中国农业科学

Ac/Ds转座子激活标签技术研究进展

王文静, 马浩然, 李加纳, 张洪博

中国农业科学. 2013, 46(14): 2845-2855. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.001

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随着植物基因组测序工作的迅速发展，植物功能基因组学已经成为植物分子生物学研究的重要内容，而大量有表型的突变体是进行功能基因组学研究的重要基础。Ac/Ds转座子激活标签技术（Ac/Ds transposon activation tagging system）的产生使Ac/Ds转座子标签技术具有了产生显性突变的功能，并可避免在突变体库创建过程中进行大量繁重的人工转基因操作，是比较理想的植物功能基因组学研究工具。本文将对Ac/Ds转座子激活标签技术在发展过程中利用不同激活标签创建植物突变体库的研究进行介绍，并对近二十几年来报道的相关应用研究展开论述，以期对该领域的技术进步和应用研究提供一些有益的启发和参考。

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

宋修鹏1, 黄杏2, 莫凤连1, 田丹丹3, 杨丽涛12, 李杨瑞12, 陈保善1

中国农业科学. 2013, 46(14): 2856-2868. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.002

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【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL），分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况，为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析，通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL，以生物信息学方法对其序列进行预测分析，利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL，命名为ScPAL，GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp，含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF），编码704个氨基酸。序列分析表明，其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA），与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示，甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达，在根中的表达量最高，是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达，但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL），是典型的PAL家族成员，推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程，且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。

抽穗结实期不同时段高温对稻米品质的影响

张桂莲, 张顺堂, 王力, 肖应辉, 唐文帮, 陈光辉, 陈立云

中国农业科学. 2013, 46(14): 2869-2879. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.003

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【目的】研究抽穗结实期不同时段高温处理对稻米品质的影响，阐明高温对稻米品质的影响机理及其时段效应。【方法】选用耐热性不同的两个水稻品系，利用人工气候室进行抽穗结实期不同时段温度试验，研究抽穗结实期高温对稻米外观品质、加工品质、直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质含量、RVA特征谱、Mg/ K及籽粒的淀粉粒结构的影响。【结果】抽穗结实期高温使两品系稻米长宽比变小，垩白粒率和垩白度增加，糙米率、精米率、整精米率降低，直链淀粉含量和蛋白质含量增加，胶稠度降低；淀粉RVA谱特征值崩解值降低，冷胶粘度、消减值和糊化温度升高，峰值时间延长，Mg、K含量增加，Mg/K比值降低；淀粉粒扫描电镜显示，高温条件下，淀粉粒间结合较为疏松，籽粒内大多以单个淀粉粒的形式存在，折光率下降，胚乳透明度降低，导致垩白形成。相同处理条件下，耐热品系996稻米品质受高温影响低于热敏感品系4628。抽穗结实期不同时段高温对稻米品质影响存在显著差异，以始穗后8—14 d对稻米品质影响最大，其次为始穗后15—21 d、1—7 d、始穗后22—28 d影响较小。【结论】始穗后8—21 d是温度对稻米品质影响的关键时期，对稻米品质形成具有决定作用，而结实后期（始穗22 d后）环境温度对稻米品质影响较弱。

基于PyWOFOST作物模型的东北玉米估产及精度评估

陈思宁123, 赵艳霞2, 申双和3, 黎贞发1

中国农业科学. 2013, 46(14): 2880-2893. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.004

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【目的】构建合理的作物估产方案，提高作物估产精度。【方法】本文以基于集合卡尔曼滤波（Ensemble Kalman Filter，EnKF）构建的遥感信息-作物模型结合模型（PyWOFOST）为基础，建立了以LAI为结合点，适用于中国东北地区玉米的同化模拟模型，并使用MODIS LAI数据作为外部同化数据进行同化模拟，重点分析了遥感观测（MODIS LAI）和模型参数（出苗-开花期所需积温，TSUM1）的不确定性（即随机误差）对同化模拟结果的影响。最后，利用PyWOFOST模型实现了区域尺度上的玉米估产。【结果】同化外部观测数据后的玉米模拟产量较未同化外部数据的模拟产量有明显改善，20个未受灾害影响的农气站玉米产量同化前的模拟误差及在TSUM1的不确定性为0、10、20、30℃时的同化后模拟误差分别为14.04%、12.71%、11.91%、10.44%及10.48%；同化后的模拟LAI普遍较同化前的模拟LAI更接近实测LAI，更符合玉米LAI的变化趋势；同化前模拟发育期与实测发育期平均绝对误差为3.4 d，而同化后在TSUM1的不确定性为0、10、20、30℃时模拟发育期与实测发育期的平均误差分别为3.5、4.3、5.0、5.5 d。区域尺度上玉米估产结果表明，58.82%的区域玉米估产误差在15%以内，同化产量和统计产量的确定系数为0.806。【结论】基于集合卡尔曼滤波同化遥感信息进行作物估产是可行的。

白叶枯病菌和细菌性条斑病菌多样性的TALE效应蛋白调控水稻抗（感）病性机理与利用策略

李争, 熊鹂, 纪志远, 邹丽芳, 邹华松, 陈功友

中国农业科学. 2013, 46(14): 2894-2901. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.005

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培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病和条斑病的有效措施。最近几年有关TALE效应蛋白调控水稻抗（感）病性研究取得了突破性进展，这将改变水稻抗性品种培育策略。为此，本文对稻黄单胞菌-水稻互作系统中已知TALE效应蛋白与水稻中的已知或未知抗（感）病基因（R或S）的对应关系进行了归纳，并就tale基因进化及对应水稻R或S基因发掘进行了分析。另外，文中还对以TALE为基础发展而来的TALEN技术遗传修饰水稻感病基因的前景进行了展望。利用TALEN技术可将高产优质但感病的水稻品种（材料）转变为高产优质兼广谱抗病的水稻品种（材料）。

植物青枯菌遗传多样性及致病基因组学研究进展

徐进, 冯洁

中国农业科学. 2013, 46(14): 2902-2909. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.006

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植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.）引起的一种世界性重大病害。作为复合种，青枯菌在与寄主长期协同进化过程中，表现出广泛的生态和寄主适应性。Fengan和Prior提出青枯菌演化型分类框架，用以描述青枯菌种以下的遗传多样性。青枯菌种内表型特征差异的本质是其基因组较其它植物病原细菌更为复杂和更具可塑性。笔者对近期青枯菌遗传多样性和致病基因组学方面的研究进展进行了归纳和讨论。

植物病原黄单胞菌DSF信号依赖的群体感应机制及调控网络

周莲, 王杏雨, 何亚文

中国农业科学. 2013, 46(14): 2910-2922. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.007

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群体感应是微生物之间相互交流的一种重要联络方式，它协助细菌能感应群体密度从而调节基因表达。20世纪80年代以来，多种群体感应信号及其传导机制得以阐明。DSF（diffusible signal factor）是近年来在野油菜黄单胞菌中首先鉴定的1个新型群体感应信号，化学结构为顺式11?甲基?2?十二碳烯酸，其信号传导途径包括RpfC/RpfG双组分感应系统、二级信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）、全局性转录因子Clp等。在野油菜黄单胞菌中，DSF群体感应信号调控3类生物学功能：一是促进致病相关基因的表达；二是抑制生物膜形成；三是促进黄单胞菌作出代谢调整，适应高群体密度环境。RpfF是DSF信号生物合成过程中的关键酶，黄单胞菌在高群体密度条件下通过一种新型自我诱导机制大量合成DSF。DSF信号不仅存在于所有黄单胞菌属细菌中，也广泛存在于苛养木杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、伯克氏菌、铜绿假单胞菌和许多海洋细菌中，其传导途径和生物学功能还有待进一步阐明。

水稻细菌性基腐病研究进展

刘琼光, 张庆, 魏楚丹

中国农业科学. 2013, 46(14): 2923-2931. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.008

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水稻细菌性基腐病（rice bacterial foot rot）是中国及东南亚国家水稻产区重要细菌病害之一，不同年份在局部水稻产区致灾流行。本文对该病害在中国的发生危害情况、病原细菌的分类现状、侵染特性、寄主范围、致病因子、致病性等相关研究进展进行了分析，提出了该病害发生与防控研究中存在的问题。

冬小麦/夏玉米轮作系统不同施氮量的长期环境效应及区域氮调控模拟

王立刚, 李虎, 杨黎, 翟振, 邱建军

中国农业科学. 2013, 46(14): 2932-2941. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.009

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【目的】针对环渤海区域冬小麦/夏玉米轮作系统氮肥施用量过大，环境效应逐渐增大的实际情况，研究不同氮肥施用量下长期和区域环境效应，明确冬小麦/夏玉米的减氮潜力和区域。【方法】利用定位试验和生物地球化学模型相结合的研究方法。【结果】冬小麦/夏玉米不同氮素施用量15年的模拟结果表明，随着氮肥施用量的增加，作物产量逐渐增加，到两季作物施氮量达到240—300 kg N•hm-2以上时，作物产量增加能力有限，而氮淋溶损失量则逐渐加大，土壤中残留的无机氮素也逐渐增加。与当前区域氮肥施用量364×104 t相比，区域氮肥总量减少30%和优化施肥两种调控方案下环渤海地区总氮素平衡的各个输出项都有不同程度的降低，其中降低幅度最大的是氮淋溶，分别减少了67.23%和79.93%，极大地降低了氮素的环境风险。【结论】环渤海地区冬小麦/夏玉米轮作系统氮素的环境效应有随氮素施用量逐渐增加的态势，目前该种植模式具有减氮的潜力，区域减氮30%能够有效的减少环境效应，节氮潜力最明显的地区在山东东部、西南部和河北中部。

半无叶型豌豆根瘤菌接种效应及其竞争结瘤能力分析

郭丽梅12, 杨永2, 张世晨2, 胡跃高2, 隋新华3, 曾昭海2

中国农业科学. 2013, 46(14): 2942-2952. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.010

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【目的】研究不同根瘤菌株对豌豆生长发育、产量及品质的影响，并分析比较不同根瘤菌株的竞争结瘤能力，筛选出与供试豌豆品种匹配较好的根瘤菌株。【方法】在盆栽条件下，应用湖南省华容县棉田低氮土壤，对加拿大半无叶型豌豆MISER分别接种9株豌豆根瘤菌（CCBAU 33109、CCBAU 43228、CCBAU 43227、CCBAU 43232、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43242及商用菌株F98-1和F98-4）。测定豌豆的生育时期；在豌豆盛花期测定豌豆的主要生育特征、根瘤菌的结瘤固氮性能，并用BOX-PCR指纹图谱技术测定根瘤菌的占瘤率；在成熟期测定豌豆的主要生育特征、产量、产量构成因子，及其干籽粒粗蛋白、粗纤维含量。【结果】与不接种对照（CK）相比，接种CCBAU 33109后，MISER盛荚期和成熟期分别延长4.1和7 d（P＜0.05，下同）；接种ACCC 16058后，主茎节数在成熟期分别比对照、F98-1和F98-4多2.8、3.8和2.9节，株高比F98-4高15.67%，粗蛋白含量比对照和F98-1分别提高9.88%和10.63%；接种CCBAU 41242后，豌豆单株籽粒鲜重比商用菌株F98-1提高40.46%；接种菌株CCBAU 43228的占瘤率最高，为57.50%。【结论】根据接种根瘤菌对豌豆生长发育、产量以及品质等方面的影响，结合各根瘤菌株的竞争结瘤能力，本研究筛选出较适于豌豆MISER的豌豆根瘤菌株CCBAU 33109、ACCC 16058、CCBAU 41242、CCBAU 43228。

葡萄雌能花相关基因VvMS2的克隆及表达分析

郑焕1, 张计育12, 王新卫1, 章镇1, 季晨飞1, 陶建敏1

中国农业科学. 2013, 46(14): 2953-2962. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.011

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【目的】从欧亚种葡萄‘魏可’和‘钟山红’的花中分离出VvMS2基因，为研究葡萄雌能花形成的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中寻找与拟南芥雄性不育基因MS2同源性最高的葡萄序列（CBI29968），设计特异引物进行克隆测序，通过生物信息学方法分析结构特征，利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在‘魏可’各组织中及‘魏可’和‘钟山红’雄蕊发育不同时期中的表达特性。【结果】VvMS2基因cDNA编码区全长为1 755 bp，编码584个氨基酸，含有NAD结合域和雄性不育C-末端区域。VvMS2对应基因组DNA全长2 776 bp，含有9个外显子和8个内含子。基因编码蛋白质分子量为64.74 kD，等电点为8.84。该基因与GenBank中其它来源的MS2蛋白序列的相似性为40%—71%。VvMS2为花蕾特异表达基因，且仅在花粉发育四分体期到二核期有表达，单核期‘魏可’的表达量显著高于同时期‘钟山红’。【结论】推测该基因异常表达与‘钟山红’葡萄雌能花形成有关。

嫁接对辣椒次生代谢的影响及其与青枯病抗性的关系

刘业霞1, 付玲1, 艾希珍1, 王洪涛2, 姬德刚2

中国农业科学. 2013, 46(14): 2963-2969. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.012

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【目的】探讨嫁接辣椒酚酸类物质代谢在提高青枯病抗性中的作用。【方法】以‘富根卫士’辣椒为砧木，以‘新丰2号’为接穗嫁接，自根嫁接辣椒为对照（CK），通过人工接种青枯假单胞杆菌（Ralstonia sdanacearum E. F. Smith）研究嫁接与自根辣椒电解质渗漏率（EL）和过氧化氢（H2O2）含量、酚酸类物质及其相关酶活性的变化。【结果】随着接种后时间的延长，嫁接与自根辣椒的EL快速增加，但嫁接辣椒的EL升高幅度显著小于自根的；接种初期，嫁接辣椒叶片与根系中的H2O2含量显著高于自根的，而6—8 d后显著低于自根的。与自根辣椒相比，嫁接辣椒的香草醛、水杨酸、木质素含量及苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性均较高。【结论】嫁接辣椒次生代谢增强，酚酸类物质增多是其抗病性增强的重要原因，水杨酸和香草醛在提高嫁接辣椒青枯病抗性中发挥主要作用。

两大优势产区‘红富士’苹果园土壤和叶片营养诊断研究

王富林, 门永阁, 葛顺峰, 陈汝, 丁宁, 彭福田, 魏绍冲, 姜远茂

中国农业科学. 2013, 46(14): 2970-2978. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.013

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【目的】通过对中国环渤海和黄土高原两大优势产区‘红富士’苹果园土壤有效养分和叶片矿质元素含量的测定及营养状况诊断，为苹果园科学施肥提供理论依据。【方法】根据土壤有效养分分级标准及叶片DRIS诊断法，采用DPS V7.05软件进行LSD单因素方差分析和差异性显著分析，对两大产区树龄15—20年的高产（＞37 500 kg•hm-2）、低产（＜37 500 kg•hm-2）园土壤和叶片营养状况进行诊断。【结果】环渤海产区土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾有效养分均值分别为10.9 g•kg-1、73.21 mg•kg-1、70.22 mg•kg-1、169.2 mg•kg-1 ；黄土高原产区土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾有效养分均值分别为11.7g•kg-1、56.46 mg•kg-1、14.91 mg•kg-1、135.78 mg•kg-1 ；除有机质外，碱解氮、速效磷、速效钾有效养分含量为环渤海产区高于黄土高原产区；环渤海产区叶片N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo各养分元素含量均值分别为2.73%、0.18%、1.15%、9.63 g•kg-1、2.86 g•kg-1、87.97 mg•kg-1、124.02 mg•kg-1、13.36 mg•kg-1、15.64 mg•kg-1、35.09 mg•kg-1、0.51 mg•kg-1；黄土高原产区叶片N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo各养分元素含量均值分别为2.72%、0.18%、1.17%、10.23 g•kg-1、2.99 g•kg-1、88.69 mg•kg-1、116.39 mg•kg-1、10.85 mg•kg-1、15.94 mg•kg-1、39.55 mg•kg-1、0.51 mg•kg-1。通过DRIS法对两大优势产区叶片营养诊断结果表明，环渤海产区低产园叶片最缺乏的元素为Ca、K，其次是Fe、N、Zn，最不缺乏的是Cu、Mo；黄土高原产区低产园叶片最缺乏的元素是P、K，其次是N、Zn、Cu等,最不缺乏的是B、Ca。【结论】环渤海、黄土高原产区土壤有效养分状况均为有机质中等偏低、缺氮；环渤海产区富P少K；黄土高原产区贫P缺K。低产园叶片诊断表明，黄土高原产区树体营养平衡状况优于环渤海产区，两产区均具有很大的增产潜力。建议环渤海产区增加K、N、Ca、Fe和Zn施用，黄土高原产区增加P、K、N、Zn、Cu、Mn、Fe施用，同时重视有机肥施用。

土壤干旱对葡萄果实中黄烷醇类多酚时空积累及隐色花色素还原酶活性、组织定位的影响

温鹏飞, 牛兴艳, 邢延富, 高美英, 牛铁泉

中国农业科学. 2013, 46(14): 2979-2989. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.014

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【目的】葡萄果实发育过程中，土壤干旱对黄烷醇类多酚时空积累及其合成关键酶隐色花色素还原酶（leucoanthocyanidin reductase, LAR）活性和组织定位的影响。【方法】以5年生赤霞珠葡萄为试材，采用避雨棚和断根沟措施模拟土壤干旱，跟踪果实发育进程，采用分光光度计法、免疫组织定位等方法，就黄烷醇类多酚的时空积累及其合成关键酶LAR活性和组织定位进行研究。【结果】土壤干旱明显抑制葡萄果实生长，促进果实总酚积累，特别是在幼果期，土壤干旱明显促进葡萄果实总酚积累。土壤干旱未改变黄烷醇类多酚和总黄烷-3-醇的时空积累模式，但对其积累具有一定的诱导作用，且这一诱导作用具有明显的器官和发育阶段依赖性。土壤干旱明显诱导幼果期葡萄果皮和果肉中LAR酶活性增强，对LAR1、LAR2分布无明显作用，但诱导其积累，特别是在果肉维管束中，土壤干旱明显诱导LAR1、LAR2蛋白积累。【结论】土壤干旱诱导果实中LAR1、LAR2蛋白积累，进而导致LAR酶活性增强，最终表现为促进相应发育阶段、部位黄烷醇类多酚积累。

薏米多酚细胞抗氧化及HepG2细胞毒性和抗增殖作用

王立峰1, 陈静宜1, 谢慧慧1, 王玉梅1, 石嘉怿1, 梁正昌2, 刘瑞海2, 鞠兴荣1, 袁建1

中国农业科学. 2013, 46(14): 2990-3002. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.015

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【目的】了解薏米多酚的体内抗氧化能力，着重分析薏米结合多酚的抗氧化能力，确定结合多酚对总抗氧化能力的贡献；研究薏米多酚对肝癌细胞的毒性和抗增殖作用，在细胞层面上对薏米多酚的功能作用进行评价分析。【方法】以贵州黑谷薏米、辽宁5号薏米、龙薏1号薏米为原料，通过对薏米样品多酚类物质游离型和结合型部分构建细胞模型，评价细胞内抗氧化能力指数，以HepG2细胞为研究对象，测定分析薏米多酚提取物对细胞毒性的中位浓度CC50值和细胞抗增殖作用的半最大效应浓度EC50值。【结果】薏米结合型多酚抗氧化能力显著高于游离型多酚。不同品种间总多酚含量和抗氧化能力差异显著，辽宁5号薏米和龙薏1号薏米明显优于贵州黑谷薏米。对于HepG2细胞，薏米品种对于人体肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用，且基本在试验浓度范围内，薏米样品本身无细胞毒性的存在。【结论】薏米作为中国传统的药食两用全谷物食品，含有丰富的多酚类物质，具有较强的抗氧化能力，之前的研究，往往仅考虑薏米游离型多酚，实际薏米中还存在大量结合型多酚。考虑到此结合型多酚，薏米多酚的抗氧化能力明显提升，且薏米多酚对肿瘤细胞具有较明显的抗增殖作用。

酱肉中β-咔啉harman和norharman来源的研究

潘晗, 王振宇, 郭海涛, 倪娜, 陈丽, 张德权

中国农业科学. 2013, 46(14): 3003-3009. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.016

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【目的】探讨酱肉中辅助致突物β-咔啉1-甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚(harman)和9H-吡啶[3,4-b]吲哚(norharman)的来源。【方法】采用固相萃取-高效液相色谱法分析6种酱肉及5种酱油中harman和norharman的含量，并选取其中1种酱油制作酱羊肉，分析酱羊肉中harman和norharman的来源。【结果】6种酱肉及5种酱油中均检测出β-咔啉，其中酱肉中harman含量为3.71—42.32 ng•g-1，norharman含量为2.95—63.97 ng•g-1；酱油中harman含量为111.47—301.30 ng•g-1，norharman含量为74.71—199.27 ng•g-1。在生鲜羊肉中未检测到harman和norharman，而在未添加酱油和调料的水煮空白羊肉中检测到harman和norharman，其含量分别为3.39 和4.05 ng•g-1，在加入调料和酱油的羊肉中，harman和norharman含量分别为17.30和12.18 ng•g-1。在酱羊肉制作过程中，羊肉仅水煮产生的harman、norharman含量分别占总含量的15%、23%；酱油与调料单独水煮后产生的harman、norharman含量分别占58%、46%；羊肉与酱油共同反应生成的harman、norharman所占比例分别为27%、31%。【结论】酱肉和酱油中普遍存在harman和norharman，且酱油中含量更高。酱羊肉中，约有50%的harman和norharman来源于酱油，羊肉成分的热降解及羊肉与酱油共同反应也是harman、norharman的重要来源。

成肌细胞成脂过程中PPARγ、C/EBPα和Myogenin 基因启动子的甲基化变化

姜美华, 巨婷婷, 刘洋, 许玲, 孙文娟, 赵泮峰, 尹靖东

中国农业科学. 2013, 46(14): 3010-3021. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.017

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【目的】利用C2C12成肌细胞探讨肌源性干细胞成脂过程与调控成脂和成肌分化的关键转录因子PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）、C/EBPα（CCAAT/enhancer binding protein alpha）和Myogenin启动子区甲基化的关系。【方法】分别用2%马血清和三联诱导剂诱导C2C12细胞成肌和成脂分化，在马血清促进的成肌分化第0、1、3和5天收集细胞进行姬姆萨染色观察肌管形成情况；在三联诱导的成脂分化第0、2、4、6和10天收集细胞进行油红O染色观察脂滴形成情况；提取成肌诱导第0、1、3、5天和成脂诱导第0、2、4、6天的RNA和DNA，分别采用qRT-PCR检测成肌和成脂分化相关基因的表达，采用重亚硫酸盐测序的方法检测PPARγ、C/EBPα和Myogenin启动子区甲基化的变化，并分析基因表达与甲基化状态的相关关系。【结果】①C2C12细胞经马血清诱导形成了多核肌管，表达成肌相关基因，但不表达脂肪特异性基因；三联诱导使C2C12细胞自主分化的肌管中沉积了脂滴，同时表达成脂和成肌相关基因；②重亚硫酸盐测序结果表明，在未分化的成肌细胞中，PPARγ基因启动子的甲基化水平是61%，在三联诱导第2、4和6天，其甲基化程度依次为49%、39%和42%，呈逐渐去甲基化趋势，与PPARγ基因转录负相关；在马血清诱导第3和5天，甲基化水平为56%和48%，与未分化的成肌细胞相比差异不显著，同时PPARγ基因的表达水平也没有显著变化；③Myogenin基因在马血清促进的成肌过程中甲基化水平不断降低（49%、42%、35%和34%），转录水平急剧增加；在三联诱导过程中，Myogenin启动子的甲基化水平由0天的49%下降为第1天的37%、第3天的41%和第5天的38%，但下降幅度弱于马血清诱导的成肌过程，这一结果与降低的Myogenin转录上调相吻合；④C/EBPα基因在未分化的C2C12细胞中呈低甲基化状态，甲基化程度仅为1.6%，在成肌分化和脂肪沉积过程中均未发生显著变化，与基因表达无显著关联。【结论】成脂和成肌关键转录因子PPARγ和Myogenin启动子区的DNA甲基化变化参与了成肌细胞的分化和脂肪沉积的调控。

麦洼牦牛H-FABP、HSL基因多态性及与生长性状的相关分析

柴志欣1, 王永1, 罗晓林2, 武志娟1, 刘仲娜1, 钟金城1

中国农业科学. 2013, 46(14): 3022-3031. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.018

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【目的】探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein，H-FABP）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）基因在牦牛中的遗传多态性，进一步揭示牦牛各品系间的遗传分化以及候选基因与牦牛生长性状间的关联性，同时为2个候选基因在牦牛中的表达调控等研究提供理论依据，寻找可用于辅助选择的分子标记。【方法】采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对共100头麦洼牦牛个体的H-FABP、HSL基因的外显子部分进行遗传多态性分析，统计基因和基因型频率，进行Hardy-Weinberg平衡性检测，计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标，分析候选基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。【结果】①麦洼牦牛H-FABP、HSL基因外显子部分均存在多态性，多态性检验均存在3种基因型；②适合性检验表明仅HSL基因外显子8上多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态，其余多态位点均偏离；③测序分析表明，H-FABP基因外显子4第7 339位（与原序列相比）发生单碱基突变（T→C），该突变属同义突变；HSL基因外显子7第6 883位发生G→C转换，以及第6816处发生碱基A→G突变，并导致编码氨基酸由天冬氨酸（D）转变为甘氨酸（G）；外显子8第10 183 bp处发生A→G碱基突变，编码氨基酸由半胱氨酸（C）变为甘氨酸（G）；④对各标记基因型生长发育指标（体高、体斜长、胸围、管围、体重）进行差异显著性检验，仅HSL基因外显子7上A6816G基因座差异极显著（P﹤0.01）。【结论】麦洼牦牛H-FABP、HSL基因存在遗传多态性，且HSL基因外显子7上A6816G基因座表现的多态有可能作为一种遗传标记。

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

李伟, 郑蒙蒙, 张亚妮, 朱才业, 邱峰龙, 韦光辉, 李碧春

中国农业科学. 2013, 46(14): 3032-3039. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.019

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【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因，并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA，定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein，eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中，构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1，经过酶切、测序鉴定后，采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast，GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化，探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因，并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点，将其终止密码子TGA定点突变为GGA，定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体，获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1；经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后，获得MyoD1异位表达的GEF细胞株；间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay，IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志；采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生，并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志，处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因，构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系，过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。

原核表达番鸭呼肠孤病毒σC与σB蛋白对雏番鸭的免疫保护

吴晓平, 吴异健, 韩典霖, 吴宝成, 黄一帆

中国农业科学. 2013, 46(14): 3040-3045. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.020

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【目的】探讨原核表达的番鸭呼肠孤病毒（DRV）外壳蛋白σC与σB对于雏番鸭的免疫保护作用，为研制有效的DRV亚单位疫苗提供理论基础。【方法】对pET-30a-S3/BL21重组菌与pET-30a-S4 ORF2/BL21重组菌进行稳定性检验，表达的重组蛋白进行纯化和复性后，进行油乳剂制备，50只1日龄雏番鸭随机平均分为5组，即DRV σB蛋白免疫组、DRV σC蛋白免疫组、DRV σB + σC蛋白免疫组及PBS对照组和攻毒对照组，免疫组皮下接种剂量为500 μg/只，7日龄时进行二次免疫，14日龄时进行攻毒试验，ELISA和琼扩（AGP）检测抗体水平并计算保护指数。【结果】重组菌具有良好的稳定性，各免疫组的雏番鸭均在第2次免疫后7 d产生了一定效价的抗体，其中DRV σB + σC蛋白免疫组和DRV σC蛋白免疫组的雏番鸭血清抗体ELISA效价均为1﹕200，高于DRV σB蛋白免疫组的1﹕100。攻毒保护试验结果表明，联合免疫的保护指数最高，可达70，重组DRV σC保护指数次之，为60，重组DRV σB蛋白保护指数最低，仅为40。【结论】使用原核表达的DRV外壳蛋白σC与σB制备油乳剂，联合免疫可诱导雏番鸭快速产生一定效价的抗体，并提供良好的免疫保护力。

玉米杂交种与亲本苗期叶片差异表达蛋白谱分析

郭宝健, 隋志鹏, 李洋洋, 冯万军, 闫文文, 李慧敏, 孙其信, 倪中福

中国农业科学. 2013, 46(14): 3046-3054. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.021

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【目的】建立玉米杂交种与亲本苗期叶片差异表达蛋白谱，探讨叶片大小杂种优势形成的分子机理。【方法】以玉米强优势杂交种Mo17/B73及其亲本发芽后第5天的第3片叶为材料，采用双向电泳技术（2-DE），结合MALDI TOF MS质谱技术，建立叶片细胞分裂和生长关键区域的差异表达蛋白质谱，并对差异表达蛋白进行质谱鉴定。【结果】在检测到的630个蛋白质点中，有52个蛋白质点在杂交种与亲本之间的表达差异达到显著水平，表现为单亲沉默（15个）、偏高亲（13个）、偏低亲（8个）、杂种上调（6个）、杂种下调（7个）和杂种特异表达模式（3个）。另外，还成功鉴定出了其中的28个差异表达蛋白质点，涉及到代谢、胁迫响应、糖酵解、转录调控、蛋白折叠和降解、三羧酸循环、细胞骨架、发育及未知蛋白质等9个功能类别。【结论】玉米杂交种与亲本在蛋白丰度上存在明显的差异，并且差异表达蛋白涉及到多个功能类别，可能与玉米叶片大小杂种优势的形成有关。

粉垄耕作对黄淮海北部春玉米籽粒灌浆及产量的影响

李轶冰1, 逄焕成1, 李华1, 李玉义1, 杨雪1, 董国豪2, 郭良海2, 王湘峻2

中国农业科学. 2013, 46(14): 3055-3064. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.022

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【目的】在黄淮海北部引入一种称作“粉垄”的新型深土耕作措施，旨在解决由于连年旋耕所致的犁底层上移、耕层变浅，限制作物产量提高的现实问题。【方法】以旋耕和深松为对照，设置粉垄30 cm、粉垄50 cm、粉垄30 cm+地膜、粉垄50 cm+地膜等处理，探究其对春玉米灌浆和产量的影响。【结果】与旋耕和深松相比，粉垄利于水分入渗，增加了土壤贮水，改善了土壤水分供给，提高了春玉米的穗粒数和籽粒含水率；尽管灌浆渐增期不具有优势，且耕作深度越深，起始生长势和平均灌浆速率越低，但灌浆快增期和缓增期平均灌浆速率随耕作深度增加的优势突出；最终粉垄的百粒重和产量显著高于两对照。粉垄加盖地膜保存了更多水分，显著提高了穗粒数，灌浆渐增期灌浆速率便优势明显，且耕作深度越深，优势越明显，加之灌浆期延长，百粒重和产量显著高于未覆膜两处理。【结论】粉垄覆膜的新型耕作措施为打破犁底层、解决耕层变浅、促进作物增产提供了一种新的可行方法。

NO对缺氮胁迫下棉花幼苗生理生长的调控效应

陈静, 刘连涛, 孙红春, 张永江, 王占彪, 李存东

中国农业科学. 2013, 46(14): 3065-3071. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.023

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【目的】探讨外源一氧化氮（Nitric oxide，NO）对氮素胁迫下棉花幼苗生长和叶片生理性状的影响，为NO的供体硝普钠（Sodium nitroprusside，SNP）调控棉花生长发育提供理论依据。【方法】采用水培处理，设置两个对照：以全营养素Hoagland营养液培养棉花幼苗为对照1（CK1），缺氮Hoagland营养液培养棉花幼苗为对照2（CK2）。在CK2的基础上，利用SNP处理棉花幼苗，设置5个处理，每个处理SNP浓度分别为50、100、200、500和1 000 μmol•L-1，研究NO对氮胁迫下棉花幼苗生理生长的调控效应。【结果】氮素胁迫对棉花幼苗产生抑制作用，导致棉苗的光合系统及蛋白质、脯氨酸含量产生变化。低浓度外源NO能明显促进氮素胁迫下棉花幼苗的生长，显著提高叶绿素、脯氨酸及可溶性蛋白含量，其中以100 μmol•L-1 SNP缓解胁迫效果最好。而高浓度的外源NO则加剧氮素胁迫对棉苗的抑制。【结论】低浓度外源NO（SNP:50—100 μmol•L-1）的确能缓解氮素胁迫对棉花幼苗造成的伤害，提高棉花幼苗对氮素胁迫的耐性。

响应面法优化姜脯糖煮液活性炭脱色工艺

张璐, 乔旭光, 刘晓宇, 于华洋, 刁顺泽, 唐晓珍

中国农业科学. 2013, 46(14): 3072-3078. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.024

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【目的】解决姜脯糖煮液重复使用过程中色泽加深的问题，以期经过脱色的糖液可供姜脯生产中继续使用。【方法】以姜脯糖煮液为原料，通过紫外扫描确定最大吸收波长，分别选择活性炭添加量1%、2%、3%、4%、5%，温度60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，时间10 min、20 min、30 min、40 min、50 min进行单因素试验，以脱色率为指标确定试验条件；而后在单因素试验的基础上进行响应面优化试验。【结果】通过紫外扫描确定糖煮液的最大吸收波长在306 nm，单因素试验确定活性炭添加量为5%，脱色温度80℃，脱色时间30 min；在79℃下、加入5%活性炭、搅拌35 min的响应面优化工艺条件下进行脱色，脱色率可达45.1%。【结论】活性炭添加量、脱色温度、时间都显著影响糖煮液的脱色效果，经过响应面优化工艺脱色的糖煮液脱色效果良好，可供制作姜脯继续使用。

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