中国农业科学

植物安全转基因技术研究现状与展望

王根平, 杜文明, 夏兰琴

中国农业科学. 2014, 47(5): 823-843. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.001

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转基因技术是进行基因功能研究和作物遗传改良的重要工具。根癌农杆菌介导转化法和基因枪轰击法是两种主要的遗传转化方法。从1996年首例转基因作物商业化种植以来，2012年全球有28个国家和地区种植转基因作物，种植面积已达1.7亿公顷。随着全球转基因作物的大面积商业化种植，转基因植物的安全性越来越多地受到公众关注。安全转基因技术的研发对于转基因植物的商业化生产具有重要意义。文章详细介绍了目前已报道的安全转基因技术原理及其应用现状。按其作用原理和目的将其分为4类：安全选择标记、标记基因删除及基因叠加、基因漂移防控法和基因定点编辑整合技术。其中，安全选择标记按其筛选原理分为糖代谢相关标记、氨基酸代谢相关标记、激素相关标记和抗逆相关标记。与抗生素和除草剂抗性标记相比，这类标记基因及其表达产物对人和其他生物更安全。标记基因删除及基因叠加技术包括共转化法、位点特异性重组法、转座子法、同源重组法以及基于位点特异性重组的基因叠加技术，其中共转化法又包括农杆菌介导的共转化法和基因枪介导的表达盒共转化法。基因叠加技术为复合性状转基因植物研发奠定了基础，有望成为未来多性状转基因植物研发的重要技术之一。基因漂流防控法包括叶绿体转化法和基因拆分法。基因定点编辑和整合技术包括锌指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9系统介导的基因定点编辑和整合技术。其中，TALEN和CRISPR/Cas9技术，设计简单，成本低，易操作，靶点分布广泛，有望成为安全转基因研发和应用的重要技术。文章对这些技术原理及其应用现状进行了综述，讨论了其优缺点，并展望了安全转基因技术研发重点和发展趋势。

人工合成小麦衍生品种的物质积累、冠层结构及群体光合特性

汤永禄, 李朝苏, 吴晓丽, 吴春, 杨武云, 黄钢, 马孝玲

中国农业科学. 2014, 47(5): 844-855. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.002

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【目的】人工合成六倍体小麦（synthetic hexaploid wheat，SHW）具有较强的抗逆能力和高产潜力，研究SHW衍生品种的物质积累与分配、冠层结构与光合特性，为区域小麦遗传改良和产量提升奠定基础。【方法】2011—2013年在四川广汉市选择3个SHW衍生品种和5个非SHW衍生品种（普通小麦品种），测定主要生育阶段的物质积累与分配、开花灌浆阶段的冠层结构与光合参数。【结果】联合方差分析表明，产量和主要农艺性状均存在显著的年际、品种及其互作效应，且年际效应大于品种与互作效应。SHW衍生品种3年平均产量9 163 kg•hm-2、19 133粒/m2、千粒重47.5 g，分别比普通小麦品种高12.31%、5.31%和7.95%；其干物质积累速率，尤其是生育前期的干物质积累速率明显高于普通小麦品种，如播种—分蘖、分蘖—拔节的干物质积累速率分别比普通小麦品种高18.66%和20.46%，相应地主要生育阶段的干物质积累量、干物质转移量和转移贡献率也高于普通小麦品种。成熟期SHW衍生品种的叶片、穗轴（颖壳）、茎鞘干物质占成穗茎总干重的比例分别比普通小麦品种低15.46%、7.14%和2.65%。SHW衍生品种植株中等偏高，但上部叶片短而宽，株型相对紧凑；开花期参试品种之间冠层分析仪参数没有显著差异，但SHW衍生品种在灌浆中期的太阳直接辐射透过系数较低，而消光系数较高。SHW衍生品种的群体光合速率较高，而旗叶光合速率优势不明显。籽粒产量与粒数/m2、花后叶片SAPD、灌浆中期群体光合速率、消光系数等性状呈极显著正相关。【结论】参试的SHW衍生品种株型相对紧凑、前期物质积累较快，成熟后非籽粒器官干物质分配比例较低，花后冠层叶片持绿期较长、群体光合效率较高，粒数与粒重协调、增产明显。

中国328个玉米品种（组合）SSR标记遗传多样性分析

王凤格, 田红丽, 赵久然, 王璐, 易红梅, 宋伟, 高玉倩, 杨国航

中国农业科学. 2014, 47(5): 856-864. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.003

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【目的】从育成年份、种植区域角度分析中国328个玉米品种的遗传多样性，在分子水平上分析各适宜种植区域品种的遗传分化特点，为玉米品种区域试验、审定管理以及育种策略提供一定的理论依据。【方法】利用均匀分布于玉米基因组的40对核心SSR引物，采用10重荧光毛细管电泳检测技术对328个代表性育成品种进行基因分型；通过Power-Marker ver.3.25软件评估40对SSR引物多态性，对参试品种按年份、区试组分析遗传多样性情况；利用多变量统计分析软件MVSP ver.3.13对328个品种按区试组进行主坐标分析。【结果】基于328个玉米品种数据，检测到40对SSR引物等位基因变异范围为3—16个，平均8.10个，多态信息指数（PIC）值变化范围为0.18—0.85，平均为0.63。参试品种不同年份间遗传多样性变化不大，PIC值在0.60左右摆动；8个区试组品种的总等位基因和总基因型变异范围为170—262和200—511，京津唐和西南组分别表现出了最低值和最高值，京津唐组PIC值最低为0.51，其余组均接近于0.60，平均杂合度均在0.60左右。8个区试组主坐标分析显示鲜食、极早熟品种遗传分布偏离普通玉米区域，具有明显的种质特异性；青贮玉米由于早期对照品种为普通玉米导致遗传分布向普通玉米延伸，仅有少数品种分布偏离普通玉米；京津唐、西南、东北早熟三组品种遗传分布相对集中；极早熟、京津唐、西南三组之间品种遗传分布几乎无重叠区域；东华北和黄淮海两组参试品种遗传分布具有明显的分化但也有部分重叠，原因与对照品种曾经相同、育种同质化有关。【结论】利用SSR标记分析328份玉米品种的遗传多样性及遗传分化特点，表明近年来育成品种遗传多样性指数在不同年份间变化不大，除京津唐组之外在其它区试组间差异性也不大。参试品种主坐标分析显示各区试组划分、对照品种设置起到了育种导向的作用。

钵苗机插水稻群体动态特征及高产形成机制的探讨

胡雅杰1, 邢志鹏1, 龚金龙1, 刘国涛1, 张洪程1, 戴其根1, 霍中洋1, 许轲1, 魏海燕1, 郭保卫1, 沙安勤2, 周有炎2, 罗学超2, 刘国林2

中国农业科学. 2014, 47(5): 865-879. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.004

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【目的】旨在阐明钵苗机插水稻产量构成特征和群体动态特征以及高产形成机制。【方法】2010年选用24个不同单穗重粳稻品种统一高产栽培，以成熟期平均单穗重聚类分析划分3种穗型，并每种穗型筛选2个具有代表性品种。2011—2012年采用大穗型品种甬优8号和甬优2640，中穗型品种武运粳24号和宁粳3号，小穗型品种淮稻5号和淮稻10号为试验材料，在江苏省兴化市钓鱼镇进行大田试验，以毯苗机插水稻为对照，系统研究钵苗机插水稻产量及其产量构成、群体茎蘖动态、叶面积指数动态和干物质积累动态特征，并从秧苗素质、栽后物质积累、阶段光合物质生产、光合势、群体生长率、净同化率、株型特征、茎鞘物质输出与转运、根系活力等方面深入探讨钵苗机插水稻高产形成机制。【结果】钵苗机插水稻产量显著或极显著高于对照，大穗型品种增产8.71%—11.11%，中穗型品种增产6.85%—7.89%，小穗型品种增产5.30%—6.34%。钵苗机插水稻产量的提高主要原因是在足够穗数的基础上，显著或极显著增加每穗粒数，进而提高群体颖花量，同时保持稳定的结实率和千粒重。与对照相比，钵苗机插水稻群体茎蘖数栽后增长快，高峰苗适宜，拔节后群体茎蘖数消减缓慢，最终有效穗数足，成穗率高；群体叶面积指数和干物质积累量，有效分蘖临界叶龄期钵苗机插水稻显著高于对照，拔节期两者相当，孕穗后钵苗机插水稻显著或极显著高于对照，成熟期叶面积指数钵苗机插水稻较对照高出5.17%—11.00%，干物质积累量钵苗机插水稻较对照高出5.36%—9.20%。钵苗机插水稻高产形成机制为带土带蘖栽插，秧苗素质高，群体起点质量优，活棵早，分蘖快，低位分蘖多，栽后地上和地下部物质积累多，为争足穗、促壮秆和攻大穗奠定生物学基础；抽穗期株型紧凑，叶系配置优，叶面积大，比叶重高，基部茎秆粗壮，粒叶比高，形成高光效高质量群体；生育后期根系活力强，叶面积衰减慢，光合势大，群体生长率和净同化率高，干物质积累多，灌浆充实量大，茎鞘物质输出与转运合理。【结论】钵苗机插水稻群体起点质量高，栽后分蘖早生发快，群体生长优势明显，特别是生育中后期光合生产能力强，物质积累多。钵苗机插水稻产量构成特征表现为“穗数足、穗型大、粒数多”。

渭北旱塬小麦玉米轮作区不同耕作方式对土壤水分和作物产量的影响

柏炜霞1, 李军1, 王玉玲1, 王丽2

中国农业科学. 2014, 47(5): 880-894. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.005

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【目的】陕西渭北旱塬属于暖温带半湿润易旱气候区，干旱对旱地农作物生产威胁严重，降水短缺及其季节分布不均制约着旱地冬小麦和春玉米生长发育，是导致作物产量低而不稳的主要因素。论文旨在探索渭北旱塬冬小麦—春玉米轮作区在不同轮耕措施下土壤蓄水保墒效果和作物增产增收效应。【方法】于2007—2013年在陕西合阳实施了免耕/深松、深松/翻耕、翻耕/免耕、连续翻耕等不同耕作处理田间定位试验，测定休闲期和作物生育期土壤水分及作物收获期土壤理化性状，分析各耕作处理作物产量和水分利用效率的变化规律。【结果】（1）3种耕作处理均能降低土壤容重，提高土壤孔隙度，增加田间持水量和土壤有机质，且以免耕/深松轮耕处理效果最佳，与连续翻耕相比，免耕/深松轮耕处理平均土壤容重较连续翻耕处理降低3.6%，平均土壤孔隙度、田间持水量和土壤有机质含量较连续翻耕处理分别增加4.4%、11.6%和6.9%。（2）在6个试验年度的3个休闲期间，平均土壤蓄墒率：免耕/深松＞翻耕/免耕＞深松/翻耕＞连续翻耕，免耕/深松、深松/翻耕和翻耕/免耕处理平均土壤蓄墒率较连续翻耕处理分别增加22.4个百分点、4.4个百分点和4.9个百分点，增墒效果显著；免耕/深松、深松/翻耕和翻耕/免耕处理0—200 cm土层平均土壤蓄水量较连续翻耕处理分别高18.2、1.3和11.8 mm。（3）在冬小麦生长期，免耕/深松、深松/翻耕和翻耕/免耕处理0—200 cm土层平均土壤蓄水量较连续翻耕处理分别增加13.2、1.7和14.6 mm；在春玉米生长期，免耕/深松和深松/翻耕处理0—200 cm土层平均土壤蓄水量较连续翻耕处理分别增加17.8和15.1 mm，深松/翻耕处理低于连续翻耕处理5.0 mm。（4）在冬小麦生产年度，免耕/深松、深松/翻耕和翻耕/免耕处理平均产量较连续翻耕处理分别增产8.1%、8.9%和4.9%，水分利用效率平均提高14.3%、13.8%和10.2%；在春玉米生产年度，免耕/深松和深松/翻耕处理平均产量较连续翻耕处理分别增产10.2%和6.4%，水分利用效率平均提高4.6%和8.2%，翻耕/免耕与连续翻耕处理平均产量接近，水分利用效率接近。【结论】综合可知，3种轮耕模式中，与连续翻耕处理相比，深松/翻耕轮耕模式土壤水分状况较差，但其作物产量和水分利用效率较高；翻耕/免耕轮耕模式土壤水分状况较好，但其作物产量和水分利用效率较差；而免耕/深松轮耕模式对于改善土壤耕层物理结构、提高土壤蓄水保墒效果和作物增产效应最佳，为渭北旱塬区麦玉轮作田较适宜的休闲轮耕模式。

致病疫霉NLP家族基因PITG_10839的克隆和功能分析

赵冬梅, 杨志辉, 徐进, 朱杰华, 朱丽丹

中国农业科学. 2014, 47(5): 895-902. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.006

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【目的】分析致病疫霉（Phytophthora infestans）NLP（Necrosis- and ethylene-inducing like proteins）家族基因PITG_10839的致坏死功能及所编码蛋白的活性位点对其功能的影响。【方法】以PITG_10839作为研究对象，选inf1作为正对照，以致病疫霉菌株HK09-19的总RNA为模板，通过RT-PCR获得基因的cDNA全长序列。将所得cDNA与表达载体pBI121连接，构建所选基因的重组表达载体，并采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的瞬时表达体系在本生烟（Nicotiana benthamiana）中对PITG_10839的表达和功能进行分析。利用over-lap PCR方法定点突变基因PITG_10839的活性位点，同时构建活性位点突变后的重组表达质粒，并通过农杆菌注射接种本生烟来研究各活性位点在基因坏死功能中所起的作用。通过荧光定量PCR分析致病疫霉游动孢子侵染马铃薯叶片后不同时期PITG_10839的表达模式。【结果】获得了PITG_10839和inf1的全长cDNA，分别为405及357 nt。同时，成功构建了PITG_10839和inf1的真核表达载体pBI121-10839和pBI121-inf1，并成功转入农杆菌。将含有重组质粒pBI121-10839的农杆菌注射接种本生烟，5 d后接种叶片开始逐渐黄化，7 d后叶片出现典型的皱缩坏死症状。然而含有对照重组质粒pBI121-inf1的农杆菌在注射接种3 d后，本生烟叶片便开始出现萎蔫，5 d时则出现坏死症状，7 d时坏死症状严重。进一步对PITG_10839编码蛋白的活性位点进行突变，发现D9A、E22A和D20A 3个氨基酸位点的突变使基因PITG_10839所编码蛋白的致坏死功能丧失，叶片仅出现轻微的黄化现象，然而H17A位点氨基酸的突变对该基因的致坏死功能没有影响，注射接种7 d后，仍然可以使本生烟叶片出现皱缩坏死的症状。同时，荧光定量PCR表明，致病疫霉游动孢子接种后不同侵染阶段PITG_10839的表达呈现出了不同水平的增加。接种后12 h至36 h，表达量变化水平稳定，增加了20倍左右；48 h时其表达量急剧上升至350倍左右；随后表达量开始下降，但仍高于接种36 h时的表达水平。【结论】致病疫霉NLP家族基因PITG_10839具有致使烟草叶片坏死的功能，并确定了影响该基因所编码蛋白致坏死功能的氨基酸活性位点。

基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

王念武1, 2, 王婷1, 沈建国2, 胡方平1

中国农业科学. 2014, 47(5): 903-911. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.007

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【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，CMM），一直以来都受检测周期的限制，快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上，选择连接酶依赖的PCR扩增方式，并结合实时荧光PCR技术，旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法，为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列，设计锁式探针的T1和T2臂，使之与CMM的特异性片段碱基序列互补，再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时，先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接，再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针，最后以环化的锁式探针为模板，在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法，分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异，并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM，在供试的10种菌株中，只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性，空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加，检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法，其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高，DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1，而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1，灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测，结果显示，45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性，分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102），永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度，应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测，可以直接从番茄种子中检测到CMM，该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测，有较好的口岸检疫实际应用价值。

黏质沙雷氏菌次生代谢物对TMV的抑制机理

毕建华1, 杨金广1, 欧阳明安2, 李锡宏3, 张长华4, 申莉莉1, 钱玉梅1, 王盼1, 王升平1, 王凤龙1

中国农业科学. 2014, 47(5): 912-922. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.008

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【目的】分离、纯化和鉴定黏质沙雷氏菌2A2次生代谢物中具有抑制TMV侵染力的活性成分，明确其对TMV的抑制机理。【方法】通过病毒生物学测定，确定黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV的抑制效率。为明确黏质沙雷氏菌2A2发酵液次生代谢物中抑制TMV侵染力的活性成分，通过TLC和硅胶柱层析对其发酵液进行了分离纯化，获得主要的次生代谢物，通过局部枯斑法测定各代谢物的生物学活性，筛选可显著抑制TMV侵染活性的物质，经NMR分析，确定其成分结构，进而确定物质组分。为进一步揭示代谢物对TMV的抑制机理，利用透射电子显微镜探索代谢物对TMV粒体形态的影响，TMV粒体与代谢物甲醇溶液混合30 min后，于透射电子显微镜下观察TMV粒体形态。同时，用代谢物甲醇溶液喷施处理寄主下部3片叶，共设5个处理：处理Ⅰ，喷施代谢物24 h后，接种TMV；处理Ⅱ，代谢物与等体积TMV汁液混合30 min后，接种叶片；处理Ⅲ，先接种TMV，24 h后喷施代谢物；处理Ⅳ，宁南霉素（50 μL•mL-1）与等体积TMV汁液混合30 min后，接种下部叶3片做阳性对照；处理Ⅴ，无菌水与等体积TMV汁液混合30 min后，接种下部叶3片做空白对照。分别在次生代谢物诱导和TMV侵染后1、3、5、7、9 d，取未经任何处理的上部叶，TRIZOL法快速提取总RNA并反转录cDNA，利用real-time RT-PCR分析样品PR基因和TMV的RNA相对表达量，进而明确代谢物处理寄主对寄主PR基因表达的影响和对TMV在寄主体内复制增殖的抑制作用。【结果】黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV具有显著的抑制作用。对其发酵液进行分离纯化，获得3种主要代谢物，通过局部枯斑法测定，编号为BJH-2的代谢物可显著抑制TMV的侵染活性，经NMR分析，确定了该代谢物为灵菌红素（prodigiosin）。透射电子显微镜结果显示灵菌红素可显著破坏TMV粒体，使TMV典型的杆状病毒粒体降解断裂成排列紊乱的短杆状。real-time RT-PCR结果表明，灵菌红素处理植株后，处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ可诱导寄主体内PR基因表达随着时间逐渐上调，第7 天左右，三者处理的寄主体内PR1、PR2、PR4、PR5表达上调至高峰，显著高于空白对照，亦高于处理Ⅳ的阳性对照，从而提高系统抗性；灵菌红素处理植株后，处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ寄主体内TMV RNA的表达量随着时间上调减缓，在接种TMV后的第9天，三者处理的寄主体内的TMV RNA含量分别是空白对照的11.98%、5.23%、15.90%，显著低于空白对照，亦低于处理Ⅳ的阳性对照。【结论】灵菌红素既对TMV在寄主体内的复制增殖具有抑制作用，又可诱导寄主产生系统抗性，整体效果高于宁南霉素，可作为防治植物病毒新的生物制剂。

30年间河北省曲周县土壤速效钾的时空变异特征及其影响因素

张玲娥, 双文元, 云安萍, 牛灵安, 胡克林

中国农业科学. 2014, 47(5): 923-933. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.009

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【目的】速效钾是土壤肥力的重要指标之一，与作物产量和品质密切相关。最近10年随着农业结构调整，机械化程度不断提高，秸秆还田等技术的不断推广，迫切需要研究这些因素对土壤速效钾含量时空变化的影响，从而为土壤肥力评价和管理提供指导。【方法】通过野外调查、采样分析和资料搜集得到了河北省曲周县1980年、2000年和2010年3个不同时期耕层土壤速效钾含量的数据，首先对不同时期土壤速效钾含量进行了常规统计和正态性检验；然后应用地质统计学方法分析了不同时期耕层土壤速效钾含量的空间结构特征，结合GIS空间插值、叠置分析和面积统计功能研究了该区耕层土壤速效钾含量的时空变异特征；最后对各种影响因素（土壤质地、土壤类型和土地利用类型）下的土壤速效钾含量进行了方差分析。【结果】3个时期土壤速效钾的平均含量分别为167.1、90.0和87.7 mg•kg-1，2000年的平均含量比1980年减少了46.1%，2010年比2000年减少了2.6%。具体变化为：1980年速效钾含量为I级地（＞200 mg•kg-1）和II级地（150—200 mg•kg-1）的面积比例分别为5.2%和82.9%，而到2000年和2010年时基本减少到无。1980年III级地（100—150 mg•kg-1）的面积比例为11.9%，到2000年增加到22.3%，2010年进一步增加到31.2%。1980年时没有IV级地（50—100 mg•kg-1），而2000年和2010年该等级面积比例最大，分别为78.7%和68%。1980年、2000年和2010年土壤速效钾的空间相关距离分别为8.1、2.8和9.8 km。前20年变程呈减小的趋势，而后10年变程呈增加的趋势，这是区域因素与随机因素共同作用的结果。不同质地土壤的速效钾含量顺序为：砂土＜砂壤＜轻壤＜中壤＜黏土。潮土的速效钾含量明显高于盐土。各种农用地中，林地的速效钾含量变化最大，1980年和2000年其含量最小，到2010年其含量最大。【结论】30年来曲周县土壤速效钾含量随时间的推移呈递减的趋势，前20年下降很快，后10年表现为总体略有下降，但局部有上升的趋势。土壤类型、土壤质地、土地利用类型和人为管理措施是其主要影响因素。秸秆还田和平衡施肥等措施对于保持和提升土壤速效钾含量起到了非常重要的作用，需进一步大力推广。

紫色土区植物篱模式对坡耕地土壤抗剪强度与抗冲性的影响

蒲玉琳1, 2, 3, 谢德体1, 3, 倪九派1, 3, 魏朝富1, 3, 林超文4

中国农业科学. 2014, 47(5): 934-945. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.010

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【目的】土壤抗剪强度和抗冲性是反映土壤综合对抗水力侵蚀性能和评价复合农林业模式生态效益的指标。研究植物篱模式对土壤抗剪强度、抗冲性及其坡面分布的影响，为探讨植物篱模式控制水土流失及农业非点源污染机理研究提供参考。【方法】利用植物篱控制水土流失的长期定位试验，采用原位监测法测定土壤抗剪强度，原状土冲刷法测定土壤抗冲性，剖面挖掘法测定根系参数，简易比重计法、湿筛法、吸管法、环刀法等测定土壤颗粒组成、水稳性团聚体组成、微团聚体组成、容重等主要土壤理化性质，数理统计方法研究紫色土区植物篱模式对坡耕地土壤抗剪强度、抗冲性及其坡面分布的影响。【结果】与横坡农作模式相比，0—10 cm和10—20 cm土层土壤在20°坡地紫穗槐模式下的平均抗剪强度（SS）分别增加70.3%和89.3%，平均抗冲指数（ASI）分别增加84.1%和35.2%；香根草模式下，平均SS分别增加49.6%和133%，平均ASI分别增加48.0%和26.1%；13°坡地紫花苜蓿模式下，平均SS分别增加62.2%和51.9%，平均ASI分别增加188%和57.3%；蓑草模式下，平均SS分别增加89.7%和50.6%，平均ASI分别增加175%和26.9%。20°坡地植物篱模式提高土壤SS与ASI的平均效应分别为85.5%和48.4%，13°坡地的分别为63.6%和112%。土壤ASI随冲刷时间增长呈幂函数型增大，植物篱模式土壤抗冲性的增幅远大于横坡农作模式。坡面自下而上，横坡农作模式土壤抗剪强度与抗冲性呈近直线式减小或自下、中坡位急剧减小；植物篱模式的呈波浪式减小，篱带增加，作物带减小。【结论】植物篱模式明显或显著提高了土壤抗剪强度与抗冲性。就表层（0—10 cm土层）土壤而言，20°坡地紫穗槐模式提高土壤抗剪强度与抗冲性的效应大于香根草模式；13°坡地紫花苜蓿模式提高土壤抗剪强度的效应小于蓑草模式，提高土壤抗冲性效应大于蓑草模式。20°坡地植物篱模式提高土壤抗剪强度效应大于13°坡地，提高土壤抗冲性效应则小于13°坡地。植物篱模式改善了坡地土壤抗剪强度与抗冲性的过大坡面异质性。

钾肥对富士苹果着色的影响及机理

姜学玲, 徐维华, 李延菊, 张振英, 唐美玲, 刘美英

中国农业科学. 2014, 47(5): 946-954. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.011

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【目的】钾肥过量是目前苹果果皮发黄、着色不良的重要原因。拟通过田间试验，调查不同钾肥用量在氮、磷、钙、镁不同肥料配合下，对苹果果实色泽、养分元素含量及果皮色素的影响。探讨过量钾肥导致富士苹果果皮发黄的作用机制，为有效预防提供理论依据。【方法】供试树为9年生富士，八棱海棠为砧木，单株产量约60 kg。土壤为中性潮土，中等肥力。根据苹果对营养元素的吸收特性及相互作用原理，参考农民施肥习惯和前人研究结果，试验以N-P、N-P-Mg、N-P-Ca 3种肥料配合为基础，与每株0—2 000 g (0、125、250、500、1 000和2 000 g/株）的K2O 配合施用，测定果实着色度、花青素、叶绿素、类胡萝卜素、果实和土壤中的主要矿质元素含量。【结果】在3种肥料配合中，果实着色度均随钾肥用量的增加呈先提高后降低的变化趋势，N-P-Mg配合果实着色度最好，N-P-Ca配合最差；果实着色最好的钾肥用量，N-P、N-P-Ca配合在250 g/株，N-P-Mg配合延迟至1 000 g/株；N-P配合中钾肥用量与果实K含量、土壤残留K含量呈显著正相关，与果实Mg含量呈极显著负相关；N-P-Mg配合中钾肥用量与果实中矿质元素含量相关性均不显著；N-P-Ca配合中钾肥用量与果实中N含量呈极显著负相关，与果实中Fe含量呈显著正相关，果实中N的均值比N-P处理高37.5%；果皮叶绿素含量随钾肥用量的增加，在N-P配合下呈先提高后降低趋势，在N-P-Mg配合下逐渐降低，而在N-P-Ca配合下呈先降低后提高趋势；果皮类胡萝卜素含量随钾肥用量增加，在N-P-Mg配合下呈先降低后提高的变化趋势，与N-P配合基本一致，而在N-P-Ca配合下基本上呈不断提高的趋势。3种配合的果皮类胡萝卜素含量均在钾肥用量最多时，达到最高，但花青素含量却最低，因此导致果皮发黄，着色不好。【结论】富士苹果着色度随钾肥用量的增加呈先提高后降低趋势；过量施钾促进了果实钾的积累，抑制了镁的吸收，导致果皮中花青素含量降低，类胡萝卜素含量提高，使果皮呈黄色着色不良；配施镁肥使果皮着色最好的K2O用量从250 g/株延迟到1 000 g/株，有效减轻了高量钾肥对苹果着色的不良影响；配施钙肥由于增加了果实中N和Fe的含量，使果皮叶绿素含量提高而花青素含量降低，对果实着色有负作用。本研究结果表明果实色泽是N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn几种养分元素共同作用的结果，增施某种养分时，必需注意保持与其它各元素间的平衡。

不同施磷水平下4种柑橘砧木的根际土壤有机酸、微生物及酶活性

罗燕, 樊卫国

中国农业科学. 2014, 47(5): 955-967. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.012

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【目的】探索在不同施磷水平下柑橘砧木对其根际土壤有机酸种类及含量、微生物种群及数量以及土壤酶活性的影响，为丰富柑橘磷素营养及生态学理论和发掘具有特异营养性状的柑橘砧木提供科学依据。【方法】以贵州喀斯特山地分布的野生宜昌橙（Citrus ichangensis Swing.）、酸橙（C.aurantium L.）、白黎檬（C.limonia Osbeck）和枳（Poncirus trifoliata Raf.）为材料，采用土壤盆栽试验方法研究不同施磷水平下4种柑橘砧木耐磷胁迫能力，根际土壤有机酸种类及含量、微生物种群及数量和土壤酶活性及其相互关系。【结果】酸橙、白黎檬和枳的干物质积累量均随施磷水平的升高显著增加，施磷水平对宜昌橙生长量没有明显影响；耐低磷胁迫能力从大到小依次为宜昌橙、白黎檬、酸橙、枳。不同柑橘砧木的根际土壤有机酸种类及含量有明显差异，均以草酸、琥珀酸和乙酸为主要有机酸；4种柑橘砧木的根际土壤有机酸总量、草酸、丙二酸以及宜昌橙和酸橙根际土壤的琥珀酸含量随施磷水平的降低均明显增加；在磷饥饿条件下，宜昌橙的根际土壤有机酸总量明显高于其他柑橘砧木。土壤微生物均以细菌数量最多，放线菌次之，真菌最少；随施磷水平的降低，4种柑橘砧木根际土壤细菌、放线菌数量以及微生物总数均明显增多；在磷饥饿条件下，宜昌橙的根际土壤微生物数量明显多于其他柑橘砧木。不同柑橘砧木在不同施磷水平下其根际土壤酸性磷酸酶、脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶、蔗糖酶活性大小各异，淀粉酶和过氧化氢酶活性没有显著差异。皮尔逊相关分析表明，施磷水平、根际土壤有机酸含量、微生物数量以及土壤酶活性之间有明显相关关系。【结论】耐低磷胁迫的柑橘砧木在磷饥饿条件下其根际土壤有机酸含量显著增多，土壤生物活性增强；在酸性黄壤上，宜昌橙能较好地适应低磷土壤环境。

生物炭对缓解对羟基苯甲酸伤害平邑甜茶幼苗的作用

王艳芳1, 2, 沈向1, 陈学森1, 吴树敬1, 毛志泉1

中国农业科学. 2014, 47(5): 968-976. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.013

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【目的】研究生物炭对发生对羟基苯甲酸毒害的平邑甜茶幼苗光系统功能、叶绿素含量、抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响，以期为防治苹果连作障碍提供依据。【方法】以苹果常用砧木-平邑甜茶为试材，在水培条件下，以（1）营养液作为对照（CK），用（2）营养液 +0.4 mmol•L-1 对羟基苯甲酸（FS）和（3）营养液 + 0.4 mmol•L-1 对羟基苯甲酸+0.5% 生物炭（FSC）处理平邑甜茶幼苗，测定不同处理对平邑甜茶幼苗叶片光合速率、荧光参数、叶绿素含量等与光合作用相关的系统指标和超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量的影响。【结果】与FS处理相比，FSC处理的平邑甜茶幼苗叶片净光合速率（Pn）和气孔导度（Gs）显著提高，分别提高了32.7%和25%，而胞间CO2浓度降低，可见，FS处理平邑甜茶幼苗叶片净光合速率下降的主要原因不在气孔；FSC处理的平邑甜茶幼苗叶片PSⅡ反应中心实际光化学效率（ΦPSⅡ）、电子传递效率（ETR）和光化学猝灭系数（qP）显著高于FS处理，分别提高了15.8%、16.9%和11.1%，而FSC处理的非光化学猝灭系数（NPQ）上升幅度比FS处理降低了17.5%；同时， FS处理显著降低了平邑甜茶幼苗叶片的Chl a、Chl b、Chl (a+b)含量，处理5 d后，分别为对照的66.7%、37.5%和54.1%，而FSC处理叶片Chl a、Chl b、Chl (a+b)含量显著高于FS处理，处理5 d后，分别比FS处理高35.7%、66.7%和45%；FSC处理还大大提高了对羟基苯甲酸胁迫下平邑甜茶幼苗叶片抗氧化酶活性，处理5 d后，幼苗叶片的SOD、POD和CAT 活性明显高于FS处理，分别比FS处理提高了55.5%、44.7%和18.6%；与对照相比，FS处理致使平邑甜茶幼苗叶片的MDA含量随着处理天数的增加而显著增加，生物炭处理则减缓了酚酸胁迫下MDA含量的增加幅度。可见，生物炭的加入可提高对羟基苯甲酸胁迫下平邑甜茶幼苗叶片的抗氧化酶活性，从而增强植株对逆境的抗性，对植株起到有效的保护作用。【结论】对羟基苯甲酸导致平邑甜茶幼苗光合速率下降的主要原因是非气孔因素，生物炭可提高幼苗叶片叶绿素含量及叶片保护酶活性，降低叶片MDA含量，有效缓解对羟基苯甲酸对叶片PSⅡ系统的损伤，增强光合作用，最终缓解对羟基苯甲酸对平邑甜茶幼苗的生长胁迫。

加工对牛肉稳定碳同位素组成的影响

周九庆1, 2, 郭波莉2, 魏益民2, 张国权1, 魏帅2, 赵海燕2, 张磊2

中国农业科学. 2014, 47(5): 977-983. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.014

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【目的】比较加工和未加工牛肉之间稳定碳同位素组成差异，分析不同加工方式对牛肉稳定碳同位素组成变化的影响，探讨稳定碳同位素对牛肉加工制品产地溯源的可行性。【方法】分别从吉林省榆树市、河北省张家口市、宁夏自治区吴忠市采集牛肉样品，其碳同位素平均组成呈高、中、低梯度分布。牛肉样品经剔除表面脂肪、筋和膜处理后，分成四份，一份作为对照样品，其余三份分别作为煮制、煎制和烤制处理样品。煮制处理工艺为将牛肉切分为1.5 cm3，在超纯水中回流煮沸30 min；煎制处理工艺为将牛肉切分为5 cm×5 cm×1—1.5 cm，在195℃下煎制13 min；烤制处理工艺为将牛肉样品切成5 cm×5 cm×1—1.5 cm，在180℃烘烤30 min。对未加工及加工牛肉样品进行冷冻干燥、磨粉及脱脂处理。利用元素分析-同位素比率质谱仪（EA-IRMS）检测未加工和煮制、煎制、烤制加工牛肉样品，以及加工副产物汤渣、烤渣和煎渣中的δ13C值。对加工前后的牛肉样品中δ13C值进行单因素方差分析、配对样本t检验分析和Duncan’s多重比较分析，比较未加工牛肉、不同加工处理牛肉及加工副产物之间碳同位素组成差异，并利用碳同位素为指标对未加工和加工牛肉产地来源进行系统聚类分析。【结果】煮制、煎制和烤制处理与未加工脱脂牛肉之间的碳同位素组成无显著差异，加工前后碳同位素差值范围在0.006‰—0.489‰；煮制和烤制加工处理前后牛肉粗脂肪中碳同位素无显著差异，但煎制处理前后牛肉粗脂肪中δ13C值显著降低（P＜0.05），3组煎制牛肉样品粗脂肪中δ13C平均值分别降低7.790‰、7.288‰和4.104‰，说明煎炸油影响牛肉粗脂肪中碳同位素组成；碳同位素比率高、中、低的牛肉样品经煮制和烤制后，其副产物汤渣、烤渣与加工后脱脂牛肉中碳同位素组成无显著差异，而煎制后的副产物（煎渣）与脱脂牛肉之间有显著差异，而与加工牛肉的粗脂肪中碳同位素组成比较接近；利用碳同位素对3个地域中未加工和不同加工后牛肉样品产地的聚类结果表明，加工和未加工的牛肉均按照各自的地域来源被明确聚类，而且各地域加工处理前后的牛肉均被聚为一类。【结论】煮制、煎制和烤制对牛肉碳同位素组成无显著影响，δ13C值可作为牛肉加工制品产地溯源的指标。

山羊MyoG启动子的克隆和活性检测

李硕, 郝斐, 吴海青, 毕兆伟, 张志鹏, 刘东军, 仓明

中国农业科学. 2014, 47(5): 984-994. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.015

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【目的】肌细胞生成素(myogenin，MyoG) 是生肌调节因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌细胞发育与生长过程中均可表达的调控因子, 在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用,它正调控着骨骼肌卫星细胞向成熟肌细胞分化的过程，是唯一不可代替的生肌调节因子。MyoG基因在复制、扩增、基因激活、转录、翻译等多级水平上对肌肉发育进行调控。基因转录的起始阶段是机体生长发育因子进行调控的开端，而此阶段调控的实质是通过启动子和上游调控序列的相互作用，调控目的基因的表达。因此克隆MyoG基因的启动子，探讨启动子区域的启动活性，有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点，同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理，为治疗人类相关疾病以及改良家畜肉质研究提供实验依据。本研究克隆山羊Myogenin（MyoG）基因的启动子区域，检测其在哺乳动物骨骼肌细胞内的启动活性。【方法】克隆山羊MyoG基因的启动子序列，连入pDsRed2基本骨架构建了以红荧光蛋白基因为标记基因的真核表达载体pDsRed-GoatMyoG(5.3 kb)。表达载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定后，分别转染体外培养的绵羊肌卫星细胞、肌管细胞和成纤维细胞，观察红色荧光蛋白表达情况，然后利用实时荧光定量PCR、Western blot和冰冻切片、免疫组化等技术检测细胞转染后标记基因mRNA 和蛋白在体外培养细胞中的的表达活性。pDsRed-GoatMyoG表达载体对小鼠进行肌肉注射，检测GoatMyoG启动子在体内组织中的启动特异性和效率。肌肉注射5 d后，分别取小鼠的注射腿肌肉组织、非注射腿肌肉组织、睾丸组织、肠组织和肝脏组织，通过实时荧光定量 PCR 检测标记基因DsRed在不同组织中的表达情况。【结果】克隆得到的MyoG启动子序列测序正确，载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定，证实载体构建成功；转染质粒 pDsRed-GoatMyoG后，肌卫星细胞和肌管细胞在显微镜下均可观察到细胞发红色荧光，成纤维细胞没有红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测得出，转基因肌管细胞内GoatMyoG 启动DsRed 基因表达mRNA 的相对量为14.07；通过Western blot技术检测出转基因肌管细胞含有GoatMyoG启动的DsRed蛋白质，在转基因成纤维细胞内没有检测到 DsRed 蛋白质，说明GoatMyoG启动子可在肌肉组织特异性启动外源基因表达。小鼠肌肉注射pDsRed-GoatMyoG质粒后，注射腿肌肉组织内GoatMyoG 启动DsRed 基因转录mRNA 的相对量为212.32，非注射腿肌肉组织内mRNA的相对量为39.76，注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内mRNA 的量均是其它组织的1.99倍以上。通过免疫组化技术在注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内均可检测到红色荧光蛋白，在睾丸、肠和肝脏内均未检测到DsRed 蛋白。【结论】山羊MyoG启动子可以特异性的在骨骼肌组织驱动外源基因的表达，是一种有效的肌肉特异性启动子。

玉米DDGS中抗生素残留分析

姚婷1, 秦玉昌2, 吴宁鹏3, 彭丽3, 孙丹丹1, 谷旭1

中国农业科学. 2014, 47(5): 995-1005. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.016

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【目的】玉米发酵生产燃料乙醇的副产物酒糟蛋白饲料（DDGS）常作为蛋白质替代饲料广泛用于动物生产中。随着DDGS产业链的扩大，其生产过程中所带来的抗生素的残留问题应该得到重视，但目前关于DDGS中抗生素的残留研究报道较少。对全国经营和使用环节的玉米DDGS进行抽样调查，对70种抗生素的残留含量进行分析测定，以了解目前中国饲料用DDGS中抗生素的残留情况。【方法】首先利用四级杆飞行时间质谱（quadrupole time-of-flight mass spectrometry，QTOF）建立了大环内酯类、氟喹诺酮类、磺胺类、喹恶啉类、β-内酰胺类、林可胺类、四环素类、酰胺醇类等共70种抗生素药物基于质量数、保留时间和特征碎片离子的数据库。在全国9个省、市、自治区抽取经营和使用环节的玉米DDGS样品74批次，筛查其中可能含有的抗生素药物。样品的前处理：取一定量的均质样品，加入乙腈和水的混合溶液进行提取，经涡旋、震荡、离心后，取上清液过NH2固相萃取柱，收集淋洗液N2气浓缩至一定体积，过0.22 μm滤膜。样品的分析：首先利用QTOF建立的筛查列表对样品DDGS中可能残留的抗生素进行初步筛选，以确定残留抗生素的种类，而后采用液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对发现疑似含有抗生素残留的样品进行定量分析，以确定抗生素的残留量。【结果】欧盟指令2002/657/EC规定了在应用质谱仪对目标化合物进行确证时的准则。一个母离子为2分，一个子离子为2.5分。在本试验条件下所有抗生素的检测结果都能达到这个要求，符合对目标化合物的确证准则。经QTOF定性分析后，抽样的所有DDGS中有一批次样品中含有抗生素残留，种类为甲氧苄啶。样品母离子峰、二级特征离子碎片、出峰时间与标准品完全一致，样品和标准品所有提取碎片离子及离子丰度比一致。利用LC-MS/MS对残留抗生素进行定量分析后，确定其残留量为107.7 ng•g-1。甲氧苄啶在添加浓度为10—1 000 ng•mL-1，平均添加回收率为75.2%—97.9%，线性相关系数大于0.99，日内标准偏差为2.8%—5%，日间标准偏差为8%—10%。【结论】利用QTOF建立DDGS中抗生素类药物的定性筛选方法可作为玉米DDGS中残留抗生素快速筛查方法。存在残留的甲氧苄啶抗生素，可能在玉米发酵生产DDGS前被添加，目的是抑制有害微生物的生长繁殖。抽样分析结果表明，目前中国玉米DDGS中抗生素残留的种类较少、残留量也较低，但DDGS中抗生素残留情况仍不容忽视，相关部门也未给出DDGS发酵过程中可使用的抗生素的种类范围、使用限量以及使用规范。此外，还应该研究直接采用QTOF进行定量分析的方法，以及研究包括维吉尼亚霉素在内的其他抗生素的QTOF分析方法。

基于纳米材料电化学免疫传感器检测禽呼肠孤病毒研究

黄娇玲, 谢芝勋, 谢丽基, 滕丽琼, 黄莉, 刘加波, 庞耀珊, 邓显文, 谢志勤, 范晴, 罗思思

中国农业科学. 2014, 47(5): 1006-1012. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.017

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【目的】构建一种用于检测禽呼肠孤病毒(ARV)的新型电化学免疫传感器。【方法】将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后，加入HAuCl4溶液于80℃还原成金纳米粒子（AuNPs），得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNPs)纳米复合物。将石墨烯(G)和甲壳胺(Chi)分散在乙酸溶液中得到均匀的混合物后，先加入AgNO3溶液于80℃还原成银纳米粒子（AgNPs），再加入禽呼肠孤病毒单克隆抗体(ARV-MAb)，得到石墨烯-甲壳胺-银纳米粒子-禽呼肠孤病毒单克隆抗体（G-Chi-AgNPs-ARV-MAb）纳米复合物。将G-Chi- AuNPs纳米复合物修饰金电极作为传感器平台，固定待检测样品，然后加入G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物，并对G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的孵育时间进行优化，构建了ARV电化学免疫传感器。使用构建的ARV电化学免疫传感器，对禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、新城疫病毒（NDV）、喉气管炎病毒（LTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和传染性法氏囊病毒(IBDV)进行检测，以确定ARV电化学免疫传感器的特异性。使用构建的ARV电化学免疫传感器，对106.5—100.5 TCID50/mL的病毒进行检测，以确定ARV电化学免疫传感器的敏感性试验。使用构建的ARV电化学免疫传感器，对临床样品进行检测，其确定ARV电化学免疫传感器的实用性。【结果】所建立的ARV电化学免疫传感器，G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物的最佳孵育时间为40 min。当检测的样品为阳性时，ARV与ARV-MAb特异结合，G-Chi-AgNPs-ARV-MAb纳米复合物被固定到电极的表面使其线性伏安曲线出现AgNPs的氧化峰；当检测样品为阴性时，其线性伏安曲线不出现AgNPs的氧化峰。特异性结果表明，所建立的方法仅对ARV的检测为阳性（出现AgNPs的氧化峰），而对非目标禽流感（H5N1、H3N6和H9N2亚型）、NDV、LTV、IBV和 IBDV的检测为阴性（不出现AgNPs的氧化峰）。敏感性结果表明，所构建的ARV电化学免疫传感器，具有很高的敏感性，对ARV检测的敏感性达101.5 TCID50/mL。使用建立的ARV电化学免疫传感器对22份临床样品进行检测，结果与病毒分离方法相符。【结论】所建立的ARV电化学免疫传感器，具有特异性强、敏感度高及快速的特点，为有效检测诊断禽呼肠孤病毒提供了一种新的快速检测诊断技术。

黄淮小麦农艺性状进化及对产量性状调控机理的分析

张丽英1, 2, 张正斌1, 徐萍1, 卫云宗3, 刘新江4

中国农业科学. 2014, 47(5): 1013-1028. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.018

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【目的】气候变化对小麦生产的影响已经受到广泛关注。在气候变化背景下，小麦育种必须重新定位。文章对黄淮地区小麦进化材料的农艺性状进化以及对单株产量性状调控机理进行分析，为未来小麦适应气候变化和高产育种目标提供理论依据。【方法】对30个不同染色体倍数的小麦进化材料的12个农艺性状进行进化趋势分析。并对小麦进化材料的农艺性状进行相关分析、通径分析、逐步回归分析、主成分分析和聚类分析，探讨小麦进化育种中各农艺性状对单株产量的调控规律。【结果】通过对农艺性状的进化趋势分析和多重统计分析获得如下结果：①黄淮小麦进化过程中其抽穗期、生育期、株高、单株穗数等有减少的趋势，但生殖生长期占全生育期比例、收获指数、千粒重和单株粒重等有不同程度的增加趋势。②相关分析表明，单株粒重与穗粒数、千粒重、收获指数和单株生物学产量均呈极显著正相关，与生殖生长期占全生育期比例呈显著正相关，与抽穗期、生育期和单株穗数均呈极显著负相关。③多元逐步回归分析结果表明，收获指数、单株生物学产量和生育期是决定单株粒重的3个主要因子，共同决定了单株粒重96%的变异。其中，收获指数、单株生物学产量对小麦单株粒重有大的正效应调控作用，生育期对小麦单株粒重有较大的负效应调控作用。④通径分析表明，11个农艺性状对单株粒重直接贡献大小依次为收获指数＞单株生物学产量＞穗粒数＞穗长＞单株穗数＞每穗小穗数＞生殖生长期占全生育期比例＞抽穗期＞株高＞千粒重＞生育期。其中，收获指数、单株生物学产量、千粒重和穗粒数对单株粒重有较大的正效应。⑤主成分分析结果显示，3个主成分累积贡献率达81.873%，表明3个主成分已覆盖所有性状的主要信息。⑥根据综合值的聚类分析和对不同年代的种质资源农艺性状的特征比较，将30个小麦进化材料分为了早熟矮秆低产型、晚熟高秆低产型、晚熟高秆中产型、早熟高秆中产型和早熟矮秆高产型五大类小麦资源。【结论】通过对30个小麦进化材料农艺性状的多重统计分析，得出每个小麦进化材料的相关信息。小麦由二倍体到六倍体进化过程中，收获指数、单株生物学产量和穗粒数对小麦单株粒重有明显正效应，而生育期对其有显著负效应。这是在气候变暖背景下，人工选育高产品种和自然选择共同作用的结果。

应用抑制消减杂交技术筛选葡萄冬芽和夏芽生理休眠相关基因

闵卓1, 耿万刚1, 房玉林1, 2, 张振文1, 2, 李华1, 2

中国农业科学. 2014, 47(5): 1029-1040. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.05.019

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【目的】葡萄新梢上的芽有冬芽和夏芽两种，根据这两种芽休眠特性的差异，筛选与芽生理休眠相关基因，进而从分子水平研究葡萄芽生理休眠的相关机制。【方法】以‘赤霞珠’葡萄新梢上冬芽和夏芽为材料，夏芽作为驱动方（driver），冬芽作为实验方（tester），采用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization，SSH）构建冬芽和夏芽的SSH-cDNA文库，筛选冬芽和夏芽差异表达的基因片段。通过NCBI同源比对，寻找与葡萄芽生理休眠相关的基因，并对差异表达基因进行功能注释和分类。最后，运用Real-time PCR技术对部分候选基因进行检测，以验证其与葡萄芽生理休眠的相关性。【结果】共获得359条有效、高质量的差异基因片段，经CAP3软件聚类拼接，得到106个unique EST。在GenBank中进行BLASTN同源比对，有98条EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性，占全部EST的92.4%。进行BLASTX同源比对，有54条EST与功能已知蛋白或基因具有不同程度的同源性，占全部EST的51%。已知功能的EST涉及休眠、逆境胁迫、细胞代谢、胞内物质运输等方面，且绝大多数基因信息来源于葡萄、苜蓿、橄榄、油菜、高粱、棉花、大蒜、拟南芥等植物。对差异基因片段进一步的功能分析发现，调控开花的基因占生物学过程的20%；与环境胁迫相关的基因占生物学过程的6%；与细胞代谢相关的基因占生物学过程的20%；与胞内物质运输相关的基因占总生物学过程的6%；其他包括DNA转录、减数分裂、细胞死亡及细胞壁松弛作用等。这些基因的分子功能主要有半胱氨酸型肽链内切酶、甲基转移酶、蛋白激酶、催化活性、结构分子活性、蛋白结合功能、DNA结合功能、ATP结合功能、蛋白质二聚体催化活性及丙酮酸氨基转移酶活性等。经Real-time PCR检测得知，在夏芽萌发过程中，候选基因在冬芽和夏芽中表达量呈不规律变化，且同一基因在相同节位的冬芽和夏芽中表达量均有较大差异。【结论】发现了一些在冬芽中表达频率较高的基因，如编码MADS FLC-like蛋白、钙依赖蛋白激酶、NADP依赖型的苹果酸酶、细胞壁水解酶、细胞壁松弛蛋白、外被体蛋白β亚基、热激蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素P450、细胞壁关联蛋白等基因，认为线粒体蛋白基因、未知蛋白基因、开花相关基因、ATP合成酶β亚基基因、MADs FLC-like蛋白基因等与葡萄芽生理休眠具有相关性。

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