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专题——转基因、基因编辑技术培育除草剂抗性棉花

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导读：我国耐除草剂棉花研发与育种应用     梁成真, 金双侠 中国农业科学   2023,56(17 ):3247 -3250. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.001 摘要  （318） HTML （44） PDF （282KB）（1079） 收藏 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性分析及性状鉴定     梁成真, 臧有义, 孟志刚, 王远, MUBASHIR Abbas, 何海焱, 周琪, 魏云晓, 张锐, 郭三堆 中国农业科学   2023,56(17 ):3251 -3260. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.002 摘要  （356） HTML （40） PDF （2506KB）（299） 收藏 【目的】 明确转基因耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性和营养品质等性状，为其产业化应用提供数据基础和技术支撑。 【方法】 针对实验室培育的新型耐除草剂棉花GGK2，选取其T3、T4、T5代开展试验研究。利用特异性PCR和Southern blot开展基因组整合稳定性分析；利用实时荧光定量PCR、ELISA和胶体金试纸条开展表达稳定性分析；通过田间喷施草甘膦测试其除草剂耐受稳定性，以及依据相关国际或国内行业标准进行棉籽营养成分分析等。 【结果】 抗除草剂基因GR79 EPSPS和GAT，以及筛选标记基因NPTⅡ以单拷贝形式整合到棉花GGK2基因组D10染色体，且能够在T3、T4、T5代转基因棉花中稳定遗传，同时发现基因组中不含有遗传转化载体的骨架片段。表达分析发现GR79 EPSPS、GAT和NPTⅡ 3个基因在棉花GGK2的不同时期、不同组织部位均有表达，其中，叶片中的表达量相对较高。四叶期、盛花期、吐絮期3个蛋白在叶片中表达量分别介于128.7—192.4 µg·g-1、24.4—35.0 µg·g-1和17.0—23.9 µg·g-1鲜重，利用GR79 EPSPS单克隆抗体制备的胶体金试纸条可以对田间棉花GGK2叶片实现快速鉴定。除草剂耐受性分析结果显示，转基因棉花GGK2可耐受4倍生产使用剂量的草甘膦除草剂。T3—T5不同世代棉花喷施除草剂后均未发现受害症状，而且整个生育期的生长发育未受影响。棉籽营养成分分析表明，来源于新疆、河北和河南种植的GGK2棉籽中，水分、灰分、蛋白质、脂肪、粗纤维、维生素及脂肪酸含量与非转基因对照之间无显著差异，各指标的含量水平均位于ILSI数据库报道的范围内。 【结论】 转基因棉花新种质GGK2的耐除草剂性状遗传稳定性好、除草剂耐受能力强、籽粒营养成分与非转基因对照之间无显著差异，在耐除草剂棉花生物育种具有重要的应用价值且产业化前景好。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

转1174AALdico-2+CTP耐草甘膦优异棉花种质系的创制及其特性     王宛如, 曹跃芬, 盛况, 陈进红, 赵天伦, 祝水金 中国农业科学   2023,56(17 ):3261 -3276. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.003 摘要  （268） HTML （10） PDF （2614KB）（821） 收藏 【目的】 棉田杂草是限制棉花生长的因素之一，与棉花争夺营养、水分和光照，不仅影响棉花的生长发育，还影响棉花的产量和品质。通过基因工程途径培育高耐草甘膦优异棉花种质，实现棉田间化学除草，提高植棉的经济效益。 【方法】 将来源于耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的EPSPS基因1174AALdico-2连接叶绿体转运肽，以35S为启动子，将2个目的基因串联后构建棉花转化载体。运用农杆菌活体转化技术，将目的基因导入棉花品种中棉所49，获得阳性转化体植株。以受体材料中棉所49和转化体自交分离得到的非转基因NON为对照，对转化体植株进行分子特征检测、草甘膦耐受性鉴定、农艺性状和经济性状等综合评价，以筛选出优良的转基因耐草甘膦棉花材料。 【结果】 通过农杆菌活体转化方法获得138个阳性转化体，对转化体植株进行目的基因PCR检测、Southern blot、Western blot分析和ELISA检测，从中筛选出17个分子特征明确、外源基因表达量高的阳性转化体。Southern blot和核苷酸测序结果表明，转化体插入位点和拷贝数各不相同，其中，ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体为单拷贝插入位点，外源基因插入位点分别位于棉花D亚组第7染色体、D亚组第13染色体和A亚组第12染色体。草甘膦耐受性鉴定结果表明，17个阳性转化体均高耐草甘膦，其中ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体的耐受性在3个世代之间稳定遗传，可耐4倍的田间草甘膦推荐剂量。农艺性状和经济性状评估结果表明，ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体植株生长发育正常，表现出铃大、衣分高、结铃性强等特点，皮棉产量超过对照，纤维品质达到优质棉水平。【结论】 将来源于耐辐射奇球菌的EPSPS基因1174AALdico-2与叶绿体转运肽连接，多基因串联后构建转化载体，农杆菌活体转化技术转入中棉所49，通过一系列筛选后获得3份优良的转基因耐草甘膦材料ZD131、ZD185和ZD207，该方法在提高棉花耐草甘膦水平的同时，也提高了转基因材料的农艺和经济性状。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

转基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鉴定     马燕斌, 李换丽, 文晋, 周仙婷, 秦欣, 王霞, 王新胜, 李燕娥 中国农业科学   2023,56(17 ):3277 -3284. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.004 摘要  （250） HTML （11） PDF （3187KB）（233） 收藏 【目的】 通过转化抗草甘膦除草剂基因G10aroA获得抗草甘膦除草剂的棉花转基因株系，对其进行分子特征鉴定分析，为今后棉花育种利用该株系提供必要的分子依据。【方法】 利用农杆菌介导法，在草甘膦筛选条件下，通过组织培养获得棉花再生株系，利用Western blot对转基因棉花株系不同组织的外源蛋白表达进行检测；通过Southern blot确定株系中外源G10aroA整合位点的拷贝数；利用TAIL-PCR扩增外源基因整合位点侧翼序列，并通过NCBI BLAST工具比较分析其定位的染色体位置。【结果】 通过草甘膦筛选，利用组织培养获得R1-3棉花再生株系；Western blot结果表明，外源基因在叶、苞叶、花、茎中均可正常表达，其蛋白大小约为46 kDa，与预期目标条带一致；基因组DNA酶切后杂交结果显示，R1-3株系外源序列的整合位点为单拷贝插入，其中，KpnⅠ酶切的杂交条带位于约6 557 bp处，EcoRⅠ酶切的2条杂交带位于略大于4 316 bp处；侧翼序列比对结果显示，外源序列融合到陆地棉A或D基因组的第11号染色体上，且在交换插入的过程中，左右边界的融合位点分别位于该染色体47 525 303和47 525 449处。另外，利用特异引物进行PCR鉴定，可知左侧融合位点可扩增出约300 bp的预期特定目标条带，右侧融合位点可扩增出约600 bp的预期特定目标条带。【结论】 获得具有稳定遗传特征的R1-3转基因棉花株系，不同组织中外源基因编码的蛋白均有表达，提高了该株系对草甘膦的高抗性。含有G10aroA的外源序列为单个位点插入，融合位点位于陆地棉A或D基因组第11号染色体上，该融合位点处缺失约146 bp的核苷酸序列。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价

后基因组时代发展抗除草剂作物的机遇及挑战     吴元龙, 惠凤娇, 潘振远, 尤春源, 林海荣, 李志博, 金双侠, 聂新辉 中国农业科学   2023,56(17 ):3285 -3301. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.005 摘要  （367） HTML （22） PDF （1743KB）（233） 收藏 全球农业正在面临着严峻的挑战，育种技术是种业发展的基础和关键。基因编辑技术是指对目标基因进行定点修饰，实现对特定靶标基片段的删除、插入和替换。利用基因编辑技术可以精准修改目标基因或将某种优良基因引入到作物中产生优良农艺性状，在分子设计育种中具有巨大潜力，对保障粮食安全具有重大意义。杂草危害对作物的产量和品质影响巨大，如何高效、安全、可持续地防治草害一直是研究的热点。目前，全球市场已经出现超过200种的化学除草剂，利用化学方法来防治草害已成为现代化农业的重要组成部分，抗除草剂作物的推广也显著降低了杂草防治成本，但随着抗除草剂作物的大面积推广和长期使用单一除草剂，杂草抗/耐药性和抗性基因逃逸等环境安全问题逐渐被发现。目前，功能基因组学、生物信息学、基因工程技术的发展（特别是基因编辑技术在植物中的广泛应用），为创制抗除草剂作物和新型高效的除草剂系统创造了条件。本文首先介绍抑制植物氨基酸生物合成、植物脂类代谢、植物类胡萝卜素、质体醌和生育酚生物合成途径除草剂的主要作用靶标基因及其作用机制。其次，介绍2种挖掘新型抗除草剂基因与除草剂系统的方法，包括基于CRISPR/Cas系统对作物内源的除草剂抗性基因进行定向突变方法和基于天然产物与生物体在自然界中存在共同进化理论的抗性基因导向方法。同时，介绍3种培育抗除草剂作物方法的研究进展，包括常规育种培育法、转基因育种培育法和基于CRISPR/Cas基因组编辑技术培育法。其中，重点介绍CIRSPR/Cas系统、碱基编辑技术和Prime-editing系统在培育抗除草剂作物中的研究进展。针对抗性杂草的产生及环境安全问题是当前化学防治杂草面临的主要挑战，以及抗除草剂作物所面临的主要挑战是基因逃逸问题。目前，快速发展的基因组编辑技术为后基因组时代发展抗除草剂作物提供了新的解决策略和新的机遇。最后，对除草剂作物的未来进行了展望。 数据和表丨 参考文献丨 相关文章丨 多维度评价