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2023年 第56卷 第12期 刊出日期：2023-06-16

  

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2023年第56卷第12期中英文目录

中国农业科学. 2023, 56(12):  0. 

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作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

基于16K SNP芯片的小麦株高QTL鉴定及其遗传分析

姚琦馥, 陈黄鑫, 周界光, 马瑞莹, 邓亮, 谭陈芯雨, 宋靖涵, 吕季娟, 马建

中国农业科学. 2023, 56(12):  2237-2248.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.001

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【目的】株高与产量之间关系密切。进一步挖掘具有育种利用价值的小麦株高数量性状位点（quantitative trait loci，QTL），并解析株高QTL对产量相关性状的遗传效应，为分子育种提供理论依据。【方法】以田间自然变异株msf为母本、小麦品种川农16为父本杂交衍生的F₆代重组自交系群体（MC群体）为试验材料，于2020—2022年在四川省温江区、崇州市和雅安市试验基地进行2年5个生态环境点的种植和株高表型鉴定。使用16K SNP芯片所构建的高质量、高密度遗传连锁图谱定位株高性状。同时，利用株高主效QTL侧翼标记的基因型分析其正效应位点对于产量相关性状的遗传效应，评估主效QTL对产量提升的潜力。【结果】定位结果显示，分别在1A、3D、4D、5A和7B染色体共鉴定到8个控制株高的QTL。其中，定位到2个稳定的主效QTL：QPh.sau-MC-1A和QPh.sau-MC-5A，分别解释9.09%—25.56%和3.91%—13.09%的表型变异率，其正效应位点均来源于川农16。加性效应分析发现同时携带QPh.sau-MC-1A和QPh.sau-MC-5A正效应位点株系的株高显著高于仅携带单一正效应位点或没有携带任何正效应位点的株系。相关性分析发现，株高与有效分蘖数之间存在极显著的正相关性，与旗叶宽之间存在显著的负相关性，而与每穗粒数、每穗粒重、千粒重、旗叶长和开花期之间无显著相关性。遗传效应分析发现，QPh.sau-MC-1A正效应位点极显著增加有效分蘖数（56.51%），显著减少每穗粒数（-11.26%）、每穗粒重（-13.04%）、千粒重（-5.47%）和旗叶宽（-2.85%），促进开花期提前（-0.61%）。QPh.sau-MC-5A正效应位点显著增加有效分蘖数（10.57%）、每穗粒重（4.32%）和千粒重（2.92%），延迟开花期（1.07%）。【结论】在5A染色体定位到1个株高主效QTL—QPh.sau-MC-5A，其正效应位点显著提高有效分蘖数、每穗粒重及千粒重，对产量提高可能有积极效应。

基于荧光SSR构建中国糜子核心种质DNA分子身份证

薛亚鹏, 丁艺冰, 王宇卓, 王晓丹, 曹晓宁, SANTRA Dipak K, 陈凌, 乔治军, 王瑞云

中国农业科学. 2023, 56(12):  2249-2261.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.002

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【目的】糜子（Panicum miliaceum L.）作为一种古老的粟类作物，种质丰富，基于荧光SSR标记构建其DNA分子身份证可为资源的数字化管理提供理论依据和分子检测工具。【方法】以235份中国糜子核心种质为试验材料，对山西农业大学农学院糜子作物分子育种课题组前期开发的糜子特异性SSR标记进行多次PCR筛选和优化后获取核心引物。基于糜子参考基因组信息，经过BLAST序列比对后将核心标记进行染色体定位。在SSR引物的5′端标注荧光（FAM/HEX），利用毛细管电泳给出材料的基因型，采用“0，1”二进制编码方式记录扩增条带的有无，使用ID Analysis 4.0检测材料的区分程度。采用十进制（0—9）统计扩增片段大小以获得材料的字符串分子身份证。使用Popgene、Powermarker、MEGA、NTSYS进行遗传多样性、遗传聚类和主成分分析。利用二维码在线软件（https://cli.im/）给出材料的二维码DNA分子身份证。【结果】PCR扩增结果发现，7个荧光SSR（RYW3、RYW6、RYW11、RYW18、RYW37、RYW43和RYW125）组合在一起可以将235份材料全部区分开。BLAST结果表明，RYW18、RYW37分布在第2染色体，分别位于0.60和0.80 cM处；RYW125位于第4染色体，定位在10.40 cM处；RYW43、RYW6分布在第5染色体，分别位于52.80和53.00 cM处；RYW11和RYW3定位在第6染色体，分别位于2.10和20.70 cM处。遗传多样性分析结果表明，235份材料在7个位点共检出87个等位变异，每个位点检出3（RYW11）—25（RYW6）个，平均为12.4286；检出Shannon多样性指数（I）变幅为0.2055（RYW18）—2.0587（RYW6），平均1.1398；观测杂合度（Ho）为0.0086（RYW11）—0.9455（RYW18）；期望观测杂合度（He）为0.0795（RYW18）—0.7452（RYW6）；Nei’s基因多样性指数（Nei）为0.0793（RYW18）—0.7452（RYW6）；多态性信息含量（PIC）为0.0334（RYW11）—0.8071（RYW6），平均为0.5185。聚类分析和主成分分析均将材料划归8个类群。将电泳条带进行数字编码，利用7个标记组合，构建了全部材料的字符串和二维码DNA分子身份证。【结论】以235份中国糜子核心种质为试验材料，利用PCR扩增和毛细管电泳筛选到7个糜子荧光SSR核心标记。基于糜子参考基因组信息将上述标记定位在4条染色体上。利用上述标记扩增供试材料，给出遗传多样性衡量参数，基于遗传距离将材料聚为8个类群，主成分分析解决了聚类结果中出现的偏差。依照最少引物区分最多种质的原则，利用十进制编码方式给出材料的字符串DNA分子身份证，结合表型数据，利用二维码在线软件构建了全部材料的二维码DNA分子身份证。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

长期定位条件下栽培模式对麦田土壤理化性质和氮素平衡的影响

郭鑫虎, 马静, 李仲峰, 初金鹏, 徐海成, 贾殿勇, 代兴龙, 贺明荣

中国农业科学. 2023, 56(12):  2262-2273.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.003

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【目的】基于2009—2010小麦生长季开始设置的长期定位试验，研究栽培模式对土壤理化性质、冬小麦氮素营养指数、麦田氮素供需平衡状况、氮素吸收利用和籽粒产量的影响，以期为进一步优化土壤-作物系统综合管理模式提供理论指导。【方法】试验共设置当地农户模式（T1）、农户基础上的改良模式（T2）、不计生产成本的高产更高产模式（T3）和土壤-作物系统综合管理模式（T4）4个栽培模式。【结果】历经13个小麦-玉米生长季后，T1、T2、T3、T4模式小麦播前容重分别降低6.21%、9.80%、12.25%和13.56%，有机质含量分别提高21.88%、26.80%、32.05%和36.39%，全氮含量分别提高34.16%、12.38%、39.60%和20.79%，碱解氮含量分别提高47.85%、48.87%、74.49%和62.21%，速效磷含量分别提高62.73%、36.56%、297.93%和68.68%，速效钾含量分别提高14.36%、40.00%、221.20%和59.60%。0—100 cm土层无机氮积累量分别提高了33.96%、10.32%、52.77%和19.49%。pH分别从最初的7.50下降至6.28、6.68、5.35和6.64。2020—2022生长季4个栽培模式间籽粒产量和氮素的吸收利用差异显著。与T1模式相比，T2、T3、T4模式的籽粒产量分别提高14.14%、27.65%、22.52%，氮素利用率分别提高54.80%、19.97%、49.15%，氮肥利用率分别提高72.95%、37.54%、48.15%，氮素表观损失量分别降低49.76%、11.62%、44.14%，氮素表观损失率分别降低24.63%、11.62%、26.68%。T4模式开花期的整株和成熟期的穗子处于氮素供需平衡。【结论】历经13个小麦-玉米生长季后，4个栽培模式0—20 cm土层土壤酸化趋势明显，表层土壤容重降低，有机质、全氮、速效氮磷钾养分含量升高，0—100 cm土层无机氮积累量相应升高。与其他3种模式相比，T4模式更有利于实现土壤理化性状、小麦籽粒产量和氮素吸收利用的协同改善，但其氮肥利用率仍有待进一步提高，且在现有基础上仅通过降低施氮量无法实现其产量和氮素吸收利用的进一步协同优化。

基于改进的混合蛙跳算法对旱地小麦籽粒生长模型参数的优化

崔炜楠, 聂志刚, 李广, 王钧

中国农业科学. 2023, 56(12):  2274-2287.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.004

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【目的】作为农业智能化生产的核心决策模块，作物模型的精确模拟取决于模型参数的高效准确优化。为了提高调参效率，提升作物模型的性能和精确度，本研究通过改进优化算法对旱地春小麦籽粒生长子模型进行单目标参数优化，为中国西北部黄土丘陵区旱地春小麦的适应性研究提供参考，扩大模型的应用范围，以便于模型更好地指导农业生产。【方法】立足于2015—2021年甘肃省定西市安定区凤翔镇安家坡村的田间试验，结合1970—2021年的天气数据和年鉴产量数据，在发挥传统混合蛙跳算法（SFLA）全局交流、局部深度搜索的基础上，使用轮盘赌选择策略对旱地小麦籽粒生长阶段的6个参数进行进一步的优化，进行算法改进前后产量实测值与模拟值的误差计算与对比，对APSIM-Wheat模型进行检验。【结果】（1）在相同的迭代次数下，传统混合蛙跳算法在200次左右收敛，改进后的混合蛙跳算法在100次左右收敛；（2）旱地春小麦籽粒生长阶段的参数优化结果为小麦茎部分的每克籽粒数为26.0；开花至开始灌浆阶段的潜在籽粒灌浆速率为0.00119 grain/d；灌浆阶段的潜在籽粒灌浆速率为0.00174 grain/d；氮限制下的潜在籽粒灌浆速率为6.20×10^-5 g grain/d；氮限制下的最小籽粒灌浆速率为1.90×10^-5 g grain/d；单株小麦籽粒部分的最大干重值为0.0437 g；（3）分别使用传统混合蛙跳算法优化后所得参数值和改进混合蛙跳算法优化后所得参数值模拟小麦产量，参数优化后，产量实测值与模拟值的均方根误差（RMSE）从363.22 kg·hm^-2降至57.85 kg·hm^-2，标准均方根误差（NRMSE）从21.78%降至3.47%。【结论】相较于传统的混合蛙跳算法，改进后的混合蛙跳算法增加了种群和子群的多样性，收敛速度快，提高了优化效率和精度，优化后的结果符合旱地春小麦的生长发育过程，适用性较高，明显改善了中国西北部黄土丘陵农业区APSIM-Wheat模型的性能。

植物保护

香石竹斑驳病毒属简并引物RT-PCR检测方法的建立

廖富荣, 陈红运, 沈建国, 方志鹏, 黄蓬英, 陈青, 林玲玲, 洪钧

中国农业科学. 2023, 56(12):  2288-2301.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.005

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【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析，为甲型香石竹斑驳病毒属（Alphacarmovirus）、乙型香石竹斑驳病毒属（Betacarmovirus）和丙型香石竹斑驳病毒属（Gammacarmovirus）病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析，在依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2，在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列（AATAAATCATAA）形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a，测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度，并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑（Hibiscus rosa-sinensis）样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法，扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因，扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒（angelonia flower break virus，AnFBV）、小花矮牵牛斑驳病毒（calibrachoa mottle virus，CbMV）、香石竹斑驳病毒（carnation mottle virus，CarMV）、天竺葵花碎色病毒（pelargonium flower break virus，PFBV），乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus，HCRSV），丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus，MNSV），显示出良好的广谱性。特异性检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus，MCMV；Machlomovirus）、天竺葵线纹病毒（pelargonium line pattern virus，PLPV；Pelarspovirus）、香石竹环斑病毒（carnation ringspot virus，CRSV；Dianthovirus），健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10^-2稀释液，简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10^-3稀释液，在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明，测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科（Procedovirinae）病毒的分类情况，且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品，均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法，可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测，结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定，并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

李小食心虫GfunOBP2的原核表达及气味配体结合特性

年和粉, 张钰析, 李伯辽, 陈秀琳, 罗坤, 李广伟

中国农业科学. 2023, 56(12):  2302-2316.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.006

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【目的】通过测定李小食心虫（Grapholita funebrana）Plus-C气味结合蛋白2（odorant binding protein，GfunOBP2）结合性信息素和苹果树挥发化合物的能力，分析GfunOBP2的嗅觉功能，为阐释李小食心虫定位寄主植物的嗅觉分子机理打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增GfunOBP2的ORF序列，通过同源注释和比对氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）的分布模式确定GfunOBP2属于Plus-C OBP亚家族；利用RT-qPCR检测GfunOBP2在李小食心虫3日龄成虫触角、头、胸、足、翅、腹部和性腺中的相对表达量；构建pET30a(+)/GfunOBP2原核表达载体，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)细胞中表达GfunOBP2重组蛋白。利用荧光竞争结合试验测定重组GfunOBP2蛋白对5种性信息素和35种苹果树挥发化合物的结合能力；通过分子对接预测GfunOBP2与具有强结合能力的气味配体的相互作用力及关键氨基酸残基。【结果】克隆获得GfunOBP2（GenBank登录号：OQ054799.1）的全长序列，共编码183个氨基酸，氨基酸序列中有12个保守的Cys，其分布模式表明GfunOBP2属于Plus-C OBP。GfunOBP2主要在成虫触角中表达，在雄虫触角中的相对表达量显著高于雌虫触角（P<0.05）。重组GfunOBP2蛋白对反-2-己烯-1-醇、苯甲醇、1-庚醇、1-癸醇、己醛、庚醛、乙酸-顺-3-己烯酯、2-甲基丁酸叶醇酯、α-罗勒烯、β-石竹烯、α-蒎烯和柠檬烯具有强结合能力，抑制常数K_i均小于5.0 μmol·L^-1。分子对接结果显示氢键、Donor-Donor相互作用和烷基相互作用是GfunOBP2结合反-2-己烯-1-醇、1-庚醇和1-癸醇的主要弱相互作用力，氢键和碳氢键是GfunOBP2结合乙酸-顺-3-己烯酯和2-甲基丁酸叶醇酯的主要弱相互作用力，烷基相互作用是GfunOBP2结合α-罗勒烯和β-石竹烯的唯一弱作用力。疏水性氨基酸Ile、Pro、Phe、Ala、Leu和Val在GfunOBP2结合气味配体中起着重要作用。【结论】GfunOBP2主要在李小食心虫成虫触角中表达，重组GfunOBP2蛋白对被测的35种苹果树挥发化合物中的12种具有强结合能力、对10种化合物具有中等结合能力，表明其在识别寄主植物挥发化合物的过程中起着重要作用。研究结果为证实Plus-C OBP参与李小食心虫外周嗅觉通讯提供了理论依据。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

葡聚糖改性磷肥对冬小麦产量和肥料利用率的影响

严艳鸽, 张水勤, 李燕婷, 赵秉强, 袁亮

中国农业科学. 2023, 56(12):  2317-2328.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.007

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【目的】研究不同聚合度葡聚糖与磷肥反应制备的葡聚糖改性磷肥对小麦生长和土壤磷有效性的影响，以期为葡聚糖在磷肥上的应用提供科学支撑和理论依据。【方法】将葡萄糖（单体）、麦芽糖（2聚）、低聚麦芽糖（≈5聚）和聚葡萄糖（≈20聚）按1%添加量加入磷酸与氢氧化钾混合液中，利用反应法制备葡萄糖改性磷肥（GP）、麦芽糖改性磷肥（MP）、低聚麦芽糖改性磷肥（OP）和聚葡萄糖改性磷肥（PP），同时，制备仅反应不添加葡聚糖的普通磷肥（P）。利用傅里叶红外变换光谱（FTIR）和³¹P核磁共振波谱（³¹P NMR）探究葡聚糖与磷肥反应的结构特征，按照等磷量原则分别设置P、GP、MP、OP和PP等5个处理，以仅施氮钾肥处理为对照（CK），通过土柱栽培试验明晰不同聚合度葡聚糖改性磷肥对小麦产量和肥料利用率的影响。【结果】（1）与P处理相比，葡聚糖改性磷肥的FTIR谱图在975 cm^-1处出现新的振动峰，³¹P NMR波谱在3.09—4.51 ppm出现新的位移峰，可能是葡聚糖的羟基与磷酸发生反应生成正磷酸单酯。（2）不同聚合度葡聚糖改性磷肥（GP、MP、OP和PP）处理的小麦产量分别较P处理提高5.1%、9.3%、11.2%和1.4%，主要通过增加穗数实现增产，其次是穗粒数。（3）与P处理相比，不同聚合度葡聚糖改性磷肥处理的小麦磷素总吸收量显著提高8.2%—21.4%，其中，OP处理显著高于其他处理。（4）葡聚糖改性磷肥处理的磷肥表观利用率较P处理提高4.4—11.5个百分点，磷肥偏生产力、磷肥农学效率分别提高1.4%—11.2%和1.6%—13.1%。MP和OP处理的磷肥利用率均显著高于P处理。（5）葡聚糖改性磷肥处理的土壤速效磷含量较P处理显著提高10.2%—29.9%，且OP处理显著高于其他聚糖改性磷肥处理。【结论】与普通磷肥相比，不同聚合度葡聚糖改性磷肥均能提高小麦产量，促进小麦对磷素的吸收利用，提高土壤速效磷含量，减少磷肥固定。随着葡聚糖聚合度的增加，小麦产量和磷肥表观利用率均先增加后降低。葡聚糖聚合度为4—6时，其对磷肥的改性效果最佳。

免耕结合覆盖措施对渭北旱塬黑垆土结构与团聚体有机碳含量的影响

周明星, 代子俊, 樊军, 付威, 郝明德

中国农业科学. 2023, 56(12):  2329-2340.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.008

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【目的】阐明长期免耕及覆盖措施对渭北旱塬农田土壤团聚体结构和有机碳含量的影响，探索改善区域土壤的适宜耕作措施。【方法】在连续16年的黑垆土田间定位试验中选择传统耕作（CT）、免耕无覆盖（NT）、免耕+秸秆覆盖（NS）、免耕+地膜覆盖（NP）、免耕+秸秆覆盖+地膜覆盖（NSP）等共5种田间管理措施，于2019年10月春玉米收获期采集0—40 cm土层土样，测定容重、团聚体粒级分布及有机碳含量。【结果】（1）免耕及覆盖措施（NT、NP、NS和NSP）影响了黑垆土容重和团聚体粒级分布。免耕及覆盖措施均提高了耕层（0—20 cm）土壤容重，其中0—10 cm土层容重提高7.1%—17.8%，犁底层容重和孔隙度变化与耕层相反。耕层大团聚体比例显著提高、微团聚体比例显著降低，促进耕层微团聚体向大团聚体的转化。各粒级团聚体重量百分比在耕层（0—20 cm）分布为：较大团聚体（0.25—2 mm）>大团聚体（>2 mm）>微团聚体（0.053—0.25 mm）>粉黏粒组分（<0.053 mm），在犁底层（20—40 cm）为较大团聚体和粉黏粒组分显著高于大团聚体和微团聚体。（2）免耕及覆盖措施下有机碳含量随团聚体粒级增大而增加。在0—40 cm土层，NT处理各粒级团聚体有机碳含量均显著低于CT处理，而NS、NSP处理均显著高于CT处理。（3）耕层总有机碳累积以>0.25 mm团聚体有机碳为主，犁底层以粉黏粒组分和较大团聚体有机碳为主。【结论】长期免耕及覆盖措施促进耕层微团聚体向大团聚体转化。与传统耕作相比，免耕和地膜覆盖均降低了耕层各粒级团聚体有机碳含量。而免耕覆盖（NS、NP和NSP）比免耕无覆盖（NT）均增加了各粒级团聚体有机碳含量。免耕结合秸秆覆盖（NS）显著改善土壤容重且对各粒级团聚体有机碳含量提升幅度最大，是最佳处理。

秸秆隔层结合春灌对河套灌区盐碱地土壤呼吸及其温度敏感性的影响

于茹, 宋佳珅, 张宏媛, 常芳弟, 王永庆, 王希全, 王婧, 王伟妮, 李玉义

中国农业科学. 2023, 56(12):  2341-2353.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.009

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【目的】探究河套灌区盐碱土壤呼吸对秸秆隔层与灌溉制度的响应，明确土壤呼吸速率与土壤温度、含水量的关系。【方法】采用完全随机区组设计，于2015年分别设置秋浇且春灌（I_SA），不秋浇只春灌（I_S），不秋浇只春灌+秸秆隔层（SI_S）3个处理，于2017、2018年测定土壤呼吸、温度和含水量，并计算土壤呼吸的温度敏感性。【结果】（1）0—20 cm土层温度和含水量波动较为明显，而20—40 cm土层则相对稳定。相较于I_SA、I_S处理，SI_S处理提高了0—40 cm土层温度和20—40 cm土层含水量。（2）2017年的土壤呼吸速率大于2018年；开花期土壤呼吸速率最高，其次为现蕾期、春灌前、播种前、收获期。（3）I_S、SI_S处理在开花期的土壤呼吸速率均显著高于I_SA处理（P<0.05）。相较于I_SA处理，I_S和SI_S处理的土壤呼吸速率分别增加了0.12—0.44和0.06—0.42 μmol·m^-2·s^-1。相较于I_S处理，SI_S处理的土壤呼吸速率降低0.01—0.49 μmol·m^-2·s^-1。表明不秋浇增加了土壤呼吸，但秸秆隔层降低了土壤呼吸。（4）土壤呼吸速率与土壤温度极显著正相关（P<0.01），与土壤含水量没有显著相关性。0—20和20—40 cm土层温度分别能够解释土壤呼吸速率变化的40.74%—53.84%和39.27%—53.46%。（5）不同处理的土壤呼吸敏感性（Q₁₀）介于1.68—1.98，20—40 cm土层的Q₁₀大于0—20 cm土层的。相较于I_SA处理，I_S和SI_S处理能够降低土壤呼吸敏感性；相较于I_S处理，SI_S处理能够增加土壤呼吸敏感性。【结论】综合比较，不秋浇只春灌结合秸秆隔层可以提高0—40 cm土层温度和20—40 cm土层含水量，降低土壤呼吸速率，增加土壤呼吸的温度敏感性，可以作为河套灌区节水减排的有效措施。

园艺

基于品质、产量与水肥利用效率的基质栽培辣椒水肥管理优化

周道明, 孙涛, 赵玉红, 贾媛婕, 杨铭菲, 屈锋, 胡晓辉

中国农业科学. 2023, 56(12):  2354-2366.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.010

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【目的】探究灌溉频率和营养液供应量耦合对袋培辣椒品质、产量、水分利用效率和肥料偏生产力的影响，优化袋培辣椒水肥管理方案。【方法】以‘凯莱（37-83）RZ F1’辣椒为试材，以维持基质含水量55%—60%所需要的灌水量（IA）为每日单株总灌水量，设置3种单株灌溉频率和2个营养液供应量。单株灌溉频率是将IA分别按照1次（IF1）、2次（IF2）和4次（IF3）供应；营养液供应量为标准山崎辣椒营养液供应量（NS1，即门椒开花至三层果收获期和三层果采收后，每日供应量分别为250 mL/株和500 mL/株）和持续增加营养液供应量（NS2，即初始营养液供应量每日为250 mL/株，辣椒每采收一层果实后，单株营养液供应量增加50 mL，至500 mL/株时不再增加），共6个耦合处理。采用主成分分析-优劣解距离法、隶属函数分析法和灰色关联度分析法对果实品质、产量、水分利用效率和肥料偏生产力指标进行综合评价。【结果】除果肩长外，灌溉频率对辣椒果实的品质指标均有极显著影响（P<0.01）；营养液供应量对辣椒果实的维生素C、可溶性蛋白、辣椒素和二氢辣椒素有极显著影响（P<0.01），对其他品质指标无显著影响；二者耦合对辣椒果实除果皮厚度之外的品质指标均有极显著影响（P<0.01）；同时，灌溉频率、营养液供应量和二者耦合对辣椒产量和水分利用率均表现出极显著影响（P<0.01）。PCA-TOPSIS法、隶属函数分析法和灰色关联度分析法对测定指标的评价结果一致，排名前两位的处理均为IF1NS1和IF2NS2，其中，IF1NS1处理的果实品质最好，产量、水分利用效率和氮磷钾肥偏生产力均最高，分别为74 482.24 kg·hm^-2、34.21 kg·m^-3、625.95 kg·kg^-1、679.54 kg·kg^-1和367.23 kg·kg^-1。因此，IF1NS1为最优水肥耦合处理。【结论】袋培辣椒的最优灌溉频率和营养液管理方案为：单株灌溉频率为维持基质含水量55%—60%所需要的灌水量按照1次供应，门椒开花至三层果收获期和三层果采收后分别按照每日250 mL/株和500 mL/株供应标准山崎配方营养液。

189份桃种质肉质性状形成相关位点基因型鉴定及组合分析

王朝晖, 李勇, 曹珂, 朱更瑞, 方伟超, 陈昌文, 王新卫, 吴金龙, 王力荣

中国农业科学. 2023, 56(12):  2367-2379.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.011

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【目的】通过分子标记与生物信息学手段，鉴定189份桃种质与肉质形成相关的F-M基因座、YUC11启动子区转座子插入、NAC72编码区9 bp插入的基因型及3个位点组合情况，为深入研究桃果实肉质形成机制及育种亲本选配提供理论基础。【方法】通过PCR扩增、竞争性等位基因特异PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）、高分辨率溶解曲线（high resolution melting analysis，HRM）技术，对F-M基因座倍型、YUC11转座子插入、NAC72 9 bp插入进行检测；同时结合重测序数据利用生物信息学方法进一步验证，从而准确鉴定189份桃种质肉质性状形成相关位点基因型及组合情况。【结果】F-M基因座编码多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）的PGM与PGF是调控桃果实肉质形成的两个重要基因。189份桃种质中，PGM与PGF分别有159份（84%）、99份（52%）。F-M基因座共发现H0、H1、H2、H3 4种单倍型，占比分别为33%、39%、4%、24%。在F-M基因座，不溶质粘核以H3H3、H2H3组合为主，溶质粘核以H0H0、H0H1组合为主，溶质离核以H1H1、H0H1组合为主。发现18份含有硬质基因型的种质，在YUC11启动子区含有转座子纯合插入。HRM结果表明，NAC72编码区9 bp插入纯合（早熟）有45份种质、插入杂合（中熟）有71份种质、无插入（晚熟）有73份种质，中熟与晚熟种质占比77%；其中6份种质基因型与表型差别较大。不溶质粘核、溶质粘核、溶质离核3种常见肉质类型，在3个位点最多的基因型组合分别是mmffHdHdI、MMffHdHdI、MMFFHdHdL。【结论】通过分子试验与生物信息学相结合进一步证实了F-M基因座存在4种单倍型；发现18份含有硬质基因型的种质；开发了一种用于鉴定桃成熟期的分子标记；鉴定出不同种质在肉质相关位点的基因型组合形式。

食品科学与工程

黑曲霉改性葛渣膳食纤维的工艺优化及其理化功能特性

符慧珍, 邓梅, 张名位, 贾栩超, 董丽红, 黄菲, 马勤, 赵东, 张瑞芬

中国农业科学. 2023, 56(12):  2380-2394.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.012

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【目的】筛选适宜粉葛渣膳食纤维（dietary fiber，DF）改性的微生物种类，优化建立其最佳改性条件，分析改性前后葛渣DF结构和理化功能特性差异，为粉葛加工副产物的综合利用提供理论依据和技术支撑。【方法】比较黑曲霉、米根霉、绿色木霉和枯草芽孢杆菌发酵对葛渣可溶性DF（soluble dietary fiber，SDF）得率的影响，确定最佳发酵菌种；以料液比、接种量、发酵时间、发酵温度和pH为条件进行单因素试验，以SDF得率为考察指标，通过Box-Benhnken中心组合试验设计优化葛渣DF的最佳改性工艺条件；通过酶解法从发酵改性前后的葛渣中提取不溶性DF（insoluble dietary fiber，IDF）和SDF，利用扫描电镜观察其微观结构，对比分析葛渣发酵改性对其IDF理化（持水力、持油力和溶胀力）和功能特性（葡萄糖、胆酸盐和胆固醇吸附能力）的影响。【结果】黑曲霉、米根霉和绿色木霉发酵葛渣均能不同程度地增加葛渣中SDF得率，其中黑曲霉效果最好，而枯草芽孢杆菌发酵对葛渣中SDF得率无显著影响。因此，本研究选定黑曲霉为葛渣DF微生物改性菌种。通过响应面优化确定黑曲霉最佳发酵条件为料液比1﹕5.8（m/v）、接种量4.9%（v/v）、发酵时间100 h、发酵温度24.9 ℃，在该条件下SDF得率由发酵前的6.34%增加到13.75%，IDF/SDF的比例由6.14下降至2.83。与发酵前相比，黑曲霉发酵后葛渣IDF和SDF呈现更为疏松多孔的微观结构。发酵后葛渣IDF的持水力和溶胀力均是发酵前的1.2倍，但持油力无显著变化。此外，发酵后葛渣IDF的葡萄糖吸附能力是发酵前的1.70倍，胆固醇吸附能力在pH 2.0和pH 7.0条件下分别是发酵前的1.44倍和1.28倍。【结论】4种受试菌株中，黑曲霉促进葛渣IDF转化为SDF的作用最显著，以SDF得率为指标优化建立了黑曲霉发酵改性葛渣DF的最佳工艺；发酵后葛渣SDF得率提高2.17倍，IDF的理化和功能特性均得到改善。

畜牧·兽医

热应激对奶牛GNAS启动子区DNA甲基化水平的影响

陈玉梅, 张聪聪, 胡丽蓉, 房浩, 窦金焕, 郭刚, 王炎, 刘巧香, 王雅春, 徐青

中国农业科学. 2023, 56(12):  2395-2406.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.013

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【目的】热应激严重影响奶牛的生产和健康，是制约奶业持续健康发展的重要因素。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制参与动物的热应激反应，但其在奶牛热应激过程中的作用和分子机制研究较少。研究通过检测奶牛热应激相关的DNA甲基化变化，筛选和验证DNA甲基化相关的关键基因，为奶牛热应激的表观遗传机制研究积累数据。【方法】以北京市三元绿荷金银岛牧场的24头中国荷斯坦牛(泌乳阶段及胎次相同) 为研究对象，分别于春季 (非应激期，2017年4月份) 和夏季(热应激期，2017年7月份) 采集试验个体的血液，提取DNA，共获得48份DNA样本。首先，随机选择其中15头奶牛，并随机分为3组，每组5份DNA样本混合，通过全基因组重亚硫酸盐测序法(Whole- genome bisulfite sequencing, WGBS) 检测奶牛基因组DNA的甲基化状态，筛选差异甲基化区域 (Differential methylation region, DMR; 1000 bp windows, 500 bp overlap, P<0.05) 及相关基因，利用PROMO和Methprimer软件预测基因启动子的转录因子结合位点和CpG岛区。然后，39 ℃热处理牛乳腺上皮细胞 (Bovine mammary gland epithelial cells, Mac-T)不同时间 (24 h, 48 h, 72 h)，MTT法检测细胞活力。最后，利用亚硫酸盐测序法 (Bisulfite sequencing PCR, BSP)分别对春夏季的24头奶牛及39 ℃热处理不同时间的Mac-T细胞中目的基因启动子区的甲基化状态进行分析。【结果】通过WGBS共得到49 861个DMRs，其中一个DMR注释到基因GNAS复合体基因座(GNAS complex locus, GNAS)的启动子区，其整体甲基化水平在夏季热应激期极显著上调(P<0.001)，且该区域预测到一个352 bp的CpG岛，包含Sp1、C/EBP等重要转录因子的结合区域。24头奶牛个体中GNAS启动子区31个CG位点的整体甲基化水平在热应激期显著上调(P<0.05)，与WGBS结果一致，其中，21号(-113 bp，Chr13:57532733)和27号CG (-63 bp，Chr13:57532683) 位点甲基化水平显著上调(P<0.05)。Mac-T 细胞热处理48和72 h后，细胞活力极显著下降(P<0.01)，GNAS启动子的CG 位点整体甲基化水平显著上调 (P<0.05)，21号和27号CG均为显著上调的差异甲基化位点，与个体水平结果一致。【结论】热应激会引起奶牛GNAS启动子甲基化水平增加，GNAS是奶牛热应激DNA甲基化调控的潜在靶基因。

丙戊酸对双峰驼成纤维细胞重编程影响

张启冉, 李宗帅, 马甜, 李怡娜, 赵兴绪, 张勇

中国农业科学. 2023, 56(12):  2407-2420.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.014

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【目的】探讨提高双峰驼成纤维细胞重编程效率，减少因原癌基因引入造成致瘤风险。试验在成纤维细胞重编程过程中添加丙戊酸（valproic acid，VPA），探索小分子物质对双峰驼成纤维细胞重编程的影响，为双峰驼发病机制研究提供参考依据。【方法】采用3月龄双峰驼胎儿成纤维细胞，结合经典诱导组合OSKM（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc及治疗）和EGFP等5种逆转录病毒对双峰驼成纤维细胞进行重编程（OSKM组），并在第二次病毒感染后添加VPA处理7 d（OSKM+VPA组）收集细胞。利用PCR技术对所得细胞进行内、外源基因检测以证实逆转录病毒对双峰驼成纤维细胞的修饰作用，根据RNA-seq数据从VPA影响较为明显的基因中随机挑选8个基因，检验其在添加VPA前后的变化趋势是否与RNA-seq数据趋势一致，以验证RNA-seq数据的准确性。通过GO分析对转录组样本基因进行分类，并使用KEGG通路富集分析和超几何验证分析明确目的基因显著富集通路。对收集到的细胞进行总RNA提取并结合RNA-seq技术和实时荧光定量PCR（Real time-quantitative interpretation，RT-qPCR）技术检测VPA对双峰驼成纤维细胞重编程的影响。【结果】使用PCR技术检测内、外源基因在不同分组的表达，结果显示nSox2、Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc在OSKM和OSKM+VPA组中均有表达，且OSKM+VPA组表达量高于OSKM组，而其在BCEFs组不表达。随机挑选8个基因检测，结果表明与细胞周期信号通路有关的TP53、CCNB1、CDC20这3个基因在添加VPA后表达量下调；与癌症表型特征相关的S100A4、CKS2、VIM、MMP9表达下调；PI3k-Akt信号通路中VEGFC表达上调；此表达趋势与组学数据趋势一致。结果显示在添加VPA后，增殖基因Mki67和PCNA表达下调，而凋亡基因CASP7表达上调。对转录组数据进行KEGG和超几何验证分析，根据分析结果筛选出959个差异表达基因，富集在276个信号通路中，其中Q值小于0.05的信号通路有八条：类固醇生物合成、细胞周期、PPAR信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟、脂肪酸代谢、ECM-受体相互作用、细胞黏附分子和胆固醇代谢。经筛选获得与细胞周期、脂肪酸代谢、细胞黏附分子和胆固醇代谢等相关的26个差异表达基因，并随机选取其中四个基因进行检测，结果表明：VPA可使双峰驼成纤维细胞黏附分子信号通路中L1CAM、CNTN1、NFASC三个基因表达上调，细胞间互作增强，同时上调脂肪酸信号通路中CD36基因的表达。【结论】VPA可将细胞阻滞在分裂期之前，以减少重编程过程中分化几率。同时，VPA对双峰驼成纤维细胞重编程过程中多条信号通路均具有影响，调节信号通路中相关基因表达趋势，有效提高细胞重编程效率，在双峰驼成纤维细胞重编程中发挥重要作用。

致马属动物流产沙门氏菌通用型间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

郭奎, 张泽楠, 李帅杰, 初晓雨, 王垚鑫, 郭巍, 胡哲, 王晓钧

中国农业科学. 2023, 56(12):  2421-2430.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.015

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【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌（ Salmonella）共同的优势抗原，建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA（iELISA）抗体检测方法，实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀（pull down）试验，筛选出马流产沙门氏菌优势抗原；根据质谱分析结果找到优势抗原基因，将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性；其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达，设计3对引物，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a；测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L^-1异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达，观察蛋白的表达形式；蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性；然后利用纯化后蛋白作为包被抗原，通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法，并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测，并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein, OMP)，通过序列比对，该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%，具有很好的保守性；PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因；成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3 3个重组质粒。SDS-PAGE结果表明，在24 ℃、0.6 mmol·L^-1 IPTG诱导5 h下，含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白，其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达，重组ompA3蛋白以可溶性形式表达；Western blot显示，重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应，证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性，可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，在最大P/N比确定的最佳反应条件如下：最佳包被抗原浓度为1 μg·mL^-1，待检血清（1﹕200）37 ℃作用1 h，酶标抗马二抗（1﹕10 000稀释），TMB在37 ℃孵育10 min，待检血清OD450>0.143判定为阳性，特异性试验结果显示，该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测，iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d，相比微量凝集（69 d）多监测了47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测，其抗体平均阳性检出率为63.3%，比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA，实现了对该蛋白的可溶性表达，建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法，该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测，该方法具有特异性强、敏感性高，可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。