中国农业科学

2023年第56卷第8期中英文目录

中国农业科学. 2023, 56(8): 0.

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结合基因关联和转录组分析鉴定小麦成株期抗条锈病位点YrZ501-2BL的候选基因

张旭, 韩金妤, 李晨晨, 张丹丹, 吴启蒙, 刘胜杰, 焦韩轩, 黄硕, 李春莲, 王长发, 曾庆东, 康振生, 韩德俊, 吴建辉

中国农业科学. 2023, 56(8): 1429-1443. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.001

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【目的】小麦条锈病是小麦的主要病害之一，每年都会对小麦产量安全造成严重危害，挖掘小麦抗条锈病基因，为小麦抗条锈病种质创新和揭示小麦抗条锈病遗传机制奠定基础。【方法】利用多组学手段结合全基因关联分析（GWAS）开展对小麦成株期抗条锈病性状的解析。首先对411份来自CIMMYT和ICARDA的春小麦进行全基因组关联分析，在小麦2BL染色体上定位到一个主效的成株期抗条锈病位点，并利用含有该位点的抗病材料Z501及感病亲本晋麦79的双亲群体进行连锁作图，成功验证了该位点抗性的稳定性，暂命名为YrZ501-2BL。在此基础上，通过基因注释、比较基因组分析、转录组分析和候选基因的关联分析对目标区间筛选候选基因。【结果】综合GWAS和连锁作图结果，将YrZ501-2BL锁定在小麦2B染色体0.26 Mb（575.706—576.587 Mb）范围内，根据中国春参考基因组注释信息分析，该区间含有12个基因，其中，高可信基因6个；利用在线网站，将目标区间所在的中国春参考基因组与其他已公布的不同倍性小麦基因组进行比较，发现该区间的6个高可信小麦基因基本都能在其他小麦材料中找到同源基因，且基因排列顺序相同，说明该区间可能不存在较大片段的插入、缺失、倒位等现象，可以利用参考基因组信息进行候选基因预测；结合抗病亲本Z501和感病亲本晋麦79的成株期接种条锈菌后的转录组数据，发现只有TraesCS2B02G406400、TraesCS2B02G406500和TraesCS2B02G406600受诱导表达，且抗感病亲本存在表达差异。根据中国春基因组注释，三者分别编码GATA转录因子、SH3P2蛋白和锌指蛋白。通过进一步的候选基因关联分析，发现只有SH3P2蛋白中存在与条锈病表型显著性差异的SNP位点（G/A），虽然该位点（G1369A）在2个可变剪切的转录本中均未引起氨基酸编码变化（TCG和TCA均编码丝氨酸），但可能与可变剪切有关，同时该位点（G1369A）的不同单倍型表型之间也存在极显著差异，进一步分析发现，在G1369A位点下游还有2个引起氨基酸改变的变异位点G1377A和G1431A，分别引起缬氨酸（GTT）到异亮氨酸（ATT）和缬氨酸（GTG）到甲硫氨酸（ATG）的改变，但这两个位点在455份重测序材料中所占比例只有0.87%，属于稀有变异，因此，未进行显著性检验。综上，推测TraesCS2B02G406500为YrZ501的重要抗病候选基因；此外，针对YrZ501候选区间的差异SNP开发了相应的AQP标记，可用于辅助选择，为下一步小麦抗锈病分子育种应用提供了标记资源。【结论】利用多组学整合关联分析的方法，成功在小麦2B染色体上挖掘到1个抗条锈病候选基因TraesCS2B02G406500。

转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

李俊, 单露英, 肖芳, 李允静, 高鸿飞, 翟杉杉, 吴刚, 张秀杰, 武玉花

中国农业科学. 2023, 56(8): 1444-1455. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.002

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【目的】转基因检测标准物质是转基因生物安全监管、标识制度实施的物质基础，是实验室内检测数据溯源、实验室间检测数据可比的保证。中国于2017年批准进口转基因玉米MON87427用作加工原料，其安全监管和检测急需研制有证标准物质。【方法】以开发商提供的转基因玉米MON87427杂合种子和非转基因受体种子为原材料，对转基因玉米MON87427和其受体种子分别清洗、干燥、冷冻研磨、粒径及含水量检测，按质量分数（以干基计）称量配制得到质量分数分别为60.0、99.5和1 000.0 mg·g^-1的转基因玉米MON87427基体标准物质MON87427a、MON87427b和MON87427c。运用实时荧光定量PCR进行粉末的均匀性初检，初检合格后分装。用MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR（ddPCR）方法进行标准物质均匀性、稳定性评估和8家实验室联合定值。根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》（JJF 1343）进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。【结果】本批标准物质有MON87427a、MON87427b、MON87427c 3个浓度，粒径小于200 μm的粉末大于80%，含水量低于5%。用棕色玻璃瓶分装，不低于1.0 g/瓶，充氮后轧盖，3个浓度的标准物质各分装400瓶。3种标准物质均匀性检验的F值均小于临界值F_0.05(14,30)（2.04），在瓶内和瓶间具有良好的均匀性，使用时，最小取样量为100 mg。标准物质在25℃、37℃和60℃条件下可稳定储存14 d，表明在常温下运输14 d标准物质特性量值不发生趋势性变化；在4℃和-20℃条件下长期稳定性达到12个月；开盖取样5次，标准物质特性量值未发生显著偏离。8家实验室联合测定的标准物质拷贝数比值无异常值、呈正态分布、且等精度，标准物质MON87427a、MON87427b、MON87427c的标准值及扩展不确定度分别为（2.92±0.44）%、（4.89±0.57）%、（52.1±3.4）%。【结论】研制的转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质均匀性良好，可稳定运输和储存，满足转基因玉米MON87427定性、定量检测需求，为转基因玉米MON87427的安全监管、定量标识制度的实施提供了可靠的有证标准物质。

大田不同播种间距单株小麦根长密度动态研究

孙启滨, 王建楠, 李毅念, 何瑞银, 丁启朔

中国农业科学. 2023, 56(8): 1456-1470. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.003

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【目的】为探明单粒精播种植方式种间距对小麦根系的土层分布影响，构建了基于根系数字化仪实测根系3D拓扑结构数据下MATLAB分割分析复合型小麦根长密度（RLD）定量技术，获取大田条件不同种间距单株稻茬麦RLD在不同土层的分布特征和相对根长密度（NRLD）分布模型。【方法】选用宁麦13为试验材料，采用免耕等距单粒线播法，分别于2020和2021年进行稻茬小麦的免耕种植试验，设置单粒精播种间距 1.5、3.0、4.5、6.7、9.0 cm共5个处理（JT1.5、JT3、JT4.5、JT6.7、JT9），行距20 cm。RLD分析采用根系构型数字化仪实测根系3D拓扑结构配合Pro-E软件数字重构，辅以MATLAB实现基于“空间voxel元技术”的根系生长空间3 cm³精细分割和定量分析，跟踪各土层RLD分布动态和NRLD模型。【结果】不同处理的单株稻茬麦根长密度随土层深度的增加而逐步减小，0—9 cm土层深度内分布的稻茬麦根系达总根量95%以上，超过9 cm土层深度小麦根系急剧减小；单株小麦根系扩展面积随土层深度的增加先增加后减小，根构型以种子位作为中心点向四周拓展，且表现出明显的拓展方向性和约束性。群体稻茬麦RLD随种间距增加先增加后减小，且在JT4.5最大；RLD扩展面积随种间距的增大而不断增加，最大可达22 972 mm²。过高与过低的群体都造成不良的根构型影响，适宜的播种密度才能创建最佳的根系3D分布，实现土壤空间资源的高效利用。经归一化处理后0—20 cm土层NRLD分布同时符合三次多项式和指数模型，两模型的拟合效果均极好（R²>0.99，RMSE<0.1），但指数模型更符合随土层深度的RLD特征实际。【结论】融合根系数字化仪实测根系3D拓扑结构与MATLAB分割分析的复合型小麦根长密度定量技术实现了单粒精播稻茬麦不同种间距的单株及群体双尺度的根长密度分布动态的定量描述，所得结果可为今后开展小麦精确耕种、水肥精准运筹、根构型调控等研究提供方法学借鉴。

高温干旱下缩节胺通过调节碳和氨基酸代谢提高Bt棉杀虫蛋白含量的生理机制

邢羽桐, 滕永康, 吴天凡, 刘媛媛, 陈源, 陈媛, 陈德华, 张祥

中国农业科学. 2023, 56(8): 1471-1483. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.004

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【目的】探讨高温干旱胁迫下缩节胺（mepiquat chloride，DPC）调控Bt（Bacillus thuringiensis）棉杀虫蛋白含量的生理机制，为高抗虫性Bt棉品种选育及高产高效栽培提供理论依据。【方法】2020—2021年以转Bt抗虫基因抗虫棉品种泗抗3号为材料，采用盆栽法，在人工气候室进行高温干旱胁迫，胁迫开始后立即用20 mg·L^-1 DPC和清水（对照）喷施。7 d后测定铃壳杀虫蛋白含量、α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量以及谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸转氨酶活性、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量。并进行转录组测序，利用DESeq进行差异基因分析，通过GO富集和KEGG Pathway数据库注释参与DPC调节杀虫蛋白含量的差异表达基因。【结果】与清水对照相比，DPC可显著提高高温干旱条件下Bt棉铃壳中杀虫蛋白含量，提高幅度达4.7%—11.9%。在碳代谢方面，α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量提高46%—57%和25%—29%；在氨基酸代谢方面，谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸转氨酶活性、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量分别提高32%—44%、30%—40%、28%和22%—27%。转录组分析结果表明，DPC处理后上调基因7 542条，下调基因10 449条。GO和KEGG结果显示，差异基因主要涉及氨基酸代谢、碳代谢等生物过程。其中编码6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶、谷氨酸丙酮酸转氨酶、丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶、谷氨酸合酶、吡咯啉-5-羧酸脱氢酶、谷氨酸草酰乙酸转氨酶、N-乙酰谷氨酸合成酶、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶基因表达显著上调。【结论】高温干旱下，DPC通过调节碳、氨基酸代谢增加丙氨酸、α-酮戊二酸含量，提高天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸和精氨酸合成能力，进而提高Bt棉杀虫蛋白含量。

csi-miR399响应柑橘溃疡病菌侵染的表达模式及其抗病性分析

王兆昊, 郭兴茹, 张乐欢, 何永睿, 陈善春, 姚利晓

中国农业科学. 2023, 56(8): 1484-1493. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.005

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【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）侵染的表达模式，筛选其靶基因，进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性，为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘（Citrus microcarpa）和感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis）为试材，通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化，明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式；利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因，并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化；克隆csi-miR399前体基因序列，通过同源重组方法构建病毒表达载体 pCLBV202-MIR399，根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬（Citrus limon），通过qPCR分析csi-miR399表达量；进而采用离体叶片针刺法接种Xcc，观察发病症状，统计病情指数，分析csi-miR399过表达对Xcc抗性的影响。【结果】接种Xcc后，csi-miR399在抗病品种四季橘中的表达呈现先下降再上升的趋势，而在感病品种纽荷尔脐橙中的表达呈持续下降趋势。接种Xcc 5 d时，csi-miR399在四季橘与纽荷尔脐橙中的表达量分别是健康对照的4.64倍和7.61%，初步表明csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性相关。从13个预测靶基因中筛选鉴定了csi-miR399的3个靶基因Cs2g06030、Cs7g03830、Cs8g18800，分别编码泛素偶联酶PHO2、未知蛋白和漆酶。利用构建的病毒表达载体pCLBV202-MIR399获得过表达csi-miR399的柠檬植株（Y37、Y41和Y57），与空载体对照pCLBV202接种植株（L35）相比，Y37、Y41和Y57中csi-miR399表达量显著增加，接种Xcc后的溃疡病病斑面积显著减小，病情指数显著降低（P<0.01），表明csi-miR399过表达显著提高了柠檬的溃疡病抗性。【结论】csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性密切相关，过表达csi-miR399显著提高柑橘对溃疡病的抗性，可应用于柑橘抗溃疡病的分子育种。

基于基因组序列分析的烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物侵染性克隆构建

高晓晓, 涂丽琴, 杨柳, 刘亚楠, 高丹娜, 孙枫, 李硕, 章松柏, 季英华

中国农业科学. 2023, 56(8): 1494-1502. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.006

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【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus，TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性，为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样，提取总RNA，利用TMGMV特异检测引物确认阳性后，设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列，通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上，获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性，利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒，经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果，测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白CP。同源性分析结果显示TMGMV-JS与重庆分离物TMGMV-TN29（MF139550）同源性最高，厦门分离物（JX534224）次之，系统进化分析结果也显示TMGMV-JS与其他TMGMV聚于同一大分支，其中与重庆、厦门两个分离物在同一小分支，相对近缘。构建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆载体可以系统侵染本氏烟，引起叶片黄化，植株系统性坏死；也可以系统侵染辣椒，引起叶片斑驳、卷曲和植株矮化等症状。【结论】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV-JS分离物基因组全长6 356 nt，与国内重庆、厦门TMGMV分离物具有较近的亲缘关系，同属于一个分支；构建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系统侵染本氏烟和辣椒，在本氏烟上会导致系统性坏死。

长期秸秆配施化肥下土壤团聚体碳氮分布、微生物量与小麦产量的协同效应

韩紫璇, 房静静, 武雪萍, 姜宇, 宋霄君, 刘晓彤

中国农业科学. 2023, 56(8): 1503-1514. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.007

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【目的】研究秸秆配施化肥对暗棕壤团聚体组成、团聚体碳氮含量、土壤微生物量特征及小麦产量的影响，揭示长期秸秆配施化肥下土壤肥力和生产力的协同提升机制。【方法】依托长期定位40年施肥试验，选取4个处理：单施化肥（NP）、秸秆配施化肥（S+NP）、秸秆配施1/2化肥（S+1/2NP）、秸秆配施1/4化肥（S+1/4NP），其中秸秆为麦秸隔年还田，用量为3 000 kg·hm^-2，氮磷化肥用量为150 kg N·hm^-2、150 kg P₂O₅·hm^-2。采集0—20 cm土层土样，利用湿筛法得到不同粒级的水稳性团聚体，测定团聚体中有机碳（SOC）、氮含量及土壤微生物量碳（SMBC）、微生物量氮（SMBN）含量。【结果】（1）长期秸秆配施化肥显著降低土壤容重并提高了团聚体稳定性，和NP相比，S+NP处理土壤容重降低4.7%，>2 mm团聚体含量、平均重量直径（MWD）和几何重量直径（GWD）分别提升254.4%、76.5%和91.3%。（2）S+NP、S+1/2NP处理>2 mm团聚体百分含量、MWD和GWD显著高于S+1/4NP，分别增加了49.1%—52.4%，19.43%—22.4% 和24.2%—33.3%。（3）S+NP、S+1/2NP、S+1/4NP和NP相比增加了>2 mm和>0.25 mm团聚体对土壤有机碳、全氮贡献率，并显著提高全土SOC、SMBC和SMBN含量；其中，SOC含量在S+NP中最高，比S+1/2NP、S+1/4NP高6.3%和12.6%。（4）产量表现为S+NP>NP>S+1/2NP>S+1/4NP处理，S+NP比减施化肥处理提高小麦产量28.6%—47.5%。（5）土壤团聚体稳定性、SOC含量及小麦产量之间有较好的相关性，>2 mm和>0.25 mm团聚体含量、MWD和GWD分别与全土SOC含量及小麦产量呈显著或极显著正相关。【结论】暗棕壤地区在长期秸秆还田条件下，配施化肥量150 kg N·hm^-2、150 kg P₂O₅·hm^-2时能提高土壤团聚体稳定性、有机碳含量、微生物生物量和小麦产量，最大化实现土壤结构改良、肥力提升和作物增产的协同效应。

膜下滴灌与细流沟灌对玉米生长及产量的影响

刘梦洁, 梁飞, 李全胜, 田宇欣, 王国栋, 贾宏涛

中国农业科学. 2023, 56(8): 1515-1530. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.008

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【目的】明确等灌溉量膜下滴灌与细流沟灌对玉米生长、产量及水分利用效率的影响。【方法】以郑单958为研究对象，于2015—2021年进行田间试验，通过管式水分仪测定窄行、根区和宽行下0—50 cm土层水分含量，研究膜下滴灌与细流沟灌对土壤水分分布状况及其对玉米株高、叶面积指数、叶绿素含量、生物量、产量、水分利用效率等的影响。【结果】膜下滴灌优先补充窄行和根区的土壤水分，而细流沟灌优先补充宽行表层的土壤水分。而玉米耗水主要集中在0—30 cm土层范围内，膜下滴灌的窄行和根区0—30 cm土层水分含量均高于细流沟灌；随着土层深度增加灌溉对土壤含水量的影响减小，40—50 cm土层水分动态受灌溉方式影响较小。膜下滴灌较细流沟灌可显著促进玉米在开花期和成熟期的生长，提高叶面积指数。开花期膜下滴灌玉米的株高和叶面积指数较细流沟灌平均增加4.3%和8.3%，成熟期平均增加4.9%和15.1%。开花期和成熟期玉米总生物量均为膜下滴灌>细流沟灌处理，开花期增加12.2%，成熟期增加11.5%。膜下滴灌处理的玉米干物质转移量、干物质转移率和干物质转移量对籽粒贡献率均显著高于细流沟灌处理，分别增加17.8%、3.8%和3.5%。膜下滴灌显著提高玉米产量和灌溉水利用效率，平均增产14.4%，灌溉水利用效率平均提高14.6%。【结论】在等灌量条件下，膜下滴灌增加玉米根区水分含量，促进玉米生长，有利于玉米干物质积累及转运，提高产量，实现节水增效；较细流沟灌平均增产2 131.68 kg·hm^-2，灌溉水利用效率提高8.8%—24.1%。因此膜下滴灌是北疆玉米种植的高产高效灌溉方式。

水分亏缺下有机无机肥配施比例对棉花水氮利用效率的影响

王宁, 冯克云, 南宏宇, 丛安琪, 张铜会

中国农业科学. 2023, 56(8): 1531-1546. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.009

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【目的】探究不同水分条件下有机无机肥配施对棉花水氮利用效率和产量的影响，为河西走廊棉区合理利用有机肥提供理论依据。【方法】于2020—2021年进行田间定位试验，采用裂区试验设计，主区为充分灌溉（W1）和亏缺灌溉（W2）；副区为不施肥（CK）、单施化肥（CF）、25%有机肥+75%化肥（OF1）、50%有机肥+50%化肥（OF2）和75%有机肥+25%化肥（OF3），分析不同水分条件下施肥对棉花生育期土壤含水量、阶段耗水量、干物质和氮素积累及转运分配、水氮利用效率、籽棉产量和经济效益的影响。【结果】棉花籽棉产量和水氮利用特征受不同水肥处理及交互作用的显著影响。亏缺灌溉下棉田土壤含水量、总耗水量、植株干物质积累量、氮素积累量和籽棉产量显著下降，而水分利用效率显著提高。适宜的有机无机肥配施处理能够提高0—40 cm土层土壤含水量，降低棉花苗期和蕾期耗水，增加花铃期耗水量，提高棉花干物质和氮素积累量，并促进其向生殖器官中分配。充分灌溉条件下，25%有机肥配施处理（OF1）籽棉产量最高，两年平均较单施化肥（CF）提高10.5%；50%有机肥配施处理（OF2）与单施化肥（CF）无显著差异，但75%有机肥配施处理（OF3）显著降低。25%有机肥配施处理在各施肥处理中水氮利用效率最高，其中水分利用效率、氮素利用率和氮肥农学利用率分别较单施化肥提高8.9%、14.3%和28.9%。亏缺灌溉条件下，有机无机肥配施处理籽棉产量均高于单施化肥，其中50%有机肥配施处理表现最高，两年籽棉平均产量较单施化肥提高12.9%，同时50%有机肥配施处理水氮利用效率也表现为最高，其中水分利用效率、氮素利用率和氮肥农学利用率分别较单施化肥提高6.3%、35.5%和31.6%。【结论】适宜比例的有机无机肥配施能够协调土壤-作物水分养分供需关系，提高棉花籽棉产量和水氮利用效率。综合考虑产量、水氮利用效率和植棉效益，25%有机肥配施处理为河西走廊棉区适宜的有机肥配施模式。

基于GBS技术开展柚类资源群体遗传评价并发掘酸含量相关基因

江东, 王旭, 李仁静, 赵晓东, 戴祥生, 柳正葳

中国农业科学. 2023, 56(8): 1547-1560. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.010

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【目的】弄清我国柚类种质资源的起源与演化、群体遗传结构和多样性水平，高效利用柚类自然资源群体发掘与果实重要品质性状相关的基因，为柚类种质资源群体的遗传结构研究、起源演化和柚类种质创新提供重要的理论及实践依据。【方法】利用国家果树种质重庆柑橘资源圃中保存的具有广泛遗传多样性和不同地理来源的282份柚类资源作为材料，采用EcoR I限制性内切酶消化基因组DNA后构建GBS文库，然后进行Illumina HiSeq PE150二代测序获得短读序列，通过BWA软件将序列映射到柚参考基因组上，利用SAMTOOLS软件鉴定SNP位点。依据SNP的基因分型结果，进行主成分分析和群体结构分析,并采用邻接法构建系统演化树，分析亚群的遗传多样性水平。选择23个低酸种质和32个高酸种质构成两个群体进行Fst、XP-CLR分析，同时利用282个柚类种质的基因型数据与果实可滴定酸含量的表型数据进行GWAS全基因组关联分析。【结果】利用GBS简化基因组测序技术对282份柚类种质进行测序，获得201.66 Gb的原始测序数据，每个样本的平均测序数据量为0.72 Gb，经过测序深度为5×次要等位基因频率>0.01、Miss0.2的筛选条件过滤，最终获得121 726个高质量的SNP位点。主成分分析、群体结构分析和聚类分析均表明282份柚类资源可被分为6个亚群，其中柚与‘清见’杂交群体、葡萄柚等橘柚杂种群体可明显区别于其他真正柚类种质。不同地理来源和特定类型的柚类种质在遗传水平上存在明显差异，来源于泰国、越南等东南亚国家的柚类资源形成了较为独特的类群，与国内的沙田柚类、文旦柚类、垫江柚类等群体能够明显区分开。在中国南方的大部分柚类种质中有来自于越南柚的基因渗入，表明越南是柚的原始起源中心。另外，一些来源不清的柚类种质也通过GBS技术得以准确鉴定。Fst、XP-CLR选择性清除分析发现在7号染色体上的强烈选择信号区域中包含有丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶（PDH-E2）和铝激活苹果酸转运蛋白（ALMT9），涉及柠檬酸的合成和运输。GWAS全基因组关联分析在2号染色体上鉴定了一个与果实酸度高度关联的区域。【结论】GBS技术为研究柚的系统发育和演化提供了一种可靠和高效的方法。本研究表明人工杂交育种、长期人工选择和驯化、地理隔离是形成不同类型柚类种质的驱动力，同时也是导致柚类种质遗传分化和多样性增加的重要原因。通过Fst、XP-CLR选择性清除和全基因组关联分析鉴定了多个与柚类果实柠檬酸含量相关的候选基因，为柚类的遗传改良和育种提供了重要的基因资源。

葡萄果粒质量相关性状全基因组关联分析

王慧玲, 闫爱玲, 王晓玥, 刘振华, 任建成, 徐海英, 孙磊

中国农业科学. 2023, 56(8): 1561-1573. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.011

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【目的】果粒大小是葡萄外观和产量的重要构成因子之一，为受多基因调控的复杂数量性状，挖掘葡萄果粒大小相关性状的关键遗传调控位点和基因，将有助于葡萄产量的提高。【方法】本研究以150份葡萄品种资源为材料，分别于2019年和2020年对葡萄果实单粒重、种子数目和种子质量等进行测定，并结合重测序获得的高密度基因型数据进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS），挖掘调控各性状的遗传位点和基因。【结果】各性状在关联群体中呈现广泛的连续变异，变异系数为39.55%—68.89%；在不同年份均服从正态分布，符合数量性状遗传特征；相关性分析表明葡萄果实单粒重、种子数目和种子质量呈显著正相关。全基因组关联分析共检测到150个与果实单粒重显著关联的SNP，在2019年检测到99个SNP，解释表型变异的14.48%—25.59%；在2020年检测到73个SNP，解释表型变异的16.08%—26.83%；其中24个SNP位点在两个年份均检测到，主要位于1号、5号、11号和16号染色体。相较于果实单粒重，检测到的与种子数目显著关联的SNP较少，2019年检测到1个显著性SNP，表型解释率为24.29%；2020年检测到17个显著性SNP，均位于18号染色体。两个年份检测到与种子质量显著关联的SNP分别有1个和2个，位于18号染色体，解释表型变异的23.59%—48.29%。在两年重复检测到SNP位点基因组区域内，根据基因功能注释筛选出11个可能与果实单粒重相关的候选基因，其中包括乙烯信号通路基因（基因ID：VIT_05s0049g00490、VIT_05s0049g00500、VIT_05s0049g00510和VIT_16s0100g00400）、赤霉素信号途径基因（基因ID：VIT_11s0016g04630和VIT_16s0022g02310）、生长素响应蛋白基因（基因ID：VIT_11s0016g05640）和一些重要的转录因子基因（基因ID：VIT_05s0049g00460、VIT_11s0016g05660和VIT_16s0022g02330）。在18号染色体鉴定到与种子含量相关的候选基因（基因ID：VIT_18s0041g01880，编码MADS-box蛋白VviAGL11），位于该基因上的SNP基因型变化显著影响葡萄果实种子数目和质量。【结论】结合两个年份的表型数据，共检测到150个与果实单粒重显著关联的SNP，主要定位于1号、5号、11号和16号等染色体；检测到19个与种子含量关联的SNP，主要定位于18号染色体。基于基因注释和基因型分析结果，确定了包含VIT_11s0016g04630和VIT_16s0022g02310等在内的11个候选基因可能参与调控葡萄果实单粒重，确定候选基因（基因ID：VIT_18s0041g01880）与种子含量显著相关。

超声辅助玉米醇溶蛋白基乙烯吸附膜的制备及其香蕉保鲜性能

范鑫, 李宇鑫, 邝吉卫, 杨婷, 刘苗苗, 曹云刚, 黄峻榕

中国农业科学. 2023, 56(8): 1574-1584. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.012

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【目的】乙烯是影响水果品质及货架期的关键植物激素。本研究利用高场强超声波（HIU）对玉米醇溶蛋白（zein）进行物理改性处理，使其蛋白结构舒展，内部活性官能团暴露；利用超声改性zein膜中的活性官能团（如巯基等）与乙烯发生“点击反应”吸附乙烯，从而达到延长水果货架期的目的。【方法】将5 g zein溶于80%醋酸溶液中，选用频率为20 kHz、功率为400 W的超声波经不同时长（0、5、15和30 min）的预处理后，分别取2 mL蛋白溶液移至培养皿（55.0 cm²）中，放置于40℃烘箱干燥24 h，分别得到zein-0膜、zein-5膜、zein-15膜、zein-30膜，通过圆二光谱、内源性荧光、粒径电位仪和扫描电镜分析不同条件超声处理后蛋白结构及形貌的变化；借助物性分析仪和VOC检测仪表征zein膜的力学性能和乙烯吸附性能。以香蕉为研究对象，将超声处理后的zein膜与香蕉放置于同一塑封袋中，室温密闭放置10 d，基于香蕉表皮的褐变程度、香蕉果肉的硬度变化和香蕉失重率分析zein膜延长水果货架期的性能。【结果】高场强超声波处理对蛋白质的高级结构具有修饰作用，频率为20 kHz、功率为400 W超声处理15 min后，zein的平均粒径降低（1 013.3±6.9 nm），α-螺旋结构的比例降低（45.86%），β-折叠结构的比例升高（12.20%），上述现象表明适度超声处理使zein结构舒展。同时，zein-15膜的乙烯吸附性能与zein-0膜（未经超声处理）相比增加了9.486 mg·m^-3·h^-1，阻氧性能与zein-0膜相比增加了0.75×10^-16 kg·m·m^-2·s^-1·Pa^-1。本研究以呼吸跃变型水果的香蕉为代表，zein-15膜能有效降低香蕉的失重率，延缓香蕉表皮的褐变和香蕉果肉硬度的降低，延长了香蕉的货架期。【结论】一定条件的超声处理（20 kHz、400 W、15 min）能够诱导zein结构舒展，暴露出更多的活性官能团，提高其乙烯吸附性能。zein-15膜具有良好的阻氧性和力学性能，有效延长了香蕉的货架期和乙烯吸附膜的使用寿命。

不同筛选方法的低密度SNP集合填充准确性比较

林雨浓, 王泽昭, 陈燕, 朱波, 高雪, 张路培, 高会江, 徐凌洋, 蔡文涛, 李英豪, 李俊雅, 高树新

中国农业科学. 2023, 56(8): 1585-1593. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.013

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【目的】尝试通过在华西牛参考群高密度标记芯片位点中，使用两种标记筛选方法挑选具有代表性的且密度梯度不同的SNP位点集合，后利用基因组填充策略在相同填充参数下将低密度芯片数据填充至高密度继而进行后续基因组研究，从而达到降低华西牛基因型分型成本的目的。研究分别比较了不同标记集合填充准确性和填充一致性的差异，阐述了标记筛选方法、标记密度、最小等位基因频率和参考群体数量等4个因素对填充结果的影响，为华西牛低密度SNP填充芯片设计提供参考。【方法】将质控后剩余的1 233头华西牛群体随机分为参考群（986头）和验证群（247头）。使用等间距法（equidistance，EQ）和高MAF法（high MAF，HM）两种标记筛选方法分别从华西牛参考群体的Illumina Bovine HD 芯片位点集合中筛选出16种不同密度的SNP集合，共生成32种不同SNP梯度密度集合。随后在验证群体中利用Beagle（v5.1）软件将各低密度集合填充至770 k密度水平，计算填充准确性和填充一致性并对填充性能影响因素进行分析。【结果】32种低密度SNP集合的标记数量在100—16 000之间，窗口最大为24 176 kb，最小151 kb。随着标记密度升高，EQ和HM两种筛选方法填充一致性和准确性不断提升，但填充准确性和填充一致性增加的幅度越来越小。当标记集合密度超过12 k后均趋于平稳。SNP密度在16 k时两种方法的填充准确性达到最高（r2 EQ=0.8801，r2 MAF=0.8696）。当标记密度低于11 k时，不同标记密度梯度下HM方法填充一致性均高于EQ方法。然而当SNP集合密度超过11 k时，EQ筛选方法较表现出填充优势。与填充一致性结果趋势相似，在SNP集合密度低于10 k时，HM方法仍然具有较高的填充准确性，但当SNP集合密度高于10 k时，EQ方法的填充准确性则较高，且在SNP密度集合大于12 k后，EQ填充准确性趋于稳定。同时研究发现与低MAF标记位点相比，高MAF位点的填充准确性更高。填充过程中发现，填充一致性和填充准确性随着参考群体增大而提高。当参考群体数量在600—800时，位点填充准确性和一致性较高。【结论】在华西牛群体中，填充一致性和填充准确性随标记密度递增而上升，在标记密度为10 k—12 k区间，可获得较好的填充效果。当标记密度小于10 k时优先选择HM方法，更高密度时EQ方法较好。高MAF标记位点填充准确性更高。采用填充策略进行低密度标记填充时，参考群体数量在400头以上时填充效果较为理想。

基于转录组测序筛选鸡蛋绿壳性状相关基因

肖涛, 李辉, 罗韦, 叶涛, 余欢, 陈友波, 石钰仕, 赵德鹏, 吴芸

中国农业科学. 2023, 56(8): 1594-1605. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.014

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【背景】绿壳蛋深受消费者喜爱，蛋壳绿色的深浅在市场上是影响绿壳蛋定价销售的重要参考指标。绿壳蛋的形成受多基因共同调控，蛋壳绿色深浅不一，其分子机理尚不清楚。通过对赤水乌骨鸡蛋壳腺组织进行转录组测序，挖掘其调控绿壳蛋蛋壳颜色深浅的候选基因以及关键信号通路，探究影响蛋壳颜色遗传性，以期发展绿壳蛋的选种选育和提高经济效益。【目的】探讨赤水乌骨鸡的遗传基础，并通过SLCO1B3基因分型对其进行鉴定和筛选，以期通过分子标记在青壳鸡育种规划中提供新的见解，并在后期的选择策略中帮助控制和提高赤水乌骨鸡蛋壳品质的同质性。【方法】以纯系的 280 日龄赤水乌骨鸡为研究对象，屠宰产浅绿色蛋（QL）和深绿色蛋（SL）的母鸡各3只，采集蛋壳腺以RNA-seq技术检测分析，筛选与蛋壳颜色密切相关的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并对这些 DEGs进行 GO 和 KEGG 富集分析。利用qRT-PCR技术检测与蛋壳颜色相关的 6 个候选基因的转录水平变化以验证转录组数据可靠性。【结果】在深绿组与浅绿组中共筛选到93个显著DEGs，有 59 个基因在深绿组中显著上调，34个显著下调。DEGs注释到 GO 数据库进行比对，主要显著性富集的是钠离子转运、负离子结合、肌质网膜等。KEGG 分析富集程度最显著的是醛固酮调节钠的重吸收，以及富集的矿物质吸收、亚油酸的新陈代谢等信号通路。通过qRT-PCR验证，结果显示这些基因的表达趋势与转录组的测序结果一致。【结论】经功能分析，TF 基因、SCNN1 家族基因、CYP450 家族基因、SLC 家族基因和FAM 家族基因，以及醛固酮调节钠的重吸收信号通路参与蛋壳色素合成、转运和沉积。上述基因和信号通路可能是影响赤水乌骨鸡蛋壳绿色深浅不一的候选基因和关键信号通路。

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

张鹏云, 陈敏, 刘明星, 周红, 蔺辉星, 范红结

中国农业科学. 2023, 56(8): 1606-1614. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.015

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【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA 反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1 μg·mL^-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1﹕50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

新发鸽腺病毒A型感染的病理变化

杨志远, 周雨婷, 林健, 黄程, 高洁, 段会娟, 程水生, 赵际成, 罗伟珏, 刘月焕

中国农业科学. 2023, 56(8): 1615-1616. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.016

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