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析A组APSES转录因子基因FpAPSES1和FpAPSES4在假禾谷镰孢侵染过程中的表达。通过PEG介导的原生质体转化和PCR筛选FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株。在PDA培养基上测定假禾谷镰孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突变体菌株的菌丝形态和生长速率;测定在CMC培养液中培养后的分生孢子产生情况、形态以及在无菌水中的萌发率;利用菌丝块和分生孢子接种小麦胚芽鞘和大麦叶片以及盆栽试验测定其致病性;采用ELISA方法测定小米培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的含量。【结果】假禾谷镰孢中有4个APSES同源蛋白,均含有保守的DNA结合结构域HTH。与其他物种的APSES蛋白构建系统进化树,发现FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4属于A组APSES,FpAPSES3分布在C组。FpAPSES1和FpAPSES4在侵染阶段诱导表达,推测可能参与假禾谷镰孢的致病。分别获得2个FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株Δfpapses1-T10、Δfpapses1-T27和Δfpapses4-T1、Δfpapses4-T2。表型测定结果显示,与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在PDA平板上的生长速率明显减慢、色素积累明显增多;FpAPSES1基因缺失突变体菌丝形态无差异,而FpAPSES4基因缺失突变体菌丝弯曲、分支明显增多;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在CMC液体中的分生孢子产生明显减少,分别比野生型下降了99.5%和97.4%,产生的分生孢子变短、隔膜减少、萌发率有所降低;与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体菌丝体和分生孢子对小麦胚芽鞘的致病力明显降低,菌丝在小麦胚芽鞘表皮细胞中的扩展明显受阻;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体对大麦叶片和小麦根部的致病力也明显降低;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在小米培养基中产生的DON毒素分别比野生型下降了约78%和44%。【结论】编码A组APSES同源蛋白的FpAPSES1和FpAPSES4对假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生和致病力均具有重要作用。

苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白基因鉴定及毒性功能分析

王程利,尹志远,聂嘉俊,林永辉,黄丽丽

中国农业科学. 2021, 54(16):  3440-3450.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.007

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【目的】CAP（Cysteine-rich secretory protein,Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1）超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种,并且参与病原菌的致病过程。本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）的CAP超家族基因并明确CAP超家族基因在病菌致病方面的作用。【方法】通过BLASTP在苹果黑腐皮壳菌全基因组中检索具有CAP保守结构域的基因;利用特异性引物对鉴定到的CAP基因进行PCR扩增和凝胶电泳检测;使用生物信息学软件和在线数据库进行蛋白序列特征和系统发育分析;利用RT-qPCR分析基因在病菌侵染过程中的表达模式;使用特异性引物扩增CAP基因上、下游片段并从PDL2质粒上扩增筛选标记基因;利用Double-joint PCR构建基因敲除盒并通过PEG介导的原生质转化技术进行基因敲除和基因回补;以遗传霉素（G418）抗性为筛选标记并利用4对引物PCR检测获得基因敲除突变体;以潮霉素（HPH）抗性为筛选标记获得基因回补菌株;通过对菌株进行培养皿内生长试验明确基因对病菌营养生长的影响;通过离体苹果枝条接种试验分析该病菌CAP超家族基因的毒性功能。【结果】在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个具有CAP保守结构域的基因,分别命名为VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c。序列特征分析发现,3个CAP蛋白均包含4个保守区：N端信号肽、N端延伸区（NTE）、CAP保守功能域和C端延伸区（CTE）。系统发育分析显示,3个CAP蛋白聚于不同的进化支,VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉（Neurospora crassa）CAP蛋白进化关系较近;VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属（Fusarium spp.）CAP蛋白的进化关系更近;VmPR1c聚于clade1,并且也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近。RT-qPCR分析结果显示,VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c在病菌侵染早期（6 h和12 h）均显著上调表达。利用PEG遗传转化技术获得VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c敲除突变体（ΔVmPR1a-7/23、ΔVmPR1b-20/31和ΔVmPR1c-26/40）;营养生长观察发现,所有敲除突变体生长表型与野生型菌株03-8均无明显差异;致病力检测发现,ΔVmPR1b-20/31致病力较野生型无明显变化,而ΔVmPR1a-7/23和ΔVmPR1c-26/40致病力较野生型显著下降。将VmPR1a和VmPR1c分别回补至ΔVmPR1a和ΔVmPR1c,回补菌株（VmPR1a/C和VmPR1c/C）致病力恢复至野生型水平。【结论】苹果黑腐皮壳菌中存在3个CAP超家族基因（VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c）,其中VmPR1a和VmPR1c是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。

贝莱斯芽孢杆菌LJ02中植物免疫蛋白的筛选及其功能

魏艳侠,李卓然,张斌,苑瑜瑾,于玮玮,常若葵,王远宏

中国农业科学. 2021, 54(16):  3451-3460.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.008

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【目的】贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LJ02菌株能够诱导黄瓜等植物产生免疫抗病反应。本研究从生防菌LJ02中分离鉴定具有激发植物免疫活性的蛋白分子,通过验证其功能,进一步解析免疫蛋白的免疫信号通路。【方法】用硫酸铵沉淀法处理LJ02菌株发酵液,离心获得LJ02蛋白粗提物,将其经凝胶层析后再利用半制备高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）分离,收集不同峰值处的蛋白组分。以烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）为靶标进行活性组分的筛选,从而获得具有免疫活性的组分。液相质谱联用仪（LC-MS）检测分析活性组分后发现,在组分F-23中含鞭毛蛋白（flagellin,Flg^LJ02）。将鞭毛蛋白Flg^LJ02进行原核表达并纯化,经过敏性坏死反应（hypersensitive reaction,HR）和抗病试验验证其免疫功能。为确定其主要免疫信号通路,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测水杨酸（salicylic acid,SA）和乙烯（ethylene,ET）途径的相关合成酶基因ICS1、PAL、ACS1以及免疫相关抗性基因NPR1、PR-1、EIN2和EIN3,通过免疫相关抗性基因的相对表达量解析鞭毛蛋白Flg^LJ02免疫信号转导途径。【结果】HPLC层析分离出贝莱斯芽孢杆菌LJ02菌液产生的60个外泌蛋白组分（F-1—F-60）,免疫烟草接种TMV后,观察分析发现组分F-20、F-23、F-41、F-44具有显著的免疫抗病效应,其中组分F-23抗TMV效果最为显著,其抑制率为81.7%。经过质谱数据分析发现该组分包含鞭毛蛋白Flg^LJ02等7种物质。选择鞭毛蛋白Flg^LJ02为研究对象构建表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达后破碎细胞,获得粗提蛋白。将粗提蛋白过柱、透析纯化后的Flg^LJ02渗入珊西烟（Nicotiana tabacum var. xanthi）叶片,24 h后能观察到过敏性坏死反应。将Flg^LJ02稀释为终浓度50、100、200 μg·mL ^-1的稀释液后预处理珊西烟叶片,24 h后接种TMV,其对TMV的枯斑抑制率分别为65.6%、76.1%、88.1%。用鞭毛蛋白Flg^LJ02处理珊西烟,其SA途径和ET信号途径的免疫抗病相关基因ICS1、PAL、NPR1、PR-1、ACS1、EIN2、EIN3的相对表达量在24—48 h均显著上调。【结论】贝莱斯芽孢杆菌LJ02外泌的鞭毛蛋白Flg^LJ02可以激发珊西烟植株的免疫防御反应,提高烟草植株对TMV的抗病性。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

锌与尿素结合对锌有效性及尿素转化的影响

赵丽芳, 袁亮, 张水勤, 赵秉强, 林治安, 李燕婷

中国农业科学. 2021, 54(16):  3461-3472.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.009

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【目的】通过研究锌与尿素以不同方式结合施用对土壤中锌有效性及尿素在土壤中转化的影响,探究氮锌相互作用机制,为锌与尿素科学配伍及养分高效利用提供科学依据。【方法】将七水硫酸锌按0.5%和5%的重量份与尿素分别进行物理掺混（U+Zn）和熔融混合（UZn）,制备含锌尿素试验产品：U+Zn0.5、U+Zn5、UZn0.5和UZn5。采用土壤培养试验,研究锌与尿素以不同方式结合施用对土壤有效锌含量、土壤酰胺态氮含量、土壤NO₃^–-N和NH₄⁺-N含量及土壤脲酶活性的影响,并结合X射线光电子能谱和核磁共振波谱分析锌与尿素不同结合方式对锌有效性和尿素转化的影响机制。试验设置8个处理：①CK（对照）,不施任何肥料;②U,施用普通尿素;③Zn0.5,单施ZnSO₄·7H₂O;④Zn5,单施ZnSO₄·7H₂O;⑤U+Zn0.5,施用含锌尿素U+Zn0.5;⑥U+Zn5,施用含锌尿素U+Zn5;⑦UZn0.5,施用含锌尿素UZn0.5;⑧UZn5,施用含锌尿素UZn5。其中,处理②、⑤、⑥、⑦和⑧的氮用量相同,处理③、⑤和⑦的锌用量相同,处理④同⑥和⑧的锌用量。【结果】（1）与单施锌肥相比,锌与尿素以物理掺混和熔融混合方式结合后施用均可提高土壤有效锌含量,且熔融混合方式对锌有效性的提高效果强于物理掺混。在0.5%水平下,锌与尿素混合施用较锌肥单施土壤有效锌含量平均提高17.3%,而熔融混合较物理掺混平均提高了10.9%;在5%水平下,锌与尿素混合施用较锌肥单施土壤有效锌含量平均提高13.1%,熔融混合较物理掺混则平均提高了12.7%;在熔融混合方式下,0.5%用量（UZn0.5）的锌固定率较5%用量（UZn5）的降低了23.93个百分点。（2）与普通尿素（U）相比,4种含锌尿素均可减缓尿素水解,其中锌与尿素熔融结合较物理掺混结合更有利于延缓尿素水解,且以0.5%的用量时二者差异达到显著水平（P<0.05）。（3）锌与尿素结合可在培养后期提高土壤NH₄⁺-N含量,以UZn0.5提高幅度最明显。与普通尿素（U）相比,U+Zn5、UZn0.5和UZn5处理在培养后期可显著提高土壤NO₃^--N含量,且UZn0.5处理提高幅度显著高于UZn5处理。（4）锌与尿素熔融混合在培养后期可提高土壤矿质态氮含量,与U处理相比,UZn0.5和UZn5处理土壤矿质态氮含量分别提高了7.6%和1.9%,且UZn0.5较UZn5处理土壤矿质态氮含量仍高出5.6%,差异达显著水平（P<0.05）。（5）锌与尿素结合在培养前期可抑制土壤脲酶活性,熔融混合较物理掺混抑制效果更强;锌与尿素熔融混合可在培养后期提高土壤脲酶活性,UZn0.5处理提高土壤脲酶活性的程度高于UZn5处理。【结论】锌与尿素结合（物理掺混、熔融混合）均可减少土壤对锌的固定,提高土壤有效锌含量,以氮锌熔融混合效果更好。锌与尿素结合能够延缓尿素水解,在培养后期提高土壤NH₄⁺-N、NO₃^–-N和矿质态氮含量,以熔融混合方式和锌添加量以0.5%效果较好。0.5%添加量的七水硫酸锌与尿素熔融混合制成含锌尿素产品,在生产中具有推广前景。

氮磷钾运筹模式对北疆滴灌棉花生长发育和产量的影响

文明, 李明华, 蒋家乐, 马学花, 李容望, 赵文青, 崔静, 刘扬, 马富裕

中国农业科学. 2021, 54(16):  3473-3487.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.010

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【目的】明确北疆滴灌棉花干物质积累及产量形成对氮磷钾综合运筹的响应特征,为节省氮肥成本提供依据。【方法】以鲁棉研24号为材料,在4种施氮量（506、402.5、299和195.5 kg·hm^-2,分别用N1、N2、N3和N4表示）和蕾期、花铃期4种不同磷钾肥运筹方式（100%+0,25%+75%,50%+50%和75%+25%,分别用PK-M1,PK-M2,PK-M3和PK-M4表示）下进行田间试验。试验期间测定棉花叶面积指数（LAI）、干物质积累、蕾花铃数量及产量等指标。【结果】在相同磷钾运筹方式下,随着施氮量的降低,LAI的Logistic模型K’值表现为先上升后下降趋势,N3比N2处理高5.1%—16.5%,快速增长起始期（t₁）和快速增长结束期（t₂）均为N3处理最晚,且N3处理快速增长期持续时间最长,N3处理比N2处理多2—12 d;N3处理生长特征值GT最高,N2处理次之,N3比N2处理高5.2%—16.7%;干物质积累量在生长前期表现为N1>N2>N3>N4处理,在生长后期表现为N2>N1>N3>N4处理;蕾花铃数在全生育期表现为N2>N3>N1>N4处理;产量相对值在各施氮处理下表现为N2处理最高,N3处理次之,N2处理比N3处理高3.6%—6.5%。在相同施氮量下,LAI的Logistic模型K’值最高为PK-M3处理,最低为PK-M1处理,PK-M3处理比PK-M1处理高20.5%—27.4%;快速增长起始期t₁(2019年除外)和快速增长结束期t₂均为PK-M3最晚,且PK-M3处理快速增长期持续时间（T）最长;PK-M3处理生长特征值（GT）最高,PK-M2处理次之,PK-M3处理比PK-M2处理高13.0%—24.5%;干物质积累量在生长前期表现为PK-M2处理>PK-M3处理>PK-M4处理>PK-M1处理,生长后期表现为PK-M3>PK-M2>PK-M4>PK-M1处理;蕾花铃数在生长前期表现PK-M4>PK-M3>PK-M>PK-M2处理,生长后期表现为PK-M3>PK-M2>PK-M4>PK-M1处理;产量相对值表现为PK-M3处理最高,比其他磷钾处理高5.2%—18.2%。所有处理中,N3PK-M3处理下LAI Logistic模型K’值和GT值最大,T最长,在吐絮期干物质积累量、相对产量值和后期蕾花铃数仅次于N2PK-M3处理,生殖器官干物质分配比例高于其他处理。相关分析表明,LAI在2018年播种后109 d以后和2019年播种后120 d以后与生殖器官干物质、干物质总量和相对产量呈极显著正相关,全生育期生殖器官个数、总干物质积累量、生殖器官干物质与相对产量均为显著或极显著正相关。所有处理中N2PK-M3产量最高,N3PK-M3处理次之,N3PK-M3相对产量仅比N2PK-M3处理降低1.5%。【结论】N3PK-M3处理与农户常规施氮量相比,减少25%的氮肥施用量仍能获得较高产量,可能是由于推迟了棉花后期LAI到达峰值的时期,延缓了LAI下降速率,提高棉花群体干物质生产能力,并促使其向生殖器官转运,且降低蕾铃脱落,保证后期铃数,为产量的形成提供物质基础。因此,本研究认为在蕾期和花铃期各分施50%磷钾肥的条件下,氮肥的施用量可以降低至299 kg·hm^-2,这比农户常规施氮降低25%,以达到减氮稳产、节本增效的目的。

园艺

苹果叶片不定芽再生过程的差异表达基因鉴定与分析

刘锴,何闪闪,张彩霞,张利义,卞书迅,袁高鹏,李武兴,康立群,丛佩华,韩晓蕾

中国农业科学. 2021, 54(16):  3488-3501.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.011

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【目的】筛选分析‘GL-3’苹果叶片不定芽再生过程中的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）,进一步解析苹果叶片不定芽再生的潜在分子机制,为提高苹果的遗传转化效率提供理论参考。【方法】‘GL-3’苹果继代组培苗叶片外植体接种在再生培养基上,分别于0、3、7、14和21 d后取样并提取RNA,构建mRNA文库后采用Illumina Nova seq平台进行测序。筛选出各时间点的DEGs,根据GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注释结果以及官方分类,使用R软件中的phyper函数对筛选到的DEGs进行GO和KEGG富集分析;利用BLAST软件进行基因比对注释;重点分析植物再生相关的激素、酶、转录因子、多胺等DEGs;采用qRT-PCR对DEGs进行定量验证。【结果】再生培养基上培养3、7、14和21 d的苹果叶片外植体与对照组相比,分别筛选到5 250、4 937、6 852、6 493个DEGs,4个时间点共有的DEGs有3 027个。DEGs的GO功能富集显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要与氧化还原过程、细胞外围、蛋白激酶活性和有机环化合物结合等功能有关;下调表达的DEGs主要与单细胞代谢过程、钙离子结合、光合膜和类囊体部分等功能有关。DEGs的KEGG通路富集分析显示,4个时间点筛选到的共有DEGs中上调表达的DEGs主要富集在磷酸戊糖途径、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用和内质网蛋白质加工等途径中;下调表达的DEGs主要富集在α-亚麻酸代谢、苯丙烷生物合成、碳代谢和光合作用等途径中。对与植物离体叶片再生相关的激素、酶、转录因子和多胺等相关DEGs的表达模式进行分析发现,这些DEGs大部分呈上调表达趋势。经qRT-PCR验证后,所检测基因的表达趋势与转录组测序结果一致。【结论】通过对苹果叶片不定芽再生过程中不同时间点的基因表达谱进行检测和对比分析,获得了大量与苹果叶片不定芽再生相关的基因,研究结果为深入探讨苹果离体叶片再生机理提供了理论依据。

荔枝果皮BPox的分离纯化及其在果实成熟过程中的表达

郭志雄,孙冷雪,郑嘉敏,蔡灿军,王蓓,李开拓,潘腾飞,佘文琴,陈桂信,潘东明

中国农业科学. 2021, 54(16):  3502-3513.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.012

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【目的】植物第III类过氧化物酶具有广泛的生理功能。前期研究发现荔枝果皮具高活性的离子结合态过氧化物酶（BPox）,与果实的着色、成熟密切关联,但其特性、作用机制不清楚。明确BPox的生化特性及其基因表达变化,为进一步研究BPox参与荔枝果实着色和成熟机制奠定基础。【方法】以‘乌叶’荔枝成熟果果皮为材料,通过提取及Streamline Phenyl、CM-52、Phenyl Sepharose HP和Superdex 200等柱层析,纯化获得BPox。测定BPox的最适反应pH、最适反应温度、底物特异性、抑制剂等生化特性。采用双倒数法测定其催化愈创木酚、(-)-表儿茶素的K_m值及V_max。应用MALDI串联质谱鉴定BPox的肽段序列,克隆BPox的cDNA。分别测定盛花后58、69、76、80和90 d荔枝果皮BPox的活性变化,应用荧光定量PCR分析BPox的基因表达变化。【结果】从荔枝果皮纯化得到BPox最主要的2个组分,分别命名为BPox-2和BPox-3。凝胶过滤层析和SDS-PAGE结果显示,BPox-2和BPox-3的表观分子量分别约为30 kD和34 kD。BPox-2和BPox-3的最适反应pH均为6.0,最适反应温度分别为40℃和45℃;二者具有相似的底物特异性;DTT、ASA和L-Cys等能强烈抑制其活性。BPox-2和BPox-3催化愈创木酚的K_m值分别为2.97和2.58 mmol∙L^-1,其V_max分别为38.72×10⁶和23.06×10⁶ U∙mg^-1;其催化(-)-表儿茶素的K_m值分别为3.49和3.24 mmol∙L^-1,V_max分别为38.72×10⁶和23.06×10⁶ U∙mg^-1。尽管BPox-2和BPox-3的肽质量指纹（PMF）不同,串联质谱分析显示,二者均具一个序列为TASLSAANSDLPSPFADLATLIAR的胰酶水解肽段。克隆得到BPox2的cDNA,大小为960 bp,共编码319个氨基酸。cDNA编码的多肽链N端包含1段26个氨基酸残基的信号肽,C端缺乏液泡分选序列,具1个潜在的N-糖基化修饰位点。幼果期,荔枝果皮BPox的活性表现弱;至盛花后76 d,果皮开始着色变红,BPox的活性迅速启动升高直至果实成熟。qPCR的结果显示,在盛花后的58和69 d,果皮BPox2的转录水平很低;盛花后76 d,BPox2的表达急剧上升,达到高峰,为盛花后69 d的60.56倍,而后下降。至盛花后90 d,其表达水平又显著上升。【结论】荔枝果皮的BPox-2与BPox-3最适反应pH、最适反应温度、底物特异性等与荔枝果皮可溶性Pox组分相似,但其对愈创木酚和(-)-表儿茶素的催化效率显著高于SPox。BPox-2与BPox-3同为BPox2所编码,因翻译后修饰差异而形成同工酶。BPox参与荔枝果皮的着色和成熟进程,其活性受转录水平调控。

基于表型性状构建传统菊花核心种质

李嘉伟,苏江硕,张飞,房伟民,管志勇,陈素梅,陈发棣

中国农业科学. 2021, 54(16):  3514-3526.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.013

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【目的】探讨构建传统菊花品种核心种质的最优取样方法并构建核心种质,以便于传统菊花种质资源的收集与保存。【方法】以《中国菊花》专著中记载的2 249份传统菊花品种为材料,依据舌状花花色分为8组,采用逐步聚类法基于4种总体取样规模(5%、10%、15%、20%)和4种组内取样比例方法(简单比例、对数比例、平方根比例、多样性比例)构建了传统菊花备选核心种质16个,探讨最优的取样策略。筛选出最优取样策略后进一步比较2种组内取样方法(随机和聚类)的构建效果。对最优方法下建立的核心种质代表性进行检验,利用多个特征值（最小值、最大值、均值、标准差、变异系数、Shannon-Weaver遗传多样性指数）和评价参数（均值差异百分率（MD）、方差差异百分率（VD）、极差符合率（CR）、变异系数变化率（VR）和表型保留比例（RPR））综合地评价核心种质。【结果】传统菊花按照花色进行分组,各组品种呈现正态分布,能够确保取样的均匀性;对数比例法和多样性比例法都能够使每组的取样份数更加均衡,起到良好的修正作用,对数比例法下构建的核心种质各项参数值达到最大,是最优取样比例法;随着总体取样规模的增加,遗传多样性指数呈现先增大再减小的趋势,变异系数变化率不断减小,极差符合率和表型保留比例不断增大;当取样规模大于10%时,遗传多样性指数和变异系数变化率减小,而极差符合率和表型保留比例的升幅并不大,因此,构建传统菊花核心种质最适宜的总体取样规模为10%;聚类取样构建的备选核心种质各项参数值均大于随机取样构建的对应备选核心种质的参数值,以聚类取样方法构建的核心种质变异的丰富性和均匀程度更好。核心种质各特征值与原始种质表现一致,多个评价参数值表明核心种质的均度和丰度较好,充分体现了表型的遗传多样性。通过补充聚类丢失的“追抱”1个花抱性状和对花序高度、外层瓣长2个性状的完善,最终构建得到228个传统菊花品种的核心种质,占原始材料的10.14%。【结论】本研究基于2 249份传统菊花品种材料的15个表型性状,系统地比较了多种总体取样规模、组内取样比例方法、组内取样方法构建的备选核心种质后,确定了最佳的核心种质构建方法,并对核心种质的代表性进行了分析和验证,各特征值和评价参数表明本研究构建的核心种质是有效的,核心种质充分地代表了传统菊花原始种质的遗传多样性。

食品科学与工程

焦磷酸钠与谷氨酰胺转氨酶对氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶性能的协同改善效应

李保玲,李颖,范鑫,马文慧,曹云刚

中国农业科学. 2021, 54(16):  3527-3536.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.014

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【目的】探究焦磷酸钠（sodium pyrophosphate,PP）、谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase,TG）及其组合（PP+TG）对氧化损伤猪肉肌原纤维蛋白（myofibrillar protein,MP）凝胶性能的影响,为改善氧化损伤蛋白的功能特性提供理论依据。【方法】从猪背最长肌中提取MP,采用亚油酸-脂肪氧合酶氧化体系诱导MP发生氧化,然后分别添加PP（1 mmol∙L^-1）、TG（E﹕S=1﹕500）及其组合（PP+TG）。采用圆二色谱探究不同添加处理对氧化损伤MP溶液二级结构的影响;通过内源性色氨酸荧光测定探究MP三级结构的变化;通过粒度、溶解度及SDS-PAGE探究不同处理对MP交联聚集情况的影响;借助物性测试仪探究MP凝胶强度的变化;采用离心法测定凝胶持水性的变化;通过分光测色计测定其白度变化;借助扫描电镜观察MP凝胶的微观结构。【结果】PP处理明显改变了氧化损伤MP的构象,使氧化MP的平均粒径明显减小、溶解度显著增强,在增强凝胶强度的同时显著提高了其持水性能（P<0.05）,凝胶的微观结构也明显比氧化损伤MP凝胶更规则、均匀、细腻和致密。TG处理显著改善了MP凝胶强度,但对其持水性能并无积极影响;凝胶的微观结构孔径变小、结构致密的同时,仍存在形状不规则、表面粗糙等问题。综合来看,PP+TG协同使用效果最好,氧化损伤MP的凝胶强度及持水性显著增强,且明显好于未氧化MP的凝胶性能。【结论】焦磷酸钠与谷氨酰胺转氨酶的协同使用可以有效改善氧化损伤MP的凝胶性能。

畜牧·兽医·资源昆虫

高山美利奴育成羊的能量与蛋白质需要量

王晨,张宏伟,王虎成,孙晓萍,李发弟,杨博辉

中国农业科学. 2021, 54(16):  3537-3548.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.015

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【目的】研究高山美利奴育成羊的能量与蛋白质需要量,为制定其饲养标准提供基础数据和理论支撑。【方法】试验选取健康、体况良好的14月龄高山美利奴育成公羊（46.50±2.12 kg）和母羊（35.75±2.31 kg）各24只作为供试动物。试验共计40 d,包括5 d过渡期,10 d预试期和25 d正试期;过渡期每天早晚饲喂燕麦干草,中午饲喂少量全混合颗粒料;预试期试验羊单栏自由采食全混合颗粒料,并记录采食量;正试期根据预试期羊只的采食量进行分组并单栏饲养,育成公羊和育成母羊各分为4组,按照自由采食（AL组）,自由采食量的80%（IR80组）,自由采食量的60%（IR60组）和自由采食量的40%（IR40组）4个水平饲喂,每组6个重复,每个重复1只羊。采用全收粪尿法于正试期最后5d连续进行消化代谢试验,在这期间准确记录并收集每只羊每天的饲料、粪和尿,并于最后2d采用呼吸面具间接测热法进行呼吸测热试验,测定其生长性能,能量利用和氮平衡指标,通过回归分析得出高山美利奴育成羊的能量和蛋白质需要量参数及预测模型。【结果】育成公羊和育成母羊的初重在各饲喂水平间无显著差异（P>0.05）。随着饲喂水平的降低,育成羊的末重、平均日增重、干物质采食量、食入总能、粪能、消化能、代谢能、能量沉积量、氮采食量、粪氮、消化氮、沉积氮、沉积氮/氮采食量和沉积氮/消化氮显著降低,即AL组>IR80组>IR60组>IR40组（P<0.05）。但饲喂水平对高山美利奴育成母羊的气体排放有显著影响（P<0.05）,IR40组的氧气消耗量和二氧化碳产生量显著低于其余3组（P<0.05）。随着饲喂水平的降低,育成公羊的总能消化率、总能代谢率和氮表观消化率显著升高（P<0.05）。高山美利奴育成公羊和育成母羊的维持净能（NE_m）需要量分别为227和213 kJ·kg^-1BW^0.75·d^-1,维持代谢能（ME_m）需要量分别为283和279 kJ·kg^-1BW^0.75·d^-1,代谢能维持利用效率（K_m）分别为0.80和0.76,当ADG为1 g·kg^-1BW^0.75·d^-1时,消化能（DE）需要量分别为760和830 kJ·kg^-1BW^0.75·d^-1,代谢能（ME）需要量分别为570和750 kJ·kg^-1BW^0.75·d^-1,净能（NE）需要量分别为290和370 kJ·kg^-1BW^0.75·d^-1。高山美利奴育成公羊和育成母羊的维持净氮需要量分别为220.8和190.4 mg·kg^-1BW^0.75·d^-1,维持净氮需要量乘以6.25即维持净蛋白（NP_m）需要量分别为1.38和1.19 g·kg^-1BW^0.75·d^-1,当ADG为1 g·kg^-1BW^0.75·d^-1时,粗蛋白（CPI）需要量分别为7.75和6.55 g·kg^-1BW^0.75·d^-1,可消化蛋白（DCP）需要量分别为6.02和4.38 g·kg^-1BW^0.75·d^-1。【结论】高山美利奴育成羊的能量和蛋白质需要量与既定的绵羊推荐值存在差异,可能是与品种、生理状况、年龄阶段和环境等因素有关。此外,本研究所建立的模型可用于估算高山美利奴育成羊的能量和蛋白质需要量。

快大型黄羽肉种鸡VD₃需要量研究

王一冰,陈芳,苟钟勇,李龙,林厦菁,张盛,蒋守群

中国农业科学. 2021, 54(16):  3549-3560.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.016

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【目的】通过研究饲粮中添加不同水平维生素D₃（VD₃）对快大型黄羽肉种鸡及其子代肉鸡生产性能、胫骨指标与钙磷代谢的影响,确立黄羽肉种鸡VD₃需要量,为黄羽肉种鸡营养需要量的制定提供科学依据。【方法】试验采用单因素随机分组设计,选用720只48周龄快大型岭南黄羽肉种母鸡,根据体重和产蛋率一致原则分为6个处理组,每组6个重复,每重复20只,各处理分别饲喂添加0（对照组）、800、1 600、2 400、3 200、4 000 IU·kg^-1 VD₃的试验饲粮,试验期8周。种鸡饲养试验结束后选取种蛋孵化,子代肉鸡按照种鸡的组别进行分组分栏饲喂（基础饲粮中含1 000 IU·kg^-1VD₃）,试验期63d。【结果】（1）与对照组相比,添加800 IU·kg^-1 VD₃显著提高平均蛋重（P<0.05）;添加1 600与3 200 IU·kg^-1 VD₃显著增加种蛋的蛋壳强度（P<0.05）;添加1 600 IU·kg^-1 VD₃增加蛋壳厚度（P<0.05）;添加4 000 IU·kg^-1 VD₃显著提高种鸡脱脂胫骨比例与骨密度（P<0.05）,添加VD₃可不同程度地提高种鸡胫骨折断力（P>0.05）;添加VD₃可提高种鸡血浆中钙、磷含量,降低AKP活性（P<0.05）。（2）种鸡饲粮添加VD₃对子代肉鸡生长性能指标无显著影响（P>0.05）;但与对照组相比,添加4 000 IU·kg^-1 VD₃显著提高子代鸡胫骨折断力（P<0.05）,添加800、1 600或4 000 IU·kg^-1VD₃显著增加子代肉鸡胫骨密度（P<0.05）,添加1 600—4 000 IU·kg^-1VD₃可不同程度地提高子代鸡脱脂胫骨比例（P>0.05）;添加VD₃提高了子代肉鸡1日龄血浆中钙、磷含量,降低AKP活性（P<0.05）,但对21、63日龄子代肉鸡无显著影响（P>0.05）。【结论】饲粮中添加VD₃显著影响黄羽肉种鸡产蛋性能、种蛋蛋壳品质、肉种鸡及其子代肉鸡胫骨指标与钙磷代谢。综合试验观测与回归模型来估测黄羽肉种鸡VD₃需要量,饲粮添加800 IU·kg^-1 VD₃即可获得最优产蛋性能,1 650—1 828 IU·kg^-1 VD₃获得最优蛋品质,而获得种鸡和子代肉鸡最优胫骨性状均需要较高的种鸡饲粮VD₃水平（4 000 IU·kg^-1）。