专题——作物抗病虫相关基因的挖掘与利用

作物抗病虫相关基因的挖掘与利用

何旎清, 林少俊, 程朝平, 杨德卫

中国农业科学 2024,57(23 ):4589 -4592. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2024.23.001

摘要（260）

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胱硫醚-β-合成酶OsCBSX4调控水稻稻瘟病抗性的机理

刁志娟, 陈立喆, 王勋, 鲁玲, 刘燕, 张静, 夏娜, 唐定中, 李生平

中国农业科学 2024,57(23 ):4593 -4606. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2024.23.002

摘要（230）

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【目的】稻瘟病是影响水稻产量和品质的主要病害之一，OsBSK1-2在水稻稻瘟病抗性中发挥着重要作用。前期通过对OsBSK1-2进行互作蛋白筛选，获得候选蛋白胱硫醚-β-合成酶OsCBSX4。验证OsBSK1-2与OsCBSX4之间的相互作用，解析OsCBSX4在水稻抵抗稻瘟病中的功能及作用机制，为水稻抗病育种提供重要的理论基础。【方法】利用免疫共沉淀、双分子荧光互补和荧光素酶互补试验验证OsBSK1-2与OsCBSX4之间的相互作用；利用实时荧光定量PCR和农杆菌介导的烟草瞬时转化，分析OsCBSX4的表达特征及蛋白定位；利用CRISPR/Cas9和农杆菌介导的遗传转化技术构建OsCBSX4敲除和过量表达植株，并通过接种稻瘟菌进行稻瘟病抗性鉴定；同时，通过ROS爆发测定和DAB染色分析，明确oscbsx4突变体中稻瘟菌和chitin诱导的免疫反应变化；此外，利用双分子荧光互补和荧光素酶互补试验验证OsCBSX4与OsRbohB之间的相互作用，用离体接菌法分析OsCBSX4的代谢产物对水稻抵抗稻瘟菌的影响，揭示OsCBSX4的免疫功能和作用机制。【结果】免疫共沉淀、荧光素酶互补及双分子荧光互补试验均表明OsBSK1-2与OsCBSX4之间存在相互作用。敲除OsCBSX4降低了水稻对稻瘟菌的抗性，喷雾接种稻瘟菌后，与野生型相比，oscbsx4突变体病斑数量更多；打孔接种稻瘟菌后，oscbsx4突变体较野生型病斑面积更大，稻瘟菌生长量更多。同时，OsCBSX4的功能缺失也降低了稻瘟菌侵染所诱导的病程相关基因OsRP5、OsPR10的表达和H₂O₂的积累，以及chitin诱导的ROS爆发。而过量表达OsCBSX4则提高了水稻的稻瘟病抗性，打孔接菌后，与野生型相比，过量表达OsCBSX4植株病斑面积更小，稻瘟菌生长更少。同时，OsCBSX4能够与介导水稻ROS产生的关键蛋白OsRbohB互作。此外，用OsCBSX4的代谢产物L-胱硫醚处理水稻，并不影响水稻的稻瘟病抗性。【结论】 OsCBSX4为OsBSK1-2信号通路中的重要组分，正调控水稻的稻瘟病抗性及免疫反应，OsCBSX4可能是通过与OsRbohB互作而影响ROS的产生，进而调控水稻免疫。

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水解酶基因BGIOSGA023826在稻瘟菌侵染过程中的抗病表型效应

赵婕, 赵龙缘, 潘凝辉, 管丽蓉, 杜云龙, 李成云, 王云月, 谢勇

中国农业科学 2024,57(23 ):4607 -4618. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2024.23.003

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【目的】月亮谷（Acuce）是云南重要的地方水稻种质资源，也是目前元阳哈尼梯田的主栽品种，种植历史已逾百年，却未曾有过稻瘟病大流行的发生。探索其对稻瘟病的抗性机制，明确参与抗性反应过程功能基因的种类、数量、表达特征及其表型效应，有助于保护和利用水稻地方品种。【方法】以前期月亮谷-稻瘟菌互作转录组中筛选到与抗病表型高度相关的候选基因BGIOSGA023826为研究对象，首先进行基因克隆及生物信息学分析，然后通过构建过表达载体进行农杆菌遗传转化，获得过表达植株，并进行过表达植株阳性鉴定和抗病表型分析，最后利用实时荧光定量PCR进行过表达植株PR基因表达分析，以及通过酶联免疫测定内源激素含量的变化。【结果】候选基因BGIOSGA023826为一个水解酶基因，编码354个氨基酸，是不稳定疏水蛋白且不存在跨膜域，不属于膜蛋白，为非分泌性蛋白；与日本晴相比，BGIOSGA023826过表达植株对稻瘟病的抗性显著增强；实时荧光定量PCR结果显示，接种后，与日本晴相比，PR基因PR1b、OsNPR1、OsAOS2和转录因子基因WRKY45的相对表达量显著上调，PR1b及茉莉酸合成途径的关键基因OsAOS2在12 hpi表达量持续上调；转录因子基因WRKY45表达量在24 hpi显著上调，至36 hpi时达到峰值，比日本晴上调近2倍；内源激素含量测定结果表明，JA含量在12 hpi升高至263.88 pmol·L^-1，到36 hpi时达到高峰304 pmol·L^-1；水杨酸（SA）含量在24 hpi升高至186.5 pmol·L^-1，36 hpi时达到峰值198.88pmol·L^-1；活性氧（ROS）含量也持续上升，且当ROS在36 hpi达到峰值时，丙二醛（MDA）含量也从40.43 nmol·g^-1增至53.94 nmol·g^-1；而过表达植株的超氧化物歧化酶（SOD）在各接种时段活性差异不大，但在日本晴中呈现上升趋势。【结论】明确了水解酶基因BGIOSGA023826与PR基因及内源激素含量在稻瘟菌侵染初期的时空表达关系，证明其参与了月亮谷对稻瘟菌侵染的抗病过程。

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水稻抗褐飞虱基因QBPH1和QBPH4的精细定位与聚合效应分析

熊尚烨, 张翔, 梁宝慧, 叶仰东, 李浴阳, 朱晓, 朱志鸿, 官华忠, 张帅, 吴建国, 胡杰

中国农业科学 2024,57(23 ):4619 -4631. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2024.23.004

摘要（228）

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【目的】利用遗传群体发掘新的水稻抗褐飞虱QTL，并评估其聚合效应，为抗虫育种提供重要的遗传材料和基因资源。【方法】利用日本晴（感虫型）和佳辐占（抗虫型）的重组自交系（RILs）群体，结合苗期抗性评价和极端混池测序法（BSA-seq）定位抗褐飞虱QTL。进一步通过QTL精细定位、候选基因鉴定、聚合效应分析及混池转录组测序（BSR-seq），揭示QTL介导的抗性生理和分子机制。aaaa【结果】 BSA-seq分析，在水稻第1（30—32 Mb区段）和第4（5—7 Mb区段）染色体上定位到2个主效抗性QTL，分别命名为QBPH1和QBPH4。通过区间连锁的分子标记，验证了这些QTL的真实性。QBPH4与已克隆的BPH3和BPH15位于同一位置，而QBPH1为一个新发现的QTL。通过加密标记和重组单株分析，将QBPH1的位置精确到30.61—30.65 Mb。在此区域内，Os01g53294和Os01g53330分别编码呼吸爆发氧化酶蛋白B和花青素5,3-O-葡萄糖基转移酶，被认为是QBPH1的可靠候选基因。此外，通过对比QBPH1和QBPH4单基因及其聚合家系在苗期的抗性、褐飞虱蜜露面积和重量、虫增重、致死率、偏好性等指标，发现双基因聚合家系的抗性未显著增强。QBPH1和QBPH4均介导了抗生性和趋避性的生理机制，但其效应存在差异。BSR-seq分析揭示了QBPH1的不同等位基因型在转录调控、蛋白质氨基酸磷酸化和氧化还原过程中的差异表达基因（DEGs）显著富集。此外，与茉莉酸（jasmonic acid，JA）合成和信号传导路径相关的基因在抗虫材料中得到显著上调，并通过RT-qPCR试验得到了验证。【结论】成功在水稻第1染色体上鉴定了一个新的抗褐飞虱QTL——QBPH1。该QTL介导了水稻对褐飞虱的抗生性和趋避性，但与另一QTL的聚合效应并不显著。QBPH1可能通过参与JA通路来介导对褐飞虱的防御机制。在此基础上，Os01g53294和Os01g53330被确定为QBPH1的可靠候选基因。

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大豆抗花叶病毒病基因GmRHF1的克隆及功能分析

冯雯蜜, 周芳雪, 于哲, 牟可欣, 井妍, 李海燕

中国农业科学 2024,57(23 ):4632 -4643. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2024.23.005

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【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，SMV）引起的大豆花叶病毒病严重制约着大豆的产量和品质，通过序列变异分析、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）等技术验证了大豆RING-H2型锌指蛋白基因GmRHF1的抗病功能，利用酵母双杂交试验和荧光素酶互补试验筛选并验证其互作蛋白，为深入探究GmRHF1的抗SMV作用机制奠定基础。【方法】首先，从大豆品种徐豆14（高抗SMV）和石山黑豆（高感SMV）中分别克隆GmRHF1，并在代表性抗、感种质资源中分析序列变异的一致性，挖掘基因抗病优异变异。其次，利用荧光定量PCR分析基因在不同组织的表达量差异及SMV处理下基因的表达量变化趋势；同时，采用病毒诱导的基因瞬时沉默技术验证GmRHF1的抗SMV功能。通过酵母cDNA文库筛选、酵母对点验证和荧光素酶互补试验筛选并验证GmRHF1的互作蛋白。最后，利用病毒诱导的基因瞬时沉默技术验证GmClpP6的抗SMV功能，明确GmRHF1与GmClpP6互作对大豆抗SMV的生物学意义。【结果】 GmRHF1具有E3泛素蛋白连接酶家族RING-H2型保守结构域，属于典型的RING-H2 finger家族成员。序列变异分析发现GmRHF1具有一个自然存在的非同义突变，可能与SMV抗感性相关。荧光定量PCR显示，病毒诱导后，GmRHF1在抗病材料中的表达量水平显著高于感病大豆。病毒诱导的基因沉默试验显示，有效沉默GmRHF1大豆的叶片降低了大豆对SMV的抗病性，说明GmRHF1具有抗SMV功能。通过酵母cDNA文库，筛选到30个GmRHF1的潜在互作蛋白，利用酵母对点验证和荧光素酶互补试验，证实GmRHF1与GmClpP6间的互作关系。同时，病毒诱导的基因瞬时沉默试验表明，在有效沉默GmClpP6的植株叶片中，大豆对SMV的抗病性减弱。【结论】大豆GmRHF1在编码区序列中存在的非同义突变可能与SMV抗感性相关；GmRHF1可与GmClpP6发生相互作用。GmRHF1在SMV抗性反应中具有重要作用。

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