中国农业科学

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中国农业科学. 2021, 54(22): 0. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021-22-0

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小麦TaNAC基因基于可变剪切和microRNA的转录后调控分析

吕士凯, 马小龙, 张敏, 邓平川, 陈春环, 张宏, 刘新伦, 吉万全

中国农业科学. 2021, 54(22): 4709-4727. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.001

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【目的】以条锈菌和白粉菌胁迫的普通小麦（Triticum aestivum L.）为研究对象,分析由可变剪切（alternative splicing,AS）形成的TaNAC结构变异转录本,同时分析TaNAC基因的microRNA调控位点,为进一步解析TaNAC基因通过转录后调控参与小麦响应真菌胁迫奠定基础。【方法】普通小麦兼抗种质N9134在被白粉菌和条锈菌分别侵染后,各8个时间点取样并混合,然后从混合样本中克隆得到大量TaNAC转录本。参考中国春小麦基因组注释信息（IWGSC RefSeq v1.1）进行比对,选择由可变剪切形成的TaNAC序列结构变异转录本,分析它们的序列结构特征。利用生物信息学软件和在线工具,对这些TaNAC结构变异转录本编码产物的功能结构域、高级结构、理化性质、亚细胞定位等特征和变异情况进行比对分析。同时,利用洋葱表皮细胞瞬时表达系统验证其中1对TaNAC结构变异转录本的亚细胞定位预测结果,并选取5组TaNAC基因的可变剪切序列结构变异转录本进行酵母转录自激活试验,研究序列结构变异对TaNAC基因转录调控活性的影响。此外,利用miRBase数据库收录的小麦中已报道的miRNAs和TaNAC基因,进行靶基因预测分析,建立小麦TaNAC家族成员与miRNAs的靶向关系。【结果】以条锈菌和白粉菌侵染的普通小麦兼抗种质N9134为材料,克隆得到的TaNAC转录本中的35条序列结构变异转录本由13个TaNAC基因可变剪切形成。通过分析发现,同一TaNAC基因由可变剪切形成的不同结构变异转录本的核酸序列结构存在差异,而且其对应编码产物的功能结构域、高级结构、理化性质和亚细胞定位等方面均会存在差异,同时也会表现出不同的转录调控活性;不同TaNAC基因的可变剪切方式存在差异,而且它们的结构变异转录本及其编码产物在结构特征、理化性质和转录调控活性等方面也均呈现出多样性的特征。通过分析TaNAC基因与其在编码序列区域的靶标tae-miRNAs,发现具有可变剪切转录本的TaNAC基因与tae-miRNA的结合位点均在其非可变剪切区域。【结论】TaNAC基因可以通过可变剪切这种转录后调控方式参与小麦对真菌胁迫的响应;同时发现,调控TaNAC基因的tae-miRNA可以独立于可变剪切这种转录后调控方式行使功能。

转基因玉米NK603转化体/zSSIIb内标基因二重微滴数字PCR方法的建立及应用

肖芳,李俊,王颢潜,翟杉杉,陈子言,高鸿飞,李允静,吴刚,张秀杰,武玉花

中国农业科学. 2021, 54(22): 4728-4739. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.002

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【目的】批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象。转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR（dPCR）方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术。【方法】采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR（ddPCR）的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化二重ddPCR的反应体系和反应条件;用梯度稀释的标准质粒溶液作模板,考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围;将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合,配制质量分数分别为100%、10%和6%的盲样,考察二重ddPCR的定量准确性。【结果】用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照,通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性,确定将NK603转化体特异性PCR方法与内标基因zSSIIb PCR方法组合,建立NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。二重ddPCR反应体系中NK603转化体和zSSIIb内标基因的引物/探针浓度相同,均为400 nmol·L^-1/200 nmol·L^-1,在60℃退火延伸。NK603/zSSIIb二重ddPCR的检测极限是2 copies DNA模板,定量极限是48 copies DNA模板,动力学范围是10—60 000 copies DNA。应用NK603/zSSIIb二重ddPCR方法可准确定量玉米盲样中的NK603转化体含量,定值结果变异系数小于25%;dPCR定量结果与荧光定量PCR（qPCR）定量结果无显著差异,且具有更高的精确性。【结论】内标基因的选择会影响dPCR定量结果的准确性,在建立dPCR方法的过程中,要用具有准确量值的样品作为质控对照,评估内标准基因的适用性。以人工合成的标准质粒分子pUC57-NK603为质控对照,建立了NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。应用建立的二重ddPCR定值方法进行标准物质的研制和定值,已成功研制出转基因玉米NK603有证标准物质。

基于新遗传连锁图谱的豇豆抗豆象QTL定位

王彦,范保杰,曹志敏,张志肖,苏秋竹,王珅,王学清,彭秀国,梅丽,武玉华,刘少兴,田胜民,徐俊杰,蒋春志,王伟娟,刘长友,田静

中国农业科学. 2021, 54(22): 4740-4749. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.003

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【目的】豆象是危害豇豆最主要的仓储害虫。发掘豇豆抗豆象基因为抗性品种的选育,以及减少豆象对豇豆生产的危害奠定基础。【方法】以中豇1号（感）和Pant-lobia-1（抗）为亲本构建的包含282个株系的RIL群体为研究材料,利用人工接种法分别对282个株系接种绿豆象和四纹豆象,进行抗豆象表型鉴定,并利用两亲本对3 992个来源于绿豆、小豆和豇豆的SSR标记进行多态性筛选,然后利用筛选到的多态性标记对282个株系进行基因型分析,最后结合RIL群体各株系抗豆象表型鉴定数据和基因型分型数据,采用完备区间作图法（ICIM-ADD）进行抗豆象QTL定位分析,在此基础上构建遗传连锁图谱,并定位豇豆抗豆象基因。【结果】中豇1号和F₁籽粒的被害率均为100%,Pant-lobia-1籽粒的被害率分别为22.5%和42.5%。推测Pant-lobia-1对绿豆象和四纹豆象的抗性均为隐性遗传;筛选到182个多态性标记,利用这些多态性标记构建了一个包含11个连锁群的豇豆遗传连锁图谱,图谱总长1 065.23 cM,相邻标记间平均遗传距离为5.85 cM;经2种豆象处理,分别在连锁群1和连锁群5上检测到2个稳定的QTL位点,暂定名为vubr1-1和vubr5-1,其中vubr1-1位于标记XD11-44和HAAS_VR_2274之间,标记间的遗传距离为7.6 cM,在2种豆象处理中分别可以解释表型变异的7.16%和6.92%;vubr5-1位于标记XD1-14和CP185之间,标记间的遗传距离为2.90 cM,在2种豆象处理中分别可以解释表型变异的6.96%和6.37%。【结论】构建了一个包含11个连锁群、182个多态性标记的豇豆遗传连锁图谱,检测到2个与抗豆象相关的QTL位点。

西北干旱灌区不同地膜覆盖利用方式对玉米水分利用的影响

殷文, 郭瑶, 范虹, 樊志龙, 胡发龙, 于爱忠, 赵财, 柴强

中国农业科学. 2021, 54(22): 4750-4760. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.004

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【目的】资源型缺水严重制约干旱灌区的农业生产,传统玉米生产模式地膜投入量大。在极端高温和生态环境污染的挑战日益加剧的情境下,探讨通过免耕地膜重复利用维持较高水分利用的可行性,以期为构建试区地膜减量玉米高效生产技术提供理论支撑。【方法】2017—2018年,在甘肃河西绿洲灌区,设置免耕地膜重复利用（免耕覆膜,NM）、秋免耕春覆膜（少耕覆膜,RM）与传统耕作每年覆盖新膜（传统覆膜,对照,CM）3种地膜覆盖利用方式,研究其对玉米田土壤水分利用的影响,以期为优化试区玉米高产高效栽培管理技术提供理论依据。【结果】NM与RM处理较CM处理提高玉米播种时0—120 cm土层平均土壤重量含水量,分别为7.8%与5.1%,这为玉米播种创造良好的土壤水分环境。玉米播种—拔节期及吐丝—灌浆初期,NM处理较CM处理提高0—120 cm土层平均土壤重量含水量,分别为5.0%与4.7%,弥补了灌浆期玉米植株旺盛生长对土壤水分的大量需求。与CM处理相比,NM处理增加了玉米播种—大喇叭口期的耗水量,降低了玉米吐丝—灌浆初期的耗水量,增大了玉米灌浆初期—收获期的耗水量,有效协调玉米各生育阶段的水分需求关系。虽然NM处理较RM与CM处理提高了玉米吐丝期之前的棵间蒸发量,分别为11.7%与26.0%,提高棵间蒸发量占耗水量的比例（E/ET）,分别为13.4%与19.9%,但是NM处理较RM与CM处理降低了玉米吐丝期之后的棵间蒸发量,分别为9.2%与19.4%,降低E/ET,分别为9.7%与20.7%,说明NM处理有利于增强玉米吐丝期之后土壤水分的有效利用。因而,在地膜减投与免耕措施下,NM处理获得与RM及CM处理相当的籽粒产量与水分利用效率。【结论】在西北干旱灌区,应用免耕地膜重复利用并没有导致玉米产量和水分利用效率的降低,具有稳定产量及水分利用效率的作用,是玉米生产中地膜减投的可行措施。

有效积温与不同氮磷钾处理夏玉米株高和叶面积指数定量化关系

陈杨, 王磊, 白由路, 卢艳丽, 倪露, 王玉红, 徐孟泽

中国农业科学. 2021, 54(22): 4761-4777. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.005

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【目的】探究基于有效积温的不同氮磷钾处理夏玉米株高和叶面积指数（LAI）的生长动态预测模型及其特征参数,以期为利用有效积温定量模拟夏玉米生长发育动态提供理论依据。【方法】在河北廊坊两年大田试验（2019—2020年）基础上,以郑单958为试验材料,分为氮、磷、钾3个单因素肥效试验,每个因素设4个水平,分别为不施肥、低肥、适量肥和高肥处理。采用Logistic模型拟合不同氮磷钾营养水平下夏玉米株高和叶面积指数基于有效积温的动态方程,并利用增长速率曲线及其特征参数定量分析了夏玉米生长发育特征。【结果】（1）在本试验条件下,与其他处理相比,适量施肥处理（N2、P2和K2）夏玉米株高最大值均为最大。过量施用钾肥对夏玉米最大株高有显著的抑制作用。适量施肥处理夏玉米株高进入平台期所需积温为952.43—958.83℃·d。适量施肥能有效增加夏玉米叶面积指数,养分过量或过少均影响叶面积的形成。适量施肥处理夏玉米叶面积指数进入平台期所需积温为849.18—952.43℃·d。（2）各施肥处理条件下以有效积温为自变量建立的夏玉米株高和叶面积指数方程的拟合度R²分别为0.9949—0.9970和0.9840—0.9939,方程均达到极显著水平,具有生物学意义。基于有效积温的株高拟合方程得出的模拟值和实测值的相关系数（r）在0.9961—0.9983;基于有效积温的叶面积指数拟合方程的模拟值和实测值的r在0.9815—0.9981。（3）各施肥条件下,夏玉米株高和叶面积指数增长速率均表现为“单峰曲线”,适量施肥处理条件下,增长速率曲线呈现上升快下降也快的特点,不施氮肥、不施磷肥和不施钾肥处理增长速率曲线呈现上升慢下降也慢的特点。（4）适量施肥处理条件下夏玉米株高进入快增期积温、进入缓增期积温和达到最大增长速率积温分别为394.17、776.63和585.40℃·d,均与N0、P0和K0处理差异显著,株高最大增长速率和快增期平均增长速率分别为0.4907和0.4302 cm·(℃·d)^-1,均与N0、P0和K0处理差异不显著。（5）适量施肥处理条件下夏玉米叶面积指数进入快增期积温、进入缓增期积温和达到最大增长速率积温分别为609.69、855.08和732.38℃·d,叶面积指数最大增长速率和快增期平均增长速率分别为0.0135和0.0118℃·d。【结论】养分供应不足能够增加夏玉米株高和叶面积指数进入平台期所需有效积温。基于有效积温的Logistic模型能够很好地模拟和预测不同氮磷钾处理下夏玉米株高和叶面积指数的动态变化。适量施肥条件下方程的拟合度和稳定性优于养分过量或过少的拟合方程。不施肥处理相比适量施肥处理,夏玉米株高和LAI达到关键期所需积温（进入快增期所需积温、进入缓增期所需积温、最大增长速率所需积温）明显增加,关键期增长速率（最大增长速率、快增期平均增长速率）明显减小。本研究为有效积温定量模拟夏玉米生长发育动态提供了理论依据。

农业生产风险评估及农业保险费率厘定的不确定性：研究进展和破解之道

张峭, 王克

中国农业科学. 2021, 54(22): 4778-4786. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.006

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鉴于准确厘定农业保险费率在保障农业保险持续健康发展中的重要性,20世纪80年代起学界围绕农业生产风险的科学评估和农业保险精算开展了大量研究,但尚不完善,评估结果仍存在较大不确定性。为提高农业保险定价的可信度,推动我国农业保险精算技术的发展,本文作者对国内外学界关于农业生产风险评估和农业保险费率厘定的最新研究进行了综述,在文献梳理的基础上分析了农业保险费率厘定不确定产生的根源及应对之策。研究发现,数据的稀缺性、技术问题的模糊性以及风险评估和保险定价的空间不匹配性是造成农业生产风险评估和农业保险费率厘定结果存在不确定性的3个主要原因,提高农业保险定价结果的可信度成为国外学者最新研究的努力方向。在大数据时代,降低农业保险费率厘定不确定性、提高农险定价信度最终需要依靠大数据技术,融合多种数据资源,但农业保险的精算定价并不能完全解决逆选择问题,还需要提供更加多样更具有弹性的农业保险产品进行配合。

我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA分析及一种dsRNA病毒的鉴定

曹钰晗,李紫腾,张静怡,张静娜,胡同乐,王树桐,王亚南,曹克强

中国农业科学. 2021, 54(22): 4787-4799. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.007

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【目的】苹果斑点落叶病在我国各苹果主产区均有发生,给苹果产业造成了严重的经济损失。苹果斑点落叶病是由链格孢苹果专化型（Alternaria alternata f. sp. mali）侵染引起的一种气传病害。本研究旨在探明我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况,为田间防治斑点落叶病提供新的生防资源,并为病毒的多样性以及进化研究提供新的认识。【方法】从全国8个省份采集有典型症状的组织样本,通过组织分离和单孢分离法获得纯培养;通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况;通过菌株培养特性、菌丝生长速率、在果实及叶片上的致病力测定揭示携带dsRNA病原菌的生物学性状;通过高通量测序技术、分子克隆技术对QY-2菌株携带的dsRNA病毒进行全基因组序列、基因组结构和系统进化分析。【结果】自我国苹果产区获得102株苹果斑点落叶病菌菌株的纯培养,通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确了5个菌株带有明显的dsRNA条带,携带的dsRNA分为4种类型,类型I（菌株YT-3-7）dsRNA在8、2.5和1.5 kb左右;类型II（菌株SJZ-4）dsRNA在8 kb左右;类型III（菌株QY-2）dsRNA在3和0.8 kb左右;类型IV（菌株CL-2-6和SQ-1-1）dsRNA在2.5和1.5 kb左右。含有dsRNA的菌株培养性状多样,菌落特征、生长速率与dsRNA携带与否及类型没有明显的关系,含有dsRNA的菌株大多属于弱致病力菌株。QY-2在叶片和果实上的致病力均最弱,确定其携带的dsRNA病毒基因组包括5个dsRNA片段,分别为dsRNA1—dsRNA5,片段大小依次为3 665、3 054、2 824、2 819、831 nt,提交至GenBank,登录号分别为MK672910、MK672913、MK672912、MK672911、MK836314。编码蛋白的分子量依次为124、83、84、83、13 kD。经系统进化关系分析,与Alternaria alternata chrysovirus 1遗传关系最近,确定其为产黄青霉病毒科（Chrysoviridae）、β产黄青霉病毒属（Betachrysovirus）的Alternaria alternata chrysovirus,暂定命名为Alternaria alternata chrysovirus 2（AaCV2）。【结论】我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA群体多样,dsRNA的有无及类型与寄主病原菌培养性状没有明显相关性,携带dsRNA的菌株多为弱致病力菌株,致病力最低的QY-2菌株携带AaCV2。该菌株的弱致病力可能具有潜在的应用价值,可为苹果斑点落叶病提供新的生防资源。

绿僵菌mad2敲除株构建及其生物学和诱导植物响应的功能分析

蔡霓,闫多子,农向群,王广君,涂雄兵,张泽华

中国农业科学. 2021, 54(22): 4800-4812. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.008

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【目的】昆虫病原真菌绿僵菌兼具植物内生性。已知黏附素MAD2是绿僵菌两种黏附蛋白之一,在实现绿僵菌与植物的黏附、定殖中起重要作用,但其作用机理知之甚少。本研究通过构建金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）mad2敲除突变株（Δmad2）,探究MAD2蛋白对绿僵菌生物学功能的影响。【方法】从NCBI中获取mad2前后基因组DNA序列,设计扩增mad2前后同源臂特异性引物,以绿僵菌基因组DNA为模板,扩增得到前后同源臂基因S1、S2;设计特异性引物Hyg-F/R,以pKH-KO载体为模板,扩增得到带有启动子序列的潮霉素基因hyg;再通过overlap PCR构建mad2的同源敲除盒S1H、S2H;最后利用PEG介导的原生质体转化,获得稳定遗传的mad2敲除株。通过对比敲除株与野生株（WT）的生长特性、黏附作用、杀虫毒力以及诱导花生共生基因转录水平的变化,分析MAD2蛋白的生物学功能。【结果】原生质体转化获得了敲除mad2的同源重组转化子;敲除株与野生株对比分析表明,敲除株的孢子萌发率显著低于野生株,萌发中时间比野生株延长5.47 h;培养12 h和14 h时,敲除株的菌丝长度显著均小于野生株,分别为野生株的77.8%和76.3%;培养12 d的产孢量也比野生株减少33.3%。敲除株对洋葱内表皮的黏附力明显降低,但对蝗虫后翅的黏附性无显著影响。敲除mad2并不影响绿僵菌对家蚕的毒力。敲除株处理花生12 h后,与野生株处理相比,花生共生受体SYMRK、钙信号解码相关基因（CaM、CCaMK和DELLA）、脂质氮素转运相关基因（LTP1、NRT24、ABCC2）的转录水平出现显著下调;而与空白对照相比,mad2缺失后SYMRK转录水平仍有一定的上调,CaM、CCaMK和DELLA的转录水平产生显著抑制,对ABCC2、LTP1、NRT24的转录无明显影响。【结论】金龟子绿僵菌黏附素MAD2影响菌株的孢子萌发、早期菌丝生长、产孢及对植物的黏附力,但对昆虫的黏附和杀虫毒力无影响;在菌株与花生互作早期,MAD2触发了花生共生基因的转录。

绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能

谭永安,姜义平,赵静,肖留斌

中国农业科学. 2021, 54(22): 4813-4825. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.009

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【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素（20E）对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数（发育历期、若虫体重及成虫羽化率）的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2 715 bp,开放阅读框2 106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区（RGS,54—175 aa）、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（S-TKc,191—454 aa）、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分（S-TK-X,455—534 aa）和PH结构域（PH,558—655 aa）,其中PH结构域是GRK2蛋白的典型结构域;系统发育分析结果表明,绿盲蝽GRK2与茶翅蝽GRK2亲缘关系最近;AlGRK2在绿盲蝽1—16日龄虫体内均有表达,mRNA表达量呈现出波动式下降的模式,在绿盲蝽初始龄期的表达量较高,而在末龄期的表达量显著下降;AlGRK2在绿盲蝽雌成虫卵巢和脂肪体中高表达,在胸与足中的表达量较低;外源20E处理后,AlGRK2在绿盲蝽1日龄和3日龄表达量显著下调,AlGRK2在雌成虫各组织中均表达上调,在卵巢及脂肪体中上调幅度最大,相反的是,20E信号通路中PLC抑制剂U73122处理的AlGRK2表达量下调;绿盲蝽若虫发育历期、末龄若虫体重和成虫羽化率均显著下降,相反的是,U73122处理组若虫期的发育历期显著延长;此外,与注射dsGFP处理组相比,注射dsAlGRK2处理后绿盲蝽的AlGRK2表达水平显著下降,若虫死亡率及发育历期显著增加,而成虫羽化率和5龄若虫体重均显著下降。【结论】AlGRK2在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;外源20E抑制剂及RNAi处理后,均可抑制AlGRK2的表达,同时还可对绿盲蝽生长发育产生不利影响,表现为延缓绿盲蝽的发育进度、降低5龄若虫体重及成虫羽化率。

畜禽有机肥磷素在冬小麦上替代化肥磷当量研究

徐久凯,袁亮,温延臣,张水勤,林治安,李燕婷,李海燕,赵秉强

中国农业科学. 2021, 54(22): 4826-4839. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.010

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【目的】近年来化学磷肥的过量施用不仅造成了磷矿资源的浪费,还增加了环境污染的风险。畜禽粪便是一种很好的化肥磷替代资源,但由于其成分复杂,转化过程影响因素较多,畜禽粪便中磷素相对化肥磷素的有效性一直存在不同结论。明确畜禽粪便中磷素替代化肥磷当量,能够确定有机肥磷素替代化肥磷素的准确比例,为有机肥磷素的合理施用提供数据支撑。【方法】选取腐熟的猪粪、鸡粪、牛粪和化肥为材料,施磷（P₂O₅）量均设置6个水平,分别为0、20、40、60、80、100 mg·kg^-1干土,利用土柱栽培试验在冬小麦上研究粪肥磷和化肥磷对小麦产量、磷素吸收利用及土壤速效磷含量的影响,并对3种粪肥中磷素替代化肥磷素的相对替代当量进行统计分析。【结果】（1）3种粪肥中有机磷和无机磷含量存在较大差异,猪粪、鸡粪和牛粪中有机磷占总磷的比例分别为25.9%、17.6%和56.5%。从磷组分看,牛粪中磷素形态主要以活性磷（H₂O-P和NaHCO₃-P）为主,而鸡粪和猪粪以高稳定态磷（HCl-P）为主。（2）等磷施用粪肥和化肥条件下,各处理间小麦产量无显著差异。化肥处理的小麦磷素吸收量略高于3种粪肥处理。（3）本试验条件下,若以磷素的当季回收率作为参考指标,鸡粪、猪粪和牛粪中磷素相对化肥磷素的等效值分别为80.3%、84.3%和90.4%。以化肥磷用量与籽粒产量、生物量、籽粒吸磷量及地上部吸磷量的回归关系函数计算的3种粪肥磷素的相对替代当量,猪粪的相对替代当量分别为90.0%、93.6%、80.6%、80.2%,鸡粪的相对替代当量分别为78.4%、87.9%、73.4%、67.6%,牛粪的相对替代当量分别为89.6%、99.9%、90.0%、87.3%。（4）粪肥磷和化肥磷均可提高土壤中速效磷含量,但短期内粪肥磷对土壤中速效磷含量的提高稍弱于化肥磷。【结论】本试验条件下综合几种计算磷素相对替代当量的方法,猪粪能够替代85.7%的化肥磷素,鸡粪能够替代77.6%的化肥磷素,而牛粪能够替代91.4%的化肥磷素。

东北黑土线虫群落对长期免耕后土壤扰动的响应

张梦亭, 刘萍, 黄丹丹, 贾淑霞, 张晓珂, 张士秀, 梁文举, 陈学文, 张延, 梁爱珍

中国农业科学. 2021, 54(22): 4840-4850. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.011

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【目的】目前对长期免耕土壤实施扰动后土壤生态系统稳定性的响应情况尚不了解。本研究选择土壤线虫作为指示生物,研究土壤线虫群落结构对长期免耕扰动前和扰动后的响应情况,为东北黑土区合理选择耕作措施提供科学依据和参考。【方法】以吉林省德惠市中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土长期保护性耕作实验站为依托平台,分别设置长期免耕（NT）及长期免耕后扰动（DNT）两种不同免耕耕作方式;在作物播种前,采集耕层（0—15 cm）土壤,进行线虫的分离鉴定。使用效应值（lnR）,以常规耕作（CT）为对照,度量不同轮作方式下（玉米-大豆轮作,CS;玉米连作,CC）长期免耕及长期免耕后扰动对土壤线虫的属数、多度和生态指数的影响效应。利用主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）进行土壤线虫群落组成及其驱动因子的分析。【结果】与CT相比,NT处理促进了各轮作方式下杂食/捕食线虫的多度,DNT处理显著（P<0.05）促进了玉米-大豆轮作下食细菌线虫的属数及多度、食真菌线虫和总线虫的多度,而对玉米连作下所有线虫营养类群的属数及多度具有抑制效应。NT、DNT处理的线虫群落组成与CT处理截然不同,其主要的土壤驱动因子分别是全氮含量和容重,可以解释线虫群落组成差异的10.5%和11.4%。此外,与CT相比,NT处理显著（P<0.05）促进了各轮作方式下的结构代谢足迹（Fs）,而DNT处理显著（P<0.05）抑制了几乎所有生态指数（除自由生活线虫与植物寄生线虫成熟度指数比率（MI/PPI）之外）。DNT处理对土壤线虫生态指数的抑制程度因轮作方式而异,与玉米连作相比,玉米-大豆轮作仍能维持对MI/PPI的促进效应。【结论】长期免耕能够在各轮作方式下形成较为稳定的土壤线虫群落结构;深翻和移除秸秆等土壤扰动会破坏长期免耕下土壤线虫群落结构的稳定性,但破坏程度因轮作方式而异。

大白菜ACA基因家族的全基因组鉴定与表达分析

王洁,吴晓宇,杨柳,段巧红,黄家保

中国农业科学. 2021, 54(22): 4851-4868. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.012

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【目的】通过对大白菜ACA（Ca²⁺-ATPase）基因家族鉴定与表达分析,研究其家族基因间的共性与特性,为进一步揭示ACA家族进化关系提供数据支撑,为深入解析BraACAs在低温胁迫、盐胁迫以及自交不亲和方面的功能研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥ACA基因家族,同源比对出大白菜ACA基因家族,利用在线软件Expasy预测其分子量、理论等电点等理化性质;采用MEGA 5.0软件构建系统进化树;运用在线软件GSDS 2.0绘制基因结构图谱;TBtools对其染色体定位;McscanX软件进行拟南芥与大白菜ACA家族基因共线性分析;利用在线软件PlantCARE预测大白菜ACA基因家族启动子元件;通过在线工具Pfam和MEME进行蛋白保守结构域分析;利用qRT-PCR技术检测BraACAs在不同组织、非生物胁迫和自交异交授粉后的表达量。【结果】大白菜ACA基因家族有18个基因成员,分布在大白菜10条染色体上;根据进化树关系分成4组,分别包含3、4、4和7个成员;蛋白结构域分析显示,有13个成员包含N端自抑结构域。qRT-PCR结果表明,BraACAs主要在花与果荚中高表达;低温胁迫下,Bra002762与Bra035649表达量总体上调;盐胁迫下,Bra031701表达量显著上调;自交和异交授粉中,Bra003276和Bra024117差异性表达。对Bra002762、Bra035649、Bra031701、Bra003276和Bra024117亚细胞定位分析,发现这些基因均定位在细胞质膜上。【结论】大白菜ACA家族基因蛋白结构均含有4个ACA基因特有的高度保守结构域。该家族在大白菜不同组织中表达模式不同,5个ACA家族基因成员编码蛋白定位于细胞膜上,其中Bra002762、Bra035649、Bra031701与低温和盐胁迫响应有关;Bra003276和Bra024117与自交不亲和性相关。

基于代谢组学分析丝瓜果肉褐变过程酚酸类物质变化

王雅慧, 刘晓宏, 雍明丽, 熊爱生, 苏小俊

中国农业科学. 2021, 54(22): 4869-4879. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.013

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【目的】褐变是影响丝瓜商品价值的主要因素,酚酸类物质代谢是导致褐变的主要原因。研究丝瓜褐变过程酚酸类物质变化有助于深入了解丝瓜褐变的生理机制,为丝瓜的贮藏和加工、品种选育和种质资源利用提供依据。【方法】以耐褐变丝瓜品种‘2D-2’和易褐变丝瓜品种‘35D-7’为试验材料,测定其鲜切后放置不同时间的褐变程度、总酚含量和多酚氧化酶活性,并借助超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）联用的方法对沸水浴褐变前后的丝瓜果肉样品进行代谢组学分析。【结果】鲜切褐变处理后,2个品种丝瓜果肉中的多酚含量及多酚氧化酶活性均有所增加。与‘2D-2’相比,丝瓜品种‘35D-7’的褐变程度较重,放置24 h后的总酚含量约为‘2D-2’的3倍以上;多酚氧化酶活性在放置12 h时最高,达174.23 U·g^-1·min^-1。通过代谢组学对易褐变丝瓜品种‘35D-7’酶促褐变反应底物及褐变前后的差异代谢物进行分析,经检测共获得420种代谢物,其中229种为差异代谢物。经褐变处理后,140种差异代谢物含量显著下降,89种升高。KEGG通路富集分析结果表明,苯丙素类生物合成、脯氨酸代谢和类黄酮生物合成等代谢途径中的代谢物含量发生了显著变化。代谢组定性定量分析结果发现,供试样品丝瓜果肉中鉴定出的酚酸类物质中对香豆酸含量最高,其次是松柏苷和龙胆酸。经褐变处理后,共有35种差异代谢物被鉴定为酚酸类代谢物。其中,松柏醛、3-氨基水杨酸和咖啡酸苯乙酯的含量下降最明显。相反地,紫丁香苷、2,5-二羟基苯甲酸O-己糖苷和异绿原酸A的含量显著提高,log2变化倍数达10以上。【结论】易褐变丝瓜品种‘35D-7’果肉中的主要酚类物质为对香豆酸,参与丝瓜‘35D-7’果肉褐变过程的主要酚酸类代谢物有松柏醛、紫丁香苷和异绿原酸A等。

葡萄无核基因分子标记的通用性鉴定

陈豆豆, 关利平, 贺亮亮, 宋银花, 章鹏, 刘三军

中国农业科学. 2021, 54(22): 4880-4893. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.014

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【目的】无核是鲜食葡萄的重要农艺性状,无核基因分子标记的准确性将影响无核葡萄早期选择的效果。本研究对前人开发的5个葡萄无核基因分子标记在183份葡萄材料中进行通用性鉴定,旨在明确各个分子标记的适用范围,为利用分子标记辅助无核葡萄育种提供参考依据。【方法】以96个葡萄品种（其中无核63个,有核33个）及‘红地球’×‘黎明无核’87个F₁单株（其中无核61株,有核26株）的叶片DNA为模板,利用已报道的5个葡萄无核基因分子标记（SCF27-2000、GSLP1-569、VMC7f2、p3_VvAGL11和5U_VviAGL11）的引物进行PCR扩增,采用1.5%琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳和8%聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测PCR产物,分析各个样品的无核特异条带,鉴定5个分子标记的准确率。【结果】SCAR标记GSLP1-569对96个葡萄品种的检测准确率为40.6%,无核检测率为63.6%。SCAR标记SCF27-2000对96个葡萄品种及87个F₁杂交单株的检测准确率分别为71.9%和76.54%,无核检测率分别为70.5%和78.5%。SSR标记VMC7f2在96个葡萄品种中鉴定出8个等位基因,经卡方检验,189-bp等位基因与葡萄无核性状显著关联,其检测准确率为85.4%,无核检测率为85.5%。SSR标记p3_VvAGL11在96个葡萄品种中鉴定出7个等位基因,经卡方检验,187-bp等位基因与葡萄无核性状显著关联,其检测准确率为89.6%,无核检测率为90.7%,在F₁杂交单株中其鉴定准确率为87.65%,无核检测率为91.1%,假阳性率为6.17%,假阴性率为6.17%。SSR标记5U_VviAGL11在96个葡萄品种中鉴定出17个等位基因,经卡方检验,306-bp等位基因与葡萄无核性状显著关联,其鉴定准确率为88.5%,无核检测率为90.6%,在F₁杂交单株中检测准确率为88.89%,无核检测率为92.7%,假阳性率为4.94%,假阴性率为6.17%。【结论】SSR标记p3_VvAGL11和5U_VviAGL11在葡萄种质及遗传群体中无核分型的准确性及无核检测的效率较高,适用范围较广,在无核基因分子标记辅助选择中可以考虑优先使用。

超声对豌豆分离蛋白结构及乳化性能的调控效应

李朝蕊,韩馨蕊,范鑫,黄峻榕,曹云刚,熊幼翎

中国农业科学. 2021, 54(22): 4894-4905. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.015

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【目的】考察超声波处理对豌豆分离蛋白（pea protein isolate,PPI）结构和理化性质的影响,揭示超声处理对PPI乳化特性的调控机制,为豌豆蛋白作为天然乳剂及其相关产品在食品领域中的应用提供理论依据。【方法】选用频率为20 kHz、功率为600 W的超声波经不同时长（0、20、30、40和60 min）的预处理后制备改性豌豆蛋白（ultrasonic-pea protein isolate,U-PPI）,再经高压均质制备U-PPI乳液。通过自由氨基、总巯基、粒径、溶解度及SDS-PAGE探究超声波处理对豌豆蛋白理化性质的影响;借助圆二色谱仪分析U-PPI二级结构的变化;通过内源性色氨酸荧光测定分析U-PPI三级结构的变化;通过乳化活性指数、粒径、乳液界面蛋白分布、Zeta电位和表观黏度表征U-PPI的乳化能力和乳液稳定性;借助激光共聚焦荧光显微镜观察乳状液的微观结构。【结果】超声波处理对PPI结构具有显著修饰作用,30—40 min的短时间超声处理能够显著降低α-螺旋并提高β-折叠含量,使PPI的结构更加舒展柔韧,更多的疏水基团暴露在界面上,同时超声波的解聚效应还引起PPI的平均粒径减小、溶解度显著增大;因而在此条件下超声处理对PPI结构的修饰有利于其在油/水界面形成致密而稳定的蛋白膜,有效地提高了PPI的乳化活性和乳状液的稳定性,微观结构也显示其乳液粒径更小、分布更加均匀。然而,60 min的长时间超声处理会导致PPI的疏水重聚,溶解度降低,不利于其在油/水界面的吸附重排,降低了其乳化活性和乳液稳定性。【结论】30和40 min超声处理产生的空化效应、机械效应等对PPI具有显著的解聚作用,促使蛋白分子结构舒展,有利于其在油/水界面的吸附重排,从而显著改善了豌豆蛋白的乳化性能。

饲粮微量元素添加模式对肉仔鸡生长和胴体性能及肌肉品质的影响

张兰,王良治,黄艳玲,廖秀冬,张丽阳,吕林,罗绪刚

中国农业科学. 2021, 54(22): 4906-4916. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.016

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【目的】研究饲粮微量元素不同添加模式对肉仔鸡生长和胴体性能及肌肉品质的影响,探寻肉仔鸡饲粮中微量元素平衡模式,为饲粮中合理添加微量元素提供试验依据。【方法】采用单因子完全随机设计,选取240只1日龄AA肉仔鸡,按体重随机分为5组,每组6个重复,每个重复8只。在玉米-豆粕型基础饲粮中分别按不同模式添加微量元素：按照NRC（1994）肉鸡推荐量以无机形式添加微量元素（T1,1—42日龄铜、铁、锰、锌和硒添加量分别为8、80、60、40 和 0.15 mg·kg^-1）;按照中国鸡饲养标准（农业行业标准NY/T 33-2004）中肉鸡推荐量以无机形式添加微量元素（T2,1—21日龄铜、铁、锰、锌和硒添加量分别为8、100、120、100和0.3 mg·kg^-1;22—42日龄添加量分别为8、80、120、80和0.3 mg·kg^-1）;按照课题组前期微量元素需要量研究结果以无机形式添加微量元素（T3,1—21日龄铜、铁、锰、锌和硒添加量分别为4、40、110、60和0.35 mg·kg^-1;22—42日龄添加量分别为0、30、80、40和0.35 mg·kg^-1）;按照实验室前期结果以有机形式减量添加微量元素（T4,1—21日龄铜、铁、锰、锌和硒添加量分别为2、30、80、40和0.25 mg·kg^-1;22—42日龄添加量分别为0、15、50、30和0.25 mg·kg^-1）;按照NY/T 33-2004中肉鸡推荐量以有机形式添加微量元素（T5,1-21和22-42日龄铜、铁、锰、锌和硒添加量同T2）。无机微量元素源分别为饲料级五水硫酸铜、一水硫酸亚铁、一水硫酸锰、一水硫酸锌和亚硒酸钠,有机微量元素源分别为饲料级蛋氨酸铜、甘氨酸铁、蛋氨酸锰、甘氨酸锌和酵母硒。试验期42d。【结果】微量元素添加模式对肉仔鸡平均日采食量、平均日增重均无显著影响（P>0.05）; T2组的22—42日龄料重比显著高于T1、T4和T5组（P<0.05）,而T2与T3组无显著差异（P>0.05）; T2组的1-42日龄料重比显著高于其他组（P<0.05）,而其他各组之间差异不显著（P>0.05）。42日龄肉仔鸡胴体性能及胸肌和腿肌的L^*值、a^*值、pH和滴水损失均不受微量元素添加模式影响（P>0.05）,但T5组的胸肌b^*值显著高于T1和T3组（P<0.05）,而与T4组无显著差异（P>0.05）;T4组的腿肌剪切力显著低于T1和T5组（P<0.05）,肌肉嫩度相对较好。【结论】本试验条件下,在玉米-豆粕型饲粮中减量添加有机微量元素（T4, 1—21日龄铜、铁、锰、锌和硒添加量分别为2、30、80、40和0.25 mg·kg^-1;22—42日龄添加量分别为0、15、50、30和0.25 mg·kg^-1）对肉仔鸡生长性能和肌肉品质的作用效果较好。

葡萄糖氧化酶对大肠杆菌攻毒肉鸭生长性能、免疫功能及肠道健康的影响

刘娇,陈志敏,郑爱娟,刘国华,蔡辉益,常文环

中国农业科学. 2021, 54(22): 4917-4930. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2021.22.017

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【目的】探究饲粮中添加葡萄糖氧化酶（GOD）对大肠杆菌攻毒肉鸭生长性能、免疫功能和肠道健康的影响及其作用机制,为寻求预防肉鸭大肠杆菌病的抗生素替代品研究提供思路。【方法】选用144只1日龄健康北京公鸭,随机分为3组,每组6个重复,每重复8只鸭。对照组饲喂基础饲粮,两个试验组分别在基础饲粮中添加30 mg·kg^-1维吉尼亚霉素（抗生素组）或200 U·kg^-1 GOD,于试验第7天分两次对所有鸭口腔灌服0.2 mL大肠杆菌 O₈₈（3×10⁹CFU / mL）,两次攻毒间隔8 h。试验期28 d。【结果】（1）与对照组相比,饲粮中添加抗生素和GOD显著提高攻毒肉鸭1—14日龄平均日增重和平均日采食量（P<0.05）。（2）GOD和抗生素显著降低28日龄攻毒肉鸭血液中白细胞数（P<0.05）,提高血液中淋巴细胞百分比（P<0.05）。此外,GOD显著降低血液中红细胞含量（P<0.05）。（3）GOD和抗生素显著降低14日龄肉鸭血清MDA和28日龄CAT的含量（P<0.05）; GOD显著提高28日龄肉鸭血清T-AOC（P<0.05）,且有降低14日龄CAT的趋势（P=0.087）。（4）抗生素和GOD显著降低14、28日龄肉鸭血清内毒素含量（P<0.05）。（5）GOD和抗生素显著降低肉鸭14、28日龄空肠IL-1β和IL-6浓度（P<0.05）,以及28日龄空肠TNF-α浓度（P<0.05）,两组间无显著差异（P>0.05）。（6）抗生素和GOD显著降低大肠杆菌攻毒肉鸭14、28日龄血清DAO活性和D-LA含量（P<0.05）,两组间无显著差异（P>0.05）。（7）GOD增加了回肠特有OTUs的数量,降低了大肠杆菌含量,提高了乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌的相对丰度。【结论】饲粮中添加GOD通过平衡大肠杆菌攻毒肉鸭的肠道菌群结构、减少细菌内毒素的产生以及降低氧化应激对细胞的损伤来维持肠黏膜的完整性、避免因内毒素进入血液后激活炎症信号通路而引起炎症反应的发生,从而改善肉鸭肠道健康、促进肉鸭生长。GOD能够作为抗生素替代物用于预防或减轻肉鸭的大肠杆菌病。

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