中国农业科学

2023年第56卷第24期中英文目录

中国农业科学. 2023, 56(24): 0.

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PPR蛋白响应植物非生物胁迫的研究进展

李程, 路凯, 王才林, 张亚东

中国农业科学. 2023, 56(24): 4801-4813. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.001

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非生物胁迫是造成全球粮食减产的主要因素之一。研究植物逆境相关蛋白的功能及应答机制，对于提高作物抗逆性具有重要意义。三角状五肽重复（PPR）蛋白属于高等植物中最大的核编码蛋白家族，因其包含高度特异性的PPR基序而得名。依据基序类型及其排列，PPR蛋白可分为P和PLS两类，PLS类蛋白又可以根据其羧基末端的结构域进一步分为PLS、E、E+、DYW等亚类。PPR蛋白广泛分布于陆生植物中，主要定位于叶绿体和线粒体，亦有少数定位于细胞核中。作为序列特异性RNA结合蛋白，PPR蛋白参与植物RNA加工的多个方面，包括RNA编辑、RNA剪接、RNA稳定和RNA翻译。PPR蛋白在植物的整个生命进程中发挥多种重要作用，但对其在植物抗逆性中的作用机制还不清楚。本文在总结已有报道的非生物胁迫相关PPR蛋白定位和功能的基础上，重点综述了PPR蛋白参与调控植物非生物胁迫的作用机制（包括转录后调控和逆行信号），并对其进行讨论。转录后调控与PPR蛋白参与RNA转录后的修饰作用有关，其一般被认为通过结合RNA并调节细胞器RNA代谢来调控逆境相关基因的表达，从而影响植物抗逆性。逆行信号方面，PPR蛋白的损伤导致线粒体或叶绿体功能受损，然后产生各类逆行信号（如ROS），进而调控相关基因表达，抵御逆境。然而，由于质体中的逆行信号会受到许多环境因素的影响，这些因素部分还未明确，导致PPR蛋白在逆行信号中的作用机制仍有很多问题有待阐明。此外，PPR蛋白存在一因多效性，部分蛋白在作用于抗逆性的同时，还会对植物的生长和生殖产生重要影响。最后，本文阐述了利用PPR蛋白作为RNA编辑工具的研究现状，探讨了目前PPR蛋白响应植物非生物胁迫方面尚待解决的问题及研究前景，提出了未来研究仍需关注的重点和难点，为深入研究PPR蛋白的功能和作物非生物胁迫抗性育种提供参考。

小麦穗长QTL鉴定及其遗传分析

姚琦馥, 周界光, 王健, 陈黄鑫, 杨瑶瑶, 刘倩, 闫磊, 王瑛, 周景忠, 崔凤娟, 蒋云, 马建

中国农业科学. 2023, 56(24): 4814-4825. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.002

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【目的】穗长在决定小麦穗的构造和产量潜力方面具有重要作用。挖掘具有育种利用价值的小麦穗长数量性状位点（quantitative trait loci，QTL），并解析其遗传效应，为分子标记辅助育种提供理论依据。【方法】以自然突变体msf和川农16构建的198份F₆代重组自交系（recombinant inbred lines，RIL）群体（MC群体）作为研究材料，于2020—2021和2021—2022年生长季，在四川温江区、崇州市和雅安市（2021WJ、2022WJ、2021CZ、2022CZ和2021YA）进行试验，对5个环境下的穗长进行表型鉴定。利用基于16K SNP芯片构建的高质量遗传连锁图谱对穗长性状位点进行定位。另外，根据穗长主效QTL侧翼标记的基因型分析主效位点对产量相关性状的遗传效应，从而评估其对产量提升的潜力。【结果】共鉴定到14个控制穗长发育的QTL，主要分布在1A（1个）、1B（1个）、2B（1个）、3D（3个）、4A（1个）、4D（2个）、5A（1个）、5B（1个）、7A（1个）、7B（1个）和7D（1个）染色体。其中，QSl.sau.1A在4个环境及最佳线性无偏预测（best linear unbiased prediction，BLUP）值中被检测到，可解释6.46%—20.12%的表型变异率，定位于1A染色体侧翼标记1A_1208254—1A_10060497间，被视为主效QTL。QSl.sau.1A的正效应位点来源于亲本msf。在多环境QTL分析结果中也检测到QSl.sau.1A，表明其受环境影响较小，为主效且稳定表达的QTL。QSl.sau.1A的效应在2个具有不同遗传背景的验证群体中得到进一步验证。除旗叶长无显著变化以外，携带QSl.sau.1A正效应位点株系的每穗籽粒数（12.68%）、每穗粒重（14.99%）、千粒重（5.79%）、旗叶宽（2.94%）和小穗数（1.48%）显著增加，花期（0.61%）显著提前，而株高（-6.47%）和有效分蘖数（-36.11%）显著减少。【结论】在1A染色体定位到1个主效且稳定的穗长位点。QSl.sau.1A正效应位点显著提高穗粒数、穗粒重、千粒重和小穗数，具有一定的育种价值。

不同抗旱性春小麦根系生长对干旱胁迫的响应及滴灌复水补偿效应

王荣荣, 陈天鹏, 尹豪杰, 蒋桂英

中国农业科学. 2023, 56(24): 4826-4841. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.003

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【目的】研究不同干旱敏感型春小麦根系生长对阶段干旱胁迫的形态及生理响应差异，阐明新疆滴灌条件下春小麦的抗旱节水生理机制，为新疆麦区进一步节水高产提供科学依据。【方法】2021—2022年采用土柱栽培法，以强抗旱性品种新春6号和弱抗旱性品种新春22号为材料，分蘖和拔节期分别设置轻度（T1和T3，60%—65% FC，FC为田间持水量）、中度（T2和T4，45%—50% FC）干旱胁迫处理后滴灌复水，以常规滴灌为对照（CK，75%—80% FC），研究生育前期干旱胁迫下根系形态特征（根长密度（RLD）、根体积密度（RVD））、抗氧化系统（丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD））、渗透物质（脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS））及根系活力的时空变化特征，分析滴灌春小麦根系生长对干旱-复水的补偿效应。【结果】随干旱胁迫程度增加，根长密度和根体积密度呈先增后降的变化趋势，轻度干旱（T1和T3）条件下，显著增加了20—60 cm土层的根长密度和根体积密度。各土层根系丙二醛含量随着胁迫程度的加剧呈上升趋势，而SOD、POD、脯氨酸及可溶性糖均随干旱程度加剧呈先升后降趋势，并随土层加深逐渐增大。T1处理复水后，根系形态特征、抗氧化酶活性、渗透物质、根系活力均达到最大值，进而提高产量，较其余处理增加2.77%—19.58%。逐步回归分析表明，根体积密度和可溶性糖是决定产量的重要因素，根长密度、SOD和可溶性糖是对新春6号抗旱性影响较为显著的指标，根长密度、丙二醛含量以及POD是对新春22号抗旱性影响较为显著的指标。【结论】春小麦在分蘖和拔节期维持60%—65%田间持水量，滴灌复水后会增加根系在20—60 cm土层的分配比例，提高根系清除活性氧及渗透调节能力，延缓根系衰老，改善根系生理特性，进而提高产量。

不同类型地膜对花生生长及根际细菌群落影响的比较分析

于天一, 杨吉顺, 吴正锋, 张智猛, 沈浦, 郑永美, 李尚霞, 吴菊香, 孙棋棋, 吴月

中国农业科学. 2023, 56(24): 4842-4853. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.004

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【目的】表征不同类型地膜对花生根际细菌群落和花生生长及产量的影响，探讨根际细菌群落与花生生长和产量间的相互关系，为进一步提高花生产量提供理论依据。【方法】设置4个处理并进行9年定位试验，包括露天对照处理（LU）、黑膜处理（HEI）、降解膜处理（JI）和普通膜处理（PU）。以2022年开花期和成熟期花生根际土壤为研究对象，借助Illumina MiSeq PE300 测序平台，以16S rRNA基因为靶标，研究不同类型地膜对根际细菌群落结构和功能、花生生长和产量的影响。【结果】与对照相比，黑膜、降解膜和普通膜处理中花生产量分别提高-0.45%—2.34%、2.44%—14.36%和6.14%—24.69%。在开花期和成熟期，黑膜处理共改变了6种纲和属水平的根际细菌群落相对丰度，但相关性分析结果表明这些细菌群落与花生生长和产量无关；降解膜处理共改变了6种纲和属水平的根际细菌群落相对丰度，其中1纲（Blastocatellia）细菌群落与花生产量呈正相关；普通膜处理共改变了12种纲和属水平根际细菌群落的相对丰度，其中1纲（Acidobacteriae）和1属（Ellin6067）细菌群落与花生主茎高和侧枝数相关，1纲（Clostridia）和2属（Pseudomonas、Ellin6067）细菌群落与花生产量相关。根际细菌群落的功能预测结果显示，黑膜处理在开花期和成熟期降低了与氮代谢相关的氮呼吸和硝酸盐呼吸功能；降解膜处理在开花期降低了硝酸盐还原、氮呼吸和硝酸盐呼吸功能，在成熟期对氮代谢功能无显著影响；普通膜处理在开花期降低了需氧氨氧化和硝酸盐呼吸功能，在成熟期提高了这两种氮代谢功能。【结论】黑膜对花生产量和根际细菌群落影响不显著；降解膜具备改善成熟期根际细菌群落结构和增产的能力，但增产效果不稳定；普通膜的增产和改善根际细菌群落结构和功能的效果优于降解膜。

氧酰基载体蛋白还原酶基因FgOAR1对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响

宫安东, 雷银玉, 吴楠楠, 刘景榕, 宋梦鸽, 张艺美, 杨光, 杨鹏

中国农业科学. 2023, 56(24): 4854-4865. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.005

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【背景】禾谷镰孢（Fusarium graminearum）是引起小麦赤霉病（Fusarium head blight）的主要病原真菌，侵染后导致作物品质和产量下降，同时产生多种真菌毒素，严重危害粮食生产和人类健康。氧酰基载体蛋白还原酶（3-oxoacyl ACP reductase，OAR1）催化羧酰基载体蛋白还原成氧酰基载体蛋白，在脂肪酸的生物合成过程中具有重要作用。【目的】构建FgOAR1基因缺失突变体，研究其表型、显微结构、孢子产量、有性生殖和致病力等的变化，探究FgOAR1的生物学功能，揭示其对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响，为新型抑菌作用靶点的筛选及小麦赤霉病的防控提供科学依据。【方法】以禾谷镰孢野生型菌株PH-1为材料，应用Split-Marker基因敲除技术，构建FgOAR1基因缺失突变体（ΔFgOAR1），Gap-repair技术获得缺失基因的回补突变体（ΔFgOAR1-C）；将PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株分别接种到常规培养基，观察菌落表型变化并测定脂肪酸含量差异；接种到含刚果红（Congo-Red）、SDS、NaCl和H₂O₂的压力筛选培养基中，观察菌丝在压力培养条件下的生长状况；接种CMC培养基，比较分生孢子产量差异；接种胡萝卜培养基，观察有性生殖及孢子性状；分别进行小麦胚芽鞘和穗部接种，统计发病率和毒素产量，比较突变体与野生型菌株的致病力差异。【结果】与野生型PH-1菌株相比，在PDA、YEG和CM培养基中ΔFgOAR1突变体未呈现明显表型变化，在0.7 mol·L^-1 NaCl、0.03% H₂O₂、0.01% SDS和300 μg·mL^-1 Congo-Red等压力培养条件下，突变体菌落直径显著低于野生型PH-1，表明FgOAR1与禾谷镰孢细胞膜和细胞壁的合成相关；ΔFgOAR1突变体在液体培养基中的分生孢子产量（8.1×10⁵个/mL）显著低于PH-1（1.26×10⁶个/mL），接种小麦胚芽鞘和麦穗后，ΔFgOAR1突变体的致病力显著低于野生型菌株PH-1。【结论】禾谷镰孢中FgOAR1参与脂肪酸的生物合成，对细胞膜合成具有重要作用，该基因缺失导致突变体抗逆性降低，分生孢子产量下降，且致病力显著降低，FgOAR1对禾谷镰孢的生长、发育和致病具有重要作用。

环境胁迫对锈赤扁谷盗呼吸速率及线粒体编码基因表达水平的影响

陈二虎, 袁国庆, 孙晟源, 唐培安

中国农业科学. 2023, 56(24): 4866-4879. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.006

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【背景】线粒体是生物体内一种重要细胞器，是细胞消耗氧和产生能量物质三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，在生物体抵抗逆境过程中发挥重要作用。锈赤扁谷盗（Cryptolestes ferrugineus）是一种世界性储粮害虫，具有极强的环境适应性。【目的】分析锈赤扁谷盗呼吸速率及线粒体编码基因对不同环境胁迫的响应，探究线粒体在锈赤扁谷盗抗逆境胁迫中的应激反应。【方法】根据锈赤扁谷盗线粒体基因组数据鉴定获得线粒体编码基因，并设计相应实时荧光定量PCR（RT-qPCR）引物。通过生物测定方法得出锈赤扁谷盗对熏蒸剂（甲酸乙酯）、植物源杀虫剂（鱼藤酮）和储粮保护剂（阿维菌素）的毒力回归方程及LC₃₀，并用该浓度对试虫进行后续药剂胁迫处理。利用RT-qPCR技术解析锈赤扁谷盗线粒体编码基因的时空（不同发育阶段和幼虫不同组织）表达模式。最后，使用CO₂检测仪和RT-qPCR技术研究锈赤扁谷盗在高温（35和40 ℃）、甲酸乙酯、鱼藤酮、阿维菌素、饥饿等逆境胁迫下呼吸速率的变化以及线粒体编码基因的表达模式。【结果】共设计12个线粒体编码基因（除nad6）的定量引物。RT-qPCR结果显示这些线粒体编码基因在3龄幼虫阶段均具有较高表达水平，且线粒体基因在3龄幼虫马氏管中特异性高表达。此外，高温胁迫下锈赤扁谷盗呼吸速率呈现显著上升趋势，线粒体编码基因nad2、cytb及cox2表达水平显著上升，而nad4、nad4L、cox3及atp6则呈现显著下调趋势。甲酸乙酯熏蒸胁迫下锈赤扁谷盗呼吸速率显著降低，12个线粒体编码基因均显著下调表达，其中nad4L和nad5的表达水平仅为对照组的3.48%和1.91%。鱼藤酮和阿维菌素胁迫下锈赤扁谷盗呼吸速率均显著降低，且除cox2外的线粒体编码基因表达量均显著下调。饥饿胁迫下锈赤扁谷盗呼吸速率显著降低，且随着胁迫时间增加，线粒体编码基因表达水平下调愈加显著。【结论】锈赤扁谷盗呼吸代谢速率以及线粒体编码基因表达水平在不同逆境条件下均发生显著变化，暗示线粒体在锈赤扁谷盗适应高温、药剂和饥饿胁迫过程中发挥重要作用。

旱地高产小麦品种籽粒氮含量与产量形成及氮磷钾吸收分配的关系

徐隽峰, 张学美, 杨珺, 郭子糠, 黄翠, 丁玉兰, 黄宁, 孙蕊卿, 田汇, 王朝辉, 石美

中国农业科学. 2023, 56(24): 4880-4894. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.007

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【目的】明确高产小麦品种间籽粒氮含量差异及其与产量形成和氮磷钾养分吸收、转移及分配的关系，为旱地高产高氮含量的优质小麦品种选育和小麦丰产优质绿色生产的养分管理提供依据。【方法】于2017—2022年，以14个产量相近、籽粒氮含量差异显著的高产小麦品种为供试材料，在陕西黄土高原旱地连续5年开展田间试验，研究小麦籽粒氮含量差异及其与产量、产量三要素和各器官氮磷钾养分含量的关系，并分析高产高籽粒氮含量小麦品种的生物量累积、产量构成和氮磷钾吸收、转移及分配对施肥的响应。【结果】小麦品种的籽粒氮含量与千粒重显著正相关，籽粒千粒重每增加1.0 g，籽粒氮含量增加0.3 g·kg^-1。高产小麦品种间籽粒氮含量差异显著，高氮品种籽粒含氮量平均为24.9 g·kg^-1，比低氮品种（21.5 g·kg^-1）高16%。高产高氮品种产量、生物量和穗数在施氮和施磷后增加幅度均高于低氮品种。高产高氮小麦品种籽粒含磷量和茎叶含钾量在不同施肥条件下均高于低氮品种，籽粒和地上部氮磷钾吸收量在施氮和施磷后增幅均高于低氮品种。高产高氮品种颖壳向籽粒转移氮的能力高于低氮品种，茎叶向籽粒和颖壳转移钾的能力却低于低氮品种，施氮后茎叶向籽粒和颖壳转移钾的能力大幅下降。施氮、磷和钾均有利于提高高产高氮小麦品种地上部向茎叶的钾素分配。【结论】高产小麦品种间籽粒氮含量存在显著差异，其中高籽粒氮含量品种的千粒重、籽粒含磷量和茎叶含钾量较高，茎叶向籽粒和颖壳转移钾的能力低，籽粒和地上部氮磷钾吸收量对施氮和施磷响应更敏感。因此，在高产的基础上，选育高籽粒氮含量的优质小麦品种，应关注高千粒重、磷向籽粒和钾素向茎叶转移分配能力强的材料，在生产中应注意磷钾与氮的协同供应，以提高小麦籽粒氮含量。

不同含油量油菜品种的养分吸收积累与利用效率特征

胡文诗, 李银水, 赵曼利, 张珊珊, 顾炽明, 代晶, 李小勇, 杨璐, 秦璐, 廖星

中国农业科学. 2023, 56(24): 4895-4905. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.008

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【目的】比较不同含油量油菜品种养分吸收累积动态变化，明确高含油量油菜对氮磷钾养分的需求及利用特征，为发挥油菜高产油潜能、提高养分利用效率提供理论依据。【方法】于2019—2021年通过田间和盆栽试验，分析高含油量油菜品种（中油杂19，简称Z19）和普通含油量对照品种（华油杂12，简称H12和华油杂62，简称H62）不同生育时期生物量、氮磷钾积累量的动态变化以及成熟期产油量、养分利用率的差异，探讨高含油量油菜品种养分需求特征。【结果】两年试验结果均表明Z19的籽粒产量显著低于H62（8.5%—20.4%），但与H12差异不大，而含油量显著高于H12和H62（10.1%—26.7%）。监测2020—2021生长季田间试验和盆栽试验中植株生物量和养分动态变化，结果表明不同生育时期Z19生物量均低于H62，在角果期前与H12没有显著差异，角果期和成熟期Z19生物量不同程度地高于H12。田间试验花期后和盆栽试验整个生育期Z19植株氮含量均低于H12和H62，钾含量在整个生育期内均不同程度高于H12和H62，磷含量没有一致性差异。不同生育时期Z19的氮积累量比H62低19.2%—29.0%，盆栽试验的Z19比H12低9.8%—13.1%；Z19的钾积累量与H62无显著差异，但除花期外比H12高7.4%—39.2%。Z19磷素积累量介于H62与H12之间，田间试验中显著高于H12，盆栽试验中显著低于H62。Z19的氮素生理利用效率及产油效率高于H12和H62，钾素生理利用效率低于H12和H62，但钾素产油效率没有显著差异，3个品种的磷素生理利用效率没有显著差异，而Z19的磷素产油效率显著高于H12。¹⁵N标记表明，花期前3个品种氮肥利用效率没有显著差异，花期开始Z19氮肥利用率低于H12和H62。【结论】高含油量油菜品种Z19的钾需求量较高，氮素生理利用效率较高且需求量相对较少，磷需求量及利用率无明显差异。在农业生产中，相对普遍油菜品种，高含油量油菜品种更要重视钾肥的施用，但可以适当调减氮肥用量。

枳PtMLP1启动子的克隆和表达分析

姚利晓, 苏娟, 郭兴茹, 李凤龙, 何永睿, 邹修平, 陈善春

中国农业科学. 2023, 56(24): 4906-4915. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.009

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【目的】基因工程是柑橘品种改良的一种重要手段。本研究基于枳根消减文库中主要乳胶蛋白基因PtMLP1片段，克隆根特异启动子序列，为研究外源基因在柑橘根组织的特异表达奠定基础。【方法】同源克隆PtMLP1及启动子序列。利用ExPASy、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线软件对PtMLP1编码蛋白的理化特征、二级结构和三级结构进行生物信息学分析，利用PlantCARE数据库对PtMLP1启动子的顺式作用元件进行预测。实时荧光定量PCR法对PtMLP1在不同树龄枳根和叶中的表达进行分析。构建PtMLP1启动子与GUS标记基因的融合载体，利用根癌农杆菌转化法转化枳上胚轴，GUS染色观察标记基因的表达部位。【结果】枳PtMLP1含2个外显子和1个内含子，开放阅读框长471 bp。PtMLP1蛋白由156个氨基酸组成，分子量17.63 kDa，等电点5.49，含Bet v I功能域。其二级结构含3个α-螺旋和7个β-折叠，三级结构包含一个保守疏水基结合位点和一个富含甘氨酸的回环结构。5′端1 666 bp的上游调控序列不仅有TATA-box、CAAT-box等启动子结构的核心元件，还具有多个根组织特异表达元件，以及TGACG-motif、P-box和ABRE等激素应答相关的顺式作用元件。3′端非翻译区具有加尾信号AATAAA。该基因在1月龄苗、6月龄苗、20年生成年枳根中的表达量分别是叶中的46.34、74.82、110.25倍。构建启动子的融合表达载体pBI121-ProPtMLP1::GUS，获得枳转基因植株。PtMLP1启动子驱动GUS在转基因枳幼苗根中特异表达，GUS在3个转基因枳株系的根中表达量分别为叶中表达量的124.78、11.53和7.76倍。【结论】获得柑橘主要乳胶蛋白PtMLP1及启动子序列，该启动子可驱动标记基因在柑橘根组织特异表达。

鼠茅草间作对茶园土壤及茶叶品质成分的影响

陈义勇, 黎健龙, 周波, 吴小敏, 崔莹莹, 冯少茂, 胡海涛, 唐劲驰

中国农业科学. 2023, 56(24): 4916-4929. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.010

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【目的】解析茶园间作鼠茅草对土壤营养成分、土壤微生物群落结构以及茶叶品质成分的影响，为鼠茅草间作改良茶树种植生态环境，提升茶叶品质提供数据支撑。【方法】以间作鼠茅草2年的茶园土壤和茶叶鲜叶为试验材料，清耕茶园为对照，对茶园表层土壤pH、有机质、矿质营养成分等进行测定；运用16S、ITS高通量测序技术分别对土壤细菌和真菌种群结构进行测定分析；茶叶品质成分采用Agilent-7890B气相色谱仪进行检测。【结果】在茶园间作鼠茅草2年后，茶园土壤pH提高0.29，土壤有机质含量增加16.46 g·kg^-1；另外，有效磷、速效钾、铵态氮、硝态氮等在鼠茅草间作的茶园土壤中有不同程度的增加，其中有效磷是清耕茶园的5.88倍。鼠茅草间作茶园土壤全氮含量高于清耕茶园，全磷、全钾、全钠含量均低于清耕茶园。有效锌、有效铁、有效铜和阳离子交换量在鼠茅草间作茶园土壤中的含量均高于清耕茶园。鼠茅草间作茶园土壤细菌数量增加，真菌数量减少。有机质分解相关放线菌门细菌和子囊菌门真菌在鼠茅草间作茶园土壤中的相对丰度增加。鼠茅草间作茶园与清耕茶园茶叶鲜叶中共鉴定出259个茶叶代谢物组分，其中20种代谢物的含量存在显著差异，差异代谢物主要包括糖类、脂肪酸类和儿茶素类等。鼠茅草间作茶园茶树叶片中麦白糖、甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、乳糖醇、半乳糖甘油及α-乳糖含量是清耕茶园的2倍以上；（9Z）-十八碳烯酸和（9Z,12Z,15Z）-十八碳三烯酸含量显著低于清耕茶园；(+)-没食子儿茶素、没食子儿茶酚、表儿茶素等4种儿茶素类代谢物在鼠茅草间作茶园茶叶中的含量也显著低于清耕茶园。【结论】茶园间作鼠茅草能有效缓解茶园土壤酸化，增加土壤有机质及矿质营养元素含量；土壤细菌和真菌数量及群落结构的变化能有效提升茶树对土壤营养成分的吸收和利用。土壤营养成分和微生物群落结构的改变对茶叶品质成分有重要影响。

加工工序对苦杏仁球蛋白免疫反应性及消化稳定性的影响

龙斐斐, 张清安, 张志华

中国农业科学. 2023, 56(24): 4930-4943. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.011

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【背景】近年来，过敏已经成为全球关注的健康问题，过敏人群数量持续上升。坚果是常见的过敏诱因之一，苦杏仁为常见的坚果，因其含有致敏的苦杏仁球蛋白（amandin），成为最易引起过敏的坚果之一，因此，脱敏已成为其研究热点。苦杏仁加工一般要经过去皮、脱苦和干制等工序，而在这些加工过程中，其致敏性是否会受到影响尚未见到相关报道。【目的】探究加工工序对苦杏仁致敏性的影响，并以苦杏仁致敏性、品质和营养特性为评价指标，优化加工工序使苦杏仁产品致敏性最低，为低致敏性苦杏仁产品加工提供理论依据和技术支撑。【方法】采用Western blotting和ELISA试验研究不同去皮、脱苦和干制方法对苦杏仁中amandin免疫反应性的影响；采用圆二色光谱、外源荧光光谱、表面疏水性和zeta电位测定以研究各加工工序对amandin结构和表面性质的影响，分析致敏蛋白免疫反应性变化的机理；最后采用体外模拟消化试验探究加工前后苦杏仁中amandin的消化稳定性，并对消化产物进行Western blotting分析，进一步探究苦杏仁潜在致敏性的变化情况。【结果】就致敏性而言，苦杏仁经饱和热空气去皮和热烫去皮后的amandin免疫反应性分别降低了8.41%和13.15%，再经超声快速脱苦后amandin的免疫反应性又降低6.79%，热水脱苦对其免疫反应性无显著影响；脱苦杏仁经自然干燥和热风干燥后amandin的免疫反应性分别显著上升4.58%和2.81%（P<0.05）。结合加工工序对苦杏仁品质和营养特性的影响，最终优化得到低致敏性苦杏仁的加工工序为饱和热空气去皮、超声快速脱苦和热风干制，经此工序加工后苦杏仁免疫反应性降低15.03%。就致敏蛋白结构而言，致敏蛋白的二级结构组成、三级结构、表面疏水性以及zeta电位在加工过程中都发生了一定程度变化，其中超声快速脱苦显著改变了amandin的三级结构并使其表面疏水性显著增强（P<0.05），从而使其免疫反应性降低最显著。就消化稳定性而言，加工后的amandin消化稳定性明显降低，致敏蛋白中与特异性抗原抗体反应相关结构降解速度加快，导致苦杏仁的潜在致敏性进一步降低。【结论】不同加工工序处理可通过改变amandin的结构而对苦杏仁致敏性产生影响，生产中可以通过合理的加工方式来降低苦杏仁的致敏性。

Lnc721靶向调控MMP9对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

郭云鹏, 谭皓云, 郭宏, 符梦云, 李新, 胡德宝, 张林林, 丁向彬, 郭益文

中国农业科学. 2023, 56(24): 4944-4955. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.012

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【背景】肌肉系统是维持动物体生存生长的重要基础，在哺乳动物肌肉中，将近一半的肌肉为骨骼肌，骨骼肌通过细胞繁育增殖到迁移融合，逐步形成了具有收缩能力的附着在骨骼上的成熟肌束。在机体内，骨骼肌不仅参与动物生长，也参与呼吸、代谢等生理活动。目前许多研究表明，lncRNA具有调控肌肉生长发育的作用，是影响骨骼肌功能、疾病的关键因子。但由于lncRNA作用机制复杂，方式多样，在物种间保守型很低，故不同种属动物 lncRNA之间作用关系不大，且大多数研究存在于人和小鼠等生物体内，而对牛肌肉生长影响的研究内容极少。近年来，人们发现lncRNA会与某些靶基因相互作用，进而调控肌肉细胞的发生过程。【目的】在前期采集不同月龄不同组织部位的牛肌肉，进行高通量测序，获得高表达差异的lncRNA，在对其调控成肌过程进行机制研究的基础上，探究长链非编码RNA lnc721与其靶基因MMP9的互作关系，以及MMP9对牛骨骼肌细胞生长发育的影响，以期为牛骨骼肌发育调控机制的研究提供参考。【方法】前期试验发现干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有正调控作用，且对其分化具有负调控作用。为了进一步探究lnc721 对牛肌肉发育的调控通路。分别在牛骨骼肌卫星细胞的分化期设置了3 个干扰lnc721牛骨骼肌卫星细胞组，与3个对照组采用 NGS 技术进行转录组测序，以期获得lnc721 差异靶基因，进一步研究lnc721 对牛骨骼肌发育的调控通路。根据筛选结果以及qRT-PCR的验证结果，试验选取MMP9作为lnc721的靶基因，并通过CatRAPID网站对lnc721与MMP9结合能力进行预测。设计并合成lnc721及MMP9干扰序列，转染至牛骨骼肌卫星细胞中，通过qRT-PCR、Western blot技术在mRNA水平与蛋白质水平分析下调lnc721对MMP9表达情况的影响。并且通过下调MMP9，采用qRT-PCR、Western blot与EdU技术检测增殖标志因子Ki67、Pax7以及分化标志因子MyHC与MyOG的表达情况，以反映下调MMP9对牛骨骼肌卫星细胞生长发育的影响。【结果】CatRAPID结果显示，lnc721与MMP9结合倾向为0.75，共有9个结合位点，二者存在互作结合。干扰lnc721之后，采用qRT-PCR分析，结果表明在细胞增殖期下调lnc721可以极显著抑制MMP9表达（P<0.01），而在分化期则极显著促进MMP9的表达（P<0.01），证实了MMP9为lnc721调控牛骨骼肌卫星细胞互作的靶基因。进而下调MMP9，检测对增殖期细胞的影响，发现Ki67的mRNA水平表达极显著上调（P<0.01），Pax7蛋白表达量显著上调（P<0.05），EdU观察下调MMP9后的阳性细胞率也明显升高。同样检测下调MMP9之后对细胞分化期的影响，发现下调MMP9后镜下观察发现下调MMP9会抑制肌管形成，同时MyHC的mRNA和蛋白表达量极显著下降(P<0.01)， MyoG蛋白表达量显著下调(P<0.05)。【结论】lnc721与MMP9相互结合。在细胞增殖期干扰lnc721极显著抑制MMP9表达，而在分化期促进MMP9的表达，且干扰MMP9可促进细胞增殖并抑制分化。证明lnc721靶向MMP9调控牛骨骼肌卫星细胞的发育。

新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

王丹, 吉艳红, 梁世蕊, 杨洁, 朱启运

中国农业科学. 2023, 56(24): 4956-4966. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.013

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【目的】由新型鹅星状病毒（novel goose astrovirus, nGAstV）引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体（nanobody, Nb）噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV，RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50 μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte, PBL），然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies, VHH）基因，将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库，计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原，通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆，将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析，将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原，利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证，并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原，利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证，获得生物学活性较好的Nb。【结果】 RT-PCR结果显示，nGAstV增殖成功；Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log₁₀TCID₅₀/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后，通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64 000；利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×10⁸ CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库；遗传进化树分析显示，该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后，初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆，其中有25株序列不同；SDS-PAGE鉴定结果显示，共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。

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