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中国农业科学. 2021, 54(10): 0.

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水稻CSC11介导干热风/干旱诱导的钙信号调控雄蕊发育

任志杰,李倩,孙钰佳,孔冬冬,刘良玉,侯聪聪,李乐攻

中国农业科学. 2021, 54(10): 2039-2052. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.001

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【目的】水稻花期偶遇干热风/干旱,导致脆弱的生殖细胞快速失水,极大地降低产量,这一过程中钙离子作为通用的第二信使传导了干旱或其他逆境信号,但背后的分子机制尚不清楚。分析钙离子透过性胁迫反应阳离子通道家族（calcium-permeable stress-responsive cation channels,CSCs）基因的生理和分子功能,为研究作物干热风的感应机制提供新的理论基础和思路。【方法】采用电生理学和遗传学方法,利用双电极电压钳技术在水稻中鉴定得到一个具有典型特征的受体类-钙通道蛋白,名为OsCSC11,对其蛋白序列进行生物信息学和进化关系分析。运用qRT-PCR和GUS报告基因活性分析确认OsCSC11的表达模式,在拟南芥原生质体细胞和洋葱表皮细胞中瞬时表达OsCSC11-GFP融合蛋白,验证OsCSC11的亚细胞定位;同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得OsCSC11的突变体,并通过细胞学等手段分析突变体表型和相关生理功能。【结果】蛋白序列比对发现,OsCSC11具有CSCs家族成员典型的保守结构域DUF221,但与其他成员序列差异大,存在不同于其他成员的特异结构域（motif）属于独立的亚家族。OsCSC11主要在水稻的花药和叶片中表达,进一步分析发现全长OsCSC11处于静息状态,可被高渗透溶液激活;但是删除N端156氨基酸（TM1-3）之后的OsCSC11^ΔTM1-3具有组成型的通道活性,特异选择钙、镁二价阳离子;推测TM1-3是这类通道的受体结构域,感应干热风胁迫,而OsCSC11^ΔTM1-3区域负责钙信号产生。OsCSC11和OsCSC11^ΔTM1-3均定位在细胞质膜上,与其干热风的受体功能相适应。与野生型相比,功能缺失突变体oscsc11-1和oscsc11-2的雄蕊较小、花药表面蹙皱,整体多呈弯曲状态,花粉含水量较低,败育率高达60%—70%。【结论】OsCSC11是水稻感应短期干热风/干旱刺激、介导钙离子内流,调控花药水分状态和花粉发育的受体类钙通道,可能参与了水稻雄蕊应对干热风的原初感应过程。

基于SNP标记的小麦籽粒性状全基因组关联分析

张芳,任毅,曹俊梅,李法计,夏先春,耿洪伟

中国农业科学. 2021, 54(10): 2053-2063. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.002

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【目的】籽粒性状是影响小麦产量的重要因素,通过对小麦籽粒性状进行全基因组关联分析,发掘控制小麦籽粒性状显著位点,为小麦籽粒性状的遗传改良研究提供理论参考。【方法】以在新疆种植的121份小麦为材料,利用小麦50K SNP芯片,对粒长、粒宽、籽粒长宽比、籽粒面积、籽粒周长和千粒重6个性状进行基于混合线性模型MLM（Q+K）的全基因组关联分析。【结果】在不同环境间6个籽粒性状均表现出广泛的表型变异,其中千粒重变异系数最大为13.91%—17.79%,各籽粒性状遗传力为0.85—0.90。多态性信息含量PIC值为0.09—0.38,最小等位基因频率MAF值为0.05—0.50。群体结构分析表明,试验所用自然群体可分为4个亚群。GWAS结果表明,共检测到592个与6个性状显著关联位点（P<0.001）,其中,涉及6个性状的29个SNP在2个及以上的环境中被重复检测到,分布于1A（5）、1B（2）、1D、2A（5）、3B、5A、5D、6B（4）、6D、7B和7D（7）染色体上,解释9.3%—22.7%的表型变异。检测到6个与粒长稳定的关联位点,分布在1A、2A和7D染色体上,解释9.9%—22.7%的表型变异;检测到2个与粒宽稳定的关联位点,分布在3B和5D染色体上,解释9.6%—12.2%的表型变异;检测到6个与籽粒长宽比稳定的关联位点,分布在2A（2）、5A、7B和7D（2）染色体上,解释10.1%—19.4%的表型变异;检测到3个与籽粒面积稳定的关联位点,分布在1A、1B和1D染色体上,解释9.9%—18.2%的表型变异;检测到6个与籽粒周长稳定的关联位点,分布在1A（2）、2A、6D和7D（2）染色体上,解释9.3%—22.6%的表型变异;检测到6个与千粒重稳定的关联位点,分布在1B、2A和6B染色体上,解释9.7%—12.9%的表型变异。挖掘到5个控制小麦籽粒性状一因多效显著关联位点,分布在1A、2A（2）和7D（2）染色体上,解释9.9%—22.7%的表型变异。【结论】本研究材料遗传多样性丰富,在自然群体中共发现29个与6个籽粒性状在2个及以上环境中稳定显著的关联位点。

利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

张翔,史亚兴,卢柏山,武莹,刘亚,王元东,杨进孝,赵久然

中国农业科学. 2021, 54(10): 2064-2072. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.003

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【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline,2-AP）是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,PMI）抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测基因编辑株系T₁籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T₁代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82 μg·kg^-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。

土壤微生物介导植物抗盐性机理的研究进展

孔亚丽,朱春权,曹小闯,朱练峰,金千瑜,洪小智,张均华

中国农业科学. 2021, 54(10): 2073-2083. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.004

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土壤盐渍化是农业可持续生产面临的严重威胁之一。利用高效、低成本和适应性强的方法对盐渍区进行修复是一个具有挑战性的目标。土壤微生物在调节植物根际环境、调控生长发育和提高系统生产力等方面具有重要作用。近年来,由微生物驱动的植物胁迫耐受性受到了广泛关注。通过识别和利用能与植物相互作用的土壤微生物来减轻盐胁迫,为盐渍区改良提供了一种新策略,也为与胁迫耐受相关新机制的发现开辟了新途径。了解不同微生物介导的胁迫耐受性的潜在生理机制对有效利用这些微生物促进农业可持续生产至关重要,本文从植物养分吸收、渗透平衡、激素水平、抗氧化功能等方面论述了国内外关于土壤微生物介导植物耐盐性的作用机理,评估了目前关于土壤微生物参与调节植物耐盐性相关研究的有益作用和不足之处,提出了未来研究的发展方向。目前通过提高养分及水分吸收效率维持盐胁迫下植物离子稳态,提高生长素的合成、降低乙烯的释放调控植物激素水平是土壤微生物改良植物耐盐性的目标过程,然而单个外源微生物接种时会与土著微生物组竞争,导致许多微生物菌株不能在土壤或植物根系中定殖或存活,致使微生物在大规模农业生产应用中仅取得了有限的成功。未来微生物介导植物抗盐性的研究应突破单一微生物接种的研究方式,进一步在群落水平上阐明植物-微生物的相互作用介导植物抗盐性的机制,解决农业微生物利用的关键问题。

基于无人机影像阴影去除的苹果树冠层氮素含量遥感反演

李美炫,朱西存,白雪源,彭玉凤,田中宇,姜远茂

中国农业科学. 2021, 54(10): 2084-2094. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.005

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【目的】去除无人机多光谱遥感影像中的阴影,以提高苹果树冠层氮素含量反演模型精度。【方法】以山东省栖霞市苹果园为试验区,利用2019年6月采集的无人机多光谱影像,分别基于归一化阴影指数（normalized shaded vegetation index,NSVI）和归一化冠层阴影指数（normalized difference canopy shadow index,NDCSI）去除果树冠层多光谱影像中的阴影,提取非阴影区域果树冠层光谱信息;通过相关性分析方法,将基于原始光谱影像和基于NSVI、NDCSI去除阴影后提取的光谱数据与实测叶片氮素含量进行相关性分析,分别筛选氮素含量的敏感波段并构建光谱参量;采用偏最小二乘（partial least square,PLS）及支持向量机（support vector machine,SVM）方法构建果树冠层氮素含量反演模型并进行精度检验。【结果】绿光波段和红光波段为果树冠层氮素含量反演的敏感波段;阴影削弱了果树冠层的光谱信息,去除阴影前后,冠层多光谱各波段光谱差异较大,在红边波段及近红外波段尤为明显;基于2个阴影指数去除阴影后构建的氮素反演模型精度均有提升,最优模型为基于NDCSI去除阴影后构建的支持向量机氮素含量反演模型,该模型建模集R²和RPD分别为0.774、1.828;验证集R²和RPD分别为0.723、1.819。【结论】基于NDCSI可有效去除无人机多光谱果树冠层影像中的阴影,提高氮素含量反演精度,为果园氮素精准管理提供了有效参考。

木尔坦棉花曲叶病毒“C4 ORF”编码蛋白对病毒致病性的影响

郑信诗,尚鹏祥,李景远,丁新伦,吴祖建,张洁

中国农业科学. 2021, 54(10): 2095-2104. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.006

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【目的】通过分析发现木尔坦棉花曲叶病毒（cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）C4开放阅读框（open reading frame,ORF）附近可编码3个不同大小的蛋白,而NCBI数据库登录的CLCuMuV各个分离物编码的C4蛋白大小也不尽相同,本研究试图通过分析该3个假定的“C4 ORF”编码蛋白对病毒致病性的影响,以明确CLCuMuV C4蛋白ORF的确切定位。【方法】根据双生病毒编码蛋白的保守性,在CLCuMuV C4 ORF附近查找到3个大小不等的ORF,分别标记为C4-L（567 nt）、C4-M（546 nt）和C4-S（303 nt）。利用同源重组的方法将该3个ORF分别构建到PVX异源表达载体,通过农杆菌介导的植物接种法,分析PVX介导的3个蛋白在本氏烟表达对本氏烟症状的影响。利用同源重组的方法构建CLCuMuV野生型及C4-L或C4-S缺失突变型的侵染性克隆,同样通过农杆菌介导的植物接种法,分别与其伴随DNA-β分子的侵染性克隆接种本氏烟,分析C4-L或C4-S缺失对CLCuMuV致病性的影响,并利用Southern blot和Western blot分别对接种烟草的病毒基因组的积累量和病毒C4蛋白的表达量进行分析。同时利用Gateway系统载体对C4-L和C4-S蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位进行分析。【结果】PVX异源表达载体接种本氏烟,结果发现PVX-C4-L和PVX-C4-S接种的本氏烟叶片卷曲、叶柄伸长,并且PVX-C4-S症状更重,而PVX-C4-M接种的本氏烟症状较轻或基本无症状,Western blot试验也在PVX-C4-L和PVX-C4-S接种组检测到了C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白对PVX异源病毒的致病性影响最大。侵染性克隆接种本氏烟,结果发现野生型（CLCuMuV）和C4-L突变型（CLCuMuV-ΔL）接种的本氏烟叶片皱缩增生、叶柄和茎秆扭曲,而C4-S突变型（CLCuMuV-ΔS）和对照组（Mock）接种的本氏烟未显示任何症状,并且前两者的植株高度明显矮于后两者,同时Southern blot试验在CLCuMuV和CLCuMuV-ΔL接种的本氏烟中均检测到大量病毒基因组的积累,而Western blot试验也在其中检测到C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白在CLCuMuV诱导寄主产生症状过程中起关键作用。亚细胞定位发现YFP-C4-L主要定位在本氏烟叶片表皮细胞的叶绿体,YFP-C4-S则定位在细胞膜或细胞质周边,并有点状聚集体结构。【结论】C4-S ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染必不可少,而C4-L和C4-M ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染不是必需。

苹果蠹蛾几丁质脱乙酰基酶2的基因克隆、表达模式和分子特性

石国良,武强,杨念婉,黄聪,刘万学,钱万强,万方浩

中国农业科学. 2021, 54(10): 2105-2117. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.007

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【目的】研究苹果蠹蛾（Cydia pomonella）几丁质脱乙酰基酶2（chitin deacetylase 2,CDA2）的分子特性和表达模式,为新型杀虫剂靶标筛选提供理论依据。【方法】基于苹果蠹蛾转录组和基因组数据,通过同源比对获得苹果蠹蛾CDA2的相关信息;新鉴定的CpCDA2a和CpCDA2b与其他昆虫中已鉴定的CDA2氨基酸序列进行多序列比对,并采用MEGA7软件邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树;通过生物信息软件预测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体的蛋白功能域和三维结构并分析其差异,并通过在线软件对其分子量、等电点和亲/疏水性等蛋白理化性质及糖基化修饰位点等方面进行分析比较;采用荧光定量PCR检测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体在苹果蠹蛾不同发育时期及其幼虫不同组织的表达情况,以及注射蜕皮激素后其表达量的变化趋势。【结果】获得了苹果蠹蛾CDA2的两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b的全长CDS序列及其内含子和外显子位置信息;分析发现两个剪切体的蛋白序列均具有信号肽、几丁质结合域（ChBD）、低密度脂蛋白受体域（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化域（CDA）等功能域。多序列比对和聚类分析结果表明,不同昆虫间CDA2差异剪切类型非常类似,相同目昆虫的序列以较高的置信度聚为一支。三维结构模拟与比较发现两个剪切体的ChBD功能域在结构上存在较大差异;理化性质分析显示两个剪切体的亲/疏水性和糖基化位点也存在差异。不同发育时期表达量分析表明,CpCDA2a主要在幼虫期高表达,CpCDA2b主要在蛹的前期和中期高表达,而且在幼虫蜕皮前和蜕皮后CpCDA2a和CpCDA2b表达量均会显著上调;不同组织的表达量分析表明,CpCDA2a和CpCDA2b均在表皮中表达量最高,而CpCDA2b在头部的表达量也较高。对注射蜕皮激素后幼虫中CpCDA2a和CpCDA2b表达量分析显示,与对照相比在注射蜕皮激素后CpCDA2a的表达量在24 h和48 h均有所上调,但差异不显著,而CpCDA2b在24 h和48 h均显著上调。【结论】苹果蠹蛾CDA2的转录本存在两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b,根据对其分子特性、发育阶段和组织表达谱、以及注射蜕皮激素后表达动态等方面的综合分析,推测两者均参与苹果蠹蛾蜕皮和新表皮形成过程,但由于可变剪切的序列差异导致的蛋白结构和理化性质上的差异造成了两者在功能上的分化。

绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

谭永安,赵旭东,姜义平,赵静,肖留斌,郝德君

中国农业科学. 2021, 54(10): 2118-2131. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.008

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【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）雷帕霉素靶标全长基因（AlTOR）,研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素（20E）诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础。【方法】RACE法克隆AlTOR基因序列全长,qRT-PCR分析AlTOR表达特性以及在20E及其抑制剂U73122诱导下的应答响应;将含有AlTOR序列T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建原核表达载体pCzn1-AlTOR,经20℃、0.5 mmol·L^-1 IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,以获得AlTOR重组蛋白,最后再通过免疫,制备AlTOR蛋白多克隆抗体,Western blot评价该抗体的特异性。【结果】AlTOR的开放阅读框编码包含435个氨基酸,具有典型的TOR基因序列特征,即SIN1结构域、高度保守的CRIM结构域及PH域;AlTOR在绿盲蝽不同日龄、不同组织中均有表达,且在1日龄以及脂肪体中表达量最高;20E可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期AlTOR的表达,同时也能诱导成虫头、翅、卵巢和脂肪体中AlTOR表达上调,分别上调200.00%、118.89%、20.53%和60.82%,而U73122在中肠和卵巢中会显著抑制AlTOR的表达。经双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,命名为pCzn1-AlTOR;IPTG诱导的重组质粒可特异性表达一个约36 kD的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经Ni-IDA亲和层析纯化后,仅在36 kD附近有一条明显的特异性条带。进一步免疫及间接ELISA方法确定抗血清对TOR蛋白的效价,Western blot分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与AlTOR重组蛋白及绿盲蝽3龄若虫总蛋白结合,说明制备的AlTOR多克隆抗体特异性较好,可以用于后续的蛋白研究。【结论】AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;20E及其抑制剂诱导后,AlTOR呈现出相反的应答反应;本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性。

东北典型黑土区旱地耕层土壤肥力指标的纬度变化特征及其关系

尹思佳,李慧,徐志强,裴久渤,戴继光,刘雨薇,李艾蒙,于雅茜,刘维,汪景宽

中国农业科学. 2021, 54(10): 2132-2141. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.009

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【目的】明确东北典型黑土区土壤肥力指标的纬度特征及其关系,探究黑土地核心地带肥力调控的问题,为黑土地耕地质量调控和国家粮食稳产增产提供有力支撑。【方法】2018年秋收后,在研究区按纬度梯度采样,测定土壤有机质、酸碱度、全磷、全钾、速效磷、速效钾、碱解氮、容重、大微团聚体质量比等肥力指标和土壤含水量、土壤温度等环境指标,通过主成分分析、冗余分析和相关分析,明确研究区内各指标纬度变化特征及相互关系。【结果】东北典型黑土区土壤肥力指标具有明显的纬度分异特征,除容重属于弱变异外,其他肥力指标均属于中等变异。土壤有机质是该区域影响土壤肥力的核心指标,随纬度升高而增加,与大微团聚体质量比、碱解氮、速效磷、速效钾、全钾、全磷和酸碱度均呈显著正相关;与土壤含水量、土壤温度和容重呈负相关。纬度在46.07°—49.18°之间土壤容重变化对土壤肥力影响较大,纬度在42.99°—45.59°之间的土壤肥力受土壤容重、有机质含量、酸碱度等共同作用。【结论】在46.07°—49.18°范围内,可通过改善土壤容重方法调控土壤肥力指标,而在42.99°—45.59°范围内需要通过测土配方施肥对作物所需的土壤养分进行综合调控。对整个研究区而言,调控土壤有机质仍是当前培肥土壤的主要内容。

长期施用有机肥对潮土区甘薯碳氮积累与分配的影响

赵鹏,刘明,靳容,陈晓光,张爱君,唐忠厚,魏猛

中国农业科学. 2021, 54(10): 2142-2153. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.010

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【目的】甘薯碳氮积累与分配是影响产量形成的关键因素。研究长期有机肥料添加条件下甘薯碳氮积累与分配的响应关系,为实现潮土区甘薯高产高效栽培提供科学依据。【方法】以40年潮土长期定位试验（徐州）为平台,选择不施肥（CK）、施氮磷钾肥（NPK）、施有机肥料（M）、有机肥料+氮磷钾肥处理（MNPK）处理作为研究对象,测定分析不同施肥措施下耕作层土壤性质、甘薯收获期的地上/地下部生物量以及各主要功能器官的碳氮含量,阐明不同施肥处理对甘薯碳氮含量及其在各功能器官中的分配比例的影响,以及不同施肥措施下甘薯地上、地下部碳氮比（C/N）的变化,并运用主成分分析法解析甘薯碳氮分配与土壤性质的关系。【结果】长期有机肥配施氮磷钾化肥（MNPK）,相较单施有机肥料（M）或化肥（NPK）,甘薯块根生物量与干物质量显著提高（P<0.05）。同时土壤全氮、速效钾含量均显著提高（P<0.05）。通过对土壤性质与甘薯碳氮固持及碳氮比之间的相关性分析表明,甘薯各器官碳氮固持量与土壤有机碳（SOC）、全氮（TN）、速效钾含量呈极显著正相关（P<0.01）。而土壤有效磷（AP）含量并未与甘薯叶片碳氮含量表现出相关关系,但与块根氮固持量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数达0.839。甘薯叶片C/N与土壤EC呈极显著正相关（P<0.01）,叶柄与藤蔓C/N与土壤EC呈极显著负相关（P<0.01）,甘薯地下块根C/N与土壤有效磷含量呈极显著负相关（P<0.01）。通过对碳氮固持量在地上部、地下部的分配比例以及地上部、地下部的C/N进行主成分分析（PCA）,结果表明前两个轴共同解释了66.6%的变异,第一主成分轴贡献率为42.8%。CK与NPK处理在轴1上的排序较高,说明两者处理下土壤pH与EC值较高,且对于碳氮在甘薯地上部的分配以及地下部C/N的解释度较高。【结论】有机物料添加能够合理调配各器官C/N,提高碳氮在甘薯地下块根部分的分配比例,促进甘薯产量的形成。

病毒诱导基因沉默在蔬菜作物上应用的研究进展

李杰,罗江宏,杨萍

中国农业科学. 2021, 54(10): 2154-2166. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.011

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近年来,病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术作为一种研究植物基因功能的反向遗传学手段,因其构建简易、成本低、周期短等优势在功能基因组领域的研究更为广泛和深入。在蔬菜作物生长发育、逆境胁迫、物质合成和代谢调控等相关基因功能的研究中,VIGS作为一种快速、高效、高通量的基因沉默新技术发挥了重要作用。因此,利用VIGS技术开展蔬菜作物新基因的挖掘、抗病抗逆基因功能鉴定、作物改良、分子育种等相关研究的意义重大。目前,在蔬菜作物中已经成功建立了多种以病毒为载体的VIGS体系,但该体系仍然存在一些不足。随着研究者对VIGS作用机制的深入探究和病毒载体的不断开发,VIGS在蔬菜作物上的应用范围越来越广阔。本文通过梳理近年来国内外基于VIGS技术研究茄果类、瓜类和叶菜类等蔬菜基因功能的研究报道和发展趋势,对VIGS技术机制、病毒载体的应用以及VIGS技术进展做了简要解析,同时对比分析了VIGS技术与RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）以及当前较为流行的CRISP/CAS9技术的优缺点。重点介绍VIGS技术在蔬菜果实发育和抗病中的应用,对该技术在蔬菜作物物质代谢、激素调控、生物与非生物胁迫应答方面的最新进展进行了综述,并列举了利用VIGS技术研究茄果类、瓜类、叶菜类和豆类蔬菜靶基因功能和沉默表型的案例,总结了VIGS技术在研究蔬菜作物基因功能时缺乏适合的VIGS载体,缺乏有效的病毒载体侵染方法,在某些组织中难以系统性沉默,沉默效率低,VIGS固有的局限性等方面存在的问题和不足。同时提出了未来VIGS技术在开发特异性与稳定性更高的病毒载体,选择高效的基因片段,建立适合更多寄主范围的病毒载体等方面的研究方向。对VIGS技术用于蔬菜基因功能分析、蔬菜作物改良、分子育种以及生产不携带外源基因的蔬菜品种育成等方面的应用前景进行了展望,以期为开展蔬菜作物生长发育、次生代谢、逆境胁迫等相关基因功能研究以及突破制约VIGS技术的关键因素研究提供思路与参考。

甜瓜种皮颜色控制基因CmSC1的精细定位及候选基因分析

马建, 李丛丛, 黄亚婷, 谢雨黎, 程玲玲, 王建设

中国农业科学. 2021, 54(10): 2167-2178. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.012

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【目的】通过对甜瓜种皮颜色进行遗传分析及基因精细定位,并推测其候选基因和开发特异分子标记,为下一步该基因的功能研究及合理利用奠定基础。【方法】利用白色种皮材料HP22和黄色种皮材料B8、B150分别配制杂交组合,获得后代遗传分离群体并进行种皮颜色的表型调查及遗传分析,通过基因图位克隆方法完成基因的精细定位。通过对定位区间内注释基因进行编码区序列和功能分析确定关键候选目的基因。【结果】甜瓜白色种皮对黄色种皮为显性,由单显性基因CmSC1控制并表现延迟遗传效应。利用368个黄色种皮F₂单株最终将CmSC1精细定位于第5号染色体分子标记S27和S28之间物理距离约95 kb区间内,共包含12个注释基因。其中一个为拟南芥AtTT8同源的编码bHLH转录因子蛋白的MELO3C014406,经序列变异位点分析,黄色种皮材料B8和B150分别在该基因ATG下游第47位碱基处插入碱基A以及在第260位碱基处缺失14 bp导致翻译蛋白提前终止,致使后面功能结构域完全缺失,进而通过开发特异分子标记YS及序列分析,发现65份黄色种皮材料均发生这两种突变形式中的一种,推测MELO3C014406即为控制种皮颜色CmSC1的目的基因。【结论】本研究将控制种皮颜色的CmSC1精细定位于第5染色体95 kb区间内,推测MELO3C014406为最终目的基因,并开发了特异分子标记YS。

森林草莓FveD27的表达特性和功能

孙洪影,王岩,李伟佳,朱天姝,姜颖,许妍,吴清悦,张志宏

中国农业科学. 2021, 54(10): 2179-2191. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.013

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【目的】新型植物激素独脚金内酯是调控植物分枝发育的关键因子,但独脚金内酯在草莓生长发育中的作用尚不清楚。揭示森林草莓（Fragaria vesca）中独脚金内酯生物合成关键基因DWARF27（D27）的表达特性及主要功能,探索FveD27在草莓分枝以及生长发育过程中的作用,为研究草莓植株构型奠定理论基础。【方法】本研究选用森林草莓作为试验材料,利用RT-PCR方法克隆FveD27的编码区序列,利用MEGA 6.0分析草莓FveD27与苹果、拟南芥等物种中D27的系统进化关系;构建FveD27与GFP的融合载体,利用注射烟草叶片的方法对FveD27进行亚细胞定位分析;通过qRT-PCR技术对FveD27在森林草莓不同器官的表达水平进行定量分析,同时构建FveD27启动子与GUS融合表达载体并通过农杆菌介导法将其转化到森林草莓中,利用GUS染色进一步分析FveD27的表达特性;构建FveD27过表达载体并通过农杆菌介导的叶盘法进行稳定遗传转化,获得FveD27过表达草莓株系。【结果】从森林草莓中克隆出编码区长度为789 bp的FveD27序列;烟草的亚细胞定位结果表明FveD27定位在叶绿体;FveD27在森林草莓组织器官中的表达量由高至低依次为幼叶、茎尖、叶柄、成熟叶、根;克隆出长度为1 670 bp的FveD27启动子序列,GUS活性分析结果显示转pFveD27::GUS融合基因草莓植株的幼叶和芽等部位GUS活性较强,而成熟叶与叶柄部位GUS活性较弱,根部几乎无GUS活性,GUS染色分析揭示的基因表达结果与qRT-PCR结果相符;构建了FveD27过表达载体并通过农杆菌介导获得了过表达FveD27的草莓转基因株系,表型调查结果表明过表达FveD27能够显著抑制新茎分枝的形成,同时增加花序数量。【结论】FveD27具有调控森林草莓新茎分枝发育、花序数量等功能。研究结果可为调控草莓新茎分枝数量和产量等提供新思路。

细胞凋亡对宰后肌肉嫩化作用机理的研究进展

黄峰,魏起超,李侠,刘春梅,张春晖

中国农业科学. 2021, 54(10): 2192-2202. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.014

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嫩度是决定肉食用品质的重要指标。宰后肉的嫩度发生不连续变化,严重降低了消费者的购买意愿,因此阐明宰后嫩化机理一直是肉品科学领域的研究热点。自“凋亡”的概念引入至宰后肌肉嫩化过程后一直广受关注,动物被屠宰放血后,活性氧（reactive oxygen species,ROS）大量累积,ATP（adenosine triphosphate）逐渐耗尽,必然导致细胞死亡。宰后肌细胞死亡和肌肉嫩化都是在一系列调控因子作用下激活肌肉内源酶,并由内源酶水解蛋白质破坏细胞结构,因此这两个生化过程被认为高度相关。本文综述了宰后肌细胞主要以凋亡的形式死亡,分析了除凋亡外,宰后早期产生少量ROS时细胞会通过自噬启动自身防御系统,宰后后期ATP逐渐耗尽肌细胞可能从凋亡转变为坏死;明确了线粒体通路是宰后肌肉中细胞凋亡酶激活的关键路径,线粒体死亡因子释放是细胞内死亡级联反应的总开关,其开放状态直接决定着细胞以何种途径进行死亡,并进一步从线粒体膜通透化和内膜嵴重构两方面,讨论了宰后线粒体损伤诱导凋亡因子的释放机理;综述了线粒体损伤变化及其对嫩化过程的影响,并从线粒体通过参与能量代谢影响肌肉pH以及通过释放凋亡因子调控细胞凋亡酶活性两方面分析了其潜在机理;探讨了宰后肌肉线粒体与内质网间相互作用以影响Ca²⁺信号传导以及细胞凋亡过程,或与溶酶体相互作用,破坏溶酶体膜稳定性,使其释放组织蛋白酶以激活线粒体Bax和Bid而加速线粒体膜通透性;综述了细胞凋亡酶在宰后早期被激活,并参与部分肌原纤维蛋白的有限降解,但随着宰后时间的延长,ATP逐渐耗尽等因素导致细胞凋亡酶失活,因此细胞凋亡酶只参与宰后早期的嫩化过程。综述内容可为完善宰后肌肉嫩化过程提供理论参考。

提高幼畜健康水平,促进畜产品品质提升

屠焰,刁其玉

中国农业科学. 2021, 54(10): 2203-2205. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.015

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高脂肪日粮对早期断奶羔羊断奶前后能量代谢和屠宰性能的影响

李文娟,陶慧,张乃锋,马涛,刁其玉

中国农业科学. 2021, 54(10): 2206-2216. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.016

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【目的】脂肪是动物日粮中一种重要的营养元素,也是主要的供能物质,在动物生产中起重要作用,本研究旨在探讨早期断奶湖羊公羔羊在断奶前饲喂高脂肪日粮对其断奶前后生长性能、能量代谢和屠宰性能的影响,为早期断奶羔羊健康培育提供理论依据和技术支撑。【方法】试验采用配对试验设计,选用出生日龄相似、体重接近、健康的湖羊双胞胎公羔30对,在7日龄断母乳,随后每对双胞胎随机分为两个处理,即高脂肪日粮组（high fat记为HF:饲喂代乳粉和开食料的脂肪水平为26.89%和5.07%）和正常脂肪日粮组（normal fat 记为NF:饲喂代乳粉和开食料的脂肪水平为15.15%和2.80%）,每处理10个重复,每个重复3只羊,饲喂在同一个圈舍。在7—60日龄期间,两组羔羊饲喂不同脂肪水平的代乳粉及颗粒料,饲喂至60日龄断代乳粉。60—120日龄期间两组羔羊饲喂相同颗粒料。羔羊分别于50—60、110—120日龄按平均体重随机选择9对双胞胎羔羊采用全收粪尿法进行消化代谢试验,用于评估断奶前饲喂不同脂肪水平日粮的羔羊断奶前后两阶段能量代谢情况,60及120日龄分别按照试验羊平均体重随机屠宰9对双胞胎羔羊,测定羔羊断奶前后的屠宰性能、器官指数及胃肠道发育情况。【结果】在断代乳粉前,两组羔羊的每日总干物质采食量（DMI）,摄入总能（GE）、粪能（FE）、尿能（UE）、总能的表观消化率、总能代谢率（ME/GE）,空体重（EBW）、屠宰率、GR值,及除蹄重外各器官、各胃室和各肠道占宰前活重的比例没有显著差异（P>0.05）;但60日龄HF组羔羊体重,DE、ME、DE/ME,宰前活重（LBW）、头重、心重、蹄重及蹄重占宰前活重的比例、瓣胃重及小肠重有高于NF组羔羊的趋势（0.05<P<0.1）,眼肌面积及皱胃重显著高于NF组（P<0.05）。断代乳粉后,所有羔羊饲喂同一种颗粒料至120日龄,前期饲喂高脂肪日粮组的羔羊61—120阶段的DMI和120日龄时羔羊BW,LBW、EBW、HCW、皮+毛重、心重、蹄重占宰前活重的比例及瘤胃重显著高于NF组羔羊（P<0.05）,脾、肾重有高于NF组羔羊的趋势（0.05<P<0.1）;断代乳粉前饲喂高脂肪日粮不影响断奶后羔羊的能量代谢、其他器官指数及胃肠道发育（P>0.05）。【结论】在本试验条件下,断奶前饲喂高脂肪日粮可提高羔羊断奶前体重、消化能和代谢能,改善胴体重及眼肌面积。哺乳期饲喂高脂肪日粮显著提高羔羊断奶后采食量、体重、宰前活重和胴体重。总之,断奶前提高日粮的脂肪含量可对湖羊双胞胎公羔断奶前后的能量代谢和屠宰性能产生积极影响。

早期断奶和育肥期饲粮NDF水平对湖羊生长性能和消化代谢的影响

黄文琴,吕小康,庄一民,崔凯,王世琴,刁其玉,张乃锋

中国农业科学. 2021, 54(10): 2217-2228. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.017

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【目的】以湖羊公羔为试验对象,探究早期断奶补饲和育肥前、后期饲粮NDF水平对羔羊生长发育和消化性能的持续影响,计算试验因素间的叠加效应,筛选出最佳的组合饲养方式。【方法】选取体重[ (8.26±2.14) kg]、日龄[(20±2) d]接近的健康湖羊公羔120只,随机分为4组,每组6个重复,每重复5只;饲粮NDF水平设置:育肥前期低（33%）高（38%）水平,育肥后期低（28%）高（33%）水平。4组处理分别为:早期断奶+育肥前低NDF饲粮+育肥后低NDF饲粮（EW-LL）;早期断奶+育肥前期低NDF饲粮+育肥后期高NDF饲粮（EW-LH）;早期断奶+育肥前期高NDF饲粮+育肥后期高NDF饲粮（EW-HH）;随母哺乳+育肥期前高NDF饲粮+育肥期后期高NDF饲粮（ER-HH）。早期断奶羔羊在20日龄由随母哺乳逐渐过渡到饲喂代乳粉,同时补饲开食料,所有试验羔羊育肥周期为61-180日龄。试验期160 d。测定羔羊不同阶段体重和采食量,在羔羊2、4、6月龄进行消化代谢试验。【结果】1）4组羔羊全期体重无显著差异（P>0.05）,除46—65日龄,其余各阶段各组间日增重无显著差异（P>0.05）。2）早期断奶羔羊21—65日龄干物质采食量显著高于随母哺乳羔羊（P<0.05）,早期断奶组中,育肥前后期均采食低NDF水平饲粮的羔羊121—180日龄时颗粒料采食量显著高于其他两组（P<0.05）。3）早期断奶组羔羊哺乳期营养物质消化率及能氮利用率低于随母哺乳组。进入育肥期后,消化代谢能力优势转移,育肥前期低NDF组羔羊干物质、有机物消化率显著高于高NDF组（P<0.05）,叠加效应分析EW-LL组全期日增重增效最高,但早期断奶和育肥前期饲喂低NDF饲粮这两种饲喂方式的叠加效果为-50.57%。【结论】从整个育肥周期来看,早期断奶补饲代乳粉对羔羊生长性能有促进作用,育肥前期低NDF水平饲粮育肥效果相比高NDF水平效果较差;而育肥后期试验羔羊饲粮相同时,育肥前期饲喂低NDF饲粮的羔羊增重效果优于饲喂高NDF饲粮的羔羊。综合羔羊整个饲养阶段生长和消化代谢情况分析,饲养效果明显的4组顺序为EW-LL>EW-LH=EW-HH>ER-HH。本试验条件下推荐组合为早期断奶+育肥前期饲粮NDF水平33%+育肥后期饲粮NDF水平28%。

日粮添加肉桂醛对奶牛公犊生长、健康及瘤胃发酵性能的影响

杨云燕,王其炎,彭地纬,潘一帆,高晓梅,宣泽义,陈少梅,邹彩霞,曹艳红,林波

中国农业科学. 2021, 54(10): 2229-2238. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.018

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【目的】在犊牛开食料中添加肉桂醛,研究其对早期奶牛公犊生长性能、健康、瘤胃发酵及微生物区系的影响,为肉桂醛在早期犊牛的培育应用提供理论依据。【方法】试验选24头出生2周龄、体重相接近,健康状况良好的荷斯坦奶牛公犊,分为对照组和试验组,每组3个重复,每个重复4头,对照组饲喂基础开食料,试验组在开食料中添加0.3%含油率为15%的包被肉桂醛。哺乳期预饲期6 d,正饲期27 d,两组饲喂等量牛奶,开食料及燕麦草自由采食,断奶日通过胃管采集瘤胃液;断奶后全部动物按照相同饲养管理方式继续饲喂51 d,试验末通过胃管采集瘤胃液。试验期的两个阶段均测定奶牛公犊采食量,生长性能、体尺指标、粪便评分和瘤胃挥发性脂肪酸指标,并基于16SrDNA基因高通量测序法对奶牛公犊瘤胃细菌区系测定分析。【结果】1)在采食量和生长性能方面,犊牛哺乳阶段、断奶后以及试验全期,试验组的平均日增重、干物质采食量、料重比等指标与对照组差异不显著(P>0.05),试验组与对照组在体尺指标中各阶段差异不显著(P>0.05);2)在犊牛健康方面,试验组犊牛腹泻率均低于对照组,但与对照组腹泻率差异不显著(P>0.05);3)在瘤胃发酵指标方面,断奶日试验组各挥发性脂肪酸的含量均低于对照组,但差异不显著(P>0.05);试验末试验组乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和总挥发性脂肪酸极显著高于对照组（P<0.01）;4) 试验末,肉桂醛显著提高了瘤胃香农多样性指数,降低了辛普森指数;在门水平上降低了Bacteroidetes菌群丰度,提高了Firmicutes和Actinobacteria丰度;在属水平上仅提高了Prevotella丰度。【结论】通过开食料对犊牛补饲0.3%含油率为15%的包被肉桂醛对哺乳期及断奶后的生长性能没有影响,但降低了腹泻率,显著提高了断奶犊牛瘤胃挥发性脂肪酸浓度并降低了乙酸/丙酸比例,提高了瘤胃细菌菌群多样性和Firmicutes和Prevotella菌丰度,表明日粮中添加0.3%的包被肉桂醛对犊牛生长性能无负作用,但可改变瘤胃微生物区系并调控瘤胃发酵模式。

葡萄籽原花青素对羔羊瘤胃发酵、血清炎症及抗氧化指标的影响

郝小燕,牟春堂,乔栋,张暄梓,杨文军,赵俊星,张春香,张建新

中国农业科学. 2021, 54(10): 2239-2248. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.10.019

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【目的】研究高精料饲粮条件下,添加不同水平葡萄籽原花青素（GSPs）对杜寒杂交羔羊生长性能、瘤胃发酵、瘤胃及血清炎症因子及抗氧化能力的影响。为葡萄籽原花青素在反刍动物生产中的应用提供数据参考。【方法】选择48只体重相近（22.75±1.20 kg）、月龄相近的杜泊×小尾寒羊杂交公羔,采用单因素完全随机试验设计,将48只羔羊随机分为4组,每组12只。基础饲粮精粗比为7:3,GSPs添加量分别为0（对照组,CON）、10（10GSPs）、20（20GSPs）、40（40GSPs）mg·kg^-1 BW。饲养期共60 d,前15 d为预饲期。正试期第1天晨饲前称量体重作为初始体重。正试期结束后颈静脉采集血液并分离血清,用于抗氧化指标、炎性因子和脂多糖含量测定;同时每组随机选择6只分别于饲喂后1、3、4、6、8、12 h口腔采集瘤胃液,立即测定瘤胃液pH,饲喂后3 h瘤胃液样品用于测定发酵指标及脂多糖含量。每组剩余6只进行屠宰,采集瘤胃组织测定抗氧化指标和炎症因子水平。【结果】10GSPs和20GSPs组的末体重显著高于对照组（P<0.05）,与40GSPs组差异不显著（P>0.05）。10GSPs和20GSPs组ADG和ADFI显著高于对照组和40GSPs组（P<0.05）,而40GSPs组与对照组差异不显著（P>0.05）;添加GSPs对瘤胃pH有一定的调控作用,饲喂后3、8、12 h瘤胃pH随GSPs添加水平增加而线性升高（P<0.05）,4 h瘤胃pH较对照组有线性升高趋势,但差异不显著（P=0.057）;添加GSPs后瘤胃液中乙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度有降低的趋势（P<0.1）,对丙酸、异戊酸、戊酸浓度及乙酸/丙酸值没有显著影响（P>0.05）;添加GSPs后血清脂多糖浓度较对照组显著降低（P<0.05）,但不影响瘤胃液中脂多糖浓度。20GSPs和40GSPs组瘤胃组织GSH-Px活性显著高于对照组和10GSPs组,MDA含量显著低于对照组和10GSPs组（P<0.05）。20GSPs和40GSPs组血清SOD活性显著高于对照组,GSH-Px活性显著高于对照组和10GSPs组（P<0.05）。添加GSPs对瘤胃组织炎症因子没有显著影响,但有降低IL-6和IL-10的趋势（P<0.1）。20GSPs和40GSPs组血清TNF-α水平显著低于对照组和10GSPs组（P<0.05）;40GSPs组血清IL-10含量显著低于对照组（P<0.05）,与10GSPs和20GSPs组差异不显著（P>0.05）。【结论】高精料饲粮条件下补饲适量GSPs可以提高羔羊瘤胃pH,提高血清和瘤胃组织抗氧化能力,对羔羊健康具有潜在的保护效应。在本试验条件下,GSPs的最佳饲喂量为20 mg·kg^-1BW。

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