中国农业科学

小麦生理型雄性不育系微丝骨架和胼胝质的变化与其相关基因的表达分析

张姣，朱启迪，巨岚，张改生，于永昂，牛娜，王军卫，马守才

中国农业科学. 2015, 48(14): 2687-2696. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.001

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【目的】研究生理型雄性不育小麦花粉细胞内微丝和胼胝质的结构及其相关基因的表达，并揭示其与生理型雄性不育的关系，为进一步研究化学杂交剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育的机理提供一定的理论依据。【方法】以化学杂交剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系ms(A)-西农1376及对应正常可育系(A)-西农1376为试材，用TRITC-phalloidin标记细胞内微丝，苯胺蓝标记胼胝质，qRT-PCR技术分别对肌动蛋白解聚因子TaADF（Actin depolymerizing factor）、类葡聚糖合成酶TaGSL（Glucan synthase-like）进行差异表达分析。【结果】(1)在减数分裂前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ这三个时期，生理型雄性不育系花粉细胞的微丝结构与可育系没有显著差异：前期Ⅰ，微丝分布于整个细胞质中，细胞核区域也可见少量微丝环绕细胞核；中期Ⅰ，微丝分布在细胞质中，在形成纺锤体部位染色更深，形成纺锤体微丝，由细胞两极发出的纺锤体微丝伸向赤道板；后期Ⅰ，在向两极移动的染色体的中间部位染色较深，微丝分布较多。(2)在早末期Ⅰ，与可育系相比，不育系花粉细胞没有形成清晰且明显可见的中国灯笼状成膜体微丝结构，且在细胞中线部位亦没有清晰可见的微丝累积。(3)晚末期Ⅰ，可育系花粉细胞在形成细胞板的部位是线性的、平滑的，成膜体微丝消失，而不育系花粉细胞在形成细胞板的部位形成了很大的缝隙，同时，可育系胼胝质在细胞板处的沉积比较平滑，而不育系胼胝质在细胞板处的沉积较可育系相比缺乏，并且是褶皱的、有裂纹的。(4)四分体时期，可育系花粉可见围绕细胞核的辐射状微丝，不育系花粉细胞中微丝呈模糊状态，并且不育系中胼胝质染色的整体荧光强度较可育系减弱。利用实时荧光定量PCR技术分析肌动蛋白解聚因子TaADF和类葡聚糖合成酶TaGSL在减数分裂期的相对表达量，结果发现，不育系中TaADF的相对表达量是可育系的4.28倍，由于TaADF表达量上调，加剧了细胞内微丝解聚，微丝结构受到破坏，同时不育系中TaGSL表达量下降，只有可育系的0.83倍，胼胝质的沉积也受到影响。【结论】TaADF在不育系中上调表达，破坏了细胞内微丝的正常结构，使微丝不能正常行使其功能，进而可能导致花药发育中与育性相关的某些代谢通路等受到影响。与此同时，微丝结构的破坏导致细胞板形成出现异常也可能是引起胼胝质在细胞板处沉积受到影响的一个重要原因。因此，微丝和胼胝质的异常变化与化学杂交剂SQ-1诱导的生理型雄性不育密切相关。

西南地区玉米地方品种B染色体多态性分析

姚启伦，陈发波，刘红芳，方平，赵彩芳

中国农业科学. 2015, 48(14): 2697-2704. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.002

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【目的】分析B染色体形态及数量多态性，从细胞水平评价西南地区玉米地方品种的遗传多样性，为中国玉米引进途径提供佐证。【方法】以来自西南地区四川、重庆、云南和贵州4省（市）的30个玉米地方品种群体为材料，各品种群体取50个单株，各单株统计镜检10个细胞，共统计镜检15 000（30 × 50 × 10）个细胞，在光学显微镜下进行B染色体细胞学鉴定；各品种群体取10个单株，制作10张染色体制片，采用改良的Giemsa染色法进行染色体C-带显带分析。【结果】细胞学鉴定结果表明，除10对常染色体外，西南地区玉米地方品种还存在3类形态的B染色体：中间着丝点B染色体（B_M）、近端着丝点B染色体（B_ST）和呈点状的微小B染色体（B_S），B_M形态上与玉米的第1染色体相似，B_ST与B_M大小相近，B_S呈圆点状，无可见着丝点。在来自四川的7个玉米地方品种群体中检测到B_M、B_ST和B_S3类B染色体，在重庆玉米地方品种群体中检测到B_M和B_ST、B_ST和B_S存在于云南玉米地方品种群体，而在来自贵州的9个玉米地方品种群体中仅检测到1类B染色体（B_ST）。B_M、B_ST和B_S的平均长度分别为2.82、2.78和0.9 µm，与第1常染色体比较，它们的平均相对长度分别为43%、45%和15%，相对长度变幅分别为34%—52%、32%—58%和13%—18%，B_M、B_ST和B_S的平均臂比分别为1.19、1.98和1.00。在供试的30个品种群体中有18个含B染色体，分别有7个、5个、4个和2个来自四川、重庆、云南和贵州，在含B染色体的18个群体中有421个单株含B染色体，421个单株中共存在487条B染色体，具有B染色体植株的频率变幅为0—90%，平均频率为29.6%，四川玉米地方品种在群体和个体水平上表现较高的B染色体频率。细胞内B染色体数最多2个，绝大多数细胞不含B染色体，0B类、1B类和2B类细胞的平均频率分别为97.04%、2.81%和0.15%。B_ST是玉米地方品种B染色体的主要类型，占B染色体总数的比率为67%，其次是B_M（19%），B_S比率最低（14%），表明B_ST是原始的B染色体，B_M和B_S是B_ST的变异类型，B_M和B_S在较小的时间和空间尺度上形成与演化。Giemsa染色显示，B_M和B_ST富含GC、高度异染色质化，在染色体结构上二者共享部分同源DNA序列，形态上与A染色体区别明显。0B类、1B类和2B类细胞A染色体平均C-带数变幅分别为11.0—20.6、10.8—19.4和10.5—18.6，玉米地方品种B染色体数与A染色体C-带数负相关。【结论】西南地区玉米地方品种在细胞水平上表现较高的遗传多样性，其B染色体具有形态和数量多态性，由B染色体分布所决定的西南地区玉米地方品种的地理中心是四川省。

超级杂交籼稻抗倒能力比较及其对氮素的响应

吴晓然，张巫军，伍龙梅，翁飞，李刚华，刘正辉，唐设，丁承强，王绍华，丁艳锋

中国农业科学. 2015, 48(14): 2705-2717. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.003

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【目的】比较不同抗倒性超级杂交籼稻抗倒伏性差异及其原因，并分析氮素影响超级杂交籼稻抗倒性的生理机制，以期为水稻高产抗倒伏品种选育与栽培管理提供依据。【方法】以超级杂交籼稻Y两优2号（抗倒伏品种）和Ⅱ优084（易倒伏品种）为材料进行大田试验，2012年设置0、150和300 kg·hm^-2 3个氮肥水平，2013年设置135、270和405 kg·hm^-2 3个氮水平，比较不同处理倒伏发生率，并从力学、形态学和生理学指标等方面分析倒伏差异的原因。【结果】Y两优2号产量达11.7 t·hm^-2，较Ⅱ优084高9.45%。这主要归因于Y两优2号较高的穗粒数及颖花量，二者分别较Ⅱ优084高28.0%和31.8%。与Ⅱ优084比较，Y两优2号成熟期田间倒伏率明显减少，倒伏指数下降19.0%，差异达显著水平，原因是Y两优2号基部节间显著缩短，茎壁明显增厚，叶鞘单位长度干重显著提高，从而弥补了茎秆粗度方面的劣势；其基部节间单位长度茎干重虽略有降低，但结构性碳水化合物含量较高，导致茎秆弯曲应力和折断弯矩显著增加，抗倒伏性提高。随施氮量增加，超级杂交籼稻基部节间茎秆折断弯矩显著降低，导致倒伏指数显著上升。大幅增加氮肥水平显著降低了抽穗期单茎鞘干重和灌浆后期基部节间单位长度叶鞘干重，从而使得茎秆质量变劣，且叶鞘对茎秆的保护和支持能力降低；此外，基部节间茎、鞘中木质素含量明显降低，茎秆弯曲应力和折断弯矩随之下降，倒伏风险增加。Ⅱ优084在较低的施氮水平下，折断弯矩大幅降低，甚至低于Y两优2号高氮水平，导致倒伏指数明显上升，尽管增加氮素用量未能显著增加其倒伏率，却较大幅度地降低了产量。【结论】缩短基部节间长度，增加茎壁厚度以弥补茎秆粗度不足的劣势，增加叶鞘充实程度，提高对茎秆的保护和支撑作用，是增强超级杂交籼稻茎秆机械强度和抗倒伏性的主要途径。氮素主要通过降低基部节间叶鞘充实程度及茎秆中结构性碳水化合物含量，特别是木质素的含量，从而降低茎秆强度，增加倒伏风险。

河北省10 000 kg·hm^-2以上冬小麦产量构成及群个体生育特性

王红光，李东晓，李雁鸣，李瑞奇

中国农业科学. 2015, 48(14): 2718-2729. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.004

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【目的】探索河北省小麦超高产水平从9 000 kg·hm^-2向10 000 kg·hm^-2突破的途径，明确河北省10 000 kg·hm^-2以上超高产小麦的产量结构特点和各个生育时期的群体、个体特征，以及适宜的生态条件，为进一步开展可稳定实现10 000 kg·hm^-2以上产量的河北省小麦超高产栽培技术体系的研究提供理论依据。【方法】于2010—2014年4个小麦生长季，在高产大田设置不同品种、氮肥基追比和追氮时期处理，结合其他超高产栽培技术措施，进行小麦超高产攻关研究。将4个生长季籽粒产量9 000 kg·hm^-2以上的处理分为9 000—9 500、9 500—10 000和10 000 kg·hm^-2以上3个水平，分析小麦产量从9 000 kg·hm^-2提高到10 000 kg·hm^-2以上，产量结构和各个生育时期群个体性状的变化，并结合土壤肥力数据和气象数据分析实现10 000 kg·hm^-2以上产量适宜的生态条件。【结果】通过3个产量水平处理的比较，河北省小麦产量从90 00 kg·hm^-2提高到10 000 kg·hm^-2以上，公顷穗数变化较小，穗粒数在30—35粒的概率较大，粒重显著提高。产量水平从9 000—9 500 kg·hm^-2提高至9 500—10 000 kg·hm^-2时，干物质积累量明显增加，进一步提高至10 000 kg·hm^-2以上时收获指数有所提高。穗数800万/hm²、穗粒数在30—35粒、千粒重43 g以上、成熟期干物质积累量22 000 kg·hm^-2、收获指数为0.46是河北省10 000 kg·hm^-2以上超高产小麦比较理想的产量结构和调控指标。10 000 kg·hm^-2以上产量水平的小麦旗叶和倒2叶叶面积均小于20 cm²，孕穗期叶面积指数为7.69—8.24，均低于9 000—9 500 kg·hm^-2产量水平，但花后20 d叶面积指数在4以上，花后30 d在2以上，均高于后者。小麦产量从9 000 kg·hm^-2到10 000 kg·hm^-2以上，土壤基础肥力和施肥量变化较小，生育期降水量和灌水量也未增加，但小麦全生育时期特别是开花至成熟阶段的积温和光照时数均有所增加。【结论】河北省实现小麦产量从9 000 kg·hm^-2到10 000 kg·hm^-2的突破，公顷穗数的增产潜力较小，提高穗粒数和粒重应作为主攻方向。大小适中、后期衰老缓慢的高质量群体是实现10 000 kg·hm^-2超高产的保证，较高的基础肥力以及积温和光照较好的年型是实现10 000 kg·hm^-2超高产的基础。

渭北旱塬麦田保护性轮耕方式的产量和土壤水分效应长周期模拟研究

张玉娇，李军，郭正，岳志芳

中国农业科学. 2015, 48(14): 2730-2746. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.005

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【目的】渭北旱塬是中国北方典型雨养旱作农区，干旱缺水是当地粮食生产主要限制因素，降水偏少且季节分布不均，制约着旱地冬小麦生长及发育，导致其产量低而不稳。研究旨在探索长周期下渭北旱塬连作冬小麦区在不同轮耕措施下麦田的土壤蓄水保墒和作物增产效应。【方法】在模拟精度验证基础上，应用WinEPIC模型长周期定量模拟研究了1980—2009年渭北旱塬连作麦田连续翻耕、免耕/深松轮耕、翻耕/深松轮耕、免耕/免耕/深松轮耕和免耕/翻耕/深松轮耕不同保护性轮耕方式下冬小麦产量和土壤水分效应。【结果】在30年模拟研究期间，随着降水量的逐年趋势性减少，不同轮耕方式下渭北旱塬冬小麦产量、年度耗水量以及水分利用效率均呈现波动性下降趋势；免耕/深松、翻耕/深松、免耕/免耕/深松和免耕/翻耕/深松轮耕处理产量较连续翻耕处理分别高14.4%、12.2%、2.4%和3.2%，以免耕/深松轮耕处理产量最高，30年平均值为3.53 t×hm^-2；免耕/深松、翻耕/深松、免耕/免耕/深松和免耕/翻耕/深松轮耕处理水分利用效率较连续翻耕处理分别高6.36%、6.13%、6.40%和6.41%，以免耕/免耕/深松轮耕和免耕/翻耕/深松轮耕处理水分利用效率最好，30年平均值为8.68 kg×hm^-2×mm^-1；与连续翻耕处理相比，干旱年型免耕/深松、翻耕/深松、免耕/免耕/深松耕和免耕/翻耕/深松轮耕处理耗水量明显增加，平水年型和丰水年型各耕作处理间耗水量差异不显著，以免耕/深松轮耕处理麦田耗水量高于其他轮耕方式。冬小麦田0—3 m土层土壤有效含水量呈现季节性波动降低趋势；与连续翻耕处理相比，免耕/深松轮耕、翻耕/深松轮耕、免耕/免耕/深松轮耕和免耕/翻耕/深松轮耕处理麦田土壤有效含水量分别高28.7%、27.2%、26.8%和26.7%；免耕/深松轮耕处理蓄水保墒效果最好，0—3 m土层土壤有效含水量平均为107.1 mm，翻耕/深松轮耕和免耕/翻耕/深松轮耕次之，连续翻耕最差。麦田0—1 m土层土壤湿度随季节降水而上下波动性变化，在降水较多或者较为干旱的年份1—1.5 m土层土壤湿度也会发生变化，1.5—3 m土层土壤湿度较为稳定，不同轮耕处理间差异不大；免耕/深松轮耕土层土壤湿度较其他耕作处理稍高。【结论】与连续翻耕处理相比，翻耕/深松产量和土壤蓄水保墒效果较好，但水分利用效率稍低。免耕/免耕/深松和免耕/翻耕/深松轮耕处理水分利用效率和土壤蓄水保墒效果较好，但产量较低。综合考虑麦田产量和水分利用效率以及土壤蓄水保墒效果，在长期连作冬小麦田，免耕/深松轮耕处理为渭北旱塬麦田最适宜保护性轮耕模式。

大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系的建立

王新艳，张丹丹，桂月晶，李楠洋，徐明，陈捷胤，戴小枫

中国农业科学. 2015, 48(14): 2747-2756. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.006

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【目的】建立适合于大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）致病性相关突变体的快速筛选体系，为突变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于5.0×10⁴、5.0×10⁵、5.0×10⁶、5.0×10⁷和5.0×10⁸孢子/mL的孢子悬浮液30 min，通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌浓度范围；对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35和45 mL的灭菌水，利用血球计数板检测洗脱的孢子浓度，明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响；以保存于96孔板的突变体为单位，在培养皿上进行单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养，培养后于培养瓶中直接加入适宜体积灭菌水洗脱孢子，并将棉花幼苗直接置于含有孢子悬浮液的培养瓶中处理30 min，接种后继续培养14 d并调查结果；致病性相关突变体的可靠性检验采用定量菌液蘸根接种法，每个突变体接种30株棉花幼苗，3个重复，孢子浓度为5.0×10⁶孢子/mL，每株棉花幼苗按接种5 mL菌液计算，处理30 min，分别在第5、8、11和14天调查病情指数。【结果】明确了适合于大丽轮枝菌致病力快速鉴定的接种孢子浓度为＞5.0×10⁵孢子/mL；建立了大丽轮枝菌培养方法，单孢纯化培养5 d，培养瓶中扩大培养9 d，确定了快速定量制备孢子悬浮液的洗脱体积为25 mL，测试的20个突变体的洗脱孢子浓度范围在（2.55±0.58）×10⁶—（1.72±0.25）×10⁷孢子/mL；优化了单孢分离、扩大培养、孢子悬浮液制备、接种、继续培养和结果统计等环节，建立了大丽轮枝菌致病性快速鉴定流程，进一步统筹设计构建了大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系；测试表明该体系1人1个循环共7个流程可完成1 344个突变体筛选，周期54 d，工作量为21人日；采用定量菌液蘸根法重复验证结果，突变体致病力同样显著下降，与快速筛选体系的鉴定结果一致，表明该体系适用于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选。【结论】通过棉花幼苗种植、突变体单孢分离、扩繁培养、孢子悬浮液制备、接种、结果统计等环节的优化和标准化，构建了适合于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选体系，为后续致病相关基因的分离提供了技术支撑。

基于FDA-PI双荧光复染法的茄病镰刀菌孢子活性检测

柴阿丽，韩云，武军，石延霞，谢学文，李宝聚

中国农业科学. 2015, 48(14): 2757-2766. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.007

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【目的】茄病镰刀菌（Fusarium solani）孢子活性的检测是病害有效防控的基础。传统的孢子萌发法操作复杂，耗时费力，需要建立一种简便、快速的孢子活性检测方法。研究旨在建立基于荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate，FDA）-碘化丙啶（propidium iodide，PI）双荧光复染法和流式细胞术（flow cytometry，FCM）的茄病镰刀菌孢子活性检测技术。【方法】通过测定FDA和PI的最佳染色时间和最佳工作浓度，建立茄病镰刀菌孢子活性检测的FDA-PI复染法。为评价该方法的准确性，一方面用FDA-PI法检测已知死孢子比例（0、25%、50%、75%、100%）的茄病镰刀菌样品，分析实测死亡率和理论死亡率的相关性；另一方面，经物理、化学和杀菌剂处理后，比较FDA-PI复染法和孢子萌发法的检测结果。【结果】确定了FDA和PI的最佳染色参数，其中PI的最佳工作浓度为3 µg·mL^-1，最佳染色时间为4℃处理10 min；FDA的最佳工作浓度为100 µg·mL^-1，最佳染色时间为25℃处理20 min。用该技术检测已知死孢子比例样品，各样品实测孢子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关（R²=0.99，P＜0.05）。经物理和化学处理后，FDA-PI复染法测得的孢子死亡率与孢子萌发法测得的孢子萌发率之间也呈显著负相关（R²=0.99，P＜0.05）。经杀菌剂处理后，随着药剂浓度增高，对茄病镰刀菌杀灭效果增强。其中，氰胺化钙处理后，FDA-PI复染法和孢子萌发法检测孢子死亡率结果一致；而咯菌腈和多菌灵处理后，FDA-PI复染法检测孢子死亡率略低于孢子萌发法检测结果。【结论】建立了基于FDA-PI复染法和流式细胞术的茄病镰刀菌孢子活性检测技术，该技术可以替代传统的孢子萌发方法，大幅度缩减病原菌活性检测时间，提高检测效率，对植物病原真菌活性检测平台的建立具有重要的参考价值，将其应用于杀菌剂的筛选还需要进一步的深入研究。

玉米大斑病菌黑色素合成酶基因的全基因组定位及表达模式分析

贾慧，孟庆江，李志勇，巩校东，藏金萍，郝志敏，曹志艳，董金皋

中国农业科学. 2015, 48(14): 2767-2776. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.008

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【目的】确定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）黑色素合成酶基因StPKS、St3HNR、St4HNR、StSCD、StLAC1、StLAC2在基因组中的位置和基因结构，分析黑色素合成途径中6个合成酶基因在玉米大斑病菌侵染过程中从分生孢子萌发至穿透不同时期及菌丝生长时期的表达模式，明确6个基因与病菌发育和致病的关系。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库，通过Blastp相似性搜索，鉴定6个基因在基因组中的定位，解析在基因组中的串联分布情况；收集玉米大斑病菌从分生孢子萌发到侵染的不同时期及菌丝生长时期的菌体材料，提取总RNA，以β-tubulin作为内参基因，根据黑色素合成6个关键酶基因序列设计引物，采用qRT-PCR技术检测基因的表达模式，对比病菌在营养生长和生殖生长时期的表达情况。【结果】在基因组数据库中，玉米大斑病菌黑色素合成酶基因StPKS、St3HNR分别位于scaffold_12的正链和负链上，St4HNR、StLAC2位于scaffold_11的负链上，StSCD位于scaffold_1正链上，StLAC1位于scaffold_7正链上，且StPKS和St3HNR在基因组中串联分布在26.9 kb范围内；6个基因的相对表达量在分生孢子诱导萌发到穿透过程的5个时期中呈上调-下调-上调或上调-下调-上调-下调两种模式；分生孢子时期，StLAC2表达量最高，明显高于其他基因，差异极显著；菌丝生长时期，St3HNR、StSCD表达量最高，明显高于其他基因，差异极显著。【结论】玉米大斑病菌6个黑色素合成酶基因中StPKS和St3HNR在基因组中位置邻近，串联在26.9 kb范围内；6个基因从分生孢子萌发至侵染的5个时期均有表达，表达量存在显著差异，但各基因的表达模式相似，说明6个基因参与了玉米大斑病菌的侵染过程，在玉米大斑病菌的致病方面具有重要作用；同时在菌丝生长时期St3HNR和StSCD发挥的作用更明显，分生孢子时期StLAC2更活跃。

铵态氮及硝态氮配比对香蕉幼苗氮素吸收动力学特征的影响

张超一，樊小林

中国农业科学. 2015, 48(14): 2777-2784. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.009

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【目的】探究不同铵硝配比条件下香蕉幼苗对铵态氮、硝态氮两种形态氮素的吸收特性以及两种氮源离子相互作用对香蕉氮素吸收动力学特征的影响，筛选最适于香蕉氮素吸收利用的铵硝配比，为香蕉氮素营养高效吸收提供理论依据。【方法】依据养分吸收动力学原理，利用改进的耗竭法研究不同铵硝配比营养液中巴西品种香蕉（Musa AAA Giant Cavendish cv. Brazil）幼苗对铵态氮、硝态氮以及总氮的吸收动力学特征。设7个处理：100%铵态氮（100%A）、90%铵态氮+10%硝态氮（90%A+10%N）、70%铵态氮+30%硝态氮（70%A+30%N）、50%铵态氮+50%硝态氮（50%A+50%N）、30%铵态氮+70%硝态氮（30%A+70%N）、10%铵态氮+90%硝态氮（10%A+90%N）和100%硝态氮（100%N）。每个处理设9个氮浓度梯度：0、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4 mmol·L^-1。【结果】不同铵态氮﹕硝态氮配合条件下，香蕉苗吸收铵态氮、硝态氮及总氮的规律均符合Michaelis-Menten酶动力学方程，其动力学方程达到极显著水平。NH₄⁺-N比例在10%—70%时，随着NO₃^--N比例的增加，可以增加香蕉幼苗对NH₄⁺-N的吸收速率。在NH₄⁺-N比例为70%时，NH₄⁺-N的最大吸收速率（Vmax）最大，为55.56 μmol·g^-1·h^-1，NH₄⁺-N比例超过70%会降低香蕉幼苗对NH₄⁺-N的吸收速率。香蕉幼苗对NO₃^--N的吸收速率呈现随营养液NH₄⁺-N比例的增加而显著降低的规律。NH₄⁺-N比例从10%增大到90%时，NO₃^--N的Vmax降低了2.62倍，增加NH₄⁺-N的比例明显抑制香蕉幼苗对NO₃^--N的吸收。铵硝配比对香蕉根系与NH₄⁺-N和NO₃^--N的亲和力影响无明显规律。在铵硝配比为3﹕7时香蕉总氮Vmax达到83.33 μmol·g^-1·h^-1，明显高于其他处理，最有利于香蕉吸收利用氮素。【结论】NH₄⁺-N比例低于70%时，增加NO₃^--N比例可以促进香蕉幼苗对NH₄⁺-N的吸收，NH₄⁺-N比例高于70%时，增加NO₃^--N比例抑制NH₄⁺-N的吸收。增加NH₄⁺-N的比例明显抑制香蕉幼苗对NO₃^--N的吸收，铵硝配比为3﹕7最有利于香蕉吸收利用氮素。

还田玉米秸秆氮释放对关中黄土供氮和冬小麦氮吸收的影响

黄婷苗，郑险峰，王朝辉

中国农业科学. 2015, 48(14): 2785-2795. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.010

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【目的】在陕西关中冬小麦-夏玉米轮作区，研究还田玉米秸秆的氮释放对土壤供氮和冬小麦氮吸收的影响，为优化区域秸秆还田的小麦氮素管理提供理论依据。【方法】田间试验于2012年10月至2013年5月在陕西省周至县终南镇进行，冬小麦播种后，在小麦行间填埋装有风干玉米秸秆的尼龙网袋，采用网袋法与¹⁵N同位素交叉标记还田玉米秸秆和氮肥，在秸秆还田条件下，设置不施氮和施氮200 kg N·hm^-2两个处理，重复4次，定期取样测定网袋中剩余秸秆的氮素变化和收获期小麦不同器官的氮含量，研究小麦生长季还田玉米秸秆的氮素释放，秸秆氮和肥料氮的去向，及不同来源的氮素对小麦地上部氮吸收的贡献。【结果】残留在玉米秸秆中的总氮量从小麦播种到越冬前降低，此后到返青期上升，返青期后又逐渐下降。从播种至收获，不施氮和施氮量200 kg N·hm^-2时，秸秆自身氮素的释放量分别为19.7和18.3 kg·hm^-2，吸持的土壤氮为10.4和7.5 kg·hm^-2；吸持肥料氮（施氮时）为3.6 kg·hm^-2，因此秸秆向土壤净释放的氮素分别为9.4和7.2 kg·hm^-2。小麦收获期，不施氮和施氮200 kg N·hm^-2时分别有65.1%和67.7%的秸秆氮残留在未腐解的秸秆中，31.5%和30.4%随着秸秆腐解释放进入土壤或损失，小麦当季吸收利用的秸秆氮很少，分别为3.4%和1.9%。秸秆还田条件下，施氮量为200 kg N·hm^-2时，经吸收进入小麦地上部、残留于土壤及损失、被玉米秸秆吸持的肥料氮分别占施入土壤肥料氮总量的25.0%、73.2%和1.8%。土壤氮对小麦当季氮吸收的贡献最大，肥料氮次之，秸秆氮的贡献最小，不施氮与施氮时，分别为98.3%和69.2%、0和30.1%，1.7%和0.6%。小麦吸收的土壤、肥料和秸秆氮素主要分配在小麦籽粒中，不施氮与施氮时分别为98.1%和68.8%、0和30.5%、1.9%和0.7%。【结论】在陕西关中冬小麦-夏玉米轮作区，种植一季小麦后，还田秸秆氮主要残留在田间未腐解的秸秆中，占65%以上；肥料氮以残留于土壤或损失为主，高于70%；土壤氮对小麦氮吸收的贡献最大，约为70%。

苹果风味评价指标的筛选研究

郑丽静，聂继云，李明强，康艳玲，匡立学，叶孟亮

中国农业科学. 2015, 48(14): 2796-2805. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.011

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【目的】筛选适宜的苹果风味评价指标，为构建苹果风味评价指标体系和苹果风味科学评价奠定基础。【方法】测定132个苹果样品的6项风味指标：用酸度计测定pH，用全糖仪测定可溶性固形物含量，用斐林试剂滴定法测定可溶性糖含量，用指示剂滴定法测定可滴定酸含量，用口尝鉴评法进行风味鉴评，固酸比用可溶性固形物含量与可滴定酸含量的比值表示，糖酸比用可溶性糖含量与可滴定酸含量的比值表示。利用水平分析、回归分析、聚类分析、因子分析等数理统计分析方法，明确各指标的水平及其分布、指标间的变化趋势和定量关系，筛选出适宜的苹果风味评价指标，并进行苹果风味评价与分类。【结果】（1）苹果品种间pH、可溶性固形物含量和可溶性糖含量差异均较小，变异系数分别为8.5%、10.7%和10.6%，可滴定酸含量、固酸比和糖酸比差异均很大，变异系数分别高达45.1%、64.9%和66.5%，可溶性固形物含量和可溶性糖含量均服从正态分布，概率值P分别达0.6241和0.6298，pH、可滴定酸含量、固酸比和糖酸比均呈偏态分布。（2）pH、固酸比和糖酸比均与可滴定酸含量呈极显著负相关，相关系数分别为-0.8810、-0.8117和-0.8116；pH与固酸比和糖酸比间、可溶性糖含量与可溶性固形物含量间、糖酸比与固酸比均呈极显著正相关，相关系数分别为0.8650、0.8507、0.8794和0.9959。（3）pH与可滴定酸含量存在极显著的对数函数变化趋势，其决定系数R²为0.8522，可溶性固形物含量与可溶性糖含量、糖酸比与固酸比均存在极显著的线性变化趋势，相关系数R分别为0.8793和0.9959；固酸比和糖酸比均与可滴定酸含量存在极显著的幂函数变化趋势，其决定系数R²分别为0.9590和0.9638。（4）研究的6项苹果风味指标中，除可滴定酸含量外，其余5项指标均存在关于其他5项指标的多元线性模型，各方程的决定系数R²均接近或超过0.9，甚至接近1，且拟合精度和预测精度极高，平均拟合误差仅为1.88%—2.74%，平均预测误差仅为1.83%—2.59%，能够用于相应指标的准确预测；可滴定酸含量的回归方程决定系数R²仅为0.8122，且平均预测误差和平均拟合误差均在20%左右，拟合精度与预测精度均较低，不能用于可滴定酸含量的准确预测。（5）确定苹果风味评价指标由可滴定酸含量、可溶性固形物和固酸比（分别代表酸味指标、甜味指标和综合风味指标）构成，利用该3项指标可将132个苹果样品分为甜、酸甜、酸甜适度、甜酸和酸5类。【结论】苹果风味评价指标以可滴定酸含量、可溶性糖含量和固酸比为宜，所筛选出的3项指标可用于苹果风味的科学评价与分类。

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

肖蓉，罗慧珍，张小娟，邓舒，张春芬，任莹，孟玉平，曹秋芬，聂园军

中国农业科学. 2015, 48(14): 2806-2817. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.012

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【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能，为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析，预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性，并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX，运用农杆菌介导法，将ZjGPX转入拟南芥，对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理，验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp，编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明，在辣椒枣组培苗中，ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达，且反应迅速，仅胁迫15 min，其相对表达量与对照相比即出现大幅升高，暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察，共获得10株阳性转基因拟南芥株系，干旱及盐胁迫处理结果显示，转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥；成株在胁迫15 d后，野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象，而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用，过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。

真空与乳酸钙处理对双孢蘑菇采后贮藏品质的影响

陈丽娟，王赵改，杨慧，张乐，王晓敏，史冠莹

中国农业科学. 2015, 48(14): 2818-2826. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.013

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【目的】研究不同浓度乳酸钙溶液对双孢蘑菇采后贮藏品质的影响，并引入真空促渗技术，为双孢蘑菇采后减损提供基础理论依据，并为优化双孢蘑菇贮藏条件提供技术支持。【方法】以‘4607’双孢蘑菇品种为试材，研究乳酸钙溶液浓度（0.016、0.032、0.048和0.064 mol·L^-1）、真空度（0.01、0.03、0.05、0.07和0.09 MPa）、处理时间（0.5、1、2、3和5 min）等单因素对低温贮藏（2±1）℃双孢蘑菇白度的影响；同时对处理条件进行正交优化，运用色差仪和CO₂分析仪等设备，分析最佳处理条件下的双孢蘑菇在贮藏期间生理生化指标及品质变化。【结果】在单因素条件下，筛选出合适的乳酸钙溶液浓度为0.032 mol·L^-1和0.048 mol·L^-1，真空度为0.05 MPa，处理时间为1—2 min；正交优化的最佳处理条件是乳酸钙浓度0.048 mol·L^-1，真空度0.05 MPa，真空度处理时间2 min；在最佳处理条件的贮藏期内，相较于空白对照组，乳酸钙处理组和乳酸钙真空渗透组均可有效减缓双孢蘑菇生理生化指标变化及保持较好品质，但是，在一些指标上，乳酸钙真空渗透组显著优于乳酸钙处理组。与乳酸钙处理组相比，在0—9 d，白度值降低不显著（P＞0.05），在9—15 d，乳酸钙真空渗透处理组效果优于乳酸钙处理组（P＜0.05）。乳酸钙处理组和乳酸钙真空渗透处理组的双孢蘑菇均在第6 天达到呼吸高峰，将呼吸高峰推迟了3 d，但乳酸钙真空渗透处理组呼吸强度显著低于乳酸钙处理组（P＜0.05）。乳酸钙真空渗透处理组的失重率低于乳酸钙处理组，但两者无显著性差异（P＞0.05）。乳酸钙处理组和乳酸钙真空渗透处理组，从贮藏第6 天之后分别有开伞现象明显增加和开始开伞，在6—15 d，乳酸钙真空渗透处理组显著低于乳酸钙处理组（P＜0.05）。乳酸钙处理组和乳酸钙真空渗透处理组均可有效抑制膜透性的增大，在3—15 d，乳酸钙真空渗透处理组效果优于乳酸钙处理组（P＜0.05）。乳酸钙真空渗透处理组的双孢蘑菇丙二醛（MDA）积累量处于较低水平，低于乳酸钙处理组（P＜0.05）。乳酸钙真空处理组在0—6 d，多酚氧化酶（PPO）活性处于较低水平，与乳酸钙处理组不显著（P ＞0.05），在6—15 d，与乳酸钙处理组差异显著（P＜0.05）。【结论】乳酸钙真空渗透处理可有效保持双孢蘑菇白度，抑制呼吸强度、减弱开伞率和失重率，降低细胞膜透性、MDA积累量和PPO活性。真空渗透技术可辅助用于双孢蘑菇保鲜处理，较好地保持双孢蘑菇贮藏品质。

放牧与舍饲条件下山羊肌肉发育和抗氧化能力变化研究

黄金玉，焦金真，冉涛，汤少勋，康劲翮，谭支良

中国农业科学. 2015, 48(14): 2827-2838. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.014

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【目的】探究在放牧、舍饲条件下幼龄山羊肌肉品质及抗氧化能力的发育性变化。【方法】选择体况良好、体重相近的经产湘东黑山羊母羊25头，进行同期发情处理，怀孕后产羔，获得36头羔羊，不记公母。出生后20 d内所有羔羊均仅喂以母乳。在0、7、14 d，每个时间点分别随机选取4头屠宰；21 d时，将剩余的24头羔羊随机分为放牧组和舍饲组，每组12头，除母乳外，放牧组以牧草为食，舍饲组补给精料及与放牧组相同的牧草，40 d断奶；在42、56、70 d时，两组每个时间点分别随机选取4头进行屠宰。称量宰前活重、胴体重，采集背最长肌，测定肌肉中粗蛋白（CP）、肌内脂肪（IMF）、氨基酸（AA）、脂肪酸（FA）的组成和含量及主要抗氧化酶活性，包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽（GSH）和总抗氧化能力（T-AOC）。【结果】（1）羔羊宰前活重、胴体重随日龄显著增加（P＜0.05），相较于舍饲羊，放牧羊宰前活重较低（P＞0.05），但胴体重较高（P＞0.05）。（2）无论是放牧还是舍饲，肌肉干物质中CP水平随日龄呈线性增加趋势（P＜0.05），IMF含量呈升高趋势（P＞0.05）；相较于舍饲羊，放牧羊CP水平较低（P＞0.05），IMF含量明显较高（P＜0.05）。（3）肌肉中氨基酸总量（TAA）、成人必需氨基酸（AEAA）、婴儿必需氨基酸（BEAA）在不同日龄间没有显著差异（P＞0.05），但TAA随日龄有升高趋势（P＞0.05），鲜味氨基酸（FAA）随日龄呈显著增加趋势（P＜0.05）；相较于舍饲羊，放牧羊TAA、AEAA、FAA含量较低，BEAA则较高，但均差异不显著（P＞0.05）。（4）肌肉中饱和脂肪酸（SFA）在放牧条件下随日龄变化不显著（P＞0.05），舍饲时呈二次曲线变化（P＜0.05），单不饱和脂肪酸（MUFA）显著降低（P＜0.05），多不饱和脂肪酸（PUFA）、必需脂肪酸（EFA）显著升高（P＜0.05）；与舍饲羊相比，放牧羊SFA、PUFA、EFA比例较低（P＞0.05），MUFA较高（P＜0.05）。（5）随着年龄的增长，CAT、SOD活力在0—14 d呈升高趋势，14—42 d有所降低，之后继续呈增加趋势，整体变化不显著（P＞0.05），GSH-Px活力呈显著性二次曲线变化（P＜0.05），T-AOC呈升高趋势（P＜0.05），GSH含量在放牧组呈线性降低趋势（P＜0.05），在舍饲组变化不显著（P＞0.05）；相较于舍饲羊，放牧羊SOD、GSH-Px、T-AOC活力较高（P＞0.05），CAT活力较低（P＞0.05），GSH含量则显著较低（P＜0.05）。【结论】随着年龄的增长，山羊宰前活重、胴体重显著增加，但饲养方式（放牧、舍饲）对其影响不显著，而肌肉中CP水平逐渐增加，IMF沉积呈升高趋势，氨基酸、脂肪酸的组成一致，含量有差异，相应指标是舍饲羊优于放牧羊。整体来看，舍饲羊肉质稍优于放牧羊。但山羊肌肉抗氧化能力随日龄逐渐增强，且放牧羊高于补饲羊。因此，根据当地和养殖场的条件，以及幼龄山羊肉质阶段性发育规律，合理选择放牧、舍饲等饲养方式，如可以将二者结合或轮换等，以获得更好的肉质和更大的经济效益。

猪支原体肺炎发生的品种敏感差异及分子基础

方晓敏，赵为民，付言峰，涂枫，李碧侠，王学敏，赵芳，任守文

中国农业科学. 2015, 48(14): 2839-2847. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.015

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【目的】检测并验证猪支原体肺炎发生的品种敏感差异，筛选相关差异表达基因，探究猪支原体肺炎发生的分子遗传基础，为猪该病发生的分子机制研究提供依据。【方法】以对肺炎支原体易感的梅山猪、耐受的长白猪及二者杂交选育的苏钟猪为材料，设立试验组（15头/品种）和对照组（5头/品种），试验组猪接种肺炎支原体 Js 强毒株，对照组猪注射等量生理盐水，所有猪隔离、无抗生素饲养，监测临床表现；处理后18、28 d测定日增重、抗体水平及肺部病变，28d试验结束时集中屠宰，评定肺部损伤，检测病原，确定肺炎支原体感染情况；选择肺炎支原体感染的梅山、长白、苏钟猪各2头，未感染猪各2头，构成芯片杂交试验猪群，应用Agilent猪表达谱基因芯片及品种内、品种间双重比较法，筛选差异表达基因，结合Gene Ontology（http://www. geneontology.org）及KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)分析差异基因涉及的信号通路及调控网络。【结果】肺炎支原体处理后1—18d，试验组猪平均日增重显著低于对照猪 (0.01＜P＜0.05)，尤以梅山猪较为典型；19—28d，体重出现负增长，平均日增重极显著低于对照猪(P＜0.01)。同时，病原处理后18d，长白猪和苏钟猪抗体水平变化不大，仍表现为阴性(s/p＜0.3)，而梅山猪抗体水平则迅速上升至阳性水平(s/p ≥ 0.4)，并显著高于长白、苏钟猪(均为0.01≤P＜0.05)；处理后28d，梅山猪抗体水平高达（0.97±0.26），极显著高于长白(0.15±0.10)、苏钟猪(0.46±0.20)(均为P＜0.01)。而试验组猪在病原接种后的18d，梅山猪有11头表现出明显的支原体肺炎临床症状，长白猪仅2头出现轻微咳嗽，苏钟猪则有5头出现咳嗽、精神萎靡等初期病状；处理后23d，试验组1头梅山猪死于肺炎支原体感染；处理后28d，试验组梅山猪全部表现出支原体肺炎症状，长白猪7头出现初期感染症状；苏钟猪5头症状典型，6头稍有咳嗽，其余无明显异常。猪肺炎支原体检测与上述结果大体一致。试验猪的肺部X-ray透射及病理剖检结果则表明：处理后18d，试验组15头梅山猪肺部均见云絮状阴影，其中6头为典型的肺炎感染影像特征；长白猪仅1头出现肺炎影像特征，4头现少量云絮状阴影；苏钟猪病变数量和程度介于长白、梅山猪之间。处理后28d，梅山猪全部表现为典型的肺炎感染影像特征，长白猪和苏钟猪则分别有7头、13头出现肺炎影像特征。肺部病理剖检评分显示，梅山猪极显著高于长白猪(P＜0.01)，显著高于苏钟猪( 0.01≤P＜0.05)。表达谱芯片筛选结果表明，支原体肺炎患猪较健康对照猪表达上调基因49个，下调基因70个，涉及免疫反应、补体凝集、类固醇合成及代谢等18条信号调控通路。【结论】猪支原体肺炎的发生确实存在明显的品种间敏感差异，先天性免疫缺陷调控通路、Toll样受体信号通路及类固醇代谢通路在猪支原体肺炎感染炎症反应调控过程中发挥重要作用。

不同铅吸收特性小麦Pb的亚细胞分布和化学提取态

杨素勤，程海宽，景鑫鑫，周志云，孙晓雪，师振亚，张彪，赵鹏

中国农业科学. 2015, 48(14): 2848-2856. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.016

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【目的】研究铅（Pb）胁迫下小麦百农160和偃展4110体内Pb亚细胞分布和化学提取态变化，为Pb低积累品种筛选提供理论依据。【方法】以前期筛选的对Pb吸收有明显差异的2个小麦品种（百农160和偃展4110）为试验材料，采用砂培试验，以Pb(NO₃)₂作为铅源，分别设置0（对照）、100和800 mg×L^-1共3个处理水平，胁迫4周后，收获并测定小麦生物量、Pb亚细胞分布及化学提取态含量，分析比较2种铅吸收特性小麦Pb的亚细胞分布和化学提取态特征。【结果】100 mg×L^-1Pb胁迫对小麦生长有促进作用，百农160和偃展4110生物量均有所增加，增幅分别为4.78%和2.66%。800 mg×L^-1Pb胁迫下，小麦生长受到抑制，百农160和偃展4110生物量均显著降低，分别降低了25.66%和38.60%。此外，2种小麦根冠比的变化也存在一定差异，当介质中Pb的浓度从100增至800 mg×L^-1后，百农160根冠比无明显变化，而偃展4110则表现出一定程度的增加，由0.71增至0.81。Pb胁迫4周后，百农160茎叶和根系中的Pb含量均低于偃展4110。就亚细胞分布而言，2种小麦体内Pb主要存在于细胞壁和细胞液中，其合量占小麦体内Pb总量的72%—86%。当介质中Pb浓度从100 mg×L^-1增至800 mg·L^-1后，偃展4110根细胞壁和细胞液中Pb所占比例降低8%，茎叶这一比例降低4%，而百农160根中这一比例增加了9%，茎叶则增加了1%。就Pb的化学提取态而言，小麦体内（茎叶和根系）Pb以难溶性的醋酸提取态和盐酸提取态为主，两者占总和的67%—85%，氯化钠提取态含量次之，占总和的6%—18%，乙醇提取态、去离子提取态和残渣态含量较低，3种形态占总和的8%—16%。此外，100和800 mg×L^-1Pb胁迫下，百农160根中活性较强的乙醇提取态和去离子水提取态Pb含量均低于偃展4110。然而，2种小麦茎叶中活性态合量特征与根中有所不同，100 mg×L^-1 Pb处理下，百农160茎叶活性态合量低于偃展4110，当胁迫增至800 mg×L^-1Pb时，2种小麦茎叶中活性态合量无明显差异。【结论】铅胁迫下，百农160的根表对Pb的阻碍能力强于偃展4110，同时将进入体内的Pb更大比例固定在细胞壁上，以减少Pb向地上部的运移，从而减轻Pb对地上部的毒害作用。就化学提取态而言，各形态的分配比例与Pb的解毒机理关系密切，但不同器官表现有所差异。

ACLSV山东苹果分离物基因重组及CP序列多样性分析

李科，时洪伟，荆陈沉，孙现超，周常勇，青玲

中国农业科学. 2015, 48(14): 2857-2867. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.017

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【目的】明确苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）山东苹果分离物全基因组的分子特征、潜在重组事件及CP基因的多样性。【方法】采用RT-PCR分段扩增、克隆、拼接获得ACLSV全基因组序列，对其进行分子特征描述，并与已报道的16条全长基因组或近全长基因组序列进行比较和系统发育分析，同时扩增其CP进行多样性分析。【结果】扩增得到ACLSV山东苹果分离物QD-13全基因组序列（GenBank登录号KJ522693），QD-13全长7 557 nt，包含3个ORF。构建进化树分析表明，QD-13与日本苹果分离物B6聚为一簇，二者相似性最高，为85.9%。17条ACLSV分离物基因组分段比较表明，5′端和3′端差异较大；ORF3保守性相对较高，除分离物Ta Tao 5和MS外，其推导的氨基酸序列相似性均在91.2%以上。ORF1编码区527—665 aa区域保守性差，所比较的17条序列在该区域的相似性为15.4%—59.7%。基因组重组分析以P≤0.05为标准，3种以上算法同时检测到则为有意义重组事件，结果显示，QD-13存在3个重组事件，它们分别发生在6 507—6 247、6 397-6 497和3 851—4 760 nt。扩增QD-15、QD-20和YT-24分离物ACLSV的CP，共获得22条序列，可分为3种类型。对CP氨基酸序列进行比对分析表明，3种类型为不同氨基酸保守位点的组合，分别是Met⁶⁰-Ser⁷³-Ser⁷⁹-Asp⁸²-Asn⁹⁷-Gly⁹⁸、Leu⁵⁹-Met⁸³-Ile¹⁹³和Ala⁴⁰- Leu⁶⁰-Ala⁷²-Phe⁷⁵-Ile⁸⁶-Arg⁸⁸-Ser¹³⁰-Gly¹³⁷-Met¹⁸⁴。【结论】报道了中国ACLSV苹果分离物的完整基因组序列；明确了其基因组分子特点并发现了3个主要的潜在重组事件；ACLSV山东苹果分离物CP存在3种序列类型，具有丰富的多样性。

苹果MdcyMDH过量表达对光合、激素和生长的影响

王庆杰，金仲鑫，周李杰，郝玉金，姚玉新

中国农业科学. 2015, 48(14): 2868-2875. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.018

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【目的】获得过量表达苹果细胞质苹果酸脱氢酶基因（MdcyMDH）的苹果植株，评价其过量表达对转基因株系生长的影响，并通过光合特性和和激素水平来探讨其调控生长的机理，为进一步揭示该基因调控生长发育的机制奠定基础。【方法】从苹果叶片中克隆MdcyMDH编码区，连接植物表达载体pBI121，转化农杆菌LBA4404；利用农杆菌侵染‘嘎啦’苹果叶片，通过叶片再生的方法获得MdcyMDH过表达的转基因苹果株系。以分化的苹果组培苗叶片为材料，提取基因组DNA，利用来自35S启动子和转化基因序列的引物，通过PCR初步筛选转基因株系；然后，提取初筛的转基因苹果组培苗叶片RNA，分别采用半定量和荧光定量PCR的方法检测MdcyMDH表达量，来确定MdcyMDH过表达株系。以继代培养40和60 d的野生型和转基因苹果组培苗为材料，进行生根处理，30 d后测定MdcyMDH过表达对组培苗表型以及株高、叶片数量、根重等生长参数的影响。以驯化的、在大田生长一年的野生型和转基因苹果苗为材料，测定叶片光合参数和叶绿素含量的变化；以组培苗为材料，利用液质联用仪测定叶片内源激素含量的变化。【结果】以苹果叶片基因组DNA为材料，PCR初步筛选获得了3个转基因株系，即Line 2、Line 3和Line 4；半定量和荧光定量PCR检测发现Line 2和Line 4中MdcyMDH表达量分别比野生型提高了12倍和5倍，因此确定以上两个株系为MdcyMDH过表达株系。此外，MdcyMDH过量表达也提高了叶绿体苹果酸脱氢酶基因（MdchMDH）表达量。组培苗生根培养30 d后，MdcyMDH过表达对转基因株系的株高、叶数目、茎粗度、地上部重量未造成显著性影响，但小幅提高了转基因株系的株高和地上部总重量；与野生型相比，MdcyMDH过量表达显著提高了根系的重量和总鲜重。MdcyMDH过表达显著提高了转基因株系的光合速率，Line 2和4光合速率分别提高了13.2%和15.1%；转基因株系的蒸腾速率和气孔导度总体上都有显著性提高，但其胞间CO₂浓度显著降低；MdcyMDH过量表达显著提高了叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量，与对照相比，Line 2和4株系叶绿素总含量分别提高了20.4%和15.9%。叶片激素含量测定表明，MdcyMDH过量表达显著抑制了ABA水平，其含量约为对照的1/2。【结论】MdcyMDH过量表达通过提高光合能力和降低ABA水平促进了转基因苹果组培苗的生长，尤其是促进了生根。

宁夏肉牛皮肤病原真菌的分离与鉴定

葛松，蒋万，何生虎，余永涛，张蕾蕾，郭澍强，王静

中国农业科学. 2015, 48(14): 2876-2883. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.019

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【目的】从患真菌性皮肤病肉牛的毛发、皮屑、痂皮等病料样本中分离皮肤病原真菌并对其进行种属分类鉴定，为牛真菌性皮肤病的诊断及防治提供参考依据。【方法】无菌采集宁夏地区患皮肤病肉牛的毛发、皮屑、痂皮，将病料样本置于载玻片上，滴加10% KOH溶液1滴，静置5 min后进行镜检观察；将病料样本接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）中进行真菌的分离、纯化培养，对分离的真菌用乳酸酚棉兰染液进行染色观察，根据真菌形态学特征对其进行初步分类；用分离的真菌制备浓度为1×10⁸ cfu·mL^-1的孢子悬液涂抹健康ICR小鼠皮肤，根据其致病性筛选病原真菌；提取病原真菌DNA，对其内部转录间隔区（ITS）进行PCR扩增并测序，登录NCBI GenBank数据库，对病原真菌ITS序列进行同源性比较并构建系统发育树，根据其同源性比较及系统发育分析结果，结合真菌形态学特征对病原真菌作出种属分类鉴定。【结果】病料中含真菌菌丝及链状厚垣孢子，毛发中存在大量小分生孢子；从病料样本中共分离、纯化到23株真菌，分属于毛癣菌属（Trichophyton）、曲霉属（Aspergillus）、横梗霉属（Lichtheimia）、链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属（Fusarium）、附球菌属（Epicoccum）、毛霉菌属（Mucor）；小鼠皮肤感染试验表明，分离的毛癣菌属真菌NXGY1、NXGY2具有较强的致病性，试验组小鼠均出现瘙痒、皮屑增多、形成结痂、脱毛等临床症状；毛癣菌属NXGY1、NXGY2 的ITS序列长度大小分别为660、662 bp，其同源性比较及系统发育分析结果表明，NXGY1、NXGY2与疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)同源性高达99% ，在系统发育树上属于同一分支，遗传距离最近。【结论】根据真菌形态特征及系统发育分析结果，鉴定分离的肉牛皮肤病原真菌NXGY1、NXGY2为疣状毛癣菌(T. verrucosum)。

降铜对植酸酶在断奶仔猪饲粮中应用的影响

陆扬，胡二永，字正浩，孙国荣，夏东

中国农业科学. 2015, 48(14): 2884-2890. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.020

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【目的】为加快仔猪生长和提高饲粮消化率，仔猪饲粮中常常同时添加高剂量铜和植酸酶，但高铜对植酸酶的作用究竟有何影响却仍鲜见报道。研究高铜饲粮中添加植酸酶对仔猪营养物质消化率、生产性能、粪铜和粪磷排放的影响，以及降低铜的添加量对植酸酶作用的影响。【方法】试验选取180头体重9—10 kg长×大二元杂交仔猪，随机分成3组，每组5栏，每栏12头猪，分别饲喂3种试验饲粮中的一种。试验饲粮为玉米-豆粕型饲粮，其营养水平达到或超过NRC(1998)相应阶段猪营养需要量。组1为对照组，饲粮铜添加量为180 mg·kg^-1（硫酸铜），不添加植酸酶；组2和组3为植酸酶试验组，添加500 IU·kg^-1植酸酶，组2和3饲粮铜添加量分别为 180和120 mg·kg^-1（硫酸铜）。试验预试期3 d，正试期3 w，试验期间仔猪自由采食和饮水，记录采食量，观察腹泻情况，计算试验期间平均日采食量、日增重、料重比和腹泻频率。试验结束前连续3 d以栏为重复单位采集部分新鲜粪样，每100 g新鲜粪样加10 mL的10%乙醇，-20℃保存待测。以酸不溶灰分为参照内标，测定计算营养物质消化率和矿物质表观消化率。【结果】（1）高铜仔猪饲粮中添加植酸酶可使磷表观消化率提高21.12%（组2与组1相比，P＜0.01），粪磷含量降低4.41%（P=0.09），腹泻频率降低19.22%（P=0.35），添加植酸酶对干物质和蛋白表观消化率，采食量、日增重和料重比均无显著影响。（2）两个植酸酶试验组相比，当铜添加量由180 mg·kg^-1降低到120 mg·kg^-1时，钙、磷表观消化率分别提高13.74%和9.79%（组3与组2相比，P=0.02和P=0.01），粪磷含量降低18.86%（P＜0.01），腹泻频率降低25.24%（P=0.25），降铜对干物质和粗蛋白表观消化率、采食量、日增重和料重比均无显著影响。（3）与高铜无植酸酶组相比，减少铜添加量并且添加植酸酶，可使饲粮的干物质、粗蛋白、钙和磷表观消化率分别提高1.80%、2.84%、17.20%和32.98%（组3与组1相比，P=0.02，P=0.04，P＜0.01和P＜0.01），腹泻频率降低39.6%（P=0.04）。【结论】现有试验表明，在添加植酸酶的玉米-豆粕型饲粮中，将铜（硫酸铜形式）添加量从180 mg·kg^-1 减少到120 mg·kg^-1可以显著减少铜对植酸酶的干扰，提高饲粮钙、磷表观消化率，降低粪铜和粪磷含量。

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