中国农业科学

《中国农业科学》2018年第51卷第11期目次

中国农业科学. 2018, 51(11): 0-0.

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水稻粉质胚乳fse3突变体的表型分析及基因定位

于艳芳，刘喜，田云录，刘世家，陈亮明，朱建平，王云龙，江玲，张文伟，王益华，万建民

中国农业科学. 2018, 51(11): 2023-2037. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.001

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【目的】水稻各种类型的胚及胚乳变异突变体是解析胚发育及淀粉合成和调控路径的优良材料。研究旨在通过大规模的粉质胚乳致死突变体的基因克隆和功能鉴定，获得一系列调控胚发育及淀粉合成的关键基因，为稻米品质改良提供理论指导。【方法】从化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）处理的粳稻品种宁粳3号突变体库中，筛选到一个稳定遗传的胚乳粉质皱缩致死突变体，命名为fse3（floury and shrunken endosperm 3）。将其与9311配制杂交组合，利用F2群体中隐性极端个体进行精细定位；将种子在30℃条件下清水浸种24 h，然后在35℃黑暗条件下用TTC染色2 h检测种子活力；用体视镜观察30℃吸胀9 h后的种子胚结构；从突变体杂合植株上分离粉质成熟种子，去壳后磨成糙米粉进行理化性质分析；用扫描电镜观察成熟淀粉颗粒的结构；制备半薄切片观察发育胚乳中的淀粉颗粒结构；利用qRT-PCR测定籽粒灌浆时期的淀粉合成相关基因表达量；并通过Western-blot检测相关淀粉合成酶的蛋白积累。【结果】与野生型相比，突变体籽粒的千粒重、籽粒大小、总淀粉含量、表观直链淀粉含量等指标均降低，淀粉在尿素溶液中的膨胀能力减弱，淀粉的黏度曲线与野生型也存在显著差异，fse3突变体的最高黏度、热浆黏度、冷浆黏度以及崩解值都显著高于野生型。TTC染色表明其胚活力下降，对发育中的胚纵切片观察发现突变体没有心型胚的分化。对发育中胚乳淀粉结构进行观察，发现fse3突变体的胚乳中产生大量小而不规则排布的单淀粉颗粒，复合淀粉颗粒发育滞后。成熟种子横截面观察发现fse3突变体淀粉颗粒排列疏松，大小不均匀，颗粒间存在较大间隙。利用F2群体中分离出的22个隐性极端个体将FSE3连锁在第9染色体长臂上，随后共用1 400个极端个体将目标基因定位于228 kb的区间内，包含28个开放阅读框。qRT-PCR发现在突变体中多个淀粉合成相关基因表现出不同程度的上调和下调，Western-blot结果表明部分淀粉合成酶的蛋白积累减少。【结论】FSE3是一个新的粉质胚致死基因，基因精细定位在第9染色体228 kb的物理区间，FSE3在水稻种子胚及胚乳的发育调控中起重要作用。

荞麦mate的克隆及表达分析

常雪玲，张宗文，李艳琴，高佳

中国农业科学. 2018, 51(11): 2038-2048. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.002

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【目的】多药物和有毒化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE）是生物中5类解毒输出转运蛋白家族之一。作为植物中最大的转运蛋白家族之一，其主要功能为次生代谢物的积累、重金属转运和激素信号转导。通过分析荞麦mate的克隆与表达为MATE型转运蛋白成员在荞麦中的功能研究提供基础。【方法】通过3′和5′RACE克隆获得荞麦mate全长cDNA序列；利用在线网上工具预测MATE蛋白的分子量、等电点、二级结构及跨膜结构域；选取MEGA软件中的NJ法构建荞麦MATE蛋白的系统发育树以初步推测MATE蛋白在荞麦中的作用方式及功能；荧光定量试验测定mate在荞麦不同组织及不同发育阶段种子中的相对表达量，并与原花青素含量测定结合进一步验证MATE转运蛋白在荞麦中的功能。【结果】通过RACE克隆获得2条荞麦mate全长cDNA，分别命名为Fett12 （GenBank accession No. MG515589）和Femate3 （GenBank accession No. MG515590）。通过ExPASy中的protparam在线分析得到Fett12编码一个含有492个氨基酸残基的蛋白，其分子量为53.81 kD，等电点为6.75；Femate3编码一个含有516个氨基酸残基的蛋白，分子量为56.12 kD，等电点为6.52。通过构建系统进化树显示FeTT12属于原花青素MATE转运蛋白；FeMATE3属于柠檬酸盐MATE转运蛋白。将FeMATE3与其他物种中转运柠檬酸盐的MATE型蛋白氨基酸多序列比对及同源分析，发现其与Al离子胁迫相关的荞麦MATE蛋白FeMATE2的一致性达到96.33%；同时将FeTT12氨基酸序列与其他植物TT12编码的氨基酸序列进行比对和同源分析，得到荞麦FeTT12与其他物种的TT12蛋白的氨基酸序列具有极高的同源性，其中与MnTT12蛋白同源性最高，为77.3%；与拟南芥TT12蛋白同源性最低，为41.5%。进一步研究Fett12的表达特异性与原花青素累积之间的相关性，得到Fett12的表达具有明显的时空特异性，且在荞麦叶中的表达量最高。原花青素的含量测定中发现原花青素作为次级代谢产物，其分布具有明显的组织器官差异，且在荞麦花中的含量明显较高。在荞麦不同发育阶段的种子中，Fett12的表达量随着种子不断成熟而增高，PA的含量逐渐下降。【结论】在荞麦中成功克隆获得2条mate序列——Fett12和Femate3。其中，Fett12与荞麦中原花青素的转运和累积相关，Femate3可能与荞麦中Al离子胁迫相关。

紫花苜蓿不同发育时期次生壁合成调控的转录组分析

刘希强，张涵，龚攀，宫文龙，王赞

中国农业科学. 2018, 51(11): 2049-2059. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.003

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【目的】探讨紫花苜蓿次生壁合成的基因网络调控变化和表达模式，确定一些关键候选基因和转录因子，为紫花苜蓿次生壁加厚调控网络的分子机制研究奠定基础。【方法】对‘中苜1号’紫花苜蓿分枝期（S1）、现蕾期（S2）、初花期（S3）和盛花期（S4）的茎进行近红外光谱法测定次生壁主要物质含量和Illumina HiSeq^TM 2500高通量转录组测序。以紫花苜蓿的近缘物种蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）基因组作为参考基因组进行序列比对并组装构建转录本。利用FPKM法计算基因表达量，以Fold change（差异表达倍数）≥2或≤0.5（表达上调或下调）、FDR（false discover rate）≤0.05为筛选条件，在3个相邻时期转录组比较组合中（S2vs S1，S3 vs S2，S4 vs S3）筛选差异表达基因。通过Gene Ontology数据库和KEGG Pathway数据库对紫花苜蓿不同发育时期差异表达基因的功能和参与的代谢途径进行注释。【结果】共获得41 734个基因在紫花苜蓿不同发育时期的转录表达情况，27个功能注释与紫花苜蓿纤维素、木质素合成密切相关的基因差异表达，其变化趋势与纤维素和木质素含量测定结果基本一致，即随着生长发育时期的变化，表达水平逐渐提高。研究表明，初花期是紫花苜蓿次生壁合成调控的转折期，纤维素和木质素含量与其合成基因表达量在初花期均显著提高。MTR_2g016630（Ces）和MTR_7g103590（Ces A1）等纤维素合成酶基因表达水平在初花期显著上升，木质素合成途径中，MTR_1g064090（PAL1）、MTR_1g111240（C4H）和MTR_2g104960（CCR）基因表达量在初花期或盛花期相比分枝期上调表达倍数达到10倍以上。本研究中27个与植物生长发育相关的转录因子在紫花苜蓿不同发育时期差异性表达，其中NAC家族和MYB家族转录因子有18个，也有少量WRKY、BHLH、ERF、C3H等转录因子。【结论】获得‘中苜1号’紫花苜蓿在4个生长发育时期茎的基因表达谱数据，共获得54个差异表达基因，其中稳定上调基因24个，稳定下调基因30个。这些基因很有可能参与紫花苜蓿次生壁的合成调控。

小麦根中NADP-脱氢酶系统关键酶活性与根系活力和产量的关系分析

周燕，杨习文，周苏玫，王言景，杨蕊，徐凤丹，梅晶晶，申冠宇，李秋杰，贺德先

中国农业科学. 2018, 51(11): 2060-2071. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.004

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【目的】在黄淮平原典型农田氮肥减施条件下，探索决定小麦根系活力的关键脱氢酶种类及酶活性变化及其对籽粒产量的影响。【方法】采用大田试验方式，运用裂区设计，主处理为施氮量，设0（N0），135（N1），157.5（N2），180（N3），202.5（N4），225（N5）kg·hm^-26个施氮水平，副处理为半冬性品种矮抗58和周麦27号。对小麦越冬期、返青期、拔节期、挑旗抽穗期、灌浆期和蜡熟期根中异柠檬酸脱氢酶（NADP-ICDH）、NADP-苹果酸酶（NADP-ME）、戊糖磷酸途径总脱氢酶（G6PDH+6PGDH）活性与根系活力（改良TTC法）和产量间的关系进行分析。【结果】小麦关键生育时期根系活力呈“高-低-高-低”变化，NADP-ICDH，NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性变化均表现为先上升后下降的趋势，灌浆后活性变化不明显。越冬前后，不同施氮处理间根中NADP-脱氢酶系统关键酶活性表现为不施氮处理（N0）大于施氮处理（N1—N5）；拔节—抽穗期，NADP-脱氢酶系统关键酶活性和根系活力均表现为施氮处理（N1—N5）显著高于不施氮（N0）处理，随着施氮水平逐步降低不同酶活性随之降低，与N5处理相比，N4处理NADP-ICDH和NADP-ME的活性未达显著水平，同时（G6PDH+ 6PGDH）活性和根系活力降幅最少。施氮量显著影响小麦籽粒产量及其构成因素，与不施氮处理（N0）相比，施氮处理（N1—N5）下的单位面积成穗数、穗粒数显著提高。综合两年度产量平均值可知，N5处理下籽粒产量最高，达9 238.02 kg·hm^-2，N4处理次之，较N5处理仅下降0.3%且差异未达显著水平。进一步分析表明，不同生育时期根中NADP-ICDH、NADP-ME与（G6PDH+6PGDH）三者之间呈显著或极显著正相关关系；NADP-脱氢酶系统关键酶活性与根系活力呈正相关关系，其中生育中、后期达显著或极显著水平；根系活力及NADP-ICDH，NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性与产量呈显著或极显著正相关关系。通径分析表明，两年度NADP-ICDH，NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性在拔节期和挑旗抽穗期对产量有较大的正向作用；挑旗抽穗期根系活力对产量的直接作用较小，但其通过NADP-ME和戊糖磷酸途径总脱氢酶（G6PDH+6PGDH）活性对产量所产生的间接正向作用较大，因而根系活力对产量的影响达极显著水平。【结论】本试验条件下，综合考虑NADP-脱氢酶系统关键酶活性和根系活力变化及籽粒产量表现，黄淮平原麦田施氮水平由N5减至N4水平当是最佳选择。NADP-ICDH，NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性与采用改良TTC法测定的“根系活力”密切相关，其中NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性对根系活力影响最大，实践中可通过分子育种手段和有效栽培措施实现NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）在根中的高表达以提高小麦根系活力。

不均匀盐胁迫对紫花苜蓿生长特性的影响

熊雪，罗建川，魏雨其，周冀琼，张英俊

中国农业科学. 2018, 51(11): 2072-2083. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.005

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【目的】土壤中的盐分通常存在不均匀分布的现象。已有的研究发现与均一盐胁迫环境相比，不均匀盐胁迫可以缓解盐分对植物的伤害。研究旨在了解植物对不均匀盐分胁迫的响应,作为对均匀盐分下植物生理的一个重要补充，为扩大盐碱地的利用和栽培管理措施提供参考依据。【方法】采用分根装置将紫花苜蓿（Medicago sativa）的根系分为两部分，设置无盐胁迫（0/0，各半根系所处环境NaCl浓度均为0）、半边根系环境NaCl浓度为0的不均匀盐胁迫系列（0/S：0/100、0/150、0/200和0/250）、半边根系NaCl浓度为50 mmol·L^-1的不均匀盐胁迫系列（50/S：50/100、50/150、50/200和50/250）以及两半根系环境NaCl浓度相同的均一盐胁迫系列（S/S：50/50、100/100、150/150、200/200和250/250）处理(“/”两边数值代表各半根系所处环境的盐胁迫状况，以NaCl浓度mmol·L^-1表示)。处理15 d后测定其植株生长速率、生物量、水分吸收、钠、钾离子浓度、丙二醛含量等指标，了解不同盐胁迫环境对紫花苜蓿生长的影响。【结果】盐胁迫抑制紫花苜蓿生长，植株生长速率、生物量、水分吸收下降，叶绿素含量降低，脯氨酸含量升高，膜质过氧化程度加大，叶片Na⁺浓度升高，K⁺浓度降低，表现为较低的K⁺/Na⁺。而不均匀盐胁迫0/S与50/S处理与均匀高盐处理S/S相比，植株生长速率和地上生物量分别增加了57.05%—369.34%和15.47%—42.57%，Na⁺浓度降低了15.85%—55.93%，缓解了Na⁺的毒害作用。且不均匀盐胁迫下70%—92%的水分吸收来自于无盐或低盐胁迫一侧根系，增加了整株植物的水分吸收。【结论】不均匀盐胁迫处理与均匀的高盐胁迫处理相比，增加了紫花苜蓿叶绿素含量，降低了膜质过氧化程度，通过调控Na⁺与K⁺的吸收维持叶片中相对较高的K⁺/Na⁺，并且无盐和低盐胁迫一侧根系表现出补偿性吸水和补偿性生长，进而促进了植物生长，增加了地上和地下生物量。在一定的浓度范围内，与均匀的高盐胁迫处理相比，不均匀盐胁迫环境下植株根系所处环境的盐分浓度差异越大其对盐害的缓解作用越显著。

基于多特征融合和稀疏表示的农业害虫图像识别方法

张永玲，姜梦洲，俞佩仕，姚青，杨保军，唐健

中国农业科学. 2018, 51(11): 2084-2093. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.006

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【目的】在农业害虫测报中，常常需要从大量的昆虫中识别出几种重要的测报害虫。目前基于图像的农业害虫识别研究，大部分是在有限种类有限样本量基础上进行的农业害虫识别。本研究为了从大量的水稻昆虫图像中识别出9种水稻测报害虫，尝试提出了一种基于多特征融合和稀疏表示的农业害虫图像识别方法。【方法】首先，为了获得最优的农业害虫识别模型，将所有图像进行旋转使昆虫头朝上，按照1﹕2长宽比裁剪图像，使昆虫居中并占据图像大部分区域，将图像进行等比例缩放至统一尺寸48×96像素。提取所有昆虫的HSV颜色特征、局部特征中的HOG特征、Gabor特征和LBP特征。然后，利用单一特征和融合特征分别对训练样本构建过完备字典，字典中的每一个列向量表示一个训练样本，且满足同一类训练样本均在同一个子空间中；应用过完备字典对测试图像进行多特征稀疏表示，通过求解l1范数意义下的优化问题获取稀疏解，使得除测试样本所在的类别外其他的训练样本的系数都是零或接近零的数值。最后，计算稀疏集中指数阈值，用于判断测试样本的有效性，如果测试样本的稀疏集中指数大于该阈值，则认为最小残差所对应的类别即为测试样本的类别，否则认为该测试样本为非测报昆虫。同时，利用相同的特征和训练样本训练SVM分类器对测试样本进行测试，与稀疏表示害虫识别模型进行比较。【结果】利用单一特征训练的稀疏表示害虫识别模型中，基于HOG特征的稀疏表示识别模型获得了9种测报害虫较高的识别率和较低的误检率，分别为87.0%和7.5%；利用颜色特征分别与3种局部特征进行结合获得的稀疏表示识别模型，测试结果表明，基于颜色和HOG特征的稀疏表示识别模型获得了最高的识别率和最低的误检率，分别为90.1%和5.2%；将颜色、HOG和Gabor 3个特征结合获得的稀疏表示识别模型，识别率下降为83.5%，误检率上升为10.3%。利用同样的特征或特征融合训练得到的支持向量机分类器，识别率均低于对应特征获得的稀疏表示识别模型的识别率，而误检率均高于对应特征训练的稀疏表示害虫识别模型的误检率。【结论】基于颜色和HOG 融合特征的稀疏表示识别模型获得了较高的农业害虫识别率和较低的误检率；通过稀疏集中指数阈值，有效地排除了非测报昆虫，实现了从大量的农业昆虫中自动识别出需要测报的害虫。

甘薯病毒病原相关的microRNA的挖掘及分析

李华伟，刘中华，张鸿，许泳清，李国良，林赵淼，邱永祥，罗文彬，纪荣昌，汤浩，邱思鑫

中国农业科学. 2018, 51(11): 2094-2105. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.007

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【目的】甘薯的病毒种类比较多，不同的病毒感染会引起相应的症状变化，田间自然发病的甘薯表型不一，这可能与病毒感染类型有关。论文旨在鉴定和研究甘薯中与不同甘薯病毒感染相关的microRNA（miRNA）。【方法】采用Illumina公司高通量测序技术，对来自福建泉州地区同一品种（龙薯9号）、具有不同症状的叶片样本（畸形黄化、疱疹、褪绿矮化和曲叶，样本编号分别为Fj01、Fj02、Fj03和1H）进行高通量测序，利用生物信息学手段挖掘和分析差异表达miRNA，并对差异miRNA和病毒表达进行PCR验证，鉴定基因和病毒在样本中表达情况，分析测序数据的可靠性，利用生物信息学分析进行miRNA靶基因预测和功能分析，探究差异miRNA与病毒种类的相关性。【结果】通过与病毒数据库的比对，发现Fj01、Fj02、Fj03样本（除1H外）均感染了甘薯常见病毒，如甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯病毒2号（Sweet potato virus 2，SPV2）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G，SPVG）、甘薯C病毒（Sweet potato virus C，SPVC）等，但Fj01、Fj02和Fj03这3个样本的症状并不一致，样本之间只在甘薯不常见的病毒种类中有差异，通过PCR验证了SPFMV和SPVC病毒在样本中的表达情况与测序数据基本一致。在4个样本中共鉴定出679个已知的miRNA和1 004个新的miRNA，通过配对比较分析，其中288个已知的miRNA和433个新的miRNA在4个样本之间有差异性表达，并且这些miRNAs，如miR-156、miR-157、miR-166等家族的成员在4个样本中表达模式各异。同时，采用实时荧光定量PCR验证几个差异miRNAs（如miR-156、novel-miR-40和miR-319m）在各个样本间的表达情况与测序结果基本一致，另外，与脱毒苗样本进行比较，检测到3个miRNA（miR-160a、miR-2096和miR-5387b）在4个症状样本中具有不同程度的上调表达，证明miRNA的表达与植株的表型有关。通过对miRNA靶基因的预测与分析，发现这些差异miRNA的靶基因多数为转录调控因子，编码蛋白多含有ZFP、WD、Myb、SPL等功能区域，这些因子多参与调控植物的基因、代谢通路和抗原识别等来调控植物生长发育、形态建成和抗逆性，表明这些miRNA靶基因的功能多样性。【结论】不同病毒感染确实能够引起miRNA差异表达，并且这些miRNA通过其靶基因参与调控植物的生长发育、抗胁迫性和防御。

抗氟苯虫酰胺小菜蛾差异表达基因及其通路

王成花，孙诗晴，徐巨龙，赵小龙，薛超彬

中国农业科学. 2018, 51(11): 2106-2115. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.008

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【目的】随着氟苯虫酰胺等双酰胺类杀虫剂的广泛应用，小菜蛾（Plutella xylostella）对该类药剂的抗性愈发突出。研究旨在从转录组水平研究小菜蛾对氟苯虫酰胺的抗性机制，明确小菜蛾对氟苯虫酰胺产生抗性的关键基因及通路，为揭示小菜蛾对氟苯虫酰胺的抗性机制打下基础。【方法】以室内筛选的小菜蛾抗氟苯虫酰胺品系（Rh28）、田间抗性种群（Rz36）和敏感品系（S）为材料，通过转录组测序技术（RNA-Seq），获得抗性小菜蛾品系/种群在转录水平上的差异表达基因及抗性显著上调表达基因，采用基因本体（GO）显著性富集分析及京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）富集分析，确定差异表达基因具有的主要生物学功能及其参与的主要生化代谢和信号转导途径。【结果】通过将不同抗性品系/种群与敏感品系的RNA-Seq数据对比，获得数量不等的差异表达基因。将差异基因富集的生物学过程（biological process）和信号通路（pathway）进行GO分析，发现其主要集中于对刺激物的反应（response to stimulus）、催化活性（catalytic activity）和代谢过程（metabolic process）等条目中；而KEGG分析发现，差异基因主要集中于代谢通路（metabolic pathway）中，基因数量占比最高，为17.84%。通过统计分析进一步获得了抗性显著上调表达基因，并对其中218个基因开展了GO分析，其仍然主要集中在代谢过程、对刺激物的反应和生物调节（biological regulation）等条目中；通过对抗性显著上调基因进行KEGG分析，发现其仍主要集中在代谢通路中，其中谷胱甘肽-S-转移酶、细胞色素P450解毒酶及参与昆虫多种生理反应的热激蛋白（Hsp）超基因家族等基因的表达量均显著上调。通过聚类热图分析发现，显著表达上调的基因较多集中在内质网上蛋白质的加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、酪氨酸代谢（tyrosine metabolism）、咖啡因代谢（caffeine metabolism）和Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）中。【结论】获得了小菜蛾抗氟苯虫酰胺差异表达基因及抗性显著上调表达基因，其主要富集于代谢过程、应激反应及对刺激物的反应等条目中，这些基因的相互协同调控是小菜蛾对氟苯虫酰胺产生抗性的重要机制。

高效施肥技术研究的现状与展望

白由路

中国农业科学. 2018, 51(11): 2116-2125. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.009

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长期以来，施肥目的是为了提高作物产量，保证人类发展对粮食的需求。化学肥料的发明大大缓解了人口增长与粮食需求的矛盾。但是，随着与之相伴的农产品安全、生态环境安全问题逐渐揭示并被广泛关注，如何在提高肥料效益、保证粮食产量与减少肥料施用、保证环境安全问题上找到平衡点，成了施肥技术必须面对的问题，解决这一问题的关键是高效施肥。文中阐述了高效施肥的内涵，认为高效施肥需要从粮食高效、生产高效、资源高效和环境高效四个方面加以理解。高效施肥可定义为，在作物营养供应的各个环节上，采用现代技术手段，最大限度地提高肥料利用效率，以充分保证提高作物的产量和品质、减少资源浪费、维护生态环境。文中详细介绍了目前国内外应用较为成熟的几种高效施肥技术，即测土施肥、精准施肥、灌溉施肥和轻简施肥等。在测土施肥方面，介绍了美国和欧洲目前的应用情况，同时也介绍了我国从20世纪70年代开始进行测土施肥以来的进展；在精准施肥方面，介绍了精准施肥技术的理论、核心技术、发展过程及其实现的技术途径等，分析了精准农业的经济效益及其在世界的应用情况；在灌溉施肥方面，介绍了灌溉施肥的优点、灌溉施肥的方式与研究历程，重点介绍了表面灌溉施肥技术、滴灌施肥技术和微喷施肥技术等。作者指出，在可预见的未来，高效施肥会向着信息化、自动化、智能化、轻简化方向发展，特别在高效施肥技术、数字化养分管理系统、养分高效利用基因筛选等方面需要深入研究，同时还要注意营养链一体化管理、作物营养调控技术的研究与应用。

施用炭基肥及生物炭对棕壤有机碳组分的影响

高梦雨，江彤，韩晓日，杨劲峰

中国农业科学. 2018, 51(11): 2126-2135. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.010

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【目的】作为土壤肥力的重要指标，土壤有机碳及其组分在耕地生产力和作物产量方面发挥着重要作用。论文以4年定位施肥试验为依托，分析连续施用炭基肥及生物炭对土壤有机碳含量及其组分的影响，为调控农田土壤肥力及棕壤有机碳库的管理提供科学依据。【方法】田间试验始于2011年，设置5个处理：不施肥（CK）、低量生物炭（C15）、高量生物炭（C50）、氮磷钾配施（NPK）、炭基肥（BBF）。其中C15与BBF是等碳量处理，NPK与BBF是等氮磷钾养分处理。于第4年花生收获后（2014年秋季）采集各处理耕层（0—20 cm）土壤样本，测定土壤有机碳总量、各组分含量及花生产量。【结果】施用炭基肥和生物炭均可以显著增加耕层土壤总有机碳含量，比试验起始年土壤（简称起始土）分别提高10%、8%；而在相同碳素（C15和BBF）或氮磷钾养分投入（NPK和BBF）条件下，施用炭基肥提升土壤总有机碳含量的效果最好，提升幅度为2%—15%。施入炭基肥及生物炭显著提高了游离态颗粒有机碳和闭蓄态颗粒有机碳含量；在等碳量投入条件下，炭基肥处理的提升幅度分别为43%、17%；等氮磷钾养分投入条件下，炭基肥处理的提升幅度更大，分别为40%、43%。无论施入炭基肥或生物炭，对于矿物结合态有机碳含量影响均不大，但都比起始土略高。土壤可溶性有机碳含量变化规律与总有机碳相似，即施入炭基肥或生物炭均提高了其含量，但等碳量投入条件下无显著差异。各施肥处理花生产量在199.4—232.9 kg/667m²，均显著高于不施肥处理，其中施用炭基肥产量最大，比等碳量处理（C15）高17%，比等养分处理（NPK）高10%，且差异显著。【结论】连续多年施用炭基肥或生物炭均能明显提高土壤总有机碳、游离态颗粒有机碳、闭蓄态颗粒有机碳含量；提升效果显著优于投入等量碳素或等量氮磷钾养分。连续多年施肥可以提高土壤中水溶性有机碳含量，但炭基肥与生物炭、氮磷钾配施处理间无明显差异。无论施用炭基肥还是生物炭对土壤矿物结合态有机碳含量影响不大。连续施用炭基肥对花生产量的提升效果最好，显著高于等氮磷钾养分和等碳量处理。

商品有机肥替代化肥对作物产量和土壤肥力的影响

温延臣，张曰东，袁亮，李伟，李燕青，林治安，赵秉强

中国农业科学. 2018, 51(11): 2136-2142. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.011

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【目的】通过连续3年定位监测华北平原冬小麦-夏玉米轮作区商品有机肥部分替代化肥施用后作物产量和土壤肥力的变化，探究商品有机肥替代化肥对作物产量及土壤肥力的影响，以期为该区域商品有机肥的科学施用提供理论依据。【方法】试验开始于2011年，于山东禹城设置3个不同施肥处理：不施肥对照（T1）；单施化肥（T2）；等养分条件下，有机肥部分替代化肥（T3）（氮、磷和钾替代比例分别为11.3%、13.7%和58.8%）。于2011—2014年连续3年进行田间取样，分析冬小麦-夏玉米轮作制度下，不同施肥处理对作物产量、产量构成以及土壤有机碳、全氮、速效磷、速效钾含量的影响。【结果】（1）商品有机肥部分替代化肥施用后，冬小麦和夏玉米3年平均产量分别为7 700和9 175 kg·hm^-2，与当地栽培条件下高产水平相当，但与单施化肥处理相比差异不显著。（2）与单施化肥相比，商品有机肥替代化肥处理对产量构成因素（有效穗数、穗粒数和千粒重）未表现出显著影响。（3）商品有机肥部分替代化肥施用3年后，与单施化肥相比，土壤有机碳增加了19.5%、土壤全氮提高了12.3%，显著高于单施化肥处理。【结论】商品有机肥部分替代化肥能保证华北平原小麦-玉米轮作体系的作物稳产、高产，并且能够培肥地力，有利于土壤可持续利用。

矿物调理剂对稻田土壤镉形态和水稻镉吸收的影响

李超，艾绍英，唐明灯，李林峰，王艳红，李义纯

中国农业科学. 2018, 51(11): 2143-2154. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.012

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【目的】探索施用调理剂对稻田土壤镉形态和水稻镉吸收的影响，为调理剂的田间应用提供指导。【方法】选取一种碱性矿物源复合材料作为供试调理剂，采用水稻盆栽试验动态取样方法，研究调理剂对不同生育时期稻田土壤镉形态及镉在植株体内迁移的影响。【结果】矿物调理剂有效提高土壤pH，降低土壤有效态镉（DTPA-Cd）含量，促进土壤镉的可利用态持续向难利用态或残渣态转化。矿物调理剂显著降低水稻根系、茎叶、谷壳和糙米镉含量，且其用量分别与水稻根系、茎叶、谷壳、糙米镉含量呈显著负相关。水稻各部位镉含量与土壤DTPA-Cd、返青期土壤可交换态镉和孕穗期土壤可交换态镉呈极显著正相关，与返青期土壤可氧化态镉和孕穗期土壤可还原态镉呈极显著负相关。不同生育时期水稻根系和茎叶中镉含量的显著不同，对照处理（CK）不同生育时期根系镉含量的大小顺序为：成熟期≈返青期＞拔节期＞分蘖期＞孕穗期；茎叶镉含量的大小顺序为：返青期＞成熟期＞分蘖期＞拔节期＞孕穗期；成熟期时，与对照相比，矿物调理剂对水稻根系、茎叶、谷壳和糙米镉含量的最大降幅依次为92.0%、94.1%、86.3%、80.6%；当调理剂用量达到5 g·kg^-1土时，糙米镉含量低于食品安全国家标准（0.2 mg·kg^-1）。水稻各部位镉含量顺序为根系＞＞茎叶＞＞糙米＞谷壳。由不同生育时期镉从根系向茎叶的转运系数可知，矿物调理剂对水稻生育前期镉的阻控效果优于生育后期。【结论】该调理剂可促进土壤中高活性镉向低活性转化，抑制水稻各器官对镉的吸收富集。

G.41×新疆野苹果树体生长性状的QTL精细定位及候选基因预测

董军，王京，梁微，马百全，董丽娟，马锋旺，符轩畅，李翠英

中国农业科学. 2018, 51(11): 2155-2163. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.013

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【目的】矮化砧木可以诱导地上部接穗品种矮化，实现苹果的丰产和稳产。因此，深入挖掘调控苹果树体生长的基因，可以改善苹果树形，加强苹果园地的管理方便性。【方法】以矮化苹果砧木‘G.41’和乔化苹果砧木新疆野苹果（Malus sieversii）为亲本构建的188株F₁代分离群体为试材，并于每个分离群体植株上嫁接‘富士冠军’。基于SSR标记技术，采用Join Map 4.0作图软件构建苹果遗传连锁图，应用Map QTL 5.0作图软件，结合后代群体的表型数据，对接穗高度和接穗横截面积生长性状进行初步QTL定位。结合苹果基因组序列信息，利用Primer5.0软件进行新SSR标记开发，并对初步定位区域进行精细定位及候选基因预测。【结果】该研究从361对SSR引物中筛选出108对在亲本之间表现出多态的SSR引物，多态率为29.9%。其中95对引物用于遗传连锁图谱构建，并在5号连锁群上初步检测出4个与植株生长性状相关的QTL位点，与接穗高度、接穗横截面积性状紧密连锁的两个标记，为L05024和Hi09b04。根据初步定位区域的序列信息，设计了新的SSR引物24对，其中在亲本间表现出多态的有10对，利用该10对引物对5号连锁群重新分析。构建了包含21个SSR标记、总长为86.0 cM的高密度遗传图谱，其平均遗传距离为7.52 cM。通过对接穗高度与接穗横截面积生长相关性状的QTL分析，在SSR标记L05024和Hi09b04之间找到与其相关的QTL位点，其表型贡献率分别为19.2%和51.7%。将该QTL位点与基因组序列对比，发现其物理距离为543 kb，并且该QTL区间包含16个候选基因。推测其中MDP0000323212为与植株生长密切相关的基因。【结论】本研究将砧木诱导矮化基因定位于苹果第5号染色体543 kb区段内，侧翼标记分别为L05024和Hi09b04，其物理距离为4.048—4.591 Mb，并筛选到可能参与调控植株生长的候选基因MDP0000323212。

外源柠檬酸对石灰性黄壤养分活化及刺梨实生苗养分吸收与生长的影响

龚芳芳，樊卫国

中国农业科学. 2018, 51(11): 2164-2177. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.014

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【目的】解析外源柠檬酸活化石灰性黄壤养分的作用，探究外源柠檬酸促进石灰性黄壤上的刺梨实生苗对养分吸收及生长的影响，为贵州喀斯特石灰性黄壤地区刺梨栽培的养分调控提供科学依据。【方法】以石灰性黄壤和‘贵农5号’刺梨实生苗为材料，采用盆栽法，设置每kg石灰性黄壤（干土）施入柠檬酸40、80和120 mg 3个处理，探究外源柠檬酸的不同施用量对石灰性黄壤养分的活化和促进刺梨实生苗养分吸收及生长的作用。【结果】外源柠檬酸施入石灰性黄壤后，土壤pH明显降低，有效氮、磷、钾、钙、铁、锌、硼的含量明显增加，其中80 mg·kg^-1柠檬酸处理的有效磷、钾、钙和硼含量增加得最多。120 mg·kg^-1柠檬酸处理的土壤有效氮、铁、锌含量提高的百分率最大，而有效锰、铜的含量明显降低，对土壤交换性镁的含量无明显作用。土壤中的细菌总数和解磷菌及解钾菌的数量随柠檬酸施用量的增大而增多，真菌和放线菌数量随之减少，其中，以80 mg·kg^-1柠檬酸处理的解磷菌和解钾菌的数量为最多。刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土施入外源柠檬酸后，明显增强了多种土壤酶的活性，随柠檬酸施入量的增加，土壤的脲酶、硝酸还原酶和铁还原酶的活性随之增强，淀粉酶活性随之降低，80 mg·kg^-1柠檬酸处理的土壤碱性磷酸酶、蛋白酶和蔗糖酶的活性最高。外源柠檬酸施入石灰性黄壤后，土壤中柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乙酸的含量明显增加，其中80 mg·kg^-1柠檬酸处理的酒石酸、苹果酸含量和有机酸总量最高，3个处理的草酸含量都明显低于对照。外源柠檬酸施入石灰性黄壤后，刺梨实生苗对N、P、K、Ca、Mg、Fe、Zn、B元素的吸收量明显增加，其中，80 mg·kg^-1柠檬酸处理的刺梨实生苗对上述元素的吸收量最大。刺梨实生苗对Cu的吸收量随柠檬酸施入量的增加无明显改变。外源柠檬酸的施入明显降低了刺梨实生苗根系中柠檬酸和草酸的含量，增加了根系中苹果酸、酒石酸、乙酸和琥珀酸的含量，根系活力和硝酸还原酶、碱性磷酸酶、分泌性碱性磷酸酶、铁还原酶和谷氨酰胺合成酶的活性明显增强，与对照的差异均达到显著水平（P，其中80 mg＜0.05）·kg^-1处理的根系活力、碱性磷酸酶、谷氨酰胺合成酶和根系分泌性碱性磷酸酶的活性最强，硝酸还原酶和铁还原酶的活性随柠檬酸施入量的增加而增强。在施入柠檬酸的石灰性黄壤上，刺梨实生苗的生长、根系发育和根系形态明显改善，其中，80 mg·kg^-1柠檬酸处理的植株生物量、高度、基径、根冠比值、根系总表面积、总体积、总根尖数都最大，3个处理的上述指标均明显大于对照，其差异达到显著水平（P＜0.05）。【结论】外源柠檬酸施入pH＞8的石灰性黄壤后，具有改善土壤生态环境和活化土壤养分的作用，增强多种土壤酶活性，增加土壤中酒石酸、柠檬酸、苹果酸和乙酸的含量，增加细菌总数、解磷菌及解钾菌的数量，促进刺梨实生苗生长。

优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵增香酿造爱格丽干白葡萄酒

王倩倩，覃杰，马得草，陶永胜

中国农业科学. 2018, 51(11): 2178-2192. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.015

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【目的】研究优选发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵对‘爱格丽’（Ecolly）干白葡萄酒的增香作用，优化干白葡萄酒的酿造工艺。【方法】将发酵毕赤酵母菌株H5Y-28与酿酒酵母菌株F5以10﹕1、4﹕1、1﹕1、1﹕4、1﹕10比例接种，进行模拟葡萄汁的混合发酵，并以酿酒酵母纯发酵为对照，发酵过程中监测酵母的活菌数、总菌数，建立菌体生长动力学模型。按相同接种比例进行爱格丽干白葡萄酒的发酵应用，以酿酒酵母纯发酵和添加发酵毕赤酵母胞外酶处理作为对照，酿造次年4月，对所酿葡萄酒酒样进行香气的感官分析和GC-MS分析。【结果】菌体生长动力学表明，随着发酵毕赤酵母接种比例的升高，其存活数量和存活时间明显增加，但优选菌株H5Y-28的高比例（10﹕1、4﹕1）接种处理会降低酿酒酵母的最大生长数量。感官分析结果表明，混合发酵有利于增强‘爱格丽’葡萄酒的果香和花香，尤其是热带水果香气，但高发酵毕赤酵母接种比例（10﹕1）会给葡萄酒带来较强的生青味，而酒样1﹕1、4﹕1仅引入较弱的生青味。挥发性香气成分分析结果表明，品种香气成分的含量随着发酵毕赤酵母接种比例的升高而增加，尤其是萜烯类和C13-去甲类异戊二烯化合物。此外，添加胞外酶能显著提高葡萄酒品种香气的含量，尤其是C13-去甲类异戊二烯化合物的含量（高于纯酿酒酵母发酵酒样90%）。混合发酵显著增加了酒样中发酵香气中的乙酸酯、C6—C12脂肪酸及其酯类、异戊醇与苯乙醇的含量。与单一酿酒酵母发酵酒样相比，1﹕1接种比例有助于提高酒样中26%品种香气成分和39%发酵香气成分的含量，尤其是显著地提高了中链脂肪酸乙酯的含量（40%）。【结论】毕赤酵母与酿酒酵母1﹕1接种处理不影响酿酒酵母生长，且具有较强的增香酿造潜力。

代乳粉对早期断奶沂蒙黑山羊羔小肠发育、菌群多样性及葡萄糖转运载体基因表达的影响

李永洙，金太花，韩照清，夏春峰，晁洪雨，张乃锋，王世琴，刁其玉

中国农业科学. 2018, 51(11): 2193-2205. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.016

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【目的】研究饲喂代乳粉对早期断奶沂蒙黑山羊羔小肠发育、菌群多样性及葡萄糖转运载体基因表达的影响，为沂蒙黑山羊早期断奶羔羊的培育提供理论依据。【方法】将36只双胎沂蒙黑山羊羔羊分成2组，每组6个重复，每个重复3只。其中，对照组(Ⅰ组)羔羊随母哺乳至75日龄，试验组(Ⅱ组)于10日龄断奶后饲喂代乳粉。分别于试验的第10、15、25、45和75 天称羔羊活体重以及屠宰后十二指肠、空肠、回肠重量，并收集各肠段内容物、黏膜组织样品。采用16S rDNA的PCR-DGGE技术和实时荧光定量PCR等方法，分析小肠菌群定植规律及葡萄糖转运载体(SGLT-1、GLUT-2)基因mRNA表达量。【结果】Ⅱ组羔羊45 d时平均日增重和空肠、回肠重量显著高于Ⅰ组(P＜0.05)，而75 d时平均日增重和回肠重量极显著高于Ⅰ组(P＜0.01)。十二指肠在45和75 d、空肠在15 d及回肠在10 d时两组间菌群变化较为明显，二者菌群多样性指数回肠最高，其次空肠、十二指肠；两组各肠段优势菌群均为溶淀粉乳杆菌和普雷沃氏菌属，但随着日龄增加，Ⅰ组各肠段益生菌属总细菌数量呈下降趋势，Ⅱ组却与此相反。Ⅱ组在10 d时SGLT-1和GLUT-2基因mRNA表达量最低，而25 d后Ⅱ组表达量均高于Ⅰ组，且差异不显著(P＞0.05)；上述基因表达量呈现肠段部位间差异，其中SGLT-1基因mRNA表达量变化空肠最大，十二指肠最低，而GLUT-2基因mRNA表达量变化十二指肠最大，回肠最低。【结论】饲喂代乳粉在第25 天时可促进沂蒙黑山羊早期断奶羔羊空肠、回肠有益菌提前定植，并通过调控葡萄糖转运载体基因表达而引起葡萄糖吸收转运的改变，进而影响羔羊后期肠道组织及机体的生长发育。

无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

杜吉革，薛麒，朱真，李启红，印春生，姚文生，康凯，陈小云

中国农业科学. 2018, 51(11): 2206-2215. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.017

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【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体，并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时，将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸，经人工合成，获得基因片段GETX_m2。将GETX_m2克隆至原核表达载体pET30a-(＋)后，将pET30a-GETX_m2转化至BL21（DE3）感受态细胞中，在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h，超声破碎后收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化，从而获得重组蛋白rETX_m2。利用Western blot方法，检测rETX_m2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将rETX_m2用细胞维持液稀释至100及10 μg·mL^-1，检测其对犬肾细胞系（MDCK细胞）的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的rETX_m2，以0.0625、0.625和6.25 mg·kg^-1 3个剂量尾静脉注射，检测rETX_m2对小鼠的毒力。随后，将rETX_m2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗，取4只健康家兔，皮下免疫2次（间隔两周），100 μg/只。同时，Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d，采血，分离血清，按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时，在二免后21 d，对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素，检测rETX_m2对家兔的免疫保护效果。【结果】在15℃和37℃条件，rETX_m2在BL21（DE3）菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达，综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间，选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性rETX_m2。灰度扫描结果显示，在37℃诱导条件下，rETX_m2可溶表达比例达30%；Western blot检测结果表明，D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别rETX_m2，出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示，在rETX_m2浓度为100 μg·mL^-1的细胞培养基中孵育24 h后，细胞未出现细胞病变，而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变；小鼠安全试验显示，尾静脉注射6.25 mg·kg^-1剂量的rETX_m2，对小鼠无致死性；血清中和试验结果显示，rETX_m2免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450—750个小鼠MLD，每毫升的二免兔抗血清可中和2 500—4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素，而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用；用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后，对照组家兔4/4死亡，免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌rETX_m2毒力基本丧失，但保留了良好的免疫原性，是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

家蚕脱胶蚕丝的蛋白组成成分

张艳，董照明，席星航，张晓璐，叶林，郭凯雨，夏庆友，赵萍

中国农业科学. 2018, 51(11): 2216-2224. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.11.018

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【目的】探讨家蚕（Bombyx mori）蚕丝纤维脱胶后蛋白质成分的变化，为了解丝蛋白在蚕丝纤维中的分布特征打下基础，并为改进蚕丝纤维加工工艺提供依据。【方法】利用木瓜蛋白酶、碳酸钠、尿素、中性皂和碱水法5种方法对蚕茧进行脱胶处理；并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同方法处理的蚕丝和不同蚕丝加工产品的脱胶程度，以及脱胶对丝素的影响；利用FASP酶解法和液相色谱-串联质谱联用的技术鉴定不同方法脱胶后的蚕丝及各种蚕丝加工产品的蛋白组分；利用生物信息学的方法对鉴定到的丝蛋白进行注释并通过非标定量的方法比较各种样品中丝蛋白的丰度。【结果】通过5种方法对蚕茧丝进行脱胶，蛋白电泳检测发现木瓜蛋白酶法降解丝胶蛋白的同时基本不会破坏丝素蛋白；碳酸钠法对丝胶的降解能力较弱，但对丝素的降解较强；中性皂法和尿素法对丝胶蛋白和丝素蛋白的降解都比较严重；碱水法的效果不理想。通过蛋白质组学研究发现木瓜蛋白酶和中性皂法脱胶后的蚕丝中几乎没有丝胶蛋白，主要是丝素蛋白、seroin 1和甘氨酸富含蛋白等；尿素法和碳酸钠法脱胶后的蚕丝中残留蛋白最少，主要是丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白等。通过蛋白电泳检测了6种蚕丝加工产品中的蛋白质，发现生丝和胚绸中的丝素蛋白比较完整，绸、缎和电力纺中的丝素蛋白出现了部分程度的降解，而丝绸旧衣中的丝素蛋白有严重的降解。通过蛋白质组学分析发现生丝和胚绸中的主要成分包括3种丝素、丝胶1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制剂SPI51等；绸、缎和电力纺的主要成分包括3种丝素蛋白和seroin 1，而丝绸旧衣中的主要成分包括3种丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白。【结论】木瓜蛋白酶脱胶法能够最大程度地保持丝素纤维的完整性，碳酸钠和尿素法的脱胶程度最高。生丝和胚绸中的丝胶蛋白含量很高，丝素纤维比较完整。绸、缎和电力纺中的丝胶蛋白很少，丝素纤维有部分程度的降解。蚕丝经过彻底的脱胶后还剩余的蛋白包括丝素重链、丝素轻链、丝素p25、seroin 1和甘氨酸富含蛋白。

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