中国农业科学

中国农业科学. 2019, 52(23): 0. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.0578-1752-52-23-0

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小麦种质资源耐热性评价

王小波,关攀锋,辛明明,汪永法,陈希勇,赵爱菊,刘曼双,李红霞,张明义,逯腊虎,魏亦勤,刘旺清,张金波,倪中福,姚颖垠,胡兆荣,彭惠茹,孙其信

中国农业科学. 2019, 52(23): 4191-4200. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.001

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【目的】利用热感指数作为耐热性鉴定指标,分别对冬、春小麦种质资源进行高通量耐热性鉴定,筛选耐热种质资源,为小麦耐热性育种提供材料基础。【方法】冬小麦材料采用延期播种、春小麦材料种植在温度有显著差异的地理环境下,人为致使小麦灌浆期遭遇高温胁迫。根据不同环境处理的千粒重值计算冬、春小麦各个材料的热感指数。依据热感指数,对来自中国不同小麦生态区和国外不同地区和组织的1 325份小麦种质资源,包括688份冬小麦和637份春小麦,分别进行耐热性评价。热感指数小于0.5为极耐热材料、大于等于0.5小于1为中等耐热材料、大于等于1小于1.5为中等热敏感材料、大于等于1.5为极敏感材料。【结果】冬小麦和春小麦热胁迫处理组灌浆期平均最高温度分别高于对照组1.91℃和7.09℃,且热胁迫处理组千粒重与对照组相比均有显著降低。根据热感指数分级评价结果,极耐热冬、春小麦材料31和48份,占供试材料的4.51%和7.54%;极敏感冬、春小麦材料19和58份,占供试材料的2.76%和9.11%;其余大多数材料为中间类型（中等耐热材料和中等热敏感材料）。从中国小麦生态区域的地理分布来看,来自南部麦区（西南冬麦区、青藏春冬麦区、长江中下游冬麦区）的冬小麦材料耐热性整体高于来自北部麦区（北部冬麦区、黄淮冬麦区）的冬小麦材料。对于春小麦,来自新疆春冬麦区的材料耐热性最强,平均热感指数为0.70,且其中88.00%的材料属于耐热材料（极耐热材料或中等耐热材料）;此外,来自国际干旱地区农业研究中心的春小麦平均热感指数为0.88,也表现出较强的耐热性。来自CIMMYT的人工合成六倍体材料耐热性最弱,平均HSI为1.18,其中69.58%的材料为热敏感材料（中等热敏感材料和极敏感材料）。【结论】采用延期播种或在高温的地理环境下种植能使小麦在灌浆期遭遇高温胁迫。以千粒重热感指数作为评价指标,对1 325份小麦种质资源进行高通量耐热性鉴定,综合考虑正常条件下的产量潜力和高温条件下的耐热性,筛选出优异耐热资源103份,可用于相应生态区小麦的耐热性遗传改良。

青稞种质资源表型性状的遗传多样性分析及综合评价

白羿雄, 郑雪晴, 姚有华, 姚晓华, 吴昆仑

中国农业科学. 2019, 52(23): 4201-4214. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.002

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【目的】解析青稞种质资源表型形状的遗传多样性关系及筛选综合性状优异的青稞种质,可为青稞育种及重要性状深入研究提供理论依据。【方法】通过对205份青稞15个表型性状采用Shannon-Wiener’s多样性指数进行遗传多样性分析。分析参试青稞种质15个表型性状在西宁试验点和海北试验点的频次分布规律。对各性状利用相关性分析以明确性状间联系;对参试种质进行聚类分析以明确其分类情况。利用主成分分析构建青稞种质综合评价体系,并通过线性回归分析对该体系进行验证。依据综合评价及丰产稳产性分析结果以筛选优异青稞种质。【结果】倒伏率遗传变异程度最丰富而重心位置遗传变异最匮乏,海北点遗传变异程度高于西宁点。穗重遗传多样性最丰富,倒伏率遗传单一性最高。除倒伏率外各性状指标均呈正态或偏态分布,分布频次呈中间高两边低的分布趋势;穗长、穗重在各基因型中呈正态分布。各表型性状受环境、基因型、年份影响极显著,且各表型性状的基因型与环境（G×E）、基因型与年份（G×Y）、基因型×环境×年份（G×E×Y）的互作效应均呈极显著。青稞根系、茎秆和穗部组织内各指标间存在显著相关性,且各组织间的农艺性状也存在显著相关性。根系发达、茎部抗折力高的青稞种质其机械固持能力强,倒伏率低;严重倒伏会限制青稞种质穗部生长发育,使穗长变短、穗粒数减少、籽粒变小、穗重变轻、进而使产量锐减。聚类结果表明参试种质可分为三类,第一类是高重心、易倒伏、其余性状居中的种质;第二类是矮秆、低重心且其余性状表现良好的优异种质;第三类是株高较高、根系欠发达、茎部易折、穗部性状表现差的种质。结合F值和丰产稳产性分析结果筛选出综合性状表现优异且有较高丰产稳产性的青稞种质5份。【结论】参试青稞种质资源的遗传多样性丰富;穗长、穗重在各基因型中呈正态分布,除倒伏率外,其余12个性状在基因型中呈偏态分布;根干重、重心位置、茎秆壁厚、茎粗、茎秆强度、穗长、穗粒数、产量8个指标可作为核心种质评价的综合指标。

磷胁迫下羊草的响应及磷响应相关基因表达分析

万东莉,侯向阳,丁勇,任卫波,王凯,李西良,万永青

中国农业科学. 2019, 52(23): 4215-4227. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.003

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【目的】磷是植物生长发育所必需的大量营养元素,研究无机磷酸盐（inorganic phosphate,Pi）胁迫下羊草的响应,筛选不同浓度Pi胁迫下的内参基因,并分析Pi响应相关基因的表达,为羊草Pi胁迫响应的分子机制研究提供基础数据。【方法】以羊草幼苗为材料,进行不同浓度Pi处理培养,对羊草的株高和根长进行检测,利用钒钼黄比色法检测羊草植株中Pi的含量。根据羊草转录组数据选取7个候选内参基因,从NCBI核酸序列数据库选取1个候选内参基因,对羊草不同处理材料进行总RNA提取和cDNA合成,利用qRT-PCR对候选内参基因的表达进行检测,并通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对其稳定性进行评估。根据筛选获得的较稳定内参基因,对Pi响应基因的qRT-PCR检测数据进行相对定量分析。【结果】表型观测结果显示,无论是低Pi还是高Pi胁迫都使得羊草的生长减缓;株高对低Pi或缺Pi胁迫较为敏感,根长对高Pi胁迫较为敏感;并随着处理浓度的增加羊草中Pi的含量也增加。qRT-PCR溶解曲线分析显示8个候选内参基因均具有单一的溶解峰,基因表达谱分析表明8个候选内参基因的CT值范围是17.16—26.61,其中,LcGAPDH的表达丰度最高为17.16—20.22,Lc18SrRNA的表达丰度最低为23.28—26.61,CT值变异系数最小的为LcARPT（2.09%）,最大的为LcTUA（6.8%）。综合geNorm、NormFinder和Bestkeeper稳定性排名,通过计算几何平均数,获得8个候选内参基因综合稳定性排名,其中排名靠前的3个基因分别为Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α,排名最后的2个基因为LcTUA和LcTUB。分别以Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α作为内参基因,qRT-PCR相对定量表达分析结果显示,与对照相比,LcPHO1-2的表达受低Pi或者缺Pi诱导;LcPAP2的表达受高Pi诱导;而LcPAP27的表达同时受低Pi和高Pi下调。【结论】低Pi和高Pi胁迫均使羊草生长受阻,羊草地上组织与地下组织对Pi胁迫响应的模式不同。筛选出3个表达较为稳定的内参基因Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α。LcPHO1-2和LcPAP2分别参与了羊草对低Pi和高Pi的应答响应,LcPAP27同时参与了羊草对低Pi和高Pi的响应进程。

侧深施氮对机插水稻产量形成及氮素利用的影响

朱从桦, 张玉屏, 向镜, 张义凯, 武辉, 王亚梁, 朱德峰, 陈惠哲

中国农业科学. 2019, 52(23): 4228-4239. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.004

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【目的】水稻机插同步侧深施肥是一项新兴的技术,正在迅速发展。深入探究不同类型氮肥机械侧深施用对机插水稻产量及氮素利用效率的影响,有利于提高水稻机械化种植水平,为机插水稻节本增效提供理论依据。【方法】2017年和2018年开展大田试验,采用完全随机区组试验设计,设置5种施氮处理,即不施氮肥（N0）、尿素撒施（CUB）、尿素机械侧深施（CUM）、控释尿素撒施（CRUB）和控释尿素机械侧深施（CRUM）,测定水稻物质生产特性、氮素积累分配、氮素利用效率、产量及产量构成因素。【结果】2年各施氮处理对水稻产量形成、氮素利用的影响基本一致。与尿素相比,控释尿素可以显著提高水稻干物质积累量、氮素积累量、氮肥利用率以及稻谷产量;2017年成熟期干物质积累量和氮素积累量、氮肥吸收利用率（NRE）、氮肥农学效率（NAE）和稻谷产量分别增加3.22%、17.50%、46.00%、17.79%和3.72%,2018年相应增幅分别为8.77%、13.27%、32.07%、12.74%和3.32%。与人工撒施相比,机械侧深施可以显著提高氮肥利用率,2017年NRE和NAE分别增加17.91%—43.14%和19.61%—37.39%;2018年NRE和NAE分别增加53.80%—54.10%和21.11%—35.11%。与人工撒施相比,机械侧深施肥处理的产量分别增加4.46%—6.95%（2017年）、5.55%—8.11%（2018年）;增产的主要原因是其具有更多有效穗数和颖花总量。齐穗至成熟期,CRUM处理茎叶鞘氮素积累量和茎叶氮素表观转移量（TNT）均显著高于其他施氮处理。此外,在穗分化期和齐穗期,相比其他施氮处理,CRUM处理的氮素积累量、SPAD值、干物质积累量均显著增加。【结论】控释尿素机械侧深施（CRUM）是一种能提高机插水稻产量和氮素利用的有效施肥方法。

超级早稻钵形毯状秧苗机插效果及产量形成

陈惠哲, 徐一成, 张玉屏, 向镜, 张义凯, 朱德峰

中国农业科学. 2019, 52(23): 4240-4250. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.005

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【目的】通过钵形毯状秧苗机插技术在双季超级早稻上机插应用,探究机插效果及对产量形成的影响,以期为我国水稻机械化种植技术发展提供参考。【方法】以常规超级早籼稻中早39、中嘉早17为试验材料,采用水稻钵形毯状秧盘（BT）和传统平盘（CK）培育秧苗,考察种子出苗、秧苗素质、根系形态及分布、机插效果、产量并比较差异。【结果】水稻钵形毯状秧盘与平盘育秧种子出苗率差异不显著;钵形毯状秧苗根系独立成钵状,56.03%的根系在底层钵碗内,上部根系比例43.97%,且白根多,根数比对照略少,但根长度、根表面积、根直径和根体积有所增加,而对照秧苗的下部根系比例37.86%,上部根系比例高达62.14%;从机插效果看,中早39和中嘉早17钵形毯状秧苗的机插断根率比平盘毯状秧苗分别降低了25.06%和14.24%,相同播种量下,2年重复试验中早39钵形毯状秧苗机插的漏秧率比对照分别下降了3.89%和1.67%,中嘉早17下降了2.22%和1.66%,另外翻秧、漂秧、伤秧比例较对照也有所减少;钵形毯状秧苗机插14 d后的秧苗叶重、茎鞘重、根重、地上部总重量和叶绿素含量均比对照明显增加,表明有利于促进秧苗早发生长;产量比较,中早39钵形毯状秧苗机插比对照增产6.35%—7.66%,中嘉早17增产8.99%—10.87%,其中主要通过有效穗数增加实现增产,中早39和中嘉早17的钵形毯状秧苗机插处理有效穗数分别增加了2.14%—6.01%和4.76%—6.98%。【结论】水稻钵形毯状秧苗机插技术通过培育形成上毯下钵的钵形毯状秧苗,按钵取秧机插,有利于提高机插质量,减少机插漏秧率及伤根,促进秧苗早发,提高有效穗数,实现机插水稻高产。

小麦籽粒灌浆与脱水特性

朱冬梅, 王慧, 刘大同, 高德荣, 吕国锋, 王君婵, 高致富, 陆成彬

中国农业科学. 2019, 52(23): 4251-4261. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.006

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【目的】研究小麦品种籽粒灌浆与脱水特性,为培育灌浆快、脱水快的少（免）晾晒小麦品种提供选择方法和理论依据。【方法】2015—2016年以长江中下游地区7个主推小麦品种为试验材料,采用Logistic方程拟合、多重比较及相关分析等方法,测定灌浆与脱水指标,生理成熟期及收获期籽粒含水率等。【结果】籽粒灌浆呈“S”型“慢-快-慢”的增长趋势,但不同品种最大灌浆速率、平均灌浆速率及灌浆持续时间差异显著,扬麦11、扬麦158、扬麦16最大灌浆速率及平均灌浆速率较大,花后30 d籽粒干重均达35 g以上,灌浆持续期较短;扬麦15灌浆速率仅次于上述3个品种,但灌浆持续期最长;宁麦13、扬麦20、扬麦22灌浆速率较小。最大灌浆速率、平均灌浆速率以及渐增期、快增期和缓增期的灌浆速率均与千粒重极显著正相关,3个灌浆时期灌浆速率R2>R1>R3,花后30 d灌浆基本完成。籽粒灌浆完成后进入脱水阶段,生理成熟期和收获期籽粒含水率、生理成熟后籽粒脱水速率品种间差异显著,扬麦11、扬麦158、扬麦16生理成熟后籽粒脱水速率较高,扬麦15最低。收获期籽粒含水率与生理成熟期籽粒含水率、籽粒平均脱水速率、生理成熟后2 d籽粒脱水速率显著或极显著相关。【结论】扬麦11、扬麦158、扬麦16灌浆速率大,灌浆完成早,籽粒脱水快。花后30 d粒重>35 g可作为育种材料灌浆快慢的选择指标,生理成熟期后籽粒平均脱水速率可作为衡量小麦品种脱水快慢的选择指标。

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的检测与分析

孟峰,张亚玲,靳学慧,张晓玉,姜军

中国农业科学. 2019, 52(23): 4262-4273. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.007

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【目的】检测黑龙江省稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t在不同地区、年份间流行菌株的分布情况与变异机制,了解其等位基因的致病表型,为黑龙江省抗瘟品种布局提供参考依据。【方法】利用NCBI中公布的无毒基因序列对3个无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的基因全长和编码序列（coding sequence,CDS）分别设计特异性引物,将2016年和2017年采自黑龙江省不同地区335个稻瘟病菌单孢分离菌株的DNA进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测分析,并挑选不同带型和不同地区代表菌株的PCR产物进行测序。测序结果与相应无毒基因序列进行碱基与氨基酸序列的比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌菌株进行致病型测定。【结果】在PCR电泳检测中AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t均出现特异性条带,说明这3个无毒基因在黑龙江省均有分布,并以不同分布频率与突变类型出现。3个无毒基因平均扩增频率分别为75.52％、87.16％和85.67％。其中AVR-Pib通过电泳检测与PCR产物测序检测出4种带型（无带、高带、中高带与低带）和5种变异类型AVR-Pib（1-1、1-2、2、3、3-1）,基因型AVR-Pib-1-1、AVR-Pib-1-2、AVR-Pib-2和AVR-Pib-3-1为新发现的变异类型,其中基因型AVR-Pib-1-1和AVR-Pib-1-2均为转座子Pot2的插入,但插入位点不同;基因型AVR-Pib-2在阅读框上游存在小片段的插入;基因型AVR-Pib-3-1碱基序列与原序列比对有4处差异,即32（C/G）35（T/A）36（T/A）38（T/A）,导致氨基酸翻译提前终止。对检测到的5种等位基因型进行致病型测定,分析发现除正常基因型AVR-Pib-3外,其他变异基因型无毒功能均已丧失。而AVR-Pik经PCR产物测序检测出7种等位基因型,AVR-Pik（D、A、B、C、E、F、F2）,碱基序列的变化均导致氨基酸错义突变,7种等位基因型均已见报道。无毒基因AvrPiz-t通过电泳检测和PCR产物测序分析,发现2种带型（高带和正常带型）与4种基因型AvrPiz-t（A、B、C、D）,其中AvrPiz-t-A为正常基因型;基因型AvrPiz-t-B在191位处有碱基A的插入,导致氨基酸翻译提前终止;基因型AvrPiz-t-C为新发现的等位基因型,其特点在于与A类型存在17（T/C）和19位处碱基C的插入,发生移码突变翻译提前终止;高带型对应的无毒基因型AvrPiz-t-D经测序验证为Pot3转座子的插入。4种基因型菌株分别接种水稻单基因系发现,AvrPiz-t-A可以被Piz-t识别表现无毒,AvrPiz-t（B、C、D）均不能被Piz-t所识别而表现为有毒性。【结论】黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t分布较为广泛,且变异类型丰富,研究结果可为选育和推广携带相应抗病基因的水稻品种提供参考。

利用TRV-HIGS技术鉴定核盘菌致病相关的分泌蛋白基因

远俊虎,丁一娟,杨文静,闫宝琴,柴亚茹,梅家琴,钱伟

中国农业科学. 2019, 52(23): 4274-4284. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.008

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【目的】由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是我国油菜种植上的主要问题,严重威胁着菜籽产量及品质。分泌性蛋白在病原菌致病过程中起着重要作用,核盘菌基因组中包含大量编码分泌性蛋白的基因,本研究旨在鉴定并筛选与致病性相关的分泌蛋白基因,揭示核盘菌的致病机理,为菌核病防控提供重要靶标。【方法】采用SMART软件对核盘菌在侵染抗病、感病甘蓝过程中差异表达明显的8个具有信号肽的候选基因进行蛋白质结构域的分析,随后将SMART分析得到的结构域分别于SCOP、Pfam、PDB数据库进行功能注释。利用基因特异性引物进行目的基因特异片段的PCR扩增,构建pTRV2-Gene和pTRV2-GFP载体。随后等量混合含有pTRV1及pTRV2-Gene,pTRV1及pTRV2-GFP载体的重悬菌液。室温静置3 h后,利用针筒浸润法将pTRV2-Gene载体及对照（TRV-GFP）侵染5—6周龄的本氏烟（Nicotiana benthamiana）。侵染植株于黑暗环境中培养48 h后,再置于正常光照条件的环境中生长7 d。将直径6 mm的核盘菌PDA菌丝块接种于侵染9 d后的烟草叶片叶腹的中央,其中带菌面紧贴叶片,随后将接种植株培养48 h后统计病斑面积。提取接种48 h后的病斑及病斑周围组织叶片（距腐烂组织边缘1 cm左右）的RNA,利用特异引物进行目的基因的qRT-PCR,计算目的基因在携带TRV-HIGS载体的烟草植株中的相对表达量。【结果】SMART及结构域注释预测这8个候选基因可能参与了蛋白、核酸或多糖的水解,影响植物的免疫反应,参与核盘菌对药物耐受性的调节及生物素合成。核盘菌接种携带这8个基因的TRV-HIGS载体及对照载体的烟草,48 h后对照植株的病斑面积平均为3.44 cm ²,除SS1G_07655外,其余7个候选基因的TRV-HIGS植株上的病斑面积相比对照植株均显著减小（P≤0.05）,其病斑面积介于1.63—2.61 cm ²。qRT-PCR结果显示,这7个致病相关的候选基因在核盘菌侵染烟草过程中的基因表达水平均显著低于对照（P≤0.05）。【结论】利用TRV介导的HIGS技术成功地对核盘菌中8个未知功能的分泌蛋白基因进行了功能鉴定,筛选到7个可能与核盘菌致病性相关的基因,其中对核盘菌致病性影响最大的SS1G_03146预测可能参与核盘菌生物素合成,同时SS1G_04343及SS1G_11912预测可能参与影响植物的免疫反应。

石灰用量对水稻油菜轮作区土壤酸度、土壤养分及作物生长的影响

闫志浩,胡志华,王士超,槐圣昌,武红亮,王瑾瑜,邢婷婷,余喜初,李大明,卢昌艾

中国农业科学. 2019, 52(23): 4285-4295. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.009

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【目的】我国南方稻油轮作区土壤酸化趋势日趋严重,降低了作物产量。研究酸性土壤施用石灰对土壤养分及作物生长的影响,明确土壤速效养分、产量与作物养分吸收量对土壤pH的响应关系,为水田两熟区酸化土壤改良提供理论依据。【方法】2015—2018年在江西进贤县选择pH 4.5的水稻土,以熟石灰作为酸性土壤改良剂,开展田间定位试验。通过实验室模拟,计算出获得不同土壤pH情况下的熟石灰用量,试验设6个土壤pH梯度,分别为4.5、5.0、5.6、6.3、6.8、7.3,2015年匀地一年,为保证各处理土壤pH与匀地一年后实测pH基本一致,以一年为周期用熟石灰进行定量调整。【结果】（1）随着石灰用量和土壤pH的增加,土壤速效氮含量呈先增加后降低的趋势、交换性钙、交换性镁含量显著增加,土壤速效钾、有效磷含量显著降低;（2）随着石灰用量和土壤pH的增加,作物产量呈先增加后降低的趋势。土壤pH 6.4时（相当于6 145 kg·hm ^-2熟石灰用量）油菜产量达到最高,较土壤pH 4.5处理增加了202.2%;土壤pH 6.8时（相当于7 474 kg·hm ^-2熟石灰用量）,水稻产量达到最高,较土壤pH 4.5处理增加了61.2%。油菜、水稻产量降低50%时的酸害阈值分别为4.7、4.2;（3）土壤pH显著影响作物养分吸收量。随着熟石灰用量的增加,油菜氮磷钾吸收量呈先增加后降低的趋势。2016—2018年油菜氮磷钾吸收量与不施石灰处理相比,施石灰处理平均增幅分别为59.5%—181.4%、36.2%—188.8%、65.7%—198.9%;水稻氮磷钾吸收量呈先增加后降低的趋势,在pH 6.8左右水稻氮磷钾吸收量最大。2016—2018年水稻氮磷钾吸收量与不施石灰处理相比,施石灰处理平均增幅分别为11.1%—88.6%、13.5%—68.5%、9.7%—66.1%。【结论】施用熟石灰的情况下,随着土壤pH升高,土壤速效氮、交换性钙镁等含量增加,提高了产量,促进了作物对氮磷钾养分的吸收。在本试验条件下,稻油轮作区酸性土壤（pH 4.5）施用熟石灰的最佳用量为6 500 kg·hm ^-2左右,改良土壤的目标为pH 6.5左右,可获得我国南方稻油轮作区的作物稳定高产。

基于SPEI和MI分析陕西省干旱特征及趋势变化

丁怡博,徐家屯,李亮,蔡焕杰,孙亚楠

中国农业科学. 2019, 52(23): 4296-4308. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.010

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【目的】目前干旱研究多为基于历史干旱事件分析成因与变化趋势,而结合过去与未来长时间序列数据更能揭示干旱变化特点。寻找在基于CMIP5模型输出未来气象数据时模拟干旱指数方法并探究陕西省过去与未来干旱变化特点,为陕西省未来农业水资源管理提供依据。【方法】根据陕西省18个气象站历史数据以及CMIP5模式输出未来气象数据,比较了3种模型模拟参考作物蒸发蒸腾量（ET₀）,并基于参考作物蒸发蒸腾量（ET₀）和降水数据计算标准降水蒸发指数（SPEI）和相对湿润指数（MI）反映干旱程度,比较过去（1958—2018年）与未来（2019—2100年）干旱的时空变化特点。【结果】多元线性回归模型（Multiple Linear Regression, MLR）能较准确的模拟参考作物蒸发蒸腾量（ET₀）（RMSE=0.457 mm·d ^-1）;在RCP2.6和RCP8.5情景下未来干旱指数呈现上升趋势,在RCP8.5情景下,21世纪40年代存在干旱指数的突变年份;陕西省未来干旱程度降低,年内干旱分布更加不均匀;未来时期夏玉米生长季干旱程度减小,冬小麦生长季干旱程度增加。【结论】在不同RCP情景下,未来干旱变化特征存在差异,相同RCP情景下,SPEI和MI反映的干旱特征变化基本一致,但部分时段存在变化差异。为有效应对气候变化对旱作作物产量造成的负面影响,应当增强土壤蓄水保墒能力,尤其加强冬小麦生长季的抗旱工作。

湖北省农业碳排放的时空特征及经济关联性

李波,杜建国,刘雪琪

中国农业科学. 2019, 52(23): 4309-4319. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.011

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【目的】湖北省是农业大省,农业生产的碳排放在总碳排放中占据较大的比重,碳排放所带来的温室效应和农业生产导致的面源污染等环境问题不容忽视。基于此,通过分析农业经济增长和农业碳排放之间的协整关系,并对其进行误差修正,为湖北省未来的碳减排工作的开展提供重要的理论依据和参考。【方法】基于6个主要方面碳源,测算了1993–2017年湖北省农业生产活动所导致的碳排放量,并分析农业碳排放的时空特征。进一步通过Kernel密度估计发现,湖北省各地市州农业碳排放的地区差距。最后,综合运用协整理论及误差修正模型,实证湖北省农业经济增长与碳排放之间的关系。【结果】湖北省农业碳排放总量和强度均呈现先升后降的趋势,年均增长率分别为2.32%、2.21%,从总体来看环比增速呈现下降的趋势。农药、农膜、化肥、农用柴油、翻耕和农业灌溉等所产生碳排放年均递增率分别为2.23%、2.44%、2.40%、3.32%、0.44%和2.32%;通过Kernel密度估计发现,在此样本考察期间内湖北省各地市州农业碳排放的地区差距有明显的扩大。湖北省农业碳排放与农业经济增长存在协整关系的有：农业碳排放总强度,农药、农膜、农用柴油和灌溉等4类碳源导致的碳排放强度,且当湖北省人均农业总产值每增加1%时,农药、农膜、农用柴油和农业灌溉等4类碳源的碳排放强度分别增加了0.58%、0.59%、0.25%和0.15%,农业碳排放总强度便增加0.19%。【结论】湖北省农业经济发展、生产条件和地区发展战略不同,而导致地区间的农业碳排放差距越来越明显。农业经济增长与农业碳排放存在长期稳定关系,这表明湖北省还处于传统耕作模式向绿色低碳耕作模式转型的关键期,并且这种发展模式已存在较长时间。

加强分子生物学研究,促进苹果产业持续发展

丛佩华,张彩霞,韩晓蕾,张利义

中国农业科学. 2019, 52(23): 4320-4321. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.012

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苹果LIM基因家族生物信息学及表达分析

袁高鹏, 韩晓蕾, 卞书迅, 张利义, 田义, 张彩霞, 丛佩华

中国农业科学. 2019, 52(23): 4322-4332. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.013

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【目的】在苹果全基因组中鉴定LIM,通过分析启动子作用元件、保守结构域、基因聚类、基因结构、染色体定位以及组织表达模式,为研究和利用苹果LIM奠定基础。【方法】利用苹果基因组数据库GDR和PLAZA,获得苹果LIM家族成员并进行编号。苹果LIM蛋白氨基酸序列的基本信息通过ExPASy Proteomics Server进行预测,利用Cell-PLoc进行亚细胞定位预测,利用CD-Search Tool进行LIM结构域分析,采用MEGA 7软件构建进化树,采用GSDS绘制基因结构,并利用TBtools软件对鉴定得到的MdLIM进行染色体定位,通过实时荧光定量RT-PCR对MdLIM的组织表达进行分析,并利用SPSS 18.0软件分析差异显著性。【结果】共鉴定得到11个苹果LIM家族成员,这些MdLIM蛋白包含96—222个不等的氨基酸残基,等电点分布在6.14—9.01。亚细胞定位结果显示,MdLIM蛋白在细胞核中均有分布。启动子作用元件分析表明,11个MdLIM启动子上分布有响应激素、环境适应性和逆境诱导的元件。蛋白保守结构域分析表明,11个MdLIM蛋白中除MdLIM8具有单LIM结构域外,其余10个均具有双LIM结构域。根据聚类分析结果可将MdLIM分为4组。染色体定位结果显示,MdLIM分布在苹果17条染色体中的7条,且MdLIM在7条染色体上的分布不均匀。花、叶、果皮和茎中的实时荧光定量RT-PCR结果显示,4个组织中均能检测到MdLIM的表达,且表达量具有一定差异。【结论】苹果LIM基因家族包括11个成员,进化上可分为4组,11个基因分布于7条染色体上,在不同组织中的表达具有多样性和特异性。

苹果NLP（Nin-Like Protein）转录因子基因家族全基因组鉴定及表达模式分析

王寻, 陈西霞, 李宏亮, 张富军, 赵先炎, 韩月彭, 王小非, 郝玉金

中国农业科学. 2019, 52(23): 4333-4349. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.014

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【目的】探究苹果NLP转录因子全基因组特征与表达模式,以便更深入地了解其结构特点与作用机制。【方法】基于本地BLAST数据库和Pfam数据库两大数据库,运用blastp和hmmsearch两种查询策略,对苹果全基因组范围内的NLP转录因子家族成员进行鉴定。经过严格筛选与确认后,对搜索结果进一步展开分析,主要分为3部分,包括NLP蛋白分析、NLP分析与苹果NLP表达分析,其中ProtParam、Clustal Omega、MEGA7、MEME 5.0.2、SOPMA、Phyre ²、WoLF PSORT、STRING等程序或软件用于蛋白质分析,基因分析使用MG2C、GSDS 2.0、PlantCARE、psRNATarget等在线工具,对于苹果NLP表达情况利用qRT-PCR进行定量检测。【结果】从苹果全部蛋白数据库中共筛选出6个NLP成员,系统进化分析可将它们分为I、II、III三类;蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋,占比最小的是β-转角;亚细胞定位预测均定位于细胞核中,符合转录因子的特征;染色体定位显示5个基因（MDP0000584547除外）定位于4条染色体上;启动子分析发现大量与激素和逆境响应相关的顺式作用元件,暗示它们可能参与到激素和逆境信号的调控过程中,此外还识别到一个响应氮的GCN4作用元件,进一步说明该类转录因子与氮素有密不可分的关系;通过定量检测揭示苹果NLP家族在茎、叶等组织高表达的特征模式,并且表达分析结果也证实苹果NLP响应氮饥饿、干旱胁迫等。【结论】通过对苹果全基因组的分析,共识别6个NLP转录因子,对6个基因的结构与蛋白保守域分析,发现它们之间具有极高的相似性、保守性,同时又存在差异。类比拟南芥NLP蛋白的关联网络,推测与拟南芥NLP7同源性最高的MDP0000132856可能也具有复杂的功能。

柱状苹果Co基因的筛选与候选基因分析

白团辉,李莉,郑先波,王苗苗,宋尚伟,焦健,宋春晖

中国农业科学. 2019, 52(23): 4350-4363. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.015

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【目的】柱状苹果是一种特殊的矮生突变类型,其节间短、短枝多、侧生分枝少、主干粗壮直立,是苹果实行矮化密植栽培的重要资源。本研究在前期Co精细定位的基础上,对定位区间的基因进行筛选,为阐明柱状苹果形成的分子机制和选育柱状苹果新品种奠定基础。【方法】以柱状苹果‘舞佳’和‘润太一号’,普通型苹果‘富士’和‘华硕’的芽、茎尖和叶片为试材,根据最新的苹果基因组以及与柱状相关的转录组信息,对Co精细定位区间27.66—29.05 Mb的基因进行注释分类,选择目标基因,查找其CDS序列,使用RT-PCR技术检测引物特异性,利用实时荧光定量PCR分析预测基因在不同组织器官中的表达特征,筛选出差异基因并将其作为候选基因。【结果】在苹果第10号染色体27.66—29.05 Mb区域内包含67个基因,其中12个为非编码RNA（ncRNA）,其余为编码蛋白质的基因。根据RNA-seq分析,柱状和普通型苹果基因相对表达差异倍数在1倍以上的有25个基因,其中13个基因在柱状苹果中上调表达,12个基因在柱状苹果中下调表达。在预测的14个基因中,发现4个基因MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500在柱状和普通型苹果的主枝茎尖或侧枝茎尖中相对表达存在显著差异。其中,MD10G1184100和MD10G1185600在两个柱状苹果主枝茎尖中的相对表达量均显著高于两个普通型苹果。MD10G1185400和MD10G1190500在两个柱状苹果侧枝茎尖的表达量显著高于两个普通型苹果,而MD10G1184100在两个柱状苹果中的表达量显著低于普通型苹果。进一步对这4个候选基因进行不同组织或器官的基因表达特征进行分析,发现基因MD10G1184100在柱状苹果根部的表达显著高于其他部位,MD10G1185400和MD10G1185600在柱状苹果的侧枝茎尖中显著高表达,而MD10G1190500在柱状苹果的顶芽中显著高表达。【结论】在柱状和普通型苹果茎尖中筛选到4个表达显著差异的基因,可作为Co候选基因,为该基因的克隆和功能验证及苹果树树型定向遗传改良奠定了基础。

苹果U6启动子的克隆及功能分析

卞书迅,韩晓蕾,袁高鹏,张利义,田义,张彩霞,丛佩华

中国农业科学. 2019, 52(23): 4364-4373. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.016

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【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA（E-value<3e ^-40）,分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。

苹果乙烯响应因子MdERF72对非生物胁迫的响应

王佳慧,顾凯迪,王楚堃,由春香,胡大刚,郝玉金

中国农业科学. 2019, 52(23): 4374-4385. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.017

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【目的】乙烯响应因子（ethylene response factor,ERF）是植物特有的一类转录因子,参与植物根系形成、下胚轴伸长、果实成熟、器官衰老等生长发育过程,在调节植物生物和非生物胁迫反应及果实品质过程中发挥着至关重要的作用。克隆苹果乙烯响应因子MdERF72,通过表达分析和转基因功能分析,研究其在抵御非生物胁迫过程中的功能,为探索MdERF72在植物生长发育过程中的功能提供理论依据。【方法】以‘王林’苹果（Malus×domestica Borkh.）愈伤组织为试材,利用RT-PCR技术克隆MdERF72,利用生物信息学方法分析其编码氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等,并利用MEGA5.0构建系统进化树,与拟南芥ERF-B2亚家族进行蛋白序列同源性分析;利用实时荧光定量PCR技术探明其在苹果组织中的表达和果实发育时期的时空表达特征;同时利用实时荧光定量PCR技术检测‘嘎拉’苹果组培苗中MdERF72对ACC、NaCl以及低温的响应;构建基因的过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得稳定遗传的过表达苹果愈伤组织;检测NaCl以及低温处理后,野生型和转基因苹果愈伤组织的鲜重、丙二醛含量、电导率、过氧化氢含量以及超氧阴离子含量的差异。【结果】MdERF72位于苹果第13号染色体上,该基因存在1个ERF家族特有的AP2/ERF结构域。进化树分析结果显示,MdERF72与拟南芥AtERF72序列同源性较高,都属于ERFs家族的B2亚家族。氨基酸理化性质分析表明,MdERF72编码253个氨基酸,预测其蛋白质分子量为27.61 kD,等电点（pI）为5.10。另外,亲疏水预测结果显示MdERF72疏水部分大于亲水部分,表明其属于疏水性蛋白。磷酸化位点分析显示,MdERF72只有苏氨酸磷酸化位点,表明该蛋白可能受到磷酸化作用的调控。MdERF72启动子序列中含有与茉莉酸（JA）、生长素及干旱信号相关的顺式作用元件。MdERF72是乙烯正调控转录因子,在苹果的各组织中均有表达,在果实和茎中表达量相对较高;并且在果实中随着果实的成熟,表达量逐渐升高。苹果组培苗中MdERF72的表达明显受到高盐和低温的诱导。过量表达MdERF72的苹果愈伤组织在高盐和低温胁迫处理下,生长势明显比野生型对照强,电导率,丙二醛、过氧化氢、超氧阴离子的含量都低于野生型,表明MdERF72提高了对盐和低温胁迫的抗性。【结论】MdERF72在响应高盐、低温胁迫过程中发挥着重要的正调控作用,过表达MdERF72可以提高苹果愈伤组织对高盐和低温胁迫的抗性。

加快推进我国水禽疫病防控技术的研究

刘月焕

中国农业科学. 2019, 52(23): 4386-4389. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.018

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UL56基因下游3513bp对鸭肠炎病毒生物特性的影响

毛娅卿,张兵,王团结,侯力丹,黄小洁,刘丹,赵俊杰,李启红,王乐元,李俊平,杨承槐

中国农业科学. 2019, 52(23): 4390-4397. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.019

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【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率,已报道了多株DEV的全基因组序列,DEV基因组大,长度约158—162 kb。与疫苗株相比,DEV疫苗检验用参考强毒株基因组UL区5′端连续插入3 513 bp（2 716—6 228位核苷酸）导致UL56基因移框突变。目前关于DEV基因功能、致病机理等报道较少。本研究通过构建了重组病毒,以研究连续3 513 bp插入对DEV生物特性的影响;【方法】以提取的DEV基因组DNA为模板,分别扩增UL56基因上下游两端同源臂UL56-u、UL56-d。将两同源臂片段克隆到pMD18T-Simple载体,获得重组质粒pT-UL56ud。将重组质粒pT-UL56ud用MluI酶切,电泳回收去磷酸化后,将红色荧光蛋白（RFP）表达盒插入到pT-UL56ud中,获得重组质粒pT-UL56-RFP。DEV接种鸭胚成纤维细胞（DEF）（MOI=0.1）,吸附1—2 h后,按Lipofectamine 2000说明书转染高纯质粒pT-UL56-RFP,通过同源重组的方法,以红色荧光蛋白（RFP）基因为报告基因,构建了缺失DEV UL56下游3 513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。将重组病毒及其亲本病毒分别接种25 cm ²的细胞瓶中（MOI=0.01）,测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;将重组病毒及其亲本病毒分别作适当稀释,接种已长成单层DEF,加入M199营养琼脂糖覆盖,培养5—7 d,随机选取20个蚀斑,测量蚀斑面积;将重组病毒、回复株及其亲本病毒分别以10 ^5.0TCID₅₀肌肉注射6周龄易感麻鸭进行致病性试验,观察10 d,每天记录发病死亡情况。试验结束后剖检所有存活鸭。对全部动物取肝脏组织,固定于4%多聚甲醛溶液,按常规程序制备病理切片并进行H.E染色;将重组病毒及鸭瘟商品化活疫苗株（CVCC AV1222）分别以10 ^3.0TCID₅₀肌肉注射6周龄易感麻鸭进行免疫原性试验,在免疫后14 d,腿部肌肉注射接种DEV强毒（CVCC AV1221）,每只10 ^3.0MLD。观察10 d,每天记录发病死亡情况。【结果】通过同源重组的方法,获得携带RFP的重组病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3 513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。重组病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其亲本毒均在接种DEF后72 h,病毒含量达到峰值（10 ^6.2-6.5TCID₅₀/0.1 mL）,病毒含量无明显差异;均能在DEF细胞中形成清晰蚀斑,大小无明显差异;DEVΔ3513对6周龄易感麻鸭毒力明显减弱,未出现任何临床症状和死亡;DEVΔ3513以10 ^3.0TCID₅₀/只免疫麻鸭,能抵抗DEV强毒株的攻击;【结论】成功构建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重组病毒,首次证实UL56基因下游3 513 bp对DEV在细胞中的复制是非必需的;缺失UL56基因下游3 513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性;UL56基因下游3 513 bp是DEV的一个毒力决定因子。

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

孙莹,张兵,李岭,黄小洁,侯力丹,刘丹,李启红,李俊平,王乐元,李慧姣,杨承槐

中国农业科学. 2019, 52(23): 4398-4405. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.020

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【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

4株鸭坦布苏病毒的毒力、E基因序列和抗原差异性

杨志远,段会娟,王小蕾,刘立新,赵际成,潘洁,刘月焕,林健

中国农业科学. 2019, 52(23): 4406-4414. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.021

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【目的】比较鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus, DTMUV）分离株的毒力、分析E蛋白基因序列、研究抗原差异性,为鸭坦布苏病防控提供依据。【方法】将DTMUV-HB(2011)、DTMUV-AH(2014)、DTMUV-GX1(2012)、DTMUV-GX2(2015) 4株病毒接种10日龄易感鸭胚进行增殖,并利用6日龄SPF鸡胚测定ELD₅₀。根据测定的病毒含量,将分离毒株稀释为100ELD₅₀/0.5mL,人工感染40只180日龄健康北京鸭,进行临床症状观察、病毒分离、大体剖检,分析分离毒株的毒力有无差异。提取8株DTMUV分离病毒株的RNA,通过RT-PCR扩增E基因,分析比较不同地区的DTMUV的E基因核苷酸和氨基酸序列相似性,构建进化树。利用实验室建立的鸭坦布苏病毒血凝抑制试验分别测定4株病毒阳性血清对4株病毒的HI效价。同时采用固定病毒稀释血清法,利用C6/36细胞测定4株病毒阳性血清对4株DTMUV的血清中和效价。通过交叉血凝抑制试验和血清交叉中和试验比较4株病毒的抗原差异性（R值）。【结果】 (1)各毒株的病毒含量范围在10 ^4.7—10 ^5.3 ELD₅₀/0.1mL。人工感染鸭试验,攻毒后3 d鸭采食量和产蛋量均显著下降,各组病毒分离阳性率均在85%以上,剖检病变主要表现为卵泡变形、出血。(2)分离株序列分析结果表明,核苷酸序列相似性为95.7%—100%,推导氨基酸序列相似性在98.2%以上。遗传进化分析表明共同构成了一个进化分支。(3)4株病毒及其阳性血清进行血凝抑制交叉试验,计算的抗原性差异R值在0.79—1.12之间;进行细胞中和交叉试验,计算的R值在0.79—1.20之间。【结论】分离的4株DTMUV在毒力、E蛋白基因和抗原性上未见显著差异。

鸭坦布苏病毒的血凝性

王小蕾, 刘月焕, 段会娟, 刘立新, 杨志远, 赵际成, 潘洁, 刘瑞华, 赵文奇, 田方杰, 吕金宝, 林健

中国农业科学. 2019, 52(23): 4415-4422. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.022

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【目的】研究鸭坦布苏病毒是否具有血凝性,确定其凝集的红细胞种类和血凝反应条件。【方法】鸭坦布苏病毒以不同稀释度经脑内途径接种1—3日龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况;收集发病乳鼠鼠脑,参照文献记载的方法用蔗糖-丙酮提纯病毒液;以适当灭活剂灭活病毒,观察灭活后的病毒液性状,并以6日龄SPF鸡胚进行灭活检验;参照文献记载的方法初步测定病毒液与鸡、鸭、鹅、鸽、猪红细胞悬液的反应性;比较并确定鸭坦布苏病毒进行血凝反应的适宜红细胞悬液浓度;比较pH6.0—7.0的反应体系对病毒血凝效价的影响;比较4℃、室温和37℃对病毒血凝反应结果的影响。【结果】乳鼠接种鸭坦布苏病毒后6日,1﹕10稀释接种组的乳鼠出现严重的临床症状,表现为四肢抽搐,瘫痪等。大部分乳鼠处于濒死状态,1﹕50和1﹕100稀释接种组的乳鼠症状稍轻于1﹕10稀释接种组乳鼠的症状;提纯后鸭坦布苏病毒液呈淡红色澄明液体,用甲醛灭活后病毒液性状无明显改变,但用β-丙内酯后产生大量絮状沉淀,性状发生明显改变;病毒液可以凝集鸡、鸭、鹅、鸽、猪红细胞悬液;不同浓度红细胞悬液的比较结果显示,病毒液与0.33%的红细胞悬液作用时凝集图形清晰稳定;通过不同pH反应体系的比较,发现病毒液在pH 6.0—6.8时均可发生血凝反应,当pH为6.0—6.2时凝集效价最高;通过不同反应温度的比较,证实病毒液在4℃、室温和37℃时均具有血凝性,但4℃时的血凝反应时间明显延长。【结论】乳鼠增殖的鸭坦布苏病毒提纯后具有广谱的血凝性,可以凝集鸡、鸭、鹅、鸽和猪的红细胞,血凝性稳定,在4℃、室温和37℃下均可以与鹅红细胞凝集,以0.33%浓度的红细胞悬液血凝为宜,反应最适pH为6.0—6.2。

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗血清学试验与免疫攻毒保护试验的相关性

王小蕾,林健,杨志远,刘立新,段会娟,程慧敏,赵际成,潘洁,刘月焕

中国农业科学. 2019, 52(23): 4423-4428. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.023

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【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗2种效力评价方法平行关系,为采用血清学检验技术替代鸭坦布苏病毒病灭活疫苗本动物攻毒效力检验奠定基础。【方法】3批疫苗实验室制品分别以0.15、0.3、0.5、1.0 mL经肌肉注射途径免疫51日龄青年鸭和260日龄产蛋鸭,首次免疫后14 d,按相同的剂量和途径进行二次免疫。二免后28日采血,分离血清并测定血清的HI抗体效价,根据抗体效价对试验鸭分组,并分别经肌肉注射途径接种0.5 mL（100 DID₅₀）的鸭坦布苏病毒。攻毒后2 d采血,分离病毒,产蛋鸭攻毒后8 d剖检,观察卵巢病变。比较和分析HI抗体效价和攻毒保护结果的相关性。【结果】免疫青年鸭HI抗体效价≤1﹕5、1﹕10、1﹕20、1﹕40、1﹕80、1﹕160、1﹕320、1﹕640组保护率分别为50%（20/40）、43.8%（7/16）、74.3%（26/35）、86.7%（26/30）、96.6%（57/59）、92.7%（51/55）、95%（38/40）和100%（11/11）,HI抗体效价低于1﹕20时攻毒保护率为48.2%,效价1﹕20时攻毒保护率为74.3%,效价1﹕40及以上时攻毒保护率达93.8%。免疫产蛋鸭HI抗体效价≤1﹕5、1﹕20、1﹕40和1﹕80组保护率分别为66.7%（12/18）、83.3%（10/12）、95.2%（20/21）和100%（15/15）;HI抗体效价1﹕10、1﹕160、1﹕320和1﹕640组保护比例分别为2/3、7/7、1/1和2/2;HI抗体效价为1﹕10及以下时攻毒保护率为66.7%,效价1﹕20时攻毒保护率为83.3%,效价1﹕40及以上时攻毒保护率达97.8%。青年鸭和产蛋鸭的HI抗体效价与攻毒保护率之间均有极显著的正相关性,Spearman相关系数分别为0.905（P<0.01）和0.932（P<0.01）。【结论】鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）免疫后HI抗体与攻毒保护率存在正相关,可替代免疫攻毒法用于鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的效力评价,初步将HI抗体效价1﹕20定为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗免疫后产生抗体保护的标准。

鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白原核表达及多克隆抗体制备

毕可然,李银,韩凯凯,赵冬敏,刘青涛,刘宇卓,黄欣梅,杨婧

中国农业科学. 2019, 52(23): 4429-4436. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.024

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【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白（oligoadenylate synthase-like protein,OASL）基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该融合蛋白的特异性抗体,为进一步明确鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白抑制病毒复制分子机制提供物质基础。【方法】根据前期研究已经获得的鸭OASL基因开放阅读框（open reading frame,ORF）序列设计全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取健康樱桃谷鸭幼鸭脾脏总RNA;通过RT-PCR,利用随机引物和M-MLV反转录酶扩增获得鸭脾脏cDNA,以cDNA为模板,利用设计合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物进行PCR扩增,扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后将片段大小与目的条带大小相同的PCR产物切胶纯化,纯化后的产物克隆到pEASY-T1载体,挑取单克隆菌落送基因公司测序,测序验证正确的PCR纯化产物通过限制性内切酶BamH I和Xho I酶切连接至带GST标签的原核表达载体pGEX-4t-1。重组质粒转化到大肠杆菌BL21（PLYSS） ^TM,经终浓度为0.5 mmol·L ^-1的IPTG诱导表达4 h后检测该融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表达。利用GST柱亲和纯化上清中的可溶性融合蛋白,经20 mmol·L ^-1Tris-HCL和0.10 mol·L ^-1NaCL溶液透析后获取纯化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白。采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔,经3次免疫后制备多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和间接免疫荧光检测抗体的纯度和效价。【结果】克隆测序结果表明,设计合成的鸭OASL基因全长扩增引物pGEX-OAS-F 和 pGEX-OAS-R能够从樱桃谷鸭脾脏中获得鸭OASL基因ORF序列,并且序列组成与前期研究结果一致。被扩增的序列经酶切后,鸭OASL基因能够与pGEX-4t-1载体成功连接,IPTG诱导后可以在大肠杆菌BL21（PLYSS） ^TM中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,融合蛋白大小约为84 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。经GST亲和层析纯化上清中的可溶性鸭OASL融合蛋白,得到0.5 mmol·L ^-1纯度抗原蛋白。经3轮免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,纯化后ELISA结果显示鸭OASL蛋白抗体具有较好的灵敏度,最高效价为1:512 000,SDS-PAGE结果显示抗体大小为55 kD,与ORF理论值相同,且抗体纯度为90%以上。【结论】设计合成的引物能够成功地获得鸭脾脏OASL基因ORF序列,该ORF能够在原核细胞中成功表达,表达的融合蛋白通过免疫新西兰兔能够获得高纯度和高效价的鸭OASL多克隆抗体,研究成果为后续深入研究鸭OASL蛋白抑制病毒复制分子机制奠定坚实的物质基础。

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