中国农业科学

2023年第56卷第7期中英文目录

中国农业科学. 2023, 56(7): 0.

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水稻穗发育与高产育种

李云峰, 任德勇

中国农业科学. 2023, 56(7): 1215-1217. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.001

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DEP1、Gn1a和qSW5组合应用调控水稻穗部性状

温一博, 陈淑婷, 徐正进, 孙健, 徐铨

中国农业科学. 2023, 56(7): 1218-1227. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.002

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【目的】水稻是重要的粮食作物，为全球超过一半的人口提供主食。穗部性状是影响水稻产量的主要因素，挖掘调控穗部性状的优异基因组合，为提高水稻产量提供聚合育种策略。【方法】以弯穗型籼稻品种R99和直立穗型粳稻品种SN265构建的151个重组自交系为试材，应用Illumina测序平台对重组自交系和双亲进行全基因组重测序。结合表型数据与遗传图谱，对每穗粒数、一次枝梗着粒数、二次枝梗着粒数和粒型进行QTL分析，筛选QTL区间内的候选基因，应用基于三代测序组装的SN265和R99高质量基因组进行候选基因预测和序列比对，在重组自交系中筛选产量性状表现最好的基因组合，并在SN265遗传背景下应用CRISPR基因编辑技术对目标位点进行基因编辑。【结果】 R99每穗粒数和二次枝梗着粒数显著多于SN265，SN265的一次枝梗着粒数显著高于R99，R99粒型细长，SN265粒型短圆。每个重组自交系平均测序深度为6.25×，R99和SN265的测序深度分别为30×和32×。获得1 456 445个高质量的SNP，利用划bin策略进行图谱构建，得到一个包含3 569个bins，平均长度为58.17 kb的遗传图。QTL分析在第9染色体检测到一个同时调控每穗粒数、一次枝梗着粒数和二次枝梗着粒数的QTL，在第1染色体鉴定到一个调控每穗粒数和二次枝梗着粒数的QTL，在第5染色体鉴定到一个调控粒型的QTL。候选基因预测和序列比对发现第9染色体的DEP1同时调控水稻一次和二次枝梗着粒数，第1染色体的Gn1a主要调控水稻二次枝梗着粒数，第5染色体的qSW5主要调控粒型。在151个重组自交系中，对DEP1、Gn1a和qSW5的不同组合进行分类并调查产量构成因素，发现Gn1a^R99/DEP1^SN265/qSW5^SN265等位基因组合产量表现最好，Gn1a^SN265/DEP1^R99/qSW5^R99产量表现最差。对SN265的Gn1a位点进行分子设计育种，获得2个独立的CRISPR基因编辑株系，通过调查其产量构成因素，发现基因编辑植株穗长显著变长，每穗粒数显著增加，进而显著增加单株产量。【结论】揭示了DEP1、Gn1a和qSW5对每穗粒数和粒型的影响，明确了Gn1a^SN265/DEP1^R99/qSW5^R99为重组自交系中最佳基因组合，通过改良SN265的Gn1a位点进一步提高了其单株产量。

水稻CSSL-Z481代换片段携带的穗部性状QTL分析及次级代换系培育

李儒香, 周恺, 王大川, 李巧龙, 向奥妮, 李璐, 李苗苗, 向思茜, 凌英华, 何光华, 赵芳明

中国农业科学. 2023, 56(7): 1228-1247. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.003

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【背景】粮食安全是保障国家安全的重要基础，水稻是人民赖以生存的主要粮食作物，提高其产量是重要的育种目标。水稻产量由每株有效穗数、每穗实粒数和粒重等性状构成，其中，粒重与籽粒形状、充实程度等密切相关。但这些性状都是由多基因控制，遗传基础复杂。染色体片段代换系(CSSL)可将这些复杂性状的QTL较准确地分解为单个孟得尔因子研究，且与育种工作紧密衔接，因而是理想的遗传研究和育种材料。【目的】前期以4代换片段的水稻染色体片段代换系Z481精细定位了一个易落粒基因SH6，但Z481与受体日本晴间还存在多个显著差异的穗部性状。明晰控制这些差异性状的QTL在代换片段上如何分布，并分解为单片段代换系，对目标QTL的图位克隆及应用于水稻分子设计育种有重要应用价值。【方法】利用受体亲本日本晴与Z481杂交构建的次级F₂分离群体以SAS9.3统计软件的混合线性模型（mixed linear model，MLM）法进行穗部性状QTL定位（P<0.05），然后，根据基因型和表型，从F₂选择42个单株在F₃株系利用MAS法培育单片段及双片段代换系，并利用IBM SPSS Statistics 25.0的ONE-WAY ANOVA和TWO-WAY ANOVA分析及LSD和Duncans多重比较（P<0.05）分析这些单片段代换系（SSSL）和双片段代换系（DSSL）的QTL加性和上位性效应。【结果】以日本晴/Z481构建的次级F₂群体共定位出12个控制水稻穗部性状的QTL，并培育出相应QTL的11个单片段代换系（S1—S11）和3个双片段代换系（D1—D3）。其中，有8个QTL（qGL1、qGL3、qGL6、qGW1、qGW3、qRLW1、qRLW3和qRLW6）可被单片段代换系所验证，表明这些QTL遗传稳定。此外，利用单片段代换系鉴定到qGL1-2、qGL1-3、qGL3-2等33个QTL。其中，qNSB1-1等15个可能为新鉴定的QTL。且利用3个DSSL分析了非等位QTL间的上位性效应，结果表明，不同QTL聚合会产生不同的上位性效应，如qGL3（a=1.26）和qGL6-2（a=0.86）聚合产生了-0.77的上位性效应，据DSSL遗传模型，D2的粒长遗传效应（1.35）产生了更长的粒长表型；qGWT3-2（a=3.18）和qGWT6-2（a=3.39）聚合产生了-5.46的上位性效应，则D2的千粒重遗传效应（1.11）产生了更小的籽粒。【结论】 Z481的4个代换片段上共携带45个水稻穗部性状的QTL，并进一步分解到11个次级单片段代换系上，单片段代换系具有比F₂群体更高的QTL检测效率。利用SSSL和DSSL解析的水稻穗部性状QTL的加性效应和上位性效应，有助于根据这些遗传信息预测设计基因型的表型，从而选择合适的SSSL进行育种设计。

水稻PDL2的突变导致小穗外稃退化

赵梓钧, 吴如会, 王硕, 张君, 游静, 段倩楠, 唐俊, 张新芳, 韦秘, 刘金艳, 李云峰, 何光华, 张婷

中国农业科学. 2023, 56(7): 1248-1259. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.004

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【目的】小穗是禾本科植物特有的花器官。在水稻中，小穗作为花序的基本单位和独有结构，对水稻的产量和品质具有重要影响。因此，研究水稻小穗和花器官的发育，为水稻产量和品质的形成提供依据。【方法】使用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）诱变籼稻保持系西农1B，获得2个具有相似突变表型的水稻等位突变体polarity defect of lateral organs 2-1和polarity defect of lateral organs 2-2（pdl2-1和pdl2-2）。由于二者表型相似，选取pdl2-1（命名为pdl2）为材料，通过显微观察和石蜡切片技术分析其小穗突变表型；通过农艺性状考察分析小穗外稃突变对水稻产量的影响；通过图位克隆技术验证PDL2的功能；运用原位杂交技术及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析PDL2的表达模式。【结果】表型分析结果表明，与野生型相比，pdl2突变体外稃明显变窄，不能与内稃紧密钩合，导致小穗开裂，内轮花器官部分裸露在外，但其雄蕊、雌蕊和浆片的形态和数量均表现正常。进一步的石蜡切片结果表明，突变体外稃硅化细胞和泡状细胞体积、数量的降低，以及维管束间距的减小，是导致pdl2外稃的宽度明显变窄的原因。农艺性状考察表明，pdl2外稃的变化最终引起籽粒呈水滴状，并使得pdl2突变体的结实率和千粒重等产量性状明显下降。遗传分析和图位克隆结果表明，PDL2是一个单隐性核基因，是位于水稻第4染色体的OsDCL4。该基因编码一个Dicer-like蛋白，在水稻ta-siRNA的合成途径中发挥重要作用，并且pdl2突变体是OsDCL4的一个新的弱等位突变。利用原位杂交技术及RT-qPCR技术进行的表达模式分析和基因功能分析结果表明，PDL2在水稻各轮花器官中组成型表达，该基因的突变不会影响水稻花器官特征的形成，但会干扰水稻ta-siRNA合成，影响水稻近-远轴极性建立相关基因的表达，从而导致突变体外稃近-远轴极性建立紊乱。【结论】水稻外稃退化基因PDL2的突变使得外稃近-远轴极性建立紊乱，影响小穗外稃的发育和产量性状的形成。

水稻短宽粒基因SWG1的图位克隆

朱洪慧, 李映姿, 高远卓, 林泓, 王成洋, 晏紫仪, 彭瀚平, 李田野, 熊茂, 李云峰

中国农业科学. 2023, 56(7): 1260-1274. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.005

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【目的】水稻产量由单位面积有效穗数、每穗粒数和粒重3个因素构成，其中，粒重主要由水稻的籽粒形态决定。筛选和鉴定新的粒型突变材料和基因，可为产量性状的分子设计育种奠定基础。【方法】在籼稻保持系西大1B（XD1B）的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变群体中鉴定到一个短宽粒突变体short and widen grain 1（swg1）；分析籽粒形态和其他农艺性状，并对颖壳进行组织细胞学观察分析；运用BSA法进行基因定位；通过遗传互补试验确定候选基因；采用qRT-PCR分析该基因的表达模式及其他粒型相关基因和细胞发育基因的表达水平。【结果】农艺性状分析发现，与野生型相比，swg1突变体粒长显著降低，粒宽显著增加，表现出短宽粒的表型；进一步组织和细胞学分析，发现突变体颖壳纵向细胞变短是粒长变短的主要原因，而粒宽增加是由于颖壳横向细胞数目和细胞大小同时增加。遗传分析结果表明，该突变性状受隐性单基因控制，通过图位克隆与遗传互补验证，确定候选基因为LOC_Os07g42410，编码一个植物特异转录因子。qRT-PCR分析发现该基因表达无明显的组织特异性，在茎、叶、幼穗中表达强烈。通过对已知粒型相关基因、细胞周期和细胞扩展相关基因进行分析，发现通过正向调控颖壳横向细胞数目和（或）细胞大小决定粒宽的GS5和GW8在突变体中上调明显，而正向调控纵向细胞数目和大小并负向调控横向细胞数目和大小的GW7/GL7在突变体明显下调；另外，部分与细胞周期和细胞扩展相关的基因也在突变体和野生型之间的表达也呈现显著差异。【结论】 SWG1编码一个植物特异的转录因子，通过调控粒型基因（GS5、GW8和GW7/GL7等）影响颖壳的细胞增殖和细胞扩展，从而决定水稻籽粒长度和宽度。

水稻α-淀粉酶基因的表达模式与颖花开放的关系

张绩, 周上铃, 何发, 刘莉莎, 张玉娟, 何晋宇, 杜晓秋

中国农业科学. 2023, 56(7): 1275-1282. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.006

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【目的】淀粉降解与水稻浆片膨大和颖花开放过程密切相关，探究α-淀粉酶基因在颖花开放过程中的作用，为杂交水稻制种效率及产量的提高提供理论依据。【方法】在水稻扬花时，利用稀释碱性品红溶液进行离体穗子吸水试验，观察碱性品红在颖花中残留的组织，通过碘-碘化钾染色法确定11—14期（依据雄蕊发育分期）淀粉粒的分布变化，并通过RT-PCR、RT-qPCR和GUS报告基因检测多个α-淀粉酶基因在此期间的时空表达模式。【结果】水稻颖花开放前，内外稃片通过相互嵌合的钩合槽（marginal tissues of palea，mtp）将浆片和雌雄蕊封闭在内。当颖花开放时，浆片快速膨大，使得内外稃片的钩合点松开。扬花期间，离体穗子在稀释碱性品红溶液中吸水后，碱性品红染料主要残留在内外稃片钩合槽和浆片相连处组织以及花丝中。碘染试验显示，在12期（颖花开放前），淀粉粒主要分布在雄蕊和内外稃片钩合槽，浆片中也有少量淀粉粒，在13—14期（颖花开放中），内外稃片钩合槽和浆片中的淀粉粒均降解。RT-PCR分析发现OsRAmy2A和OsRAmy3D的表达量从12期开始上升，至13—14期表达量显著增强，到受精后1 d（1 day after pollination，DAP1）表达量又明显下降，OsRAmy3E和OsRAmy3F在此过程中持续表达，OsRAmy3F表达量弱于OsRAmy3E。RT-qPCR分析显示，在11—14期，OsRAmy2A表达量变化最显著，其次是OsRAmy3A和OsRAmy3E，OsRAmy3F的表达量变化幅度最不明显，OsRAmy2A和OsRAmy3A在13—14期表达量显著增加，而OsRAmy3E和OsRAmy3F在不同时期均表达，在13—14期表达量略有升高。在12期，OsRAmy2A主要在内外稃以及内外稃片钩合槽上表达，在13—14期主要在内外稃片钩合槽、浆片以及花丝上表达。【结论】水稻颖花开放过程中淀粉粒在mtp和浆片中明显降解，与OsRAmy2A、OsRAmy3D等α-淀粉酶基因时空表达模式相对应，可能与水稻浆片膨大导致颖花开放过程密切相关。

绿肥还田结合减量施氮对玉米干物质积累分配及产量的影响

王鹏飞, 于爱忠, 王玉珑, 苏向向, 李悦, 吕汉强, 柴健, 杨宏伟

中国农业科学. 2023, 56(7): 1283-1294. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.007

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【目的】分析绿洲灌区玉米干物质积累分配特征及籽粒产量对绿肥还田结合减量施氮的响应，以期为该区域发展高产、高效玉米生产技术提供理论依据。【方法】田间试验于2020―2021年在甘肃河西绿洲灌区进行，研究绿肥还田结合不同的减氮比例（绿肥还田结合减量施氮0%，N100；绿肥还田结合减量施氮10%，N90；绿肥还田结合减量施氮20%，N80；绿肥还田结合减量施氮30%，N70；绿肥还田结合减量施氮40%，N60）对玉米干物质积累分配及产量的影响。【结果】拔节期后N80和N90处理地上干物质积累量显著高于N70和N60处理，至成熟期N80处理较N70和N60处理提高了13.3%—23.2%，N90处理较N70和N60处理提高了13.9%—23.7%，N100、N90、N80处理间无显著差异；N80处理较N70和N60处理玉米地上干物质最大增长速率和平均增长速率显著提高了9.5%—21.2%、13.0%—23.2%，N90处理较N70和N60处理显著提高了10.2%—21.8%、13.9%—23.7%，二者均有效延缓了吐丝期至灌浆期玉米地上干物质积累速率的降低，而且N80处理较N70和N60处理干物质最大增长速率出现的天数提前了2.44和2.77 d，N90处理较N70和N60处理提前了1.92和2.3 d；在成熟期，N80和N90处理较N70和N60处理促进了玉米穗部干物质分配，有效提高了花前干物质转运对籽粒干物质积累贡献率，同时N80处理花后干物质积累量较N70和N60处理分别提高12.2%和20.4%，N90处理较N70和N60处理分别提高12.4%和20.5%，差异显著。N100、N90、N80处理间玉米籽粒产量无显著差异，但N80处理玉米籽粒产量较N70和N60处理分别增加16.8%和27.4%，N90处理较N70和N60处理分别提高17.4%和27.9%，差异显著。【结论】豆科绿肥还田结合减量施氮10%和20%处理增加了玉米地上干物质积累量和积累速率，促进了成熟期穗部干物质的分配，提高了花前干物质转运对籽粒干物质积累贡献率，可作为绿洲灌区获得玉米高产的推荐施氮方式。

外源色氨酸对低氮胁迫下高粱苗期叶片碳氮平衡和衰老特性的影响

谷闻东, 刘春娟, 李邦, 刘畅, 周宇飞

中国农业科学. 2023, 56(7): 1295-1310. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.008

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【目的】研究外源色氨酸对低氮胁迫下高粱叶片衰老的影响，探讨低氮条件下高粱叶片碳氮平衡与衰老的关系，旨在挖掘高粱耐低氮胁迫的有效调控手段。【方法】选用耐低氮高粱自交系398B和氮敏感自交系CS3541为试验材料，采用水培试验，设置正常氮（5 mmol·L^-1）和低氮（0.5 mmol·L^-1）2个氮水平，并进行50 mg·L^-1外源色氨酸喷施处理，喷施10 d后测定叶片形态、组织结构、光合特性、叶绿素荧光参数、叶片碳氮代谢相关物质含量和酶活性、C/N及衰老相关基因表达水平，并分析低氮胁迫下高粱幼苗叶片C/N与衰老相关基因的相关性。【结果】（1）与正常氮水平相比，低氮胁迫显著降低了398B和CS3541的叶面积，而外源色氨酸处理使398B和CS3541的叶面积显著增加了36.72%和52.06%；外源色氨酸显著增加了低氮胁迫下398B和CS3541的叶干重和叶鲜重。（2）与正常氮水平相比，低氮胁迫下，398B花环结构相对完整，而外源色氨酸处理使叶片细胞排列整齐，花环结构清晰；外源色氨酸显著增加了低氮胁迫下398B叶片叶绿素含量（36.85%），而未显著提高CS3541叶片各色素含量。（3）低氮胁迫下，与未喷施色氨酸相比，外源色氨酸处理使叶片光系统II（PSII）表现出更高的最大光化学效率（F_v/F_m）和热耗散（NPQ），增加了叶片光合速率，从而维持叶片更强的光合能力。（4）外源色氨酸提高了低氮胁迫下高粱叶片氮含量和碳氮代谢相关酶活性；降低了高粱叶片碳水平（可溶性糖、蔗糖、淀粉和总糖）和C/N，进而保证低氮胁迫下植株的碳氮生理平衡。（5）外源色氨酸正调控低氮胁迫下衰老相关基因SbLHCB和SbSGR-2的表达，负调控SbNAC6、SbPaO3、SbPPDK-2和SbSAG12-2的表达；另外，C/N与SbLHCB和SbSGR-2表达量呈正相关，与SbNAC6、SbPaO3、SbPPDK-2和SbSAG12-2表达量呈负相关。【结论】低氮胁迫下，外源色氨酸通过降低C/N和衰老基因的表达量，影响叶片形态和光合特性，同时通过调节叶片碳氮代谢，延缓了叶片衰老，增强高粱幼苗对低氮胁迫的耐性。因此，喷施外源色氨酸是缓解低氮胁迫的一种潜在策略。

柑橘大实蝇气味结合蛋白BminOBP6与其气味配体的互作机制

杨岭, 田晓丽, 桂连友, 王福莲, 张国辉

中国农业科学. 2023, 56(7): 1311-1321. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.009

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【目的】通过构建柑橘大实蝇（Bactrocera minax）BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6），比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力，检测在不同pH条件下二者对气味配体结合能力的差异，为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考。【方法】通过在线工具SWISS MODEL对BminOBP6进行同源建模，根据构建的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个α螺旋（α6）之后的C末端序列；设计特异性引物扩增BminOBP6的C末端截短突变体（TOBP6）的编码序列，即TOBP6；构建重组表达载体pET32a/TOBP6，将此重组载体与实验室保存的重组载体pET32a/BminOBP6分别转入原核细胞BL21（DE3）中，异源表达野生型BminOBP6及其突变体TOBP6；以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合试验，检测BminOBP6和TOBP6在两种pH环境（pH 7.4和pH 5.0）下对1-十一醇和(+)-柠檬烯的结合能力。【结果】序列比对结果显示，BminOBP6与致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）CquiOBP1的序列具有很高的相似性，为62.6%，远高于30%，因此选择以CquiOBP1的3D结构作为BminOBP6同源建模模板。模型显示BminOBP6的α6之后是由8个氨基酸残基（D117—P124）组成的C末端序列，即将被切除的C末端序列。在此基础上设计引物克隆获得了编码TOBP6的cDNA序列，并构建了其重组表达载体pET32a/TOBP6，该重组载体和pET-32a/BminOBP6重组载体分别转入大肠杆菌细胞中进行了异源表达。荧光竞争结合试验结果显示，在pH为7.4时，BminOBP6与1-十一醇和(+)-柠檬烯具有很强的结合能力，K_i值分别为6.89和9.50 μmol·L^-1。当pH降至5.0时，BminOBP6却丧失了对1-十一醇的结合能力，同时与(+)-柠檬烯的结合能力也大幅减弱，K_i值从9.50 μmol·L^-1升至31.26 μmol·L^-1；而不论在何种pH条件下，TOBP6均丧失了对这两种气味配体的结合能力。【结论】 pH在柑橘大实蝇 BminOBP6与其配体结合和释放过程中发挥了重要作用，并且BminOBP6的C末端在配体的结合中起着关键作用。

响应槲皮素诱导的美国白蛾P450基因及CYP6ZB2功能分析

邵红扬, 孟香, 张涛, 陈敏

中国农业科学. 2023, 56(7): 1322-1332. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.010

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【目的】明确美国白蛾（Hyphantria cunea）响应槲皮素诱导的差异表达P450基因及系统发育关系，探究美国白蛾P450基因对槲皮素诱导的剂量效应，以及P450基因在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中的作用。【方法】基于槲皮素诱导的美国白蛾中肠转录组数据，从中筛选显著差异表达的P450基因，应用MEGA X软件对5个P450 基因及其他近缘物种的P450基因进行系统进化关系分析；通过RT-qPCR技术检测5个P450基因在不同槲皮素浓度（0.5%、1.0%、2.0%和4.0%）处理下的表达模式；克隆CYP6ZB2全长cDNA序列，利用RNA干扰（RNAi）技术探明CYP6ZB2基因沉默对美国白蛾体重及存活率的影响。【结果】从转录组的差异表达基因中筛选到5个显著响应槲皮素诱导的P450基因，经P450命名委员会分别被命名为CYP4G296、CYP4G297、CYP333A30、CYP304F33和CYP6ZB2（GenBank登录号：ON032363—ON032367）。系统发育分析表明，这5个基因被聚类到CYP2、CYP3、CYP4和线粒体CYP进化枝。RT-qPCR结果表明，P450基因响应槲皮素胁迫具有显著的剂量效应，CYP4G297、CYP304F33、CYP333A30和CYP4G296的表达均被不同浓度槲皮素抑制，CYP6ZB2的表达在0.5%—2.0%的槲皮素诱导下显著上调，而在4.0%的槲皮素浓度下被显著抑制。克隆CYP6ZB2的全长cDNA序列，CYP6ZB2具有完整的开放阅读框（ORF），编码500个氨基酸。RNAi结果表明，注射两种剂量（500和1 000 ng）dsCYP6ZB2均可显著抑制CYP6ZB2的表达，注射1 000 ng dsCYP6ZB2 48 h后干扰效率达到最高（96.9%）。CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫经0.5%槲皮素处理后体重增长量低于对照组，存活率（53.33%）分别为未处理组的61.5%和注射双蒸水组的72.7%（P<0.05）。【结论】筛选鉴定到美国白蛾响应槲皮素诱导的5个P450基因，槲皮素对5个基因的诱导表达具有明显的剂量效应，说明不同的P450基因对槲皮素的响应模式存在差异。RNAi能高效沉默CYP6ZB2，0.5%槲皮素对CYP6ZB2被干扰的美国白蛾幼虫的生长发育具有一定抑制作用，表明CYP6ZB2在美国白蛾对槲皮素的解毒适应中发挥着重要作用。

红壤性水稻土有机无机复合体中碳氮特征对长期施肥的响应

李浩, 陈金, 王洪亮, 柳开楼, 韩天富, 都江雪, 申哲, 刘立生, 黄晶, 张会民

中国农业科学. 2023, 56(7): 1333-1343. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.011

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【目的】研究长期施肥对红壤性水稻土有机无机复合体中有机碳（OC）、全氮（TN_OIC）特征的影响，为红壤性水稻土管理和培育土壤肥力提供依据。【方法】以长期定位施肥试验的红壤性水稻土为研究对象（始于1984年），选取CK（不施肥）、PK（施磷钾肥）、NPK（施氮磷钾肥）、NPKM（施70%氮磷钾肥+ 30%有机肥）4个处理。采集0—20 cm土层土样，分析各粒级（<2、2—10、10—20、20—50和50—250 μm）有机无机复合体的分布，并探讨施肥对复合体中有机碳（OC）和全氮（TN_OIC）含量、储量和碳氮比（C/N）的影响，以及有机无机复合体中OC和TN_OIC对红壤性水稻土有机碳（SOC）、全氮（TN）贡献率的影响。【结果】与不施肥CK相比，施肥处理显著提高了20—50 μm粒级复合体的比例，降低了<10 μm粒级复合体比例，而NPKM处理与其他施肥处理相比，50—250 μm粒级复合体的比例增加更显著；不同施肥对各粒级复合体中OC和TN_OIC含量影响不同，与PK相比，NPK处理的50—250 μm粒级复合体中OC和TN_OIC分别增加了36.3%、80.6%；与NPK相比，NPKM处理的50—250 μm粒级复合体中OC和TN_OIC含量分别增加了35.4%、19.5%，OC和TN_OIC主要分布在10—20 μm粒级复合体中，施肥显著降低了<2 μm粒级复合体OC和TN_OIC储量，同时增加了20—50 μm粒级复合体OC和TN_OIC储量，与PK相比，NPK处理对<2和50—250 μm粒级复合体OC储量分别增加了18.5%和31.2%，TN_OIC储量分别增加了18.8%和73.7%，与NPK相比，NPKM处理对<2 μm粒级复合体中OC和TN_OIC储量分别降低了25.6%和27.4%，而50—250 μm粒级复合体则分别提高了56.3%和38.6%；不同施肥处理显著影响50—250 μm粒级复合体的C/N，与PK相比，NPK处理的50—250 μm粒级复合体的C/N比降低了24.6%，与NPK相比，NPKM处理的50—250 μm粒级复合体C/N比提高了13.4%；长期不同施肥显著影响各粒级有机无机复合体对土壤SOC、TN的贡献率，与PK相比，NPK处理50—250 μm粒级复合体对SOC、TN贡献率分别提高了17.4%和47.4%。与NPK相比，NPKM处理50—250 μm粒级复合体对SOC、TN贡献率分别提高了39.5%和32.8%。【结论】在红壤性水稻土中，长期施肥促使大粒级有机无机复合体形成；化肥中的氮投入显著提高50—250 μm粒级复合体中OC、TN_OIC含量和储量；有机无机肥配施有利于提高土壤有机碳含量，提高大粒级有机无机复合体比例，有助于保存施入的无机氮肥，是红壤性水稻土长期培肥管理的有效措施。

秸秆还田量对川中丘陵冬小麦-夏玉米轮作体系土壤物理特性的影响

马胜兰, 况福虹, 林洪羽, 崔俊芳, 唐家良, 朱波, 蒲全波

中国农业科学. 2023, 56(7): 1344-1358. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.012

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【目的】探明秸秆还田量对农田土壤物理特征的影响，为川中丘陵紫色土区建立“提升土壤质量、高效利用秸秆”的种植业副产物利用模式，同时为秸秆资源化利用提供科学依据。【方法】基于田间长期定位试验（2006—至今），采用原位监测和计算机断层微扫描技术（CT）相结合的方法，研究秸秆还田量（无秸秆还田（RMW₀）、秸秆30%还田（RMW₃₀）、秸秆50%还田（RMW₅₀）和秸秆100% 还田（RMW₁₀₀））差异对冬小麦-夏玉米轮作体系耕层土壤物理特征的影响。【结果】（1）秸秆还田可明显改善土壤透气、持水和导水性能，随秸秆还田量增加改善效果明显增加。RMW₃₀、RMW₅₀和RMW₁₀₀处理较RMW₀处理土壤容重分别显著降低15.2%、11.7%和17.9%，土壤孔隙度则分别显著增加18.4%、13.7%和21.3%。另外，RMW₁₀₀处理饱和导水率高达1.62 mm·min^-1，导水性能优于其他处理。（2）秸秆还田促进已有孔隙发育成更大孔隙，且孔隙均匀性和孔隙间连通性明显改善，RMW₁₀₀和RMW₅₀处理对土壤大孔隙组成的改善优于RMW₃₀和RMW₀处理。RMW₁₀₀处理平均孔隙直径趋大，孔隙间连通性最优。RMW₅₀处理孔隙均匀性明显提高，大小孔隙配比较其他处理更合理。（3）与无秸秆还田处理相比，秸秆还田后>2 mm团聚体数量显著增加，0.25—2 mm团聚体数量显著减少，秸秆还田有利于形成土壤水稳性大团聚体，促进中团聚体向大团聚体转变，RMW₅₀和RMW₁₀₀处理改善效果均显著优于RMW₃₀处理。（4）土壤容重、>0.25 mm团聚体和大孔隙特征是反映石灰性紫色土区耕层土壤物理特征的主要指标，第一主成分和第二主成分对土壤物理性质的解释度分别为57.8%和23.6%。RMW₅₀与RMW₁₀₀处理土壤物理特征接近，与RMW₀和RMW₃₀处理在PC1和PC2轴上出现明显离散。【结论】川中丘陵紫色土区在产量无显著差异的基础上，不同秸秆还田量对耕层土壤物理性质的影响存在差异，秸秆50%和100%还田效果无显著差异，但显著优于秸秆30%还田和不还田处理，宜因地制宜进行还田量选择。

基于广泛靶向代谢组学的葡萄种子代谢物鉴定与比较分析

生弘杰, 卢素文, 郑暄昂, 贾海锋, 房经贵

中国农业科学. 2023, 56(7): 1359-1376. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.013

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【目的】葡萄种子因富含多种代谢产物而具有较高生物活性。全面鉴定葡萄种子中代谢物组分，比较分析不同品种间代谢物差异，探讨葡萄种子代谢物与果皮颜色和品种起源之间的关系，为深入开发和利用葡萄种子提供参考依据。【方法】以紫红色欧美种葡萄‘巨峰’、浅红色欧亚种葡萄‘魏可’和黄绿色欧亚种葡萄‘黄意大利’成熟期种子为材料，利用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）进行广泛靶向代谢组学分析，采用多元统计学等方法鉴定和比较代谢物。【结果】代谢组学数据质量好，组内样品重复性较好，组间样品存在差异。3个葡萄品种种子中共检测到514个代谢物，包括氨基酸、脂类等6类初生代谢物和原花青素、白藜芦醇等20类次生代谢物。不同品种间代谢物种类相似，但含量差异显著。大多数代谢物的相对含量在深色品种‘巨峰’种子中较高，在浅色品种‘魏可’种子中次之，在无色品种‘黄意大利’种子中较低，表明葡萄种子代谢物含量可能与果皮颜色呈正相关。‘魏可’和‘黄意大利’种子代谢物的相对含量较为相近，而均与‘巨峰’种子代谢物的相对含量差异较大，表明葡萄种子代谢物含量可能与品种起源有关。不同葡萄品种间的差异代谢物主要涉及苯丙烷生物合成、花青素合成和脂类代谢等途径。差异代谢物中酚类物质较多，且差异倍数最大的代谢物以类黄酮为主。葡萄种子中酚类和脂类物质种类非常丰富，除了单体黄烷-3-醇及其聚合物外，黄酮和黄酮醇等酚类物质的相对含量也较高；白藜芦醇在3个品种间没有显著差异；溶血磷脂酰胆碱等甘油磷脂含量较高，亚麻酸含量较低，不同品种间脂类物质的相对含量差异较小。【结论】不同葡萄品种种子中代谢物种类类似，但含量与果皮颜色和品种起源有关。酚类和脂类物质是葡萄种子代谢物的重要组分，可作为食品等加工行业的良好来源。

全基因组DNA甲基化和转录组联合分析鉴定杜梨耐盐相关转录因子

李慧, 张雨峰, 李晓刚, 王中华, 蔺经, 常有宏

中国农业科学. 2023, 56(7): 1377-1390. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.014

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【目的】鉴定不同杜梨株系根中响应盐胁迫信号的相关转录因子，分析盐胁迫下基因序列DNA甲基化变化与基因表达改变之间的关系，探讨参与调控不同杜梨株系耐盐能力的转录因子成员。【方法】以杜梨耐盐株系和普通株系为试材，在苗期使用200 mmol∙L^-1 NaCl对90日龄组培生根苗进行水培处理，以Hoagland营养液为对照。利用火焰石墨炉原子吸收光谱仪测定钠离子含量；利用全基因组DNA甲基化和转录组测序技术从表观遗传修饰和转录调控水平对盐胁迫下转录因子进行生物信息学分析；最后用McrBC-PCR和qPCR对差异转录因子进行验证。【结果】外源NaCl处理24 h后，杜梨植株中钠离子含量显著增加，其中耐盐株系的增加幅度比普通株系小，为普通株系钠含量的73.1%，但根中积累的钠是普通株系含量的1.1倍；杜梨根中检测到69类共2 682个转录因子的表达，盐胁迫后243个转录因子在两个株系中都发生了差异表达，包括AP2/ERF（37个）、bHLH（19个）、bZIP（7个）、HD-Zip（10个）、MYB（30个）、NAC（18个）、WRKY（8个）和ZFP（23个）等家族成员；盐胁迫后，耐盐株系基因组中转录因子甲基化水平下降，而普通株系转录因子甲基化水平上升，其发生DNA差异甲基化区域主要在基因启动子位置，差异甲基化类型主要为mCHH，占mCG、mCHG、mCHH三种类型总和的93%以上。AP2/ERF、bHLH、DREB、GRAS、GT因子、HB Zip、MYB、NAC、Trihelix和Zinc finger ZFP家族的23个转录因子响应盐胁迫表达量上调而甲基化水平降低，可能参与调节钠在根中的吸收和积累。对部分候选基因的表达模式和启动子区域分别进行实时荧光定量（qPCR）和甲基化依赖型限制性内切酶PCR（McrBC-PCR），验证了生物信息学分析结果。【结论】盐胁迫后在两个杜梨株系根中均差异表达的转录因子数目为243个，其中8个转录因子（PbERF2、PbGT3、PbZAT10.1、PbSCL33、PbDREB1、PbZAT10.2、PbERF53、PbNAC72）DNA序列的甲基化改变与基因转录水平变化呈负相关，研究结果为揭示转录因子参与不同杜梨株系耐盐能力调控的分子机制提供了依据。

间歇温度处理对育成蛋鸡采食及肠道发育的影响

刘增民, 潘亚丽, 林海, 焦洪超, 赵景鹏, 王晓鹃

中国农业科学. 2023, 56(7): 1391-1400. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.015

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【目的】研究环境温热对家禽采食的影响，补充蛋鸡饲养过程中的参数缺失，为蛋鸡的正确饲养提供科学依据。【方法】选取11周龄的伊莎褐蛋鸡360只，分为5个处理组，每组6个重复，每个重复12只鸡。正式试验前将试验蛋鸡分别转入5间智能环控鸡舍预饲1周。采用标准笼养，每笼3只鸡。鸡舍内相对湿度保持在60%，育成期每天光照8 h（9:00 — 17:00光照）。分为对照组和4个处理组，对照组保持基础温度22℃不变；4个处理组采用每日间歇温度处理，即每天10:00 —18:00期间分别进行24℃、26℃、28℃、30℃的温度处理，其余时间恢复到基础温度22℃（升温与降温时间均在1 h以内）。试验期8周。试验蛋鸡自由采食和饮水，每周统计采食量，每两周采集一次样品，每组随机挑选12只鸡，称重后断颈处死，称量腺胃重量，以及十二指肠、空肠和回肠的重量与长度。采集下丘脑、腺胃和十二指肠样品于液氮中速冻，-80℃保存。试验结束前连续3 d分别在热处理期和非热处理期统计采食量。【结果】在试验的前4周，与对照组T22相比，T30组的采食量显著降低（P<0.05）；在试验后4周时，T24组的采食量显著高于T28组和T30组（P<0.05）。在热处理期，T30组的采食量显著低于T22和T24；在非热处理期，T30组的采食量显著低于T22、T24和T26组（P<0.05）；各组热处理期的采食量均显著低于非热处理期（P<0.05），并且保持T24组采食量最高，T30组采食量最低。通过统计器官指数，发现在16周时，与T22组相比，各处理组的腺胃指数极显著升高（P<0.01）；18周时，与T22组相比，T30组的空肠指数显著降低，且低于其他处理组（P<0.05）；20周时，与T22组相比，T24组的腺胃指数、空肠指数和回肠指数显著升高（P<0.05），且空肠指数显著高于T30组（P<0.05）。检测食欲基因的表达，发现在14周时，与T22组相比，各处理组下丘脑NPY（Neuropeptide Y）的表达量显著升高（P<0.05），T30组下丘脑AgRP（Agouti-related protein）的表达量显著降低（P<0.05），T30组十二指肠CCK（Cholecystokinin）的表达量显著升高（P<0.05）；20周时，与T22组相比，T24组下丘脑CART（Cocaine amphetamine-regulated transcript）的表达量显著降低（P<0.05），T24组腺胃ghrelin的表达量显著降低（P<0.05）。【结论】育成期环境温度保持在24℃可以促进蛋鸡胃肠道的发育，提高下丘脑中促食因子NPY的表达，抑制下丘脑抑食因子CART和腺胃ghrelin的表达量，有利于蛋鸡的生长发育。而30℃高温处理会对蛋鸡的肠道造成损伤，抑制下丘脑促食因子AgRP的表达，同时促进十二指肠抑食因子CCK的表达，从而抑制蛋鸡采食，降低采食量。

非洲猪瘟病毒MGF110-5L-6L蛋白诱导宿主细胞翻译阻滞和应激颗粒形成的作用机制

樊帅, 钟函, 杨中元, 何文瑞, 万博, 魏战勇, 韩世充, 张改平

中国农业科学. 2023, 56(7): 1401-1416. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.016

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【背景】非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引发的一种猪烈性传染病，是全球公认的养猪业“头号杀手”，至今尚无安全有效的疫苗和药物。病毒作为专性细胞内寄生物，必须通过“劫持”宿主翻译系统为病毒蛋白合成服务。其中翻译起始因子eIF2α作为翻译调控的核心节点，控制细胞应激反应和翻译重编程走向，对病毒毒力、嗜性、致病性及免疫逃逸等具有重要影响，eIF2α磷酸化调控无疑是病毒与宿主细胞竞争翻译资源的重要阵地之一。然而，关于ASFV编码蛋白与eIF2α磷酸化作用关系的认知极度匮乏。【目的】探究非洲猪瘟病毒MGF110-5L-6L蛋白对宿主细胞翻译阻滞和促进应激颗粒形成的作用机制，为深入揭示非洲猪瘟病毒的致病机制研究提供科学依据。【方法】在前期利用荧光素酶报告基因载体和绿色荧光报告载体，筛选发现外源表达MGF110-5L-6L极显著上调eIF2α磷酸化水平的基础上。选择猪肺泡巨噬细胞3D4/21和猪肾细胞PK-15作为研究用细胞系，利用质粒转染和特异性化学药物处理等方法，结合免疫印迹和激光共聚焦显微镜等检测技术，验证了MGF110-5L-6L蛋白与eIF2α磷酸化及其下游翻译效应之间的功能关系。随后，通过生物信息学网站预测、亚细胞定位和功能分析等，研究了MGF110-5L-6L蛋白与诱导细胞应激之间的相关性。【结果】证实外源表达ASFV多基因家族蛋白MGF110-5L-6L能够显著增强细胞内eIF2α磷酸化水平及激活转录因子ATF4表达量，诱导综合应激反应的发生；还可诱导细胞发生内质网应激和未折叠蛋白反应，并通过活化PERK和PKR激酶来诱发eIF2α的磷酸化，进而导致细胞蛋白翻译阻滞和应激颗粒形成。进一步证实，MGF110-5L-6L蛋白含有两个高度保守的半胱氨酸基序，且主要定位于内质网，少量分布于高尔基体、线粒体和溶酶体，还可诱导高尔基体和过氧化物酶体的亚细胞定位及形态出现显著改变，提示其可能通过影响内质网腔中氧化还原稳态、蛋白分泌途径或相关膜性细胞器发生等创造应激条件。【结论】报道了ASFV早期蛋白MGF110-5L-6L的结构、亚细胞定位及其潜在功能特征，揭示了MGF110-5L-6L蛋白与eIF2α磷酸化和宿主细胞蛋白翻译系统之间的功能关系，为深入认识ASFV的病原生物学与致病机制提供了新的科学参考。

羊腧穴Telocytes形态特征及其与周围结构的关系

张迎鑫, 杨敏, 白雪兵, 陈畅, 吴睿智, 杨平, 陈秋生

中国农业科学. 2023, 56(7): 1417-1428. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.07.017

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【背景】经络是中医理论的基石，而腧穴又是经络线路上的关键节点部位，为中医针灸的实施位点。但是关于腧穴的结构基础与形态组成众说纷纭，未能科学阐明。远细胞（telocytes，TCs）是近年来发现的一种新型间质细胞，最新研究表明其可能是潜在的经络实质细胞，但腧穴处TCs的特征及其分布需要进一步阐明。【目的】分析腧穴和非穴皮肤结构差异，探究腧穴TCs的形态特征，解析TCs与其周围成分的结构联系，为中医针灸治疗的细胞机制研究提供理论支撑。【方法】选择5只成年健康湖羊为试验对象，采集百会（Du₂₀）、曲池（LI₁₁）、三阴交（Sp₆）、膻中（Ren₁₇）、承浆（Ren₂₄）、耳尖（EP₄）等腧穴以及背部和腹部非穴皮肤组织。使用蛋白标记物CD34和Vimentin标记TCs及其突起（telopodes, Tps）、TPS标记肥大细胞、PGP9.5标记神经、TSG101标记胞外囊泡。利用H.E染色和免疫组化技术分析皮肤腧穴和非穴处的结构和微细成分组成，并使用ImageJ和Image-Pro Plus统计软件对数据进行形态定量分析，探讨TCs及其相关结构在腧穴和非穴的分布差异。在此基础上利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜和免疫荧光双标技术观察TCs的形态特征和立体结构特点，进一步分析TCs与这些结构之间的形态联系，从而确定腧穴的超微形态和物质基础。【结果】腧穴与非穴的皮肤均具有毛囊、皮脂腺、汗腺、竖毛肌等皮肤衍生物以及神经、血管、肥大细胞、胶原纤维束等结构，但腧穴处神经、血管、肥大细胞的分布数量显著多于非穴（P<0.05）。更为重要的是，在腧穴皮肤中分布着具有细长管线状突起的TCs，并且显著多于非穴（P<0.05）。作为腧穴间质的整合者，TCs之间以及TCs与各形态之间具有广泛联系（包括缝隙连接以及胞外囊泡等），形成一个结构网络体系。超微水平上观察到TCs突起的典型串珠样外观，由膨大部（podom，Pd）和细长狭窄部（podomer，P）交替排列组成。膨大部胞质中分布着发达的线粒体，加上Tps之间的细胞连接，以及TCs表面及其周围的大量胞外囊泡（显著多于非穴（P<0.05）），保证了TCs在腧穴结构中的核心作用。同时TCs与皮肤衍生物之间的结构联系，也在细胞水平上验证了《黄帝内经》中腧穴与皮肤衍生物的关系。【结论】腧穴与非穴的结构组成基本相同，但腧穴TCs及其Tps、胞外囊泡、神经、血管、肥大细胞等的分布数量显著多于非穴；TCs及其Tps具备联络各系统成分的形态功能，是腧穴不同结构的介导者或整合者；TCs之间的细胞连接、发达的线粒体以及胞外囊泡等具有细胞通讯和能量产生的结构基础，与中医“气血”的形态物质相对应。

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