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中国农业科学. 2022, 55(14): 0. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.0578-1752-55-14-0

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大豆单锌指蛋白基因GmSZFP的克隆及其在SMV与寄主互作中的功能

赵玎玲,王梦璇,孙天杰,苏伟华,赵志华,肖付明,赵青松,闫龙,张洁,王冬梅

中国农业科学. 2022, 55(14): 2685-2695. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.001

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【目的】由大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV）引起的大豆花叶病是世界性大豆病害之一,利用病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术研究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中发挥的功能,为深入探讨其分子机制奠定基础。【方法】以大豆品种冀豆7号与SMV毒株SC-8、N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料,运用生物信息学预测GmSZFP的分子结构特征;以酵母转录激活试验检测其转录因子活性;借助实时定量PCR（RT-qPCR）验证GmSZFP在大豆与SMV互作中转录水平的表达特征;结合VIGS技术探究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】通过PCR克隆GmSZFP的CDS区,序列全长为1 071 bp;氨基酸序列分析和酵母转录激活试验发现GmSZFP为C₂H₂型锌指蛋白转录因子,且具有转录激活活性;RT-qPCR结果显示,GmSZFP受SMV的强烈诱导,在亲和组合与不亲和组合中的表达模式不同,在不亲和组合中,GmSZFP呈先上升后下降的表达趋势,其表达水平明显高于亲和组合,若在接种病毒前给叶片预注射咪唑,GmSZFP的表达水平降低,并与亲和组合相近,说明GmSZFP在转录水平响应SMV的侵染并受胞内H₂O₂信号调控;利用VIGS技术沉默GmSZFP后,发现接种部位胼胝质的积累水平较对照大大降低,RT-qPCR检测胼胝质合酶基因GmGSL7c和GmGSL12b的表达量较对照降低,胼胝质水解酶基因BG的表达量较对照增加;在基因沉默植株叶片上点接种SMV后72 h,病毒向外扩散至2 mm,在96 h时病毒扩散至3 mm,而对照组叶片在接种点外始终未能检测到SMV外壳蛋白CP的表达;摩擦接种SMV后10 d,在基因沉默植株的上位叶表现出花叶、失绿和卷曲等感病症状,并检测到CP的表达,说明沉默GmSZFP后,SMV在胞间扩散和长距离运输的能力均增强。【结论】大豆GmSZFP是典型的C₂H₂型单锌指蛋白,GmSZFP在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。

水杨酸引发对红麻幼苗耐盐性的影响

胡亚丽,聂靖芝,吴霞,潘姣,曹珊,岳娇,罗登杰,王财金,李增强,张辉,吴启境,陈鹏

中国农业科学. 2022, 55(14): 2696-2708. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.002

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【目的】研究水杨酸（SA）引发对盐胁迫下红麻生长及生理响应,并揭示SA引发对红麻中逆境相关基因的诱导模式,为红麻耐盐性研究提供理论依据。【方法】以2个不同耐盐性红麻品种（盐抗性材料为CP018,盐感性材料为CP047）为研究对象,将种子引发处理后进行水培试验,分析SA引发对红麻种子萌发及150 mmol·L^-1 NaCl胁迫下幼苗农艺性状及生理方面的影响,并通过qRT-PCR技术分析SA引发逆境相关基因的表达模式。【结果】盐抗性品种CP018经过0.2 mmol·L^-1 SA引发后,能显著提升种子发芽率、发芽势和发芽指数,分别提高34.78%、31.30%和58.07%;盐感性材料CP047也有一定的提高,分别提高7.50%、10.56%和6.23%,但是未达到显著水平。在盐胁迫条件下,经SA引发（S1）与未引发（N1）相比,株高抑制率在盐抗性和盐感性品种中分别显著降低4.07%（CP018）和3.91%（CP047）,干重抑制率在2个品种中分别显著降低15.50%（CP018）和15.68%（CP047）;鲜重抑制率在盐感性品种CP047中显著降低4.46%,但在盐抗性品种CP018中未达到显著水平。根系扫描分析表明,根长抑制率在盐抗性和盐感性材料中分别显著下降10.74%（CP018）和10.77%（CP047）;根表面积抑制率在盐抗性和盐感性品种中分别下降5.09%（CP018）和2.95%（CP047）,仅在盐抗性品种CP018中达到显著水平;而根系活力抑制率在盐感性品种CP047中降低46.21%,在盐抗性品种CP018中降低6.56%,仅在盐感性品种CP047中达到显著水平。灰色关联度分析发现根系活力是对影响植株干重最重要的因素。SA引发能降低盐胁迫下红麻叶片的MDA含量,提高POD和SOD酶活性。对12个逆境相关基因的表达量分析结果表明,ACCD、APX2、SOS1、ARR2、PAL、ERF.C3、CHIT和TIFY11表达水平在SA引发处理下均显著上调,而ERF9、ERS1、MYC2和XTH22在2个材料中的表达模式存在差异,其中,XTH22在CP047中显著上调,在盐抗性品种CP018中无显著变化,ERS1和MYC2在盐抗性品种CP018中显著上调,在盐感性品种CP047中却显著下降,而ERF9在2个品种中的趋势则与此相反。【结论】适宜浓度的SA引发可以显著缓解红麻在盐胁迫下的生长,且对不同红麻种质资源的影响程度和方式存在差异,SA可能通过影响生理过程如抗氧化酶系统,并通过诱导特异基因的表达调节红麻植株对非生物胁迫的响应。

秋闲期秸秆覆盖与减氮优化根系分布提高冬小麦产量及水氮利用效率

高仁才, 陈松鹤, 马宏亮, 莫飘, 柳伟伟, 肖云, 张雪, 樊高琼

中国农业科学. 2022, 55(14): 2709-2725. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.003

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【目的】冬春干旱频发和氮的过度施用限制了西南丘陵旱地雨养农业区小麦的产量与可持续发展,探讨秋闲期秸秆覆盖与氮肥减施对旱地小麦根系分布、产量及水氮吸收利用的影响,为优化四川旱地小麦耕作制度和绿色高质高效生产提供依据。【方法】试验于2016–2018年在四川省仁寿县四川农业大学试验基地进行,采用裂区设计,在夏玉米收获后,以秋闲期秸秆粉碎覆盖（SM）和不覆盖（NM）为主区,以不施氮（N₀：0）、减氮（RN：120 kg N·hm^-2）和常规施氮（CN：180 kg N·hm^-2）为裂区,研究分析土壤含水量、根长、根系分布、小麦产量、耗水量（ET）、水分利用效率（WUE）和氮素利用情况。【结果】与不覆盖相比,秋闲期秸秆覆盖显著提高播种至孕穗期0—10 cm和10—20 cm土层含水量及播种时与拔节期0―100cm土层土壤贮水量,秸秆覆盖的保墒效应可持续至孕穗开花阶段;覆盖显著促进小麦拔节期和开花期耕层根系生长,尤其是0—10 cm土层根系直径增加、根长密度显著提高;覆盖下小麦总耗水量、WUE、氮素吸收量、播种至拔节期氮素积累速率、拔节至开花期氮素积累速率、氮素籽粒生产效率（NUEg）、氮肥农学效率（AEN）和氮肥偏生产力（NPFP）两年均值较不覆盖分别提高11.4%、71.8%、73.1%、119.0%、100.0%、3.6%、264.7%和78.2%;覆盖下氮肥回收效率（REN）较不覆盖增加44.4个百分点。覆盖后冬小麦有效穗数、穗粒数和产量两年均值较不覆盖分别提高31.8%、44.4%和92.9%。秸秆覆盖效应大于施氮量效应。与常规施氮量相比,减氮处理未显著降低0—10 cm土层根长密度、耗水量、水分利用效率与籽粒产量;覆盖结合减氮显著提高群体氮素籽粒生产效率、氮肥农学效率、氮肥偏生产力和氮肥回收效率。【结论】秋闲期秸秆覆盖提高播种至拔节期土壤水分含量和储量,促进拔节期小麦根系在表层土壤中的生长,进而促进氮素吸收利用、提高冬小麦产量与水肥利用效率;秋闲期覆盖结合120 kg·hm^-2施氮量是适宜四川旱地冬小麦的减氮增效高产栽培技术模式。

翻耕深度对遮阴油菜根系生长和养分吸收利用的影响

白非, 白桂萍, 王春云, 李真, 龚德平, 黄威, 程雨贵, 汪波, 王晶, 徐正华, 蒯婕, 周广生

中国农业科学. 2022, 55(14): 2726-2739. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.004

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【目的】长江流域油菜季降雨丰沛,导致该地区光照强度下降,加之密植技术的推广,加剧了个体间对光照的竞争。故光照不足、土壤质地差成为制约该地区油菜高产的重要因素。通过研究耕作深度对遮阴油菜根系生长和养分利用的影响,以期为油菜的稳产增收提供理论支撑。【方法】2019—2021年在湖北武汉华中农业大学试验基地进行裂区试验,品种为主区（湘杂油518,XZY518;浙油50,ZY50）,土壤翻耕深度（T5,5 cm;T20,20 cm）为副区,不同光照强度（S0,0%遮阴;S1,30%遮阴）为副副区,研究不同耕作深度下遮阴油菜的土壤养分和理化性质、干物质累积、抗氧化酶活性、根冠生长、养分吸收的变化。【结果】深耕可以促进各层土壤的有机质、碱解氮、速效磷和速效钾养分的积累,其中10—20 cm土壤的养分含量增幅最大,为7.5%—42.3%。两种翻耕深度下,遮阴均导致土壤电导率下降,根表面积减少13.3%—36.6%,主根长、根冠比和侧根占比增加,氮素利用率显著下降3.0%—28.4%,根系干重减少,抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性增加。遮阴条件下,翻耕深度的增加,使土壤含水量降幅减小,油菜主根伸长且根表面积增大,根冠比和侧根占比增加,氮素利用率提高,根系的抗氧化酶（POD、SOD）活性增强,干物质积累增多。方差分析表明翻耕深度和遮阴对根系形态、干物质累积、抗氧化酶活、养分利用的互作效应多呈显著或极显著水平。在浅耕和深耕条件下,与正常光照相比,遮阴导致根表面积分别下降24.9%—36.6%、13.3%—19.2%,氮素利用率分别下降10.0%—28.4%、3.0%—23.9%。【结论】弱光胁迫下,深耕通过提高各层土壤养分含量,使油菜主根伸长,侧根占比增加,根表面积增大,同时根系抗氧化酶活力的增强延缓了根系的衰老,使根系养分吸收能力增强,氮素利用率增大,干物质积累量增大,最终促进了油菜的生长。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

方瀚墨,胡璋健,马巧梅,丁淑婷,王萍,王安然,师恺

中国农业科学. 2022, 55(14): 2740-2751. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.005

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【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO₂浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶（β- carbonic anhydrase,βCA）是植物CO₂感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄（Solanum lycopersicum）等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network 数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型（wild-type,WT）番茄‘Ailsa Craig’（AC）为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000）,利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株（OE-SlβCA3）。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2 100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工（糖基化）,氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。

侵染萝卜的油菜花叶病毒广东分离物分子特征及其致病性分析

李正刚,汤亚飞,佘小漫,于琳,蓝国兵,何自福

中国农业科学. 2022, 55(14): 2752-2761. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.006

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【目的】病毒病是萝卜（Raphanus sativus）生产上的主要病害之一,严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类,探究侵染萝卜的油菜花叶病毒（youcai mosaic virus,YoMV）分子特征及致病性,为萝卜病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广东省惠州市萝卜种植基地采集了3个疑似病毒病侵染的萝卜病样及1个无症状样品,提取样品总RNA,利用小RNA深度测序初步探明病毒种类,然后根据测序结果设计病毒特异引物进行RT-PCR验证。应用分段克隆方法扩增病原病毒YoMV基因组1—3 405 nt片段和3 194—6 304 nt片段,然后通过同源重组克隆到pCB301双元载体上,得到YoMV-GD分离物基因组全长序列,同时构建该病毒分离物的侵染性克隆。利用MEGA7软件对YoMV-GD及其他分离物全长核苷酸序列进行系统进化分析。通过侵染性克隆人工注射接种本生烟和普通烟,检验pCB301-YoMV-GD的侵染性,然后再注射接种萝卜和菜心,测定YoMV-GD分离物的致病性。【结果】侵染广东萝卜的病毒包含萝卜隐状病毒3（Raphanus sativus cryptic virus 3,RsCV3）、萝卜黄病毒1（Raphanus sativus chrysovirus 1,RasCV1）、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus,TuMV）、YoMV 4种;YoMV-GD分离物全长序列为6 304 nt,编码4个蛋白,分别为124.7 kD复制相关蛋白、183 kD复制酶、30 kD运动蛋白MP、17.7 kD外壳蛋白CP,与YoMV英国分离物（GenBank登录号：AY318866）核苷酸相似性最高,为99.18%;YoMV-GD分离物与英国、德国及我国上海、重庆分离物的亲缘关系较近;构建的侵染性克隆pCB301-YoMV-GD可以系统侵染本生烟和普通烟,引起严重的坏死、枯斑等症状,具有较强的侵染性;YoMV-GD可以系统侵染萝卜和菜心,引起轻微的黄化和花叶等症状,致病力较弱。【结论】侵染广东萝卜的病毒包含RsCV3、RasCV1、TuMV和YoMV,且以复合侵染形式存在;YoMV遗传进化并没有明显的地域性;YoMV-GD对烟草致病力较强,而对萝卜和菜心致病力较弱。

新疆小麦、玉米的产量和氮磷钾肥利用效率

汤明尧,沈重阳,陈署晃,唐光木,李青军,闫翠侠,耿庆龙,傅国海

中国农业科学. 2022, 55(14): 2762-2774. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.007

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【目的】明确新疆小麦、玉米化肥利用效率现状,进一步优化养分管理,提高化肥利用效率,为新疆乃至全国粮食安全提供基础数据和技术支撑。【方法】2018—2020年,在新疆主要粮食种植区开展72个田间试验（小麦40个、玉米32个）,设置氮磷钾（NPK）、无氮（PK）、无磷（NK）、无钾（NP）4个处理,3次重复,分析新疆当前施肥条件下小麦、玉米的养分吸收,氮、磷、钾肥产量反应,农学效率,肥料利用率等特征。【结果】（1）新疆小麦氮（N）、磷（P₂O₅）、钾肥（K₂O）平均施用量分别为233.1、128.0和75.5 kg·hm^-2,玉米氮、磷、钾肥平均施用量分别为254.9、148.0和67.8 kg·hm^-2。（2）小麦NPK处理平均产量为7 504 kg·hm^-2,氮、磷、钾肥的平均产量反应分别为2 206 kg·hm^-2（500—3 795 kg·hm^-2）、2 016 kg·hm^-2（288—4 230 kg·hm^-2）和1 362 kg·hm^-2（105—2 910 kg·hm^-2）,施氮、磷、钾肥的平均增产率分别为45.0%、39.7%和23.0%;玉米NPK处理平均产量为13 715 kg·hm^-2,氮、磷、钾肥的平均产量反应分别为4 657 kg·hm^-2（1 559—6 900 kg·hm^-2）、1 942 kg·hm^-2（473—4 699 kg·hm^-2）和1 297 kg·hm^-2（113—5 440 kg·hm^-2）,施氮、磷、钾肥的平均增产率分别为52.2%、21.2%和15.5%。玉米施氮肥的产量反应明显高于小麦。（3）NPK处理中,每形成100 kg小麦籽粒需氮（N）2.7 kg（1.7—4.0 kg）、磷（P₂O₅）0.8 kg（0.4-1.3 kg）、钾（K₂O）2.1 kg（1.2—3.9 kg）;每形成100 kg玉米籽粒需氮（N）2.1 kg（1.5-2.9 kg）、磷（P₂O₅）0.8 kg（0.4-1.2 kg）、钾（K₂O）2.1 kg（0.7—3.4 kg）。（4）新疆小麦氮、磷、钾肥的平均农学效率分别为9.6、15.9和18.7 kg·kg^-1,磷、钾肥显著高于氮肥;玉米氮、磷、钾肥的平均农学效率分别为18.7、13.4和18.1 kg·kg^-1,氮、钾肥显著高于磷肥。玉米氮肥的农学效率高于小麦,磷、钾肥的农学效率两种作物差异不大。（5）新疆小麦氮、磷、钾肥的平均利用率分别为41.4%、21.8%和45.2%;玉米氮、磷、钾肥的平均利用率分别为46.9%、20.5%和49.6%。小麦、玉米的氮、钾肥利用率均显著高于磷肥。【结论】当前新疆小麦、玉米产量水平较高,氮、磷、钾肥利用效率已处于较高水平,氮、钾肥的利用率显著高于磷肥。小麦、玉米对缺氮最为敏感,其次对缺磷,缺钾的减产幅度最低。当前新疆小麦、玉米的氮肥施用量较合理,施钾量不足,小麦存在过量施磷。今后需加大小麦、玉米的钾肥投入,减少小麦的磷肥投入。

原料、炭化温度和生物质炭组分对小白菜生长的影响

钟佳霖,许觜妍,张怡云,李婕,刘晓雨,李恋卿,潘根兴

中国农业科学. 2022, 55(14): 2775-2785. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.008

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【目的】探究不同原料、炭化温度和生物质炭不同组分对植物生长的影响,进而揭示生物质炭的增产机制。【方法】分别以木屑和玉米秸秆为原料,在350、450、550℃下裂解得到生物质炭。采用热水浸提法将生物质炭中的可溶性组分（浸提液）与难溶性组分（炭骨架）分离。通过盆栽试验,研究不同生物质炭及组分对小白菜生长的影响。【结果】添加玉米秸秆生物质炭及其各组分处理下,小白菜地上部生物量平均为16.1 g/盆,显著高于添加木屑生物质炭及其各组分（13.0 g/盆）和对照处理（13.5 g/盆）。与地上部生物量类似,添加玉米秸秆生物质炭及其各组分处理下小白菜根长、根表面积、根体积和根尖数等形态学指标较木屑生物质炭和对照处理显著改善。添加炭骨架处理下小白菜地上部生物量平均为16.5 g/盆,较添加原状生物质炭和浸提液分别提高26.9%和17.9%。添加炭骨架处理下小白菜根长、根表面积、根体积和根尖数较添加浸提液处理分别提高64.1%、51.1%、38.3%和80.0%。不同炭化温度裂解得到的生物质炭对小白菜地上部生物量和根系生长无显著影响。与添加原状生物质炭处理相比,添加炭骨架处理下小白菜地上部氮含量提高25.9%,而磷和钾含量分别降低39.7%和14.1%。添加玉米秸秆生物质炭及其各组分处理下土壤pH、有机碳、全氮、速效磷和速效钾含量较添加木屑生物质炭处理分别提高0.1个单位、20.3%、19.1%、29.1%和189.2%。与添加原状生物质炭相比,添加生物质炭骨架处理下土壤有机碳、全氮、速效磷和速效钾含量分别降低14.6%、6.6%、41.3%和55.1%,土壤pH升高0.13个单位;而添加生物质炭浸提液处理下土壤有机碳、全氮和速效磷含量分别降低49.8%、18.9%和24.2%,土壤pH和速效钾含量无显著变化。相关分析表明,不同处理下小白菜地上部生物量与根长、表面积、平均直径、根体积、根尖数等根系形态指标和土壤pH呈正相关,与小白菜地上部磷含量呈负相关。【结论】生物质炭制备原料和组成是影响植物生长的重要因素,玉米秸秆生物质炭较木屑生物质炭有更好的增产效果;玉米秸秆生物质炭经热水浸提后再添加至土壤中有更好的增产效果。生物质炭中可溶性组分对根系生长的促进作用是生物质炭增产的主要机制,而可溶性组分对根系促生作用与原料、制备温度和其本身物质组成密切相关。

腐殖酸-尿素复合物配施尿素在不同施肥土壤上的NH₃挥发特征

景建元,袁亮,张水勤,李燕婷,赵秉强

中国农业科学. 2022, 55(14): 2786-2796. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.009

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【目的】施用腐殖酸尿素可以有效减少氮素NH₃挥发损失,肥料中的腐殖酸发挥了很大作用,但是由于腐殖酸与尿素反应所得产物腐殖酸尿素复合物（UHA）对土壤NH₃挥发的影响可能不同于常规腐殖酸（HA）,进行相关研究将有利于揭示腐殖酸尿素降低土壤NH₃挥发的机理。【方法】利用无水乙醇从腐殖酸尿素中提取得到UHA,在长期不施肥与长期施肥土壤上,开展室内恒温土壤培养试验,研究HA或UHA配施尿素对土壤NH₃挥发的影响,二者的用量分别为尿素用量的0.5%与5%,分别用0.5HA+U、5HA+U、0.5UHA+U和5UHA+U表示,同时设置单施尿素（U）及不施尿素与腐殖酸处理（CK）。测定土壤NH₃挥发速率及累积量,土壤尿素态氮、硝/铵态氮含量,土壤脲酶活性等。【结果】（1）各施氮处理,长期施肥土壤NH₃挥发累积量均高于长期不施肥土壤,这可能与长期施肥导致土壤pH远低于不施肥土壤,土壤硝化过程减弱,尿素水解产生的铵态氮在土壤中累积有关。（2）HA或UHA配施尿素均可以有效降低土壤NH₃挥发量,但是降低幅度与土壤是否长期施肥及二者用量有关：在长期不施肥土壤上,与单施尿素（U）相比,HA配施尿素土壤NH₃挥发量可显著降低4.4%—22.9%（P<0.05）,且5HA+U处理降低幅度大于0.5HA+U处理,但是在长期施肥土壤上,尿素配施HA处理,土壤NH₃挥发量仅降低4.1%—7.5%,与U处理无显著差异;然而,尿素配施其用量0.5%的UHA,在长期不施肥与长期施肥土壤上均可以显著降低土壤NH₃挥发累积量（P<0.05）,土壤NH₃挥发量较单施尿素处理分别降低26.5%与12.9%（P<0.05）。（3）HA降低土壤NH₃挥发量可能与降低土壤脲酶活性有关,而UHA可能与促进土壤硝化过程有关。【结论】土壤培养条件下,与常规腐殖酸相比,腐殖酸尿素中的腐殖酸尿素复合物可更加有效地减少土壤NH₃挥发量,且作用效果与土壤是否长期施肥无关。

葡萄醇酰基转移酶编码基因遗传变异研究

冀晓昊,刘凤之,王宝亮,刘培培,王海波

中国农业科学. 2022, 55(14): 2797-2811. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.010

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【目的】开发适用于葡萄香气表型鉴定的分子标记,为葡萄分子辅助育种提供理论依据。【方法】采用固相微萃取结合气相质谱法对45个葡萄品种进行香气组分和含量测定,并分别采用Sanger测序和扩增子测序的方法对葡萄醇酰基转移酶编码基因（VvAAT）结构变异和SNP变异进行分析。【结果】45个葡萄品种中共发现65种香气组分,可以分成酯类、醇类、萜类和醛类4种类型,其中酯类香气含量表现出显著的品种差异性,‘巨峰’等20个葡萄品种酯类香气含量丰富,而‘87-1’等25个葡萄品种检测不到酯类香气;VvAAT共发现了5种结构变异类型,类型I、II、IV和V由于过早终止密码子或片段插入变异,不能正确翻译,仅类型III可以正常翻译,根据其氨基酸序列系统进化树分析结果,又可以分成III.1和III.2两种类型,结合香气测定数据,III.1为功能型,其余均为非功能型;扩增子测序及生信分析发现了8个位于外显子区域的SNP位点（T32C、A69T、G436C、A1247G、A1818T、G1929T、A1959G和C1975G）,均导致了编码氨基酸的突变,可以准确区分酯香型品种和非酯香型品种,准确率为97.8%。【结论】葡萄VvAAT位点存在丰富的遗传变异,包括基因结构变异和SNP变异;位于编码区的8个SNP位点能够准确判定葡萄酯类香气表型,可以应用于葡萄分子辅助育种。

西瓜果形基因图位克隆及分子标记开发

段雅如,高美玲,郭宇,梁晓雪,刘秀杰,徐洪国,刘继秀,高越,栾非时

中国农业科学. 2022, 55(14): 2812-2824. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.011

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【目的】基于GBS（Genotyping-by-sequencing）高密度遗传图谱初步定位结果,通过图位克隆方法对西瓜果形基因进行精细定位,并开发功能性分子标记,有助于全面研究果形基因的功能及分子标记辅助选择育种。【方法】利用114份纯合西瓜品系全基因组重测序数据及其果形指数表型进行GWAS（genome-wide association study）分析,结合GBS高密度遗传图谱初步定位结果确定果形基因候选区段,以商业小型西瓜品种纯化所得品系K2（椭圆形、FSI=1.54±0.13）和L1（圆形、FSI=1.11±0.07）为材料构建F₂群体,通过开发分子标记对果形基因ClFSI进行精细定位,根据西瓜参考基因组‘97103’v1注释信息确定候选基因,并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行验证。【结果】利用1 152份F₂群体,最终将ClFSI精细定位于3号染色体的FMFSI-1与FMFSI-2标记之间物理距离约63 kb区间内,共包含5个注释基因。其中Cla011257属于已报道与控制果实纵径和果形相关的SUN基因家族。经测序分析发现,西瓜椭圆形品系K2在该基因第3外显子上存在两个非同义突变位点Chr3：26846636 G-A和Chr3：26847041 G-A（‘97103’v1）,分别导致天冬酰胺（Asn）替换为天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）替换为赖氨酸（Lys）,并利用Chr3：26847041突变位点开发功能性分子标记FSICAPS-2。qRT-PCR分析表明,K2（椭圆形）与Charleston Gray（细长形）中候选基因表达量无显著性差异,但均显著高于L1（圆形）。【结论】本研究将控制西瓜果形的ClFSI精细定位于3号染色体63 kb区间内,推测Cla011257为最终目的基因,Chr3：26847041和Chr3：26846636突变位点是导致果形不同程度伸长的重要位点,并开发了可以同时鉴定Cla011257多种突变类型的功能标记FSICAPS-2。

不同干制方式对沙田柚果渣粉活性物质的影响

卢琦,贾栩超,邓梅,张瑞芬,董丽红,黄菲,池建伟,刘磊,张名位

中国农业科学. 2022, 55(14): 2825-2836. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.012

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【目的】比较热风干燥和冷冻干燥这两种干制方式所得沙田柚果渣粉膳食纤维（DF）和黄酮的组成、含量及理化功能特性,为沙田柚副产物在功能食品加工中的应用提供理论依据和技术支撑。【方法】以沙田柚榨汁后的果渣为原料,通过热风干燥和冷冻干燥两种干制方式,得到沙田柚果渣粉,分别测定两种果渣粉可溶性DF（SDF）和不溶性DF（IDF）的含量,通过扫描电镜观察沙田柚果渣粉的微观结构,测定其持水力、持油力和吸水膨胀力;采用福林酚法及硼氢化钠/氯醌比色法测定沙田柚果渣粉的总酚、总黄酮含量,采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）分析其单体黄酮组成,采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity,ORAC）、ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力（ferricreducing antioxidant power,FRAP）测定其抗氧化活性。【结果】热风干燥沙田柚果渣粉总DF（TDF）含量（46.10 g/100 g DW）显著高于冷冻干燥果渣粉（P<0.05）,两种干制方式得到的沙田柚果渣粉IDF/SDF比值较为均衡,分别为1.5和1.6,热风干燥果渣粉持水力（（7.55±0.43）g·g^-1DW）和持油力（（1.94±0.08）g·g^-1 DW）略高于冷冻干燥果渣粉,但后者的吸水膨胀力（12.25 mL·g^-1 DW）显著高于前者（P<0.05）;沙田柚果渣粉中酚类物质主要以游离态形式存在,占总酚含量的95%以上,热风干燥果渣粉总酚含量（5.54 mg GAE·g^-1 DW）显著高于冷冻干燥果渣粉（P<0.05）,但二者总黄酮含量无显著性差异（P>0.05）,分别为13.11和11.45 mg CE·g^-1 DW;与其他柑橘属水果主要单体黄酮为柚皮苷不同,沙田柚果渣粉主要单体黄酮为柚皮苷和melitidin,占其总黄酮含量的70%以上;热风干燥果渣粉较冷冻干燥果渣粉显示出更强的抗氧化活性,其ORAC、ABTS和FRAP值分别为141.28、4.63和20.98 μmol TE·g^-1 DW。【结论】沙田柚果渣粉同时富含DF和黄酮,且其DF的水合性质和黄酮的抗氧化活性均高于常见的水果副产物,是良好的DF和黄酮补充剂,适合用于功能食品的开发。

黄羽肉鸡胚期卵黄微生物动态变化及对早期肠道微生物定殖的影响

丁鹏,仝月月,刘会超,尹鑫,刘将军,贺喜,宋泽和,张海涵

中国农业科学. 2022, 55(14): 2837-2849. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.013

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【目的】研究黄羽肉鸡种蛋孵化过程中卵黄微生物区系的动态变化和功能,及卵黄微生物对肉鸡胚胎肠道早期微生物定殖的影响。【方法】选取35周龄黄羽肉鸡种蛋100枚,放置在全自动孵化箱中孵化。种蛋入孵前对孵化箱进行清洁消毒,检查内部通风系统和湿度控制系统是否正常工作。孵化温度控制在（37.5±1）℃,湿度控制在（60±10）%。在种蛋孵化的第7、11、15和19天随机选取6枚种蛋在无菌操作台中剥去蛋壳及尿囊膜,使胚胎露出卵黄囊后通过无菌注射器刺入,收集卵黄样品。在孵化的第19和21天在超净工作台中使用经灭菌的手术刀和镊子解剖鸡胚,切开鸡胚腹部后收集胚胎中全肠道样品。样品采集后迅速放入液氮中速冻,随后转入-80℃冰箱中保存待测。对卵黄微生物进行DNA提取,并进行16s rDNA测序和序列分析。【结果】1）黄羽肉鸡种蛋卵黄中存在丰富的微生物区系,共注释到4 305个OTU（operational taxonomical unit）,在不同孵化时间点卵黄和胚胎肠道中微生物共具有18个门（Phylum）,34个纲（Class）,53个目（Order）,89个科（Family）,126个属（Genus）。门水平上主要包括变形菌门（Proteobactreia）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）等,属水平上以嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、水杆菌属（Aquabacterium）、粪杆菌属（Faecalibacterium）等为主;2）黄羽肉鸡种蛋卵黄微生物区系在不同孵化阶段的Alpha多样性中Chao1指数（P=0.027）和Shannan指数（P=0.043）出现显著差异。随着孵化时间的推移,卵黄微生物区系趋于稳定,同时卵黄中阿克曼氏菌属（Akkermansia）相对丰度不断提高,在E07、E11、E15和E19分别为0.53%、0.84%、1.43%和3.10%。卵黄微生物区系在属水平上主要包括嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）,罗尔斯通菌属（Ralstonia）、水杆菌属（Aquabacterium）等;3）黄羽肉鸡种蛋卵黄微生物功能主要包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、辅助因子和维生素代谢等;4）黄羽肉鸡种蛋卵黄微生物区系和胚胎肠道微生物区系在门水平上均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）为主,在属水平上均以嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、水杆菌属（Aquabacterium）、阿克曼氏菌属（Akkermansia）为主。【结论】黄羽肉鸡种蛋卵黄中含有丰富的微生物种群,其对卵黄营养物质吸收代谢及胚胎肠道早期微生物区系的建立有重要作用。

咖啡酸苯乙酯通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解猪精液常温保存氧化应激的作用机制

蓝群,谢颖瑜,曹嘉程,薛丽娥,陈德军,饶勇勇,林瑞意,方绍明,肖天放

中国农业科学. 2022, 55(14): 2850-2861. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.014

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【目的】探究咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester,CAPE）通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解氧化应激对猪精液的影响及其分子机制。【方法】选取8头成年（1—2岁）、健康状况良好长白种公猪进行鲜精采集,将质检合格的样品混池待用。试验设计如下：首先,在常温基础稀释液中分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g·L^-1浓度的CAPE,将精液样品与各个浓度组依次混合后放置室温平衡,随即转入17 ℃电子恒温冰箱进行常温保存。全自动精子分析仪（CASA）测定1—5 d精子运动学参数（总活率与渐进性活力）,筛选出最佳适宜浓度为0.06 g·L^-1。其次,将0.06 g·L^-1 CAPE与400 μmol·L^-1的H₂O₂建立氧化胁迫模型,在第1、3、5天分别采用CASA测定精子总活率与渐进性活力,荧光探针技术评估质膜完整性与顶体完整性,抗氧化试剂盒检测过氧化氢酶（catalase,CAT）与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,在第5 天利用实时荧光定量 PCR技术测定AMPK/FOXO3a信号通路下游靶向基因（AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT）及凋亡基因BAX的mRNA表达水平,蛋白免疫印记技术测定AMPK、p-AMPK蛋白表达。【结果】（1）浓度筛选试验中,0.06 g·L^-1的CAPE在保存第3 天显著提高精子的总活率并维持至第5天（P<0.05）,不仅如此,精子的渐进性活力在第1 天显著高于其他处理组（P<0.05）。（2）氧化胁迫试验中,H₂O₂处理组的精子质膜完整性、顶体完整性、总活率、渐进性活力、SOD与CAT活性在保存的第5天均极限显著低于空白组与CAPE+H₂O₂混合组（P<0.001）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的总活率、顶体完整性、CAT与SOD活性不存在显著差异（P>0.05）。与CAPE+H₂O₂混合组相比,H₂O₂处理组AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,BAX的表达水平显著升高（P<0.05）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的AMPK、SOD1、CAT与BAX不存在显著差异（P>0.05）。在蛋白表达水平中,CAPE+H₂O₂混合组与H₂O₂组相比,AMPK、p-AMPK 与p-AMPK/AMPK比率显著提升（P <0.05）。【结论】在常温基础稀释液中添加0.06 g·L^-1CAPE可通过促进磷酸化AMPK的表达,诱导AMPK/FOXO3a信号下游抗氧化分子的转录,继而缓解H₂O₂介导的氧化危害对精液品质产生的影响,延长精液的保存时间,但CAPE保护精子氧化损伤更为深入的分子机制仍需作进一步探究。

黏菌素促进mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移

王雪杨,蒋君瑶,杨璐,邵东延,吴聪明,沈建忠,沈应博,汪洋

中国农业科学. 2022, 55(14): 2862-2874. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.14.015

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【背景】黏菌素是人医临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”药物,其同时作为饲料添加剂及治疗用药长期用于畜禽养殖业。2015年,我国研究人员首次报道了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1,预示该道防线面临被攻破的风险。然而,杀菌浓度及亚抑菌浓度的黏菌素对mcr-1阳性质粒传播的影响仍未知。【目的】以流行最广的mcr-1阳性IncI2型质粒为研究对象,探究不同浓度黏菌素对该质粒接合转移频率的影响,为黏菌素的科学使用提供理论依据。【方法】使用肉汤法进行了不同浓度黏菌素（0.02-4 μg·mL^-1）作用下携带mcr-1的IncI2型质粒的接合转移试验。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及构建的公式计算不同时间点（1-24 h）的接合转移频率,并分析不同浓度黏菌素对IncI2质粒接合转移频率的影响。使用PI染料、活性氧（ROS）检测试剂盒测定不同浓度黏菌素下供体菌和受体菌的细胞膜透过性和ROS产生量。选取了对照组与低中高浓度3个处理组（0.02、1、4 μg·mL^-1）进行了转录组测序,使用Deseq2软件进行基因差异表达分析。采用Prism v8.2.0软件对不同组间接合转移频率、细胞膜透过性及ROS产生量的差异进行统计学分析。【结果】结合本研究建立的接合转移频率计算公式表明黏菌素浓度为4 μg·mL^-1时可在不同时间点提高mcr-1阳性IncI2质粒3-10倍的接合转移频率,而其他浓度则无显著差异。转录组结果显示,与对照组相比,低中高浓度黏菌素均可显著提高IncI2质粒上IV型分泌系统相关基因的表达,其中包括virB1、virB2、virB5以及traC。此外,黏菌素增加了I型菌毛合成基因fim的转录水平。PI染色结果显示当黏菌素浓度为2和4 μg·mL^-1时,可增强供体菌和受体菌的细胞膜透过性,且转录组结果也显示膜相关基因（ompAX、bamDE、lolB、yiaD、csgEF）的转录水平均出现显著上调。但是黏菌素作用后ROS产生量及相关基因的转录水平无显著提高。【结论】揭示了黏菌素可通过增加细菌IV型分泌系统活性、细胞膜透过性和菌毛的生成从而提高mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移频率。研究结果提示,杀菌浓度无法完全杀死mcr-1阳性大肠杆菌的同时,还能增加质粒传播速度。因此,畜禽养殖业中黏菌素的治疗使用可能维持mcr-1阳性质粒的存在及传播,此外鉴于黏菌素已批准用于人医临床,该现象有可能引起临床黏菌素治疗mcr-1阳性病原菌的失败。

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