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中国农业科学. 2022, 55(16): 0.

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多环境下玉米保绿相关性状遗传位点的挖掘

常立国,何坤辉,刘建超

中国农业科学. 2022, 55(16): 3071-3081. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.001

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【目的】功能性保绿通常被认为是包括玉米在内的主要作物品种的理想性状。挖掘新的控制玉米保绿相关位点和候选基因,为玉米保绿遗传研究提供理论基础。【方法】以150份由许178和K12组配的重组自交系（recombinant inbred lines,RIL）群体为材料,通过Windows QTL Cartographer V2.5的复合区间作图法（composite interval mapping,CIM）对3个保绿相关性状（保绿度（visual stay green,VSG）、吐丝期绿叶数（green leaf number at silking stage,GLNS）和成熟期绿叶数（green leaf number at mature stage,GLNM））进行QTL定位。同时,以139份自然材料组成的关联群体为材料,基于混合线性模型（mixed linear model,MLM）,结合50 790个高质量SNP标记,对这3个性状进行全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）。【结果】基于CIM,利用单环境下的表型值和最佳线性无偏估计值（best linear unbiased prediction,BLUP）对GLNM、GLNS和VSG进行定位,共检测到37个QTL,分布在除第10染色体以外的其他染色体上,LOD范围为2.58—11.36,表型贡献率为4.34%—22.40%。GLNM、GLNS和VSG性状分别检测到14、12和11个位点。其中,4个遗传稳定的QTL（qGLNS2-1、qVSG1-1、qVSG1-2和qVSG7-1）,在3个及以上不同单环境中同时被检测到。利用MLM对保绿相关性状进行全基因组关联分析,共检测到44个超过阈值线的显著SNP,根据SNP标记在B73参考基因组的物理位置,发现共有15个位点落在连锁分析定位到的QTL区间内。【结论】通过QTL定位和全基因组关联分析共同检测到4个遗传稳定的共定位遗传区段（对应的B73参考基因组V4版物理位置区间为第1染色体6.2—8.2 Mb、第2染色体209.1—221.4 Mb、第6染色体96.8—102.1 Mb、第7染色体4.9—11.4 Mb）,并挖掘到4个与光合作用和抗逆相关的候选基因（Zm00001d006119、Zm00001d018975、Zm00001d006535和Zm00001d036763）。

紫花苜蓿高迁移率族蛋白基因MsHMG-Y调控花期的功能分析

张云秀,蒋旭,尉春雪,蒋学乾,卢栋宇,龙瑞才,杨青川,王珍,康俊梅

中国农业科学. 2022, 55(16): 3082-3092. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.002

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【目的】开花是植物营养生长转向生殖生长的重要标志,对植物的生物量有重要的影响。紫花苜蓿作为世界上最重要的饲草作物之一,其产量和品质与开花时间密切相关。紫花苜蓿的最佳刈割时期是初花期,此时产量和品质最佳。前期获得一个与花期相关的编码基因HMG-Y,通过分析其结构及表达模式,探究其在开花调控途径中的功能,为揭示开花调节机制提供理论基础。【方法】同源克隆MsHMG-Y,并对其进行多序列比对和进化树分析。利用qRT-PCR检测不同组织和不同开花时期该基因的表达水平;分析MsHMG-Y受光照、赤霉素（GA3）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的表达模式;观察过表达MsHMG-Y紫花苜蓿的表型,并分析开花促进因子与抑制因子的表达水平。【结果】MsHMG-Y与蒺藜苜蓿MtHMG-Y相似性最高,亲缘关系最近。组织特异性分析显示,MsHMG-Y在花、茎、叶中均有表达,其中,在父本和母本中均为花中表达量最高,叶中表达量最低;在早花表型父本的初花期表达量最高,在晚花表型母本的花芽分化期相对表达量最高。光周期分析表明,延长光照到16 h后,MsHMG-Y表达水平下调,延长光照到28 h后,MsHMG-Y表达水平持续低于对照组,说明该基因受光诱导后下调表达。外施50 μmol·L^-1 GA3、100 μmol·L^-1 SA、100 μmol·L^-1 MeJA后,与对照组相比,MsHMG-Y表达水平均上调,其中,GA3诱导1 h时表达量最高,为对照的3.5倍;SA诱导6 h时表达量最高,为对照的24倍;MeJA诱导3 h时表达量最高,为对照的11倍,说明该基因受3种激素诱导。表型观察发现,与对照相比,过表达MsHMG-Y紫花苜蓿开花较晚,促进开花相关基因的表达水平均下调,抑制开花相关基因的表达水平均上调,其中,表达量变化显著的有促进开花基因MsPHYA、MsGI和MsFTa1,分别降低了4.9、3.9和2.8倍,抑制开花基因MsTEM1和MsSVP的表达量分别提高了2.5和1.9倍。【结论】MsHMG-Y受光周期及外源激素GA3、SA和MeJA的诱导表达。MsHMG-Y对延迟苜蓿开花的调控机制有重要作用。

基于Sentinel-1/2数据的中国南方单双季稻识别结果一致性分析

杨靖雅,胡琼,魏浩东,蔡志文,张馨予,宋茜,徐保东

中国农业科学. 2022, 55(16): 3093-3109. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.003

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【目的】微波遥感因具有全天时、全天候数据获取的特点,在多云雨的中国南方水稻识别研究中表现出巨大潜力。本研究通过对比Sentinel-1SAR遥感数据和Sentinel-2光学遥感数据用于水稻遥感制图的效果,分析光学和SAR遥感数据对于单双季稻识别结果的一致性,并探索水稻识别的最优SAR影像特征。【方法】本研究使用Sentinel-1/2卫星数据,基于面向对象的随机森林分类算法和Google Earth Engine平台,提取洞庭湖平原4个典型水稻种植区的单双季稻空间分布。通过比较9种不同传感器和特征组合场景的分类精度和分类结果统计指标,并计算NDVI和SAR特征时序（VH、VV、VH/VV）的R²和DTW距离,分析识别单双季稻的最优SAR特征,评估光学和SAR遥感数据对于单双季稻识别结果的一致性。【结果】VH、VV和VH/VV时序识别单双季的总体精度分别为90.42%、82.08%和88.33%,而联合VH和VH/VV时序识别单双季稻的总体精度可达91.67%。VH（VH/VV、VV）时序与单双季稻NDVI时序的R²和DTW距离分别为0.870（0.915、0.986）、4.715（1.896、5.506）（单季稻）和0.597（0.783、0.673）、2.396（1.839、3.441）（双季稻）。较高的R²和较低的DTW距离说明单双季稻的VH/VV时序与NDVI时序相关度更高,可以较好地反映单双季稻的生长周期规律。同时,VH可以较好地反映单双季稻移栽期的淹水特征。基于光学数据和SAR数据在6个时间窗口的特征（S-2：NDVI、EVI、LSWI;S-1：VH、VH/VV）识别单双季稻的总体精度分别为91.25%和90.00%,识别结果面积相关性可达95.70%。【结论】SAR遥感数据与光学遥感数据水稻识别结果一致性较高。应用Sentinel-1在多云雨区识别单双季稻具有巨大潜力,VH和VH/VV后向散射系数时序是识别水稻的优质特征。研究结果为多云多雨区使用SAR数据进行特征优选以高精度识别单双季稻提供了重要技术支撑。

山东省冬小麦产量差与氮肥利用效率差形成机理解析

韩守威,司纪升,余维宝,孔令安,张宾,王法宏,张海林,赵鑫,李华伟,孟鈺

中国农业科学. 2022, 55(16): 3110-3122. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.004

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【目的】量化山东省冬小麦产量差及氮肥利用效率差,分析产量差和效率差之间的关系,明确环境、栽培条件及生理因素对产量差的贡献,探讨协同缩差增效的可能途径,为冬小麦产量差缩减和资源利用效率提升提供理论依据。【方法】本试验于2016—2020年在山东济宁、德州、烟台和淄博4市进行,综合肥料投入、播种密度和灌溉水平等管理措施,设置了超高产水平（SH）、高产高效水平（HH）、农户水平（FP）和基础产量水平（ISP）4种模式,定量分析不同产量水平冬小麦产量差和氮肥利用效率差,分析产量差和效率差之间关系,讨论产量差和效率差形成的影响因素及缩差增效的可能途径。【结果】当前山东冬小麦高产纪录与SH、SH与HH、HH与FP以及FP与ISP之间的产量差分别为2 729.1、674.3、1 042.9和4 349.8 kg·hm^-2,SH与HH、HH与FP之间的氮肥偏生产力差分别为-13.54和15.67 kg·kg^-1;产量和氮肥偏生产力之间存在着二次抛物线关系。当前降水、光温等不可控因素和肥水投入等可控因素对产量差的贡献率分别为31.16%和68.84%。结果显示,平均叶面积指数（MLAI）、平均净同化率（MNAR）、单位面积穗数（EN）和粒重（GW）差与SH和HH之间的产量差呈显著正相关关系;而收获指数（HI）、穗粒数（GN）和粒重（GW）差与HH和FP之间的产量差呈显著正相关。SH和HH处理较FP处理有更高的地上部生物量、单株分蘖数以及分蘖成穗率。【结论】当前山东省冬小麦农户产量只实现了最高纪录产量的64.34%,通过优化水肥投入量、提高追肥比例、增施有机肥和锌肥等栽培措施可使冬小麦产量差缩减23.46%,氮肥偏生产力提高56.99%。花后物质生产能力仍然是小麦产量提升的限制因素,在保证花后光合同化的同时,提高花前物质的再转运以提高收获指数是农户模式向高产高效发展的有效途径。

行距和密度对籽粒饲用高粱产量和品质的影响

王劲松,董二伟,刘秋霞,武爱莲,王媛,王立革,焦晓燕

中国农业科学. 2022, 55(16): 3123-3133. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.005

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【目的】阐明不同行距和密度对籽粒饲用高粱生长、产量形成、品质及氮磷钾吸收的影响,明确山西农牧交错带饲用高粱适宜的栽培模式,为籽粒饲用高粱栽培技术提供理论依据。【方法】以籽粒饲用高粱新品种辽夏梁1号为材料,于2018和2019年开展田间试验。试验共3个行距,分别为30、50和60 cm,每个行距设4个密度,分别为13.5×10⁴、16.5×10⁴、19.5×10⁴和22.5×10⁴株/hm²,分析不同行距和密度及其交互对抽穗期株高、生物量和养分积累量,收获期产量、养分累积量和品质等影响。【结果】行距和密度及其交互作用显著影响饲用高粱的生长、养分吸收、产量形成和籽粒品质。增加种植密度,抽穗期株高、生物量和养分积累量增加,但抽穗后生物量、收获期生物量和养分积累量以及产量在50和60 cm行距下,随密度增加先增加后降低。产量与收获期生物量、氮积累量及抽穗后生物量显著正相关。50 cm行距下的平均产量、抽穗后生物量、收获期氮磷积累大于60和30 cm行距;行距50 cm、密度16.5×10⁴株/hm²的组合收获期生物量和氮积累量均较高,分别比各处理平均生物量和氮积累量提高3.6%—12.8%和3.6%—18.6%,同时产量也最高,两年分别可达10 814和12 434 kg·hm^-2。籽粒中淀粉和蛋白质含量随密度增加呈降低的趋势,但行距对其影响较小;单宁含量随密度增加显著增加,随行距增加也逐渐增加,行距和密度对饲用高粱籽粒单宁含量的影响大于淀粉和蛋白质。行距为50 cm、密度为16.5×10⁴株/hm²处理的单宁含量与平均含量相当。【结论】增加生育期内氮素吸收,提高抽穗后生物量、保障收获期生物量是提高产量的关键。饲用高粱在不同行距下合理调整株距可以提高产量,但影响籽粒品质,尤其是单宁含量,综合饲用高粱产量和品质,行距50 cm、密度16.5×10⁴株/hm²的组合可作为雁门关农牧交错带（辽夏梁1号）的推荐种植方式。

玉米大斑病菌小柱孢酮脱水酶StSCD家族鉴定及其功能分析

郝玉彬,李海笑,张赛,刘宁,刘英姿,曹志艳,董金皋

中国农业科学. 2022, 55(16): 3134-3143. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.006

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【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族,并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响,为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据,获得StSCD基因家族的全序列,并与玉米小斑病菌（Cochlibolus heterostrophus）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、瓜类炭疽病菌（Colletotrichum lagenaria）等真菌的SCD进行序列比对;收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析,获得不同时期、不同StSCD的表达量,从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因;使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌,测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等,确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD,其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性,StSCD4与多主棒孢（Corynespora cassiicola）中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现,在附着胞时期4个StSCD表达量均上调,其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著,附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降,并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后,黑色素合成受阻,附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD,推测StSCD4参与DHN（1,8-间苯二酚）黑色素的合成,并进而影响附着胞膨压积累。

番茄糖转运蛋白SlSTP2在防御细菌性叶斑病中的功能

李依镁,王娇,王萍,师恺

中国农业科学. 2022, 55(16): 3144-3154. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.007

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【背景】近年来,我国番茄生产中面临的不良气候环境导致露地和设施栽培中番茄病害日益严重。由丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）所引发的番茄细菌性叶斑病频发,严重影响了番茄的产量、品质。糖是植物体内重要的信号分子与营养物质,在植物遭受病原菌侵染时,糖既可以作为信号参与调控植物抗病性,也可以作为主要碳源为免疫反应提供能量。STP（sugar transport protein）家族是一类糖转运蛋白家族,在植物生长发育过程与病原防御中起着重要作用。【目的】明确番茄中STP家族是否参与调控植株对细菌性叶斑病的抗性。【方法】以番茄CR品种（Solanum lycopersicum cv. Condine Red）为材料,通过接种Pst DC3000,明确STP基因家族对Pst DC3000的响应。构建SlSTP2的突变材料与过表达材料,并进行鉴定、繁种。在野生型和SlSTP2基因突变体、过表达植株上接种Pst DC3000,观察比较叶片发病情况、台盼蓝染色显示的死细胞数量,检测叶片菌落数（colony-forming units,CFU）和光系统II实际光化学效率,明确SlSTP2在植株防御细菌性叶斑病中的作用。为探究SlSTP2防御Pst DC3000的内在分子机制,通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary,BiFC）试验筛选互作蛋白,构建编码该蛋白的基因突变与过表达材料,并接种Pst DC3000明确其在植株防御细菌性叶斑病中的作用。【结果】在番茄植株上接种Pst DC3000后,SlSTP1和SlSTP2表达上调,选取上调最显著的SlSTP2作为后续研究对象,构建其突变材料与过表达材料。在番茄野生型和Slstp2突变植株、OE:SlSTP2过表达植株上接种Pst DC3000,相比野生型植株,Slstp2植株细菌性叶斑病的发病情况更严重,叶片CFU与台盼蓝染色显示出的死细胞数均更多,光系统II实际光化学效率下降,OE:SlSTP2植株则相反。通过BiFC试验发现,SlSTP2与G蛋白β亚基SlAGB1互作。接种Pst DC3000后,Slagb1突变体发病较野生型重,呈现与Slstp2突变体一致的发病表型;OE:SlAGB1则与OE:SlSTP2植株同样表现出更强的抗性。【结论】SlSTP2受Pst DC3000诱导,并正调控番茄对细菌性叶斑病的抗性,且SlSTP2与正调控因子SlAGB1互作,推测SlSTP2调控番茄细菌性叶斑病抗性与SlAGB1有关。

北方麦区小麦产量与籽粒氮磷钾含量对监控施钾和土壤速效钾的响应

马悦,田怡,牟文燕,张学美,张露露,于杰,李永华,王浩琳,何刚,石美,王朝辉,邱炜红

中国农业科学. 2022, 55(16): 3155-3169. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.008

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【目的】分析我国北方麦区监控施钾下小麦产量与养分吸收分配变化与土壤速效钾的关系,为节约钾资源,实现小麦丰产优质可持续发展提供理论依据。【方法】于2018—2020年在我国北方麦区43个地点进行田间试验,研究不同土壤速效钾水平下监控施钾对小麦产量、产量构成、籽粒氮磷钾含量及养分吸收分配的影响。【结果】北方麦区农户小麦施钾不足和过量问题同时存在。小麦产量随土壤速效钾含量升高显著增加,在土壤速效钾含量150—180 mg·kg^-1时,小麦产量达到最高,为6 340 kg·hm^-2。土壤速效钾过高并不能持续提高小麦产量,当土壤速效钾含量>180 mg·kg^-1时,小麦产量显著降低,平均为5 409 kg·hm^-2。与农户施肥相比,在土壤速效钾含量<90、90—120、120—150和>180 mg·kg^-1时采用监控施肥技术增加了钾肥用量,在速效钾含量150—180 mg·kg^-1时减少了钾肥用量,各土壤速效钾水平下采用监控施肥技术施用钾肥均提高了小麦产量,且在速效钾含量<90和>180 mg·kg^-1时显著增产。土壤有效磷含量>30 mg·kg^-1时,土壤速效钾含量120—150或>180 mg·kg^-1时,不施钾肥小麦产量有降低的趋势。土壤速效钾含量升高显著提高了小麦籽粒氮含量,农户施肥和监控施肥处理的籽粒氮磷钾含量无显著变化,速效钾含量>180 mg·kg^-1时不施钾肥的小麦籽粒磷钾含量显著降低。速效钾含量>150 mg·kg^-1时,监控施肥的钾肥偏生产力与钾肥吸收效率较农户施肥显著提高。【结论】在北方麦区,土壤速效钾含量150—180 mg·kg^-1时,合理施肥可使小麦产量达较高水平,但当土壤有效磷较高,超过30 mg·kg^-1时,不施钾肥小麦有减产风险。应根据土壤速效磷钾和小麦产量水平监控施肥,合理确定钾肥用量,实现北方麦区小麦丰产高效生产。

东北三省玉米生产资源投入和环境效应的时空特征

陈绪昊,高强,陈新平,张务帅

中国农业科学. 2022, 55(16): 3170-3184. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.009

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【目的】玉米的总产量在我国三大主粮作物中最高,位居世界第二位。东北三省玉米种植面积占全国的39%,而资源投入相对较低。本研究旨在明确东北三省玉米生产资源投入和环境效应的时空特征。【方法】基于生命周期评价（life cycle assessment）方法,采用适用于东北三省玉米生产的活性氮损失模型,定量化评价东北三省2007—2016年玉米生产系统的资源投入（肥料、农药和柴油等）及其相关的活性氮损失和温室气体排放等环境风险。【结果】东北三省玉米生产资源投入在时空尺度上均存在较大差异。吉林省玉米生产的平均总施肥量为400 kg·hm^-2,单产为7 065 kg·hm^-2,平均单位面积温室气体（GHG）排放量为2 965 kg CO₂ eq·hm^-2,均为三省最高,而碳、氮足迹较低,平均单位面积活性氮（Nr）损失量为中间水平且年际间变化不大。辽宁省的平均氮肥投入量为198 kg·hm^-2,Nr损失量为20.8 kg N·hm^-2,碳、氮足迹为493 kg CO₂eq·Mg^-1和3.53 kg N·Mg^-1,均为最高。单产为5 966 kg·hm^-2,处于中等水平,GHG排放量年际间变化不大。黑龙江省平均施氮量为149 kg·hm^-2,单产水平为5 318 kg·hm^-2,Nr损失量和GHG排放量等均为三省最低,碳、氮足迹均处于中等水平。时间尺度上,2008—2015年东北三省玉米种植面积逐年增大,累积增加了5.73 Mhm²。2015年东北三省玉米产量最高,达91.2 Mt（百万吨）;2007—2016年玉米平均总产量占全国的32%,其中黑龙江省、吉林省和辽宁省分别占13.9%、11.7%和6.7%;10年平均种植面积占全国的30%,其中黑龙江省、吉林省和辽宁省分别占14.7%、9.3%和6.4%。东北三省玉米10年平均单产为6 116 kg·hm^-2,平均单产最高年份为2013年,为6 824 kg·hm^-2。2007—2016年10年间东北三省玉米生产的肥料投入整体呈上升趋势,氮肥稳中有降,磷钾肥逐年升高,2014—2016年3年肥料增长趋势大幅减缓,逐渐趋于稳定,10年间氮、磷、钾肥平均用量分别为177、101和70.2 kg·hm^-2。2007—2016年,东北玉米生产农药投入量呈现稳步上升趋势;柴油投入量前4年较为稳定,后逐渐上升。东北玉米生产10年间的平均农药用量为10.2 kg·hm^-2,平均柴油用量为94.6 L·hm^-2。10年间玉米生产（2007—2016）平均单位面积Nr损失量和GHG排放量分别为19.0 kg N·hm^-2和2 770 kg CO₂eq·hm^-2。Nr损失量10年间较为稳定。2007—2008和2009—2011年玉米生产的平均GHG排放量呈下降趋势,2012—2016年呈稳定上升趋势,2016年达到最高的3 045 kg CO₂ eq·hm^-2。氮肥田间施用产生的氨挥发是玉米生产中活性氮损失的主要途径,硝酸盐淋洗损失次之,而氧化亚氮排放占比最低。温室气体的主要排放环节为肥料生产运输与田间施用。10年间,东北玉米生产的平均氮足迹和碳足迹分别为3.16 kg N·Mg^-1和459 kg CO₂eq·Mg^-1。【结论】东北三省玉米生产的资源利用和环境代价在空间尺度上差异较明显,吉林省的平均肥料投入量比黑龙江省高124 kg·hm^-2,GHG排放量高524 kg CO₂ eq·hm^-2;在时间尺度上,10年间东北三省玉米生产的氮肥投入量为170—182 kg·hm^-2,Nr损失量变化范围为18.4—19.4 kg N·hm^-2,为我国玉米主产区中较低的氮肥投入与损失量。玉米生产碳、氮足迹的高低主要取决于资源投入（尤其是氮肥投入）与单产水平之间的平衡。东北三省玉米生产资源投入和环境效应的时空特征分析有助于明确现阶段限制因素与主控因子,为优化养分管理实现粮食安全和碳减排的双赢提供理论支撑。

砂质潮土施用改良剂对土壤动物群落特征的影响

杨静,张贺,李双霜,李桂花,张建峰

中国农业科学. 2022, 55(16): 3185-3199. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.010

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【目的】土壤动物是陆地生态系统中重要组成部分。研究土壤动物与农田施用有机、无机改良剂的关系,有助于揭示改良剂对土壤动物的影响机制。【方法】2016—2019年,在小麦玉米轮作区土壤中设施用有机改良剂15 t·hm^-2（YJ）、无机改良剂2.25 t·hm^-2（WJ）、有机改良剂15 t·hm^-2+无机改良剂2.25 t·hm^-2（YW）和未施改良剂（CK）4个处理,研究其对0—20 cm表层土壤动物群落组成与多样性的影响。【结果】研究时段,共采集到土壤动物4 351只,隶属8纲20目41科44类。其中,大型土壤动物28类,食虫虻科和切叶蚁亚科为优势类群,占所捕获大型土壤动物总数的62.9%;中小型土壤动物14类,螨和甲螨亚目为优势类群,占所捕获中小型土壤动物总数的93.0%。土壤动物营养功能类群以腐食性和杂食性为主。数据显示,WJ处理土壤动物个体数和类群数最多,YJ处理的最少。与CK相比,施用改良剂后土壤中幺蚰科、绥螨科、蛱??科等的数量减少且丰富度指数降低,而蜱螨类动物数量增大而优势度指数偏高。不同年度间,土壤中小型动物群落的个体数量和多样性指数存在显著差异（P<0.05）,且个体数呈现逐渐上升的趋势。不同处理间,Jaccard指数（q）均小于0.50,大型土壤动物群落相似性均低于中小型土壤动物群落的相似性。改良剂干扰下螨、甲螨亚目和棘跳科等中小型土壤动物生态位宽度偏高,切叶蚁亚科等大型土壤动物生态位宽度普遍较小,但生态位重叠指数均大于0.97,显示施用改良剂后土壤动物共有资源增加。非度量多维尺度法（NMDS）分析显示,2018年小麦季土壤动物群落与其他年份之间差异显著,玉米季2016年与2018、2019年间有差异。冗余分析（RDA）分析发现,小麦季土壤全氮、有效钾是影响土壤螨类、甲螨亚目、棘跳科、奇蝽科、步甲科数量的主要因子（P<0.05）;玉米季土壤有机质、pH是影响土壤螨类、奇蝽科、尖眼覃蚊科、食虫虻科的主要因子（P<0.05）。主效应曲线（PRC）分析表明,有机改良剂处理下,尾足螨科的相对多度在2017年10月达到峰值,食虫虻科和切叶蚁亚科的相对多度在2016年10月达到峰值;有机无机改良剂配施处理下,棘跳科、螨和甲螨亚目的相对多度在2016年10月达到峰值,管蓟马科和奇蝽科在2019年出现并在2019年10月达到峰值,显示土壤动物类群对改良剂的响应不一致。【结论】改良剂对土壤动物的影响低于年度间变化,且主要通过影响土壤pH、有机质和全氮含量,从而影响砂质潮土中动物群落特征。

辣椒CaHsfA2上游转录因子的筛选及耐热功能分析

刘瑞瑶,黄国弘,李海艳,梁敏敏,逯明辉

中国农业科学. 2022, 55(16): 3200-3209. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.011

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【背景】辣椒作为一种在世界范围内普遍栽培的蔬菜,具有喜温不耐热的特性。随着近些年极端高温天气出现日渐频繁,热胁迫已经成为影响辣椒生产的主要环境因素之一,明确辣椒的耐热机制进而培育耐热品种对辣椒生产具有重要的意义。【目的】热激转录因子HsfA2在植物耐热性中发挥重要作用,筛选辣椒CaHsfA2上游的转录因子,并分析后者在辣椒耐热性形成中的作用,为进一步阐明辣椒耐热分子机制提供理论依据。【方法】以CaHsfA2起始密码子上游的955 bp启动子序列为诱饵,利用酵母单杂交（Y1H）技术,筛选CaHsfA2的上游转录因子,并通过Y1H点对点杂交、双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase）与萤火素酶互补技术（LCA）进一步验证二者之间的互作关系。利用qRT-PCR技术分析热胁迫下CaHsfA2上游转录因子在辣椒耐热品系‘R9’中的动态表达模式;利用基因瞬时表达技术分析上游转录因子的亚细胞定位;利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）分析CaHsfA2上游转录因子的耐热功能。【结果】筛选获得了CaHsfA2上游转录因子CaBES1,验证了二者的互作关系,通过分析双荧光素酶报告系统的结果及CaBES1沉默辣椒植株中CaHsfA2的表达量发现,转录因子CaBES1对CaHsfA2具有转录抑制作用。亚细胞定位结果表明,CaBES1在细胞膜和细胞核上均有表达,热胁迫处理后细胞核内的荧光信号增强,符合其发挥生物学功能时由细胞质向细胞核转移的特性;动态表达模式分析表明,热胁迫下,CaBES1表达水平呈现先降低后升高的变化趋势,这也说明CaBES1可以响应热信号,为下一步对其耐热功能研究提供了支撑。辣椒CaBES1被沉默后,通过对比分析沉默植株和对照植株的表型、相对电导率、叶绿素含量等指标发现,CaBES1的沉默表达提高了CaHsfA2表达量并增强了辣椒的耐热性。【结论】CaBES1通过负调控CaHsfA2表达而抑制辣椒的耐热性。

基于cpInDel标记和cpSSR标记的柑橘属及近缘属植物亲缘关系

杨程,龚桂芝,彭祝春,常珍珍,易璇,洪棋斌

中国农业科学. 2022, 55(16): 3210-3223. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.012

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【目的】通过对柑橘叶绿体基因组变异位点的研究,从胞质层面揭示柑橘类果树的遗传进化,为柑橘种质资源的收集、评价和利用提供参考。【方法】以甜橙叶绿体高变区序列为参考,利用已发表的二代基因组测序数据对代表性的柑橘属及其近缘属材料进行De Novo组装,获得叶绿体基因组高变区组装序列,通过序列比对,发掘代表性材料的差异位点,针对差异位点设计cpInDel引物。对甜橙叶绿体基因组两个及以上核苷酸重复构成的SSR位点进行定位分析,找出代表性材料间有差异的位点,针对差异位点设计cpSSR引物。选择在分类学和/或起源研究上有代表性的柑橘属及近缘属材料48份,利用新开发的cpInDel、cpSSR标记和已报道的cpSSR标记进行扩增检测、电泳谱带分析和聚类分析。【结果】本研究新开发4个cpInDel标记和13个cpSSR标记。扩增检测显示,这些标记在48份试验材料中均能扩增出较为清晰的多态性条带;但cpInDel标记扩增出的条带更为单一,类群区分时,仅通过单个标记便能实现对某一类群或几个类群的区分,具有更好的区分效果。聚类分析显示,cpInDel和cpSSR标记得到了比较类似的结果,但在小类群关系以及部分材料的归类上存在差异。二者均揭示枸橼类柠檬-藜檬-来檬杂种的胞质来源并非香橼,枳杂种的胞质也并非枳,显示宽皮柑橘类黄柑的代表性品种‘旺苍皱皮柑’有不同于宽皮柑橘类其他品种的胞质来源,‘资阳香橙’和‘韩国香橙’胞质差异明显。针对宽皮柑橘类、甜橙-酸橙类和宜昌橙-大翼橙类3个小类群的相互关系,cpInDel显示它们关系较近,而cpSSR则将它们归为独立的类群;cpInDel标记将印度野橘归于真正的枸橼类,cpSSR将其单独聚为一类。【结论】叶绿体基因组分子标记分析能从胞质角度揭示不同于核基因组的柑橘属及近缘属植物的亲缘关系,但若与核基因组分子标记分析相结合,能更全面地揭示材料间的亲缘关系,更准确地鉴定柑橘种质资源。

风冷与冷藏过程中酱卤牛肉风味逸散行为研究

强宇, 姜薇, 刘成江, 黄峰, 韩东, 张春晖

中国农业科学. 2022, 55(16): 3224-3241. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.013

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【目的】明确风冷与冷藏过程中酱卤牛肉挥发性风味物质逸散行为,为酱卤牛肉的风味保持与风味调控提供理论依据。【方法】采用电子鼻（electronic nose,E-nose）、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction gas chromatography mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS）,结合气味活性值（odor activity value,OAV）和主成分分析（principal component analysis,PCA）,明确酱卤牛肉在风冷（中心温度从50℃降至10℃,风速2 m∙s^-1,降温时间90 min）和冷藏（4℃贮藏0、6、18、30、42和54 h）阶段挥发性风味物质变化,揭示酱卤牛肉中关键风味活性物质的逸散行为。【结果】E-nose结果表明,风冷阶段,刚出卤煮罐、风冷前和风冷后酱卤牛肉的风味轮廓差异显著,主要由氮氧类化合物、醇类、醛酮类化合物、芳香类化合物和有机硫化物差异导致;冷藏0、42和54 h后,酱卤牛肉的风味轮廓差异显著,氮氧类化合物、醇类、醛酮类化合物是导致差异的主要风味物质,而冷藏6、18和30 h后风味轮廓没有显著性差异。HS-SPME-GC-MS结果表明,酱卤牛肉在风冷阶段分别鉴定出39、31和33种挥发性风味物质,含量分别为13 636.18、9 799.21和8 213.86 μg·kg^-1,总含量降低39.8%;冷藏阶段分别鉴定出36、36、34、34、31和29种挥发性风味物质,含量分别为7 712.65、6 196.00、5 319.42、4 732.69、5 295.05和4 281.82 μg·kg^-1,总含量降低44.5%。冷藏是酱卤牛肉挥发性风味物质逸散的主要阶段。OAV分析表明,风冷阶段共有18种风味活性物质,其中桉叶油醇、月桂醇、戊醛和左旋香芹酮在风冷前全部丢失;3-羟基-2-丁酮、苯乙醇、香叶基丙酮和芳樟醇逸散严重,OAV值分别降低81.3%、64.0%、63.7%和55.1%。冷藏阶段共有15种风味活性物质,其中乙酸异丁酯、庚酸乙酯在贮藏6 h后全部丢失;茴香脑、丁香酚、草蒿脑和芳樟醇逸散严重,OAV值分别降低63.9%、63.8%、58.1%和53.9%。【结论】冷藏是酱卤牛肉风味活性物质丢失逸散的主要阶段;风冷和冷藏过程中醇类、酮类、酯类和酚醚类化合物更容易发生丢失逸散;丢失逸散的风味活性物质主要来源于香辛料。

体外法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖酶谱及其对育肥猪肠道微生物的影响

邓富丽,申丹,钟儒清,张顺芬,李滔,孙曙东,陈亮,张宏福

中国农业科学. 2022, 55(16): 3242-3255. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.014

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【目的】利用体外模拟法优化玉米—杂粕型饲粮的非淀粉多糖（NSP）酶谱,并分析优化的非淀粉多糖酶谱对饲粮养分消化率和育肥猪肠道微生物组成和结构的影响,为饲粮高效利用和精准饲养提供数据支撑和理论参考。【方法】试验一在育肥猪玉米—杂粕型饲粮中分别添加不同水平的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和果胶酶6种NSP酶,采用胃—小肠体外模拟法测定体外回肠干物质消化率（IVIDMD）;取IVIDMD达到最大值时各NSP酶的添加水平为该NSP酶0编码水平,按照六元二次回归正交旋转组合设计,进行体外消化试验,建立IVIDMD与NSP酶添加量的六元二次回归方程,筛选出玉米—杂粕型饲粮最优NSP酶谱（OEC）;利用胃—小肠—大肠体外模拟消化法分析测定添加OEC前后饲粮的体外干物质消化率（IVDMD）、体外能量消化率（IVGED）和体外消化能（IVDE）,以验证OEC的效果。试验二按照单因素完全随机设计,选用16头健康、体重相近去势公猪（117.8 ± 1.66 kg）,随机分为2个处理组,每个处理8头猪,对照组饲喂玉米—杂粕型基础饲粮,加酶组在基础饲粮中添加OEC;在试验开展第18天采用直肠擦拭法采集猪新鲜粪便,利用16S rRNA基因高通量测序对粪便微生物菌群的多样性及相对丰度进行分析,并进行功能预测。【结果】（1）在本试验条件下,玉米—杂粕型饲粮OEC为：纤维素酶1 003 U·kg^-1、木聚糖酶18 076 U·kg^-1、β-葡聚糖酶1 377 U·kg^-1、β-甘露聚糖酶14 765 U·kg^-1、α-半乳糖苷酶337 U·kg^-1和果胶酶138 U·kg^-1;（2）在玉米—杂粕型饲粮中添加OEC使IVDMD由73.44%显著提高到76.26%（P<0.01）,IVGED由74.03%显著提高到76.45%（P = 0.01）,IVDE由14.97 MJ·kg^-1显著提高到15.58 MJ·kg^-1（P<0.01）;（3）在门水平上,共筛选出了12个相对丰度大于0.1%的菌门,其中Bacteroidota（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Spirochaetota（螺旋体门）为优势菌门,三者之和在组内占比达96%以上;（4）在属水平上,饲粮中添加OEC显著增加norank_f_F082,norank_f_Bacteroidales_RF16_group,Bacteroides（拟杆菌属）和Roseburia（氏菌属）的相对丰度（P<0.05）,Eubacterium_ruminantium_group（P = 0.083）有增加的趋势,而Oscillibacter（颤杆菌克）的相对丰度显著降低（P<0.05）,Clostridium_sensu_stricto_1和norank_f__norank_o__WCHB1-41（P = 0.083）有降低的趋势（P = 0.052）。【结论】饲粮中添加体外法优化的NSP酶谱,显著提高了育肥猪玉米—杂粕型饲粮干物质和能量的体外消化率以及体外消化能,增加了纤维分解菌和产丁酸菌等有益菌在育肥猪肠道微生物中的占比,在一定程度上减少了有害菌的数量,优化了肠道微生态。

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

张冯禧,肖琦,朱家平,尹力鸿,赵霞玲,严明帅,徐晋花,温立斌,牛家强,何孔旺

中国农业科学. 2022, 55(16): 3256-3266. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.16.015

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【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

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