中国农业科学

玉米灌浆期茎秆抗推力的全基因组关联分析

马青美，裴玉贺，陈东滨，宋希云

中国农业科学. 2017, 50(24): 4671-4678. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.001

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【目的】通过基因型与表型数据关联分析，检测出与玉米茎秆抗推力相关的SNP位点，发掘出控制茎秆抗推力的候选基因。【方法】以292份玉米自交系组成的自然群体为材料，2015年和2016年在菏泽、枣庄、青州、胶州等地进行茎秆抗推力的测定，并且对株高、穗位高、雄穗长和雄穗柄长进行测定。另一方面，对材料进行取样并提取DNA，由美国先锋良种有限公司利用MaizeSNP50基因芯片进行基因分型，该芯片包括55 126个单核苷酸多态性（SNP）标记，去除杂合率大于10%、缺失率大于20%和最小等位基因频率低于0.05的标记，剩余25 331个SNP，运用farmCPU结合基因型对茎秆抗推力表型数据进行全基因组关联分析，检测出与茎秆抗推力显著相关SNP位点，根据SNP所处的物理位置，对标记所在的区间进行定位，从而获得相对应的候选基因。运用SPSS statistics 20.0数据分析软件对株高、穗位高、雄穗长和雄穗柄长进行相关性分析，确定茎秆抗推力与4个性状的相关性。【结果】共检测出16个与茎秆抗推力显著相关的SNP（P＜0.0001），分别位于染色体框3.06、5.02、4.08、6.04、8.03和9.03。在多个环境中检测到的SNP位点位于相同的染色体框，例如，位于染色体框8.03中的PZE_108026930、SYN19532、PZE_108048987和PZE_108050769，在2015年枣庄和2016年枣庄分别被检测到。位于染色体框3.06的PZE_103111295和PZE_103125327，在2015年青州和2016年枣庄分别被检测到。共获得GRMZM2G504401、GRMZM2G062974、GRMZM2G053767、GRMZM2G348551和GRMZM2G024260 5个候选基因，分别编码几丁质酶A、bZIP转录因子超家族的蛋白、核糖体40S亚基S4类蛋白X1、可溶性淀粉合成酶2-3、腺嘌呤核苷酸水解酶超家族蛋白。此外，发现茎秆抗推力与株高、穗位高、雄穗长和雄穗柄长有显著或极显著相关性，但是在各个环境中相关关系不稳定，环境可能具有一定的影响。【结论】GRMZM2G062974参与植物在逆境下的表达调控，响应多种非生物胁迫。GRMZM2G348551参与糖代谢途径，调控支链淀粉的合成，与细胞壁的形成有关。GRMZM2G504401在植物中表达受到生物或者非生物胁迫的诱导，从而发挥作用。倒伏会受到自身或多种胁迫的影响。

新疆陆地棉种质资源的综合评价

刘翔宇，赵龙，巴哈尔古丽·先木西，彭华，阿不都热衣木·玉拉音

中国农业科学. 2017, 50(24): 4679-4691. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.002

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【目的】基于形态指标、产量指标和品质指标，综合评价棉花种质资源在新疆季节性水分匮缺条件下的表现，为旱区棉花主栽品种的确定和品种改良奠定基础。【方法】以126个棉花品种（系）为试验材料，对其在季节性水分匮缺状态下的株高、果枝数、生育期、有效铃数、单铃重、衣分、籽指、籽棉产量、皮棉产量、纤维长度、整齐度、比强度、伸长率、马克隆值、反射率、黄度和纺纱均匀性指数共17项数量性状指标进行测定，运用相关分析、主成分分析、聚类分析、逐步判别分析和多元方差分析等方法对这些棉花种质资源进行综合评价。【结果】首先，相关分析的结果表明，17项数量性状间存在一定的相关性和信息的重叠，因为56对数量性状的相关系数达到极显著水平，22对数量性状的相关系数达到显著水平。第二，主成分分析的结果表明，前8个主成分代表了126个棉花品种的17项数量性状86.34%的信息，其贡献率分别为27.45%、17.18%、11.61%、8.42%、6.66%、5.33%、5.08%和4.63%。第三，聚类分析的结果表明，当类间距离为12.5时，126个棉花品种被聚为7大类，第Ⅰ类有22个品种、第Ⅱ类有17个品种、第Ⅲ类有19个品种、第Ⅳ类有28个品种、第Ⅴ类有19个品种、第Ⅵ类有13个品种、第Ⅶ类有8个品种。第四，逐步判别分析的结果表明，114个棉花品种被正确判别，判对概率为90.48%；12个棉花品种被误判，误判率为9.52%，这说明聚类分析的结果是准确可靠的。最后，多元方差分析结果表明，第Ⅰ类为中产中等品质品种，第Ⅱ类为低产优质类品种，第Ⅲ类为高产优质类品种，第Ⅳ类为中高产中等品质类品种，第Ⅴ类为中高产中上等品质类品种，第Ⅵ类为高产中等品质类品种，第Ⅶ类为低产劣质类品种，同时科学地评价了7个类别的棉花品种，并提出了对应的改良方案。【结论】西北旱区棉花育种一方面在产量上进展明显，除了第Ⅵ类和第Ⅴ类外，大多数品种达不到纺高支纱的要求。适纺中支纱的主栽品种可在第Ⅲ类中选育。第Ⅱ类的纺纱指数达到了适纺高强力优质棉的要求，要着重改良产量指标。今后，西北旱区棉花育种工作要对不同类别的品种，选取适合的育种策略，以达到产量和品质均趋向最优。

利用CottonSNP63K芯片构建棉花品种的指纹图谱

孙正文，匡猛，马峙英，王省芬

中国农业科学. 2017, 50(24): 4692-4704. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.003

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【目的】利用SNP位点的单拷贝特性，结合陆地棉TM-1参考基因组序列信息，筛选基因组特异的SNP。【方法】以719份遗传背景来源广泛的陆地棉种质资源为材料，采用Illumina公司开发的CottonSNP63K芯片，利用GenomeStudio软件对芯片扫描所获得原始数据进行基因型数据质量控制，获得待测样品SNP位点的基因型数据。根据已公布的陆地棉TM-1基因组的两个版本——中国农业科学院棉花研究所版本Gossypium hirsutum（AD1）genome BGI v1.0与南京农业大学版本G. hirsutum（AD1）genome NBI v1.1为参考序列，对CottonSNP63K芯片（63 058个SNP）各位点的侧翼序列分别进行全基因组Blast比对分析，以筛选具有单拷贝特性的特异SNP位点并用于样品指纹图谱的构建。【结果】利用CottonSNP63K芯片对719份材料进行SNP位点基因分型，主要表现为无检出信号的SNP位点、无多态性的SNP位点、具有多态性的SNP位点，而具有多态性的SNP位点的分型结果又可分为单位点SNP（基因组特异SNP）、双位点SNP和多位点SNP。通过对两个已公布的陆地棉TM-1参考基因组序列Blast比对结果表明，中国农业科学院棉花研究所TM-1基因组版本比对获得基因组特异SNP标记为5 474个，而南京农业大学TM-1基因组版本比对获得基因组特异SNP标记仅为1 850个，两者共有的特异SNP为1 594个，进一步通过分型效果、检出率及多态性3个评价指标，筛选score值≥0.7，call frequency值≥0.95，且MAF值≥0.2的SNP位点，获得471个分型效果理想，检出率高且多态性较高的特异SNP位点。在471个SNP位点中，430个位于染色体上，41个位于scaffold片段上。考虑到标记间的连锁程度，剔除连锁标记37个，最终获得393个核心SNP位点。利用393个核心SNP构建了719份品种资源的特征DNA指纹图谱，除个别材料之间遗传背景高度相似、基因型完全一致外，97%的材料均能实现准确有效的鉴别。【结论】筛选出393个基因组特异的SNP，并利用这些核心SNP构建了719份资源材料的特征DNA指纹图谱，为SNP分子标记应用于棉花重要性状遗传改良提供了参考。

关于用水稻“顶3顶4叶叶色差”作为高产群体叶色诊断统一指标的再论证

凌启鸿，王绍华，丁艳锋，李刚华

中国农业科学. 2017, 50(24): 4705-4713. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.004

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【目的】进一步论证用水稻“顶3顶4叶叶色差”作为高产群体叶色诊断的统一指标。【方法】以2001—2002年的试验结果进行再论证。选择叶色（SPAD）差异较大的金南风、9915、越光、9325等4个粳稻材料，白稻、H97-322等2个籼稻材料；通过不同施氮量试验，用SPAD-502型叶绿素计于有效分蘖临界叶龄期（N-n）、倒2叶期和齐穗期测定全株各叶的SPAD值，比较单叶SPAD值、顶3顶4叶色差跟植株含氮率、产量形成的关系差异。【结果】单叶SPAD值品种间或生育期差异很大，难以用某一叶的SPAD值诊断氮素营养状态，而在生育各期会出现顶4＜顶3、顶4=顶3和顶4＞顶3三种叶色差，是氮素不足、正常和过剩的生理反映；单叶的SPAD值与分蘖率、成穗率、每穗颖花数和结实率之间没有规律性的关系，不能作为共同诊断指标，而顶3顶4叶叶色差和产量三因素的形成存在规律性的变化关系；单叶SPAD值不能作为产量诊断的指标值，而在N-n叶龄期、倒2叶龄期和齐穗期3个叶龄期顶3顶4叶色差值相等的群体，均可以获得最高的产量。【结论】顶3叶顶4叶叶色差是稻体氮素营养水平的表观指标；单叶SPAD测定和顶3顶4叶色差诊断配合，可以准确诊断水稻植株氮素的丰亏。

基于SPAD值的水稻施氮叶值模型构建及应用效果

李杰，冯跃华，牟桂婷，许桂玲，罗强鑫，罗康杰，黄世凤，石欣，管正策，叶勇，黄佑岗

中国农业科学. 2017, 50(24): 4714-4724. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.005

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【目的】研究分析不同地力条件、施氮量、SPAD值衍生指标、产量之间的关系，实现简便、快速、无损地推荐水稻施氮量，构建基于SPAD值的水稻施氮叶值模型。【方法】2015年和2016年以杂交籼稻Q优6号为试验材料，设4种施氮水平（0、75、150、225 kg·hm^-2），探讨产量、SPAD值衍生指标与田块表观供氮量之间的关系，并对初步构建的叶值模型进行变量施氮应用效果研究。【结果】产量与抽穗期田块表观供氮量之间具有极显著的曲线关系，两年拟合度R²分别为0.5523，0.7148。在其拟合关系下2年度最高产量分别为9 264.93 kg·hm^-2、11 167.97 kg·hm^-2，相差1 903.14 kg·hm^-2，2016年产量相比2015年增加20.54%；达到最高产量的表观总吸氮量较为接近，分别为575.27 kg·hm^-2，546.71 kg·hm^-2，仅相差28.56 kg·hm^-2，2016年表观总吸氮量相比2015年减少4.96%。不同年度的拔节期和抽穗期，SPAD值衍生指标中SPAD_L3（顶3叶SPAD值）、SPAD_L4（顶4叶SPAD值）、SPAD_mean（顶部4张叶片的平均SPAD值）、SPAD_L3_×L4/mean（顶3叶SPAD值×顶4叶SPAD值/顶部4张叶片的平均SPAD值）与田块表观供氮量之间具有显著或极显著的线性关系。单张叶片中，SPAD_L3与拔节期田块表观供氮量，SPAD_L1与抽穗期田块表观供氮量线性拟合的系数在年份间变化均较小，分别为0.0156，0.0154；0.0172，0.0173。年份间，2016年SPAD_L3_×L4/mean与田块表观供氮量线性拟合的系数和b值比2015年的拔节期依次增加了-28.70%，17.41%；抽穗期依次增加了-15.34%，56.11%。叶值模型施氮总量为表观总吸氮量与土壤表观供氮量之差，通过SPAD值衍生指标可以估测土壤表观供氮量，且抽穗期时SPAD值衍生指标与田块表观供氮量的线性拟合度较拔节期时的高。拔节期时，SPAD_L4与SPAD_L3_×L4/mean，SPAD_L3与SPAD_mean之间估测推荐的施氮总量较为接近，且SPAD_L4、SPAD_L3_×L4/mean估测的施氮量高出SPAD_L3、SPAD_mean50%左右。基于叶值模型的变量施氮效果表明，变量区产量高出对照区产量820.68 kg·hm^-2，变量区的氮素偏生产力、农学利用率和贡献率均明显高于对照区，分别高出13.74%，103.45%，104.12%。确定叶值模型的一般表达式为：Nw=Nz-[(Ys-b)/k-Ng]，式中Nw表示施氮总量（kg·hm^-2），Nz表示水稻品种表观总吸氮量（kg·hm^-2），Ys表示叶片SPAD值衍生指标，Ng表示追肥之前已经施入的氮量（kg·hm^-2），k、b是田块表观供氮量（Nx）与叶片SPAD值衍生指标线性关系中的斜率和截距，而田块表观供氮量等于土壤表观供氮量（Nt）与人工已施氮量（Ng）之和。【结论】应用叶值模型的变量施氮减少了产量差，提高了产量以及氮素农学利用率、偏生产力和贡献率。

侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测

谢丽雪，张小艳，郑姗，张立杰，李韬

中国农业科学. 2017, 50(24): 4725-4734. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.006

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【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus，TeMV），并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法，为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测，并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序；根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果，设计一对用于扩增TeMV外壳蛋白（coat protein，CP）基因全长的特异性引物，通过反应条件优化，建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法；序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对，同时对获得的CP基因序列采用MrBayes软件的贝叶斯法（Bayesian inference，BI）构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现，一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属（Potyvirus）通用抗体反应呈阳性；电镜观察结果表明，该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子；Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段，克隆、测序获得长度为680 bp的序列，该序列与已报道的TeMV核苷酸序列一致性最高（98.2%）。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp（命名为BXGFJ-13分离物），与已报道的TeMV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明，13个TeMV分离物共形成3个类群，相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇，表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物（KJ789129）先以较高的后验概率聚为一个分支，再与泰国2个分离物（AM409188、AM409187）聚为第2类群（Group II），表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物TeMV-CPf/TeMV-CPr建立的RT-PCR方法，具有良好的特异性，仅能从感染TeMV的西番莲样品上扩增出目的片段，而从黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、甜菜花叶病毒（Beet mosaic virus，BtMV）、大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）、虎眼万年青花叶病毒（Ornithogalum mosaic virus，OrMV）、洋葱黄矮病毒（Onion yellow dwarf virus，OYDV）、东亚西番莲病毒（East Asian Passiflora virus，EAPV）等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示，该方法能从稀释10²倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会（ICTV）关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准，同时结合血清学检测、电镜观察结果，证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有TeMV；建立的特异性RT-PCR方法能够用于TeMV的快速检测。

吡虫啉悬浮种衣剂对玉米田节肢动物群落及主要非靶标害虫的影响

李冠楠，苗昌见，李为争，王高平，刘晓岚，郭线茹，闫凤鸣

中国农业科学. 2017, 50(24): 4735-4746. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.007

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【目的】明确吡虫啉种衣剂对玉米田节肢动物群落及主要非靶标害虫的影响，为种衣剂的科学使用及玉米害虫防控提供理论依据。【方法】分别于2015年和2016年6—9月，在河南农业大学许昌校区试验田，设置600 g·L-1吡虫啉悬浮种衣剂推荐最高使用剂量及其2倍和4倍剂量进行种子包衣，以清水为对照，每个处理重复4次，随机区组排列。每小区采用5点取样方法，每点连续标记10株玉米，分别在玉米苗期、喇叭口期、孕穗期、灌浆初期和灌浆中期调查样点内玉米植株上全部节肢动物的种类及其数量，分析不同处理区节肢动物的群落特征。在玉米灌浆期，调查样点内玉米穗部害虫种类及数量；玉米成熟时每小区收获两行，每行连续收取50株，调查雌穗上和茎秆中的鳞翅目幼虫种类和数量，分析吡虫啉种衣剂对主要非靶标害虫的影响。【结果】种衣剂处理不影响玉米田节肢动物群落物种种类，处理区与对照区的物种丰富度随时间的变化趋势基本相似，同一时间内不同处理区物种丰富度的差异与有些物种的密度低而在调查样点内的分布不均匀有关。吡虫啉种衣剂处理不会造成玉米田节肢动物群落多样性和均匀度下降，在靶标害虫玉米蚜发生量大时还能通过抑制玉米蚜的数量而使多样性和均匀度增加。种衣剂处理对玉米田节肢动物优势种的影响不仅年份间有差异而且不同玉米生育期间也有差异，在靶标害虫玉米蚜种群数量较高的2015年，玉米生长前期种衣剂处理区的植食性昆虫和捕食性天敌优势种与空白对照区基本一致，灌浆期黏虫和草间小黑蛛分别成为种衣剂2倍和4倍剂量处理区的植食性昆虫和捕食性天敌的优势种；在玉米蚜种群数量较小的2016年，孕穗期以后亚洲玉米螟和棉铃虫为各处理区植食性昆虫优势种，龟纹瓢虫和异色瓢虫成为捕食性天敌优势种。玉米不同生育期各处理区优势种的优势度指标与其优势集中度指标变化趋势相似。种衣剂处理对穗部鳞翅目幼虫的影响程度较复杂，如玉米灌浆初期和灌浆中期种衣剂处理区亚洲玉米螟幼虫种群数量均高于或显著高于对照区；灌浆初期种衣剂处理区桃蛀螟幼虫种群数量均显著高于对照，灌浆中期则低于或显著低于对照；灌浆中期种衣剂处理区黏虫幼虫种群密度均高于对照；种衣剂处理区棉铃虫幼虫密度与对照区虽有不同，但差异不显著。综合两年的调查结果，玉米灌浆期种衣剂处理区亚洲玉米螟、桃蛀螟和黏虫幼虫种群密度有增加的现象，但其种群密度与600 g·L-1吡虫啉悬浮种衣剂处理剂量没有明显的相关性。【结论】建议吡虫啉种衣剂处理玉米田应注意防控鳞翅目穗部害虫。

土壤含水量对硝化和反硝化过程N₂O排放及同位素特征值的影响

郑欠，丁军军，李玉中，林伟，徐春英，李巧珍，毛丽丽

中国农业科学. 2017, 50(24): 4747-4758. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.008

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【目的】通过室内培养试验，研究不同含水量对北京顺义潮褐土N₂O排放及同位素特征值（δ¹⁵N^bulk，δ¹⁸O和nitrogen isotopomer site preference of N₂O，简称SP）的影响，以期获得不同水分条件下土壤N₂O产生途径及变化规律，为农田土壤N₂O减排提供理论依据。【方法】结合稳定同位素技术与乙炔抑制法，以北京顺义潮褐土为试材，设置3个含水量梯度：67%、80%和95% WFPS（土壤体积含水量与总孔隙度的百分比或实际重量含水量与饱和含水量的百分比，简称WFPS），在此基础上设置无C₂H₂，0.1%（V/V）C₂H₂和10%（V/V）C₂H₂处理。将土壤装入培养瓶中培养2 h，之后收集培养瓶中的气体测定N₂O浓度及同位素特征值，并采集土样测定其NH+ 4-N和NO- 3-N的含量。利用同位素二源混合模型计算硝化和反硝化作用对土壤N₂O排放的贡献率，对N₂O产生途径进行量化分析。【结果】根据室内土壤培养测定结果，高（95% WFPS）、中（80% WFPS）和低（67% WFPS）含水量土壤N₂O加权平均排放通量分别为1.17、0.27和0.08 mgN·kg^-1·d^-1，高含水量土壤N₂O排放量均显著高于中、低含水量处理，中含水量处理显著高于低含水量；整个培养周期，高、中和低含水量土壤N₂O+N₂累积排放量分别为培养初期总的无机氮含量的18.05%、5.27%和1.24%（N₂O+N₂累积排放量分别为19.61、5.72和1.35 mgN·kg^-1；各处理NH+ 4-N+NO- 3-N初始含量均为108.62 mgN·kg^-1）；与低含水量处理相比，高、中含水量土壤的N₂O+N₂累积排放量分别增加了13.53倍和3.24倍，高含水量土壤N₂O+N₂累积排放量比中含水量高2.43倍，表现为随着含水量的增加，土壤无机氮（NH+ 4-N+NO- 3-N）以气态氮（N₂O+N₂）形式的损失量逐渐增加。3个含水量处理N₂O的δ¹⁵N^bulk加权平均值变化范围为-42.93‰—-4.07‰，且较高含水量处理显著低于较低含水量处理；10%（V/V）C₂H₂抑制土壤中N₂O还原成N₂的过程，各含水量土壤中，10%（V/V）C₂H₂处理组其N₂O的δ¹⁸O值显著低于0.1%（V/V）C₂H₂处理组，且N₂O/（N₂O+N₂）比率随土壤含水量增加而降低；各处理土壤中同时存在多个N₂O产生过程，对于培养第一周，土壤产生的N₂O的SP值于培养前4 d呈逐渐增加的趋势，之后又逐渐降低，低含水量土壤在第1—2 天产生的N₂O的SP值为6.74‰—12.04‰，反硝化作用对土壤N₂O排放的贡献率为56.36%—66.15%，此培养阶段表现为土壤主要通过反硝化作用产生N₂O，之后，硝化作用贡献率（55.78%—100%）增强；中含水量土壤N₂O的SP加权平均值为10.26‰，该土壤中反硝化作用（40.90%—74.04%）占据主导地位；加10%（V/V）C₂H₂的高含水量处理，在整个培养第一周均具有较高的SP值，变化范围为7.61‰—21.11‰；与0.1% （V/V）C₂H₂处理组相比，10%（V/V）C₂H₂处理的高、中和低含水量土壤排放N₂O的SP加权平均值分别降低了0.10倍、0.33倍和0.06倍。【结论】土壤含水量增加促进N₂O排放，高含水量处理中N₂O排放量最高。67%WFPS处理中，N₂O排放前期以反硝化作用为主，后期以硝化作用为主；80%WFPS处理中，N₂O主要由反硝化过程产生；95% WFPS处理中，N₂O排放以硝化作用为主。

保护性耕作对旱作农田干湿交替过程中土壤呼吸速率的影响

丁新宇，王自奎，杨轩，杜珊珊，沈禹颖

中国农业科学. 2017, 50(24): 4759-4768. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.009

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【目的】探讨免耕及秸秆覆盖等保护性耕作措施对旱作农田干湿交替过程中土壤呼吸速率的影响。【方法】基于设在陇东黄土高原的长期草田轮作定位试验，试验开始于2001年，包括传统耕作（T，翻耕并移除秸秆）、耕作覆盖（TS，翻耕之后覆盖秸秆）、免耕移除秸秆（NT，不翻耕但除去秸秆）和免耕（NTS，不翻耕且保留秸秆）4个处理。2014年7—8月干湿交替阶段季采用LI-8150多通道土壤碳通量测量系统对农田土壤呼吸速率、土壤温度和含水量进行连续原位测定。【结果】T、TS、NT和NTS处理干旱阶段的平均土壤呼吸速率分别为2.16、3.56、2.26和2.45 µmol·m^-2·s^-1，湿润阶段分别为2.09、5.31、2.80和3.56 µmol·m^-2·s^-1。降雨初期秸秆覆盖处理（TS和NTS）土壤呼吸速率动态变化与无秸秆覆盖处理（NT和T）具有显著差异。干湿交替过程中，干旱阶段土壤呼吸速率与土壤温度（19.1—28.2℃）呈负相关、与土壤含水量呈正相关关系；湿润阶段则相反，且土壤含水量对土壤呼吸速率的解释程度降低。土壤呼吸速率在湿润阶段日动态波动较大，其温度敏感性（Q₁₀）在T、TS、NT和NTS处理下分别为1.37、1.24、1.31和1.25；干旱阶段土壤呼吸速率日动态平缓，Q₁₀值低于1.0。【结论】长期保护性耕作提高了农田的土壤呼吸速率，且秸秆覆盖处理比免耕措施提高土壤呼吸速率的效应更加显著。秸秆覆盖能够有效平抑土壤水分和温度的变化，提高土壤呼吸速率，降低土壤呼吸的温度敏感性。论文明确了干湿条件下旱作农田土壤呼吸动态及其影响因素，对准确量化旱作农田碳通量具有积极意义。

肥料袋控缓释对桃树根系生长、氮素吸收利用及产量品质的影响

张亚飞，罗静静，彭福田，郜怀峰，王国栋，孙希武

中国农业科学. 2017, 50(24): 4769-4778. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.010

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【目的】研究肥料袋控缓释和普通沟施对桃园土壤养分动态变化、桃根系生长与分布、氮素吸收利用及果实产量品质的影响，为桃园科学施肥提供参考依据。【方法】以晚熟桃‘瑞蟠21’为试材，从2012年定植开始连续5年采用肥料袋控缓释（BCRF）、等量一次沟施（FSA I）和高量两次沟施（HFSA Ⅱ）的方法施肥，每年4、7、10月测定土壤养分含量；第3年结果后统计果实产量并测定品质指标；第5年采用¹⁵N同位素示踪法研究不同施肥方式下桃树的氮素利用率，同时考察根系的生长与分布。【结果】连续5年肥料袋控缓释土壤中碱解氮、速效磷、速效钾养分含量比较稳定，而肥料沟施处理施肥前期土壤养分含量较高，随后呈下降趋势。连续5年肥料袋控缓释使桃树根系水平方向分布在距树体100 cm范围内，细根比例较高，占根系总长度的83.95%；而沟施处理根幅较大，等量一次沟施处理达140 cm，高量两次沟施处理可达160 cm，且细根比例较小，分别占根系总长度的75.16%和70.63%；袋控缓释处理根系生物量变化幅度小。连续5年肥料袋控缓释处理后，第5年植株的氮素利用率分别为等量一次沟施处理和高量两次沟施处理的1.39倍和1.81倍。综合连续3年产量统计结果，肥料袋控缓释处理的产量比等量一次沟施处理提高22.32%，与高量两次沟施处理无明显差异；果实品质较高量两次沟施处理显著提高。【结论】连续5年采用肥料袋控缓释，桃园土壤养分含量保持稳定，可促进细根的发生，使根系分布集中，形成“密集型根系”，延长了根系寿命，并提高树体对氮素的吸收利用及果实产量和品质。

万寿菊番茄红素β-环化酶基因及其启动子克隆和功能分析

张春玲，王尼慧，王宁乐，包满珠，何燕红

中国农业科学. 2017, 50(24): 4779-4789. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.011

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【目的】克隆万寿菊番茄红素β-环化酶基因和其启动子，进行生物学信息分析，并预测启动子功能，为万寿菊类胡萝卜素的代谢机制和叶黄素含量的调控提供参考依据。【方法】通过RT-PCR技术从万寿菊总RNA中克隆得到TeLCYb的cDNA序列；应用生物学方法分析其DNA序列及其编码蛋白质序列特征，使用DNAMAN和在线软件BoxShade对其氨基酸序列同源性比对分析，并利用MEGA6.0构建进化树，分析其亲缘关系；根据其cDNA序列利用FPNI-PCR法克隆其启动子序列，利用PlantCare在线数据库分析万寿菊TeLCYb启动子调控元件，构建启动子缺失表达载体pTeLCYb（-1969）∷GUS和pTeLCYb（-1140）∷GUS，利用农杆菌介导法侵染烟草，以GUS为报告基因研究不同调控元件的活性。【结果】从万寿菊中成功克隆TeLCYb，生物信息学分析发现，其全长共1 865 bp，开放阅读框为1 527 bp，编码508个氨基酸，氨基酸序列同源比对结果表明其与西洋蒲公英和菊花的同源性最高，且具有LCYb蛋白质特有的保守功能位点和特征多肽序列，在进化上与菊科单独聚为一枝。在已知基因序列的基础上获得长度为1 806 bp的TeLCYb启动子序列，生物学信息分析表明：该启动子除包含核心启动子元件TATA-box、CAAT-box外，还含有多种光应答元件和激素响应元件，其中光响应元件有13个，激素响应元件有5个，此外还具有MYBHv1 结合位点元件、耐热响应元件、生理调控作用元件等顺式调控元件。GUS化学组织染色结果显示不同长度启动子均能够驱动GUS在茎、叶、花药及柱头中表达，但不同组织GUS染色蓝色斑点深度不同，其中花器官中花药和柱头中GUS酶活性最强；相对于启动子pTeLCYb（-1969），pTeLCYb（-1140）启动子还能够驱动GUS在根、叶和花萼中特异性表达，且各组织中GUS酶活性明显强于启动子pTeLCYb（-1969）的GUS化学组织染色结果。【结论】不同长度TeLCYb启动子均能驱动下游GUS的表达，但启动子的作用部位和作用强度存在差异，推测在ATG上游1 140 bp和164 bp区间的光响应元件可能具有增强子的功能，而全长启动子特有的激素响应元件和热响应元件可能具有抑制或降低启动子功能的作用。

基于单链置换的环介导间接PCR鉴别PEDV、TGEV 方法的建立及应用?

郑鸣，李华玮，刘莹莹，王永芬，边传周，郭宏伟

中国农业科学. 2017, 50(24): 4790-4798. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.012

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【目的】猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）所引起的一种急性肠道传染病，临床上以呕吐、腹泻、脱水、高发病率和死亡率为主要特征。PEDV与 TGEV同属α冠状病毒，可以感染各年龄段猪只，尤其对仔猪的危害最为严重，可导致大量仔猪死亡，给养殖业造成严重经济损失。由于PEDV和TGEV感染在临床症状、病理变化和流行病学上极为相似，临床上很难区分，因此，建立一种高效、特异的临床鉴别诊断方法对于预防病毒性腹泻的爆发流行具有重要意义。本试验旨在建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV）环介导间接PCR检测方法，用于猪病毒性腹泻的病原学鉴别诊断。【方法】根据GenBank数据库中PEDV和TGEV基因组序列信息，在对两种病毒基因序列同源性比较的基础上，分别选取PEDV和TGEV核蛋白（N）基因序列的一段高度保守区，设计两条序列相邻的特异性探针，标记于不同大小的TOC1基因片段两端，作为特异性标记的报告基因。此报告基因与待测靶标基因经杂交、环化后，采用1对引物反向PCR扩增报告基因，建立PEDV/TGEV鉴别诊断方法，扩增片段大小分别为404、252bp。【结果】该方法特异性好，可单独或同时检测PEDV和TGEV，与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪A型轮状病毒（RAV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）等常见猪源性病毒无交叉扩增；检测灵敏度高，对PEDV和TGEV的最低极限浓度分别为1.6和8 pg·μL^-1的核酸样品，两种病原的同时检测不影响检测灵敏度；采用环介导间接PCR、常规RT-PCR和SybrGreen实时PCR对157份临床样本进行比较检测，3种方法的PEDV检出率分别为33.76%、21.66%和36.31%，TGEV检出率分别为26.75%、13.38%和28.03%；kappa检验结果，环介导间接PCR、SybrGreen实时PCR两种方法对PEDV和TGEV检测结果的符合度均为96.18%（κ≥0.90）【结论】环介导间接PCR可以用于鉴别诊断PEDV/TGEV，是一种快速、准确、灵敏、特异的病原学诊断工具。

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