当期目录

2014年 第47卷 第1期 刊出日期：2014-01-01

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

转基因水稻基因飘流研究十年回顾

贾士荣1, 袁潜华2, 王丰3, 姚克敏4, 裴新梧1, 胡凝4, 王志兴1, 王旭静1, 柳武革3, 钱前5

中国农业科学. 2014, 47(1):  1-10.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.001

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中国是世界最大的水稻生产国和亚洲栽培稻的起源中心之一。随着中国转基因水稻研发的快速发展，需要研究水稻转基因飘流可能对环境和食品安全带来的潜在风险。基因飘流及其数据是对转基因水稻进行科学评估和监管的重要参数。为此，从2002年开始组建了研究团队，对转基因水稻的基因飘流进行了为期10年的系统研究。取得的结果主要包括：（1）阐明了水稻基因飘流的基本规律，揭示了影响水稻基因飘流的生物学和气象学主控因子。沿水稻开花期的主流风向，采用长方形田间试验设计，分别在三亚、广州和杭州3个点2-3个生长季，研究了纯合转bar基因花粉供体L201或B2 (姐妹系，抗除草剂Basta)向19个非转基因受体（包括不育系、常规稻品种、杂交稻F1和普通野生稻）在不同距离上的基因飘流率，明确了转基因向不育系的飘流率最高，向普通栽培稻品种的基因飘流率最低(相邻种植时小于1%或0.1%)，向普通野生稻的基因飘流率介于不育系和常规稻之间，向不育系的最大基因飘流率比向普通野生稻和栽培稻要大1-3个数量级；基因飘流率随距离增加呈负指数曲线衰减，且存在急剧降低的“拐点”，“拐点”的距离与试验点水稻开花期的风速密切相关,广州和杭州为1-2 m，三亚约为5 m；采用圆形、以花粉供体为中心的田间试验设计，以异交结实率很高的不育系博A作受体，清晰地解析了风向与基因飘流率的数值关系，主流和次主流风向下游4个扇区的基因飘流事件累计达90%-96%，而逆风向和侧逆风向4个扇区仅为4%-10%。综上所述，水稻转基因飘流率与常规育成品种间的异交率（一般在1%以下）基本相同，在数量级上转基因并未增加新的风险。（2）建立了以气象资料为参数的水稻花粉扩散和基因飘流普适模型，计算和预测了中国南方稻区17省、市的最大基因飘流阈值距离（maximum threshold distances, MTDs）。受东南季风和地形地貌的影响，中国南方稻区MTDs的空间分布特征为：东西之间有自东向西逐渐减小的趋势，南北之间首先在南方丘陵地区逐渐减小、越过南岭后再向东南沿海地区逐渐增大。（3）利用人工构建的普通野生稻与基因（Bt或bar）飘流后代栽/野F1杂种混栽群体，经多年多代跟踪观察，分析了转基因飘流至普通野生稻后的命运，发现栽/野F1杂种在3-5年后完全消失，混栽群体中检测不到外源的Bt和bar，有理由推测普通野生稻具有自我保护的机制。（4）研究了小规模田间试验中采用花期隔离和布帐隔离措施降低水稻基因飘流率的效果；调查了海南、广东、广西普通野生稻原生境居群与相邻种植的栽培稻花期相遇情况，建立了相应的数据库；研究了基因拆分技术作为生物学限控措施从根本上限控基因飘流的效果；以本研究的结果及对国际上主要农作物基因飘流的调研数据为基础，提出了在水稻基因飘流风险评估和监管中采用分类管理和阈值管理的原则。在10年回顾和科学分析的基础上，对未来研究的重点也进行了展望。

利用产量功能基因标记分析三系杂交水稻亲本的遗传多样性

张涛1, 3, 杨蛟2, 蒋开锋1, 3, 曹应江1, 杨莉1, 3, 杨乾华1, 万先齐1, 游书梅1, 罗婧1, 高磊1, 李昭祥1, 郑家奎1, 2, 3

中国农业科学. 2014, 47(1):  11-23.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.002

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【目的】利用功能基因标记分析三系杂交稻亲本的遗传多样性。【方法】利用44个根据文献共同报道的QTL位点或者已经被精细定位或已克隆的与水稻产量性状基因紧密连锁的功能基因标记，以及29个覆盖水稻12条染色体的在三系杂交水稻亲本间多态性高、带型清晰、重复性好的SSR标记分析76个三系杂交水稻亲本的遗传多样性。按POPGEN32分析软件要求将PCR扩增产物的凝胶电泳结果数字化，将数字化的矩阵数据转换为基因型数据，在POPGEN32软件下计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、多态性位点百分率（P）、Nei’s遗传多样性指数（He），用于评价所有亲本材料的基因多样性；计算遗传分化系数（Fst）、Nei遗传距离（D），进行遗传结构和遗传关系检测。利用NTSYS-pc2.10e软件计算品种间遗传相似系数（GS），并根据GS按非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析，绘制品种间遗传聚类树状图。【结果】44个功能基因标记中有37个标记具有多态性，多态性位点百分率（P）84.09%，共检测到86个等位基因位点，平均每个位点2.32个，变化范围2—4个；其中有效等位基因（Ne）62.95个，占73.2%，Nei’s遗传多样性指数（He）变幅为0.049—0.831，平均值0.585。76份材料间的遗传相似系数（GS）变幅为0.323—0.973，平均值0.650。聚类分析表明在遗传相似系数0.618处分为保持系和恢复系两类。保持系和恢复系间的遗传分化系数（Fst）为0.151，属高度遗传分化，Nei遗传距离（GD）0.185，类群内遗传距离相对较小，类群间遗传距离相对较大。29个SSR标记共检测到72个等位基因位点，平均每个位点2.48个，变化范围2—4个；聚类分析表明未能将保持系和恢复系分为两类，部分保持系聚类在了恢复系群，部分恢复系聚类在了保持系群。【结论】相对于普通分子标记，功能基因标记具有较高的DNA多态性检测效率，用于类群划分和种质资源的多样性分析等方面更具准确性和可靠性；三系杂交稻亲本在44个产量功能基因位点的亲缘关系较近，遗传基础狭窄，同源性较高。但保持系群和恢复群系间在这些功能基因位点的遗传差异较大，遗传分化程度较高，杂交水稻骨干亲本在产量性状上仍具有较高的杂种优势利用空间。

利用甘蓝型油菜高密度SNP遗传图谱定位油酸、 亚麻酸及芥酸含量QTL位点

刘列钊, 李加纳

中国农业科学. 2014, 47(1):  24-32.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.003

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【目的】菜籽油包括多种脂肪酸组分，提高油酸（C18:1）含量，降低亚麻酸（C18:2）和芥酸（C22:1）含量是油菜育种改良和遗传研究的重要目标。本研究利用刚开发的油菜60K芯片构建的高世代重组自交系群体遗传连锁图谱，对3个不同环境中影响甘蓝型油菜品质的油酸、亚麻酸及芥酸含量进行QTL定位分析，研究结果可对脂肪酸组分QTL位点在不同的群体之间准确比较分析。【方法】以高芥酸亲本GH06为母本和低芥酸亲本P174为父本构建高世代重组自交系，分别于2008年在德国吉森、德国霍亨里特及2009年德国吉森3个不同的环境中设置田间试验，收获自交种子，采用近红外分析方法3次重复对种子的脂肪酸组分进行分析。利用油菜60K芯片对重组自交系群体进行基因型分析，DNA样品预处理及芯片处理严格按照Illumina Inc公司Infinium HD Assay Ultra操作说明进行。取最小阈值LOD 5.0利用MSTmap软件构建遗传图谱。QTL定位所用的遗传图谱包括2 756个SNP位点，覆盖甘蓝型油菜基因组1 832.4 cM。利用Windows QTL Cartographer复合区间作图法对油酸、亚麻酸及芥酸含量进行QTL定位。【结果】在3个环境中，油酸和芥酸含量均表现为极显著负相关，相关系数均达到-0.95，且表现为主基因控制的性状，芥酸和亚麻酸表现负相关，油酸与亚麻酸表现正相关。3个性状在3个环境中共检测到14个QTL，在A08和C03上都检测到油酸和芥酸含量重叠的主效QTL位点。在3个环境中，油酸主效QTL位点解释表型变异19%—31%，芥酸主效QTL位点解释表型变异19%—34%，两者表现加性效应相反。A08和C03染色体上的芥酸主效QTL位点加性效应在3个环境中为7.6到9.6，加性效应来自低油酸、高芥酸亲本GH06。亚麻酸属于典型的数量性状，受环境影响较大，在3个环境中检测到不同的微效QTL位点，解释表型变异3%—12%。遗传图谱与物理图谱比较分析发现，脂肪酸去饱和酶FAD2基因位于亚麻酸QTL qA05C18:3的置信区间，而脂肪酸延长酶FAE1基因位于芥酸QTL qA08C22:1的置信区间。【结论】利用该套油菜60K芯片准确定位了油酸、亚麻酸及芥酸QTL位点，位于A08和C03染色体上的芥酸主效QTL位点同时也是油酸的主效QTL位点，该研究结果有利于不同群体在使用该套SNP芯片分析及对脂肪酸组分定位后准确比较分析。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

玉米不同基因型双列杂交后代抽丝后氮素代谢特性

刘春晓1, 赵海军1, 董树亭2, 王庆成1, 李宗新1, 刘开昌1

中国农业科学. 2014, 47(1):  33-42.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.004

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【目的】阐明保绿型玉米和非保绿型玉米双列杂交后代抽丝后氮素代谢特征。【方法】选育氮高效品种是实现玉米高产高效生产的根本途径。为明确不同基因型玉米双列杂交后代的氮代谢和利用特征，筛选出保绿型玉米氮高效品种，采用大田试验的方法，选择保绿型（SG, stay-green）玉米自交系Q319、CZ01、VA91和非保绿型（NSG, non-stay-green）玉米自交系BM、B73、MO17，以此组配6×6完全双列杂交，以双列杂交后代为材料，系统研究不同玉米品种主要生育时期叶片、茎鞘、籽粒氮含量和粗蛋白质含量的变化，抽丝前后氮素积累、分配和氮收获指数，叶片氮代谢关键酶硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）活性等的影响，并对叶片氮代谢酶活性与保绿性的相关性进行了分析。【结果】不同基因型双列杂交后代抽丝后叶片氮含量呈倒“V”型变化特性，高峰期在灌浆期前后。茎鞘和籽粒氮含量均随生育期推进呈逐渐降低的变化趋势。保绿型（SG）玉米叶片、茎鞘、籽粒氮含量均显著高于非保绿型（NSG）玉米。抽丝前保绿型玉米自交后代氮积累、抽丝后氮积累、氮积累总量分别比NSG高20.00%、82.30%和45.23%；其转移量、转移率和氮素收获指数则分别比NSG低51.28%、66.59%和14.32%，抽丝后保绿型玉米的氮积累量约占50%，而非保绿型玉米仅为40%左右。保绿型玉米自交后代叶片和茎鞘粗蛋白质含量分别比非保绿型高108.23%和33.63%。抽丝至成熟期叶片硝酸还原酶活性的变化呈单峰曲线，高峰期在灌浆期前后，不同基因型玉米间变化趋势一致。抽丝后叶片GS活性、GOGAT活性和可溶性蛋白含量变化均呈单峰曲线，高峰期在抽丝后15 d左右。保绿型玉米NR活性、GS活性、GOGAT活性和可溶性蛋白含量在各时期均高于非保绿型。相关分析表明，叶片保绿度与叶片氮含量、可溶性蛋白含量、GOGAT活性呈极显著的正相关，与GS活性呈显著正相关，与NR呈正相关，但不显著。叶片氮含量与可溶性蛋白、GOGAT活性、GS活性呈极显著的正相关。氮素的同化与相关的酶活性关系极为密切。【结论】较高的氮代谢水平是叶片保绿的营养生理基础之一，保绿型玉米有较高的氮代谢酶活性，在后期有较强的氮素吸收和同化能力，保绿性可作为筛选氮高效玉米品种的一个重要农艺性状。

施钾时期对甘薯济徐23块根淀粉积累 与品质的影响及酶学生理机制

柳洪鹃1, 姚海兰1, 史春余1, 张立明2

中国农业科学. 2014, 47(1):  43-52.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.005

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【目的】阐明施钾时期对甘薯“济徐23”块根淀粉积累和粒度分布特征的影响及其酶学生理机制。【方法】在大田栽培条件下，以淀粉型品种“济徐23”为材料，设置不施钾肥（T1）、基施钾肥（T2）、封垄期追施钾肥（T3）和茎叶生长高峰期追施钾肥（T4）4个处理，于2008—2009年2个生长季在山东农业大学农学试验站进行试验。采用甘薯块根膨大过程中定期取样的方法留样，测定块根中淀粉、直链和支链淀粉含量，同时测定块根淀粉粒体积分布的中位粒径和大（>19.76 μm）、中（3.359-19.76 μm）、小（<3.359 μm）型淀粉粒所占的体积百分比以及淀粉合成相关酶（SS、ADPGPPase、UDPGPPase、GBSS和SSS）活性，分析不同时期施用钾肥对甘薯各生育时期块根内淀粉及组分含量、淀粉粒度分布特征及淀粉合成相关酶活性的影响。【结果】与对照（T1）相比，施用钾肥提高了块根干物质积累量和淀粉产量，3个施钾处理淀粉产量的增幅分别为24.90%、16.57%和9.24%，随施用时间的推迟淀粉产量增幅降低。封垄期和茎叶生长高峰期追施钾肥显著降低直链淀粉含量而提高支链淀粉含量。基施钾肥提高了大型淀粉粒的体积百分比，茎叶生长高峰期追施则提高中、小型淀粉粒的体积百分比，增幅均达到显著水平。不同时期施钾均可提高块根中SS、ADPGPPase和UDPGPPase的活性，提高淀粉合成前体物质的供应能力，施用钾肥对SS和ADPGPPase活性的作用时间最长为130 d，基施钾肥主要作用时期为块根膨大的前、中期，追施钾肥的主要作用时期为块根膨大的中、后期，施钾越早对UDPGPPase活性的作用时间越长；追施钾肥提高了块根膨大后期SSS活性、而降低了块根膨大后期GBSS活性。总淀粉含量与SS和ADPGPPase活性呈极显著正相关，直链淀粉含量与GBSS和SS活性呈极显著正相关，支链淀粉含量与ADPGPPase和SSS活性呈显著正相关关系。【结论】基施或封垄期追施钾肥显著提高块根干物质积累量和淀粉产量，追施钾肥显著提高支链淀粉含量、降低直链淀粉含量，基施钾肥处理的大型淀粉粒体积百分数高，高峰期施用钾肥处理的中、小型淀粉粒体积百分数高。施钾时期显著影响直链淀粉含量、支链淀粉含量和淀粉产量，这与块根中SS、ADPGPPase、UDPGPPase、GBSS和SSS活性的变化密切相关。

植物保护

草莓根颈腐烂病的病原鉴定

韩永超, 向发云, 曾祥国, 张鹏, 顾玉成

中国农业科学. 2014, 47(1):  53-60.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.006

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【目的】明确草莓根颈腐烂病的病原，为草莓根颈腐烂病的防治及抗病育种提供依据。【方法】对取自湖北省武汉市的发病草莓植株分别进行发病组织培养、分离纯化。采用牙签根颈接种方法进行致病性测定；观察病原微生物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）上的菌落形态；从所分离到的菌株中选择PDA培养基平板上形态不同的Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5进行后续试验和分析。测定各菌株在18℃黑暗条件下的菌丝生长速度，然后用方差分析程序（ANOVA）对不同菌株间的差异显著性进行分析；采用光学显微镜和扫描电子显微镜对病原菌在草莓叶柄上产生的分生孢子形态进行分析。分别以Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5的基因组DNA为模板对这3个菌株的部分肌动蛋白基因（Actin，ACT）、β-维管蛋白基因（β-Tubulin 2，TUB2）和钙调蛋白基因（Calmodulin, CAL）进行PCR扩增，并将PCR产物测序。将Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5与胶孢炭疽复合种内全部23个种的代表性菌株一起进行系统进化分析。采用Mega4.1软件和邻接法进行基于病原菌ACT、TUB2和CAL序列的多基因位点系统进化分析。【结果】从武汉市郊发病草莓植株上共分离纯化到15个菌株，不同菌株在PDA培养基平板上的正面形态没有显著差异，但是背面形态却明显不同，根据各菌株的PDA平板背面形态将15个菌株分成3组，分别从每组中选择Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5进行后续形态学鉴定和系统进化分析。3个菌株在采用牙签接种法接种草莓根颈时均能使草莓植株发病；使用这3个菌株接种草莓叶柄时均能在病斑处产生分生孢子，但分生孢子形态没有显著差异；20个分生孢子的平均大小为11 μm×3.8 μm；3个菌株在18℃黑暗条件下的菌丝生长速度分别为0.82、0.68和0.88 cm?d-1；这些生物学特征表明这些菌株属于胶孢炭疽复合种。通过基于ACT、TUB2和CAL的多基因系统进化分析结果表明菌株Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5与已鉴定为Colletotrichum siamense的菌株ICMP12567、ICMP17795、ICMP18121、CBS113199和CBS112983归在1个分支，其自展支持率为84%，能够与胶孢炭疽复合种内的其他物种区分开。【结论】通过对草莓根颈腐烂病菌的生物学特性、柯赫氏法则证病过程及基于ACT、TUB2和CAL的多基因系统进化分析，明确了引起武汉地区草莓根颈腐烂病的病原为胶孢炭疽菌复合种内的C. siamense。

恒温和波动温度下西花蓟马的实验种群生命表

王海鸿1, 薛瑶2, 雷仲仁1

中国农业科学. 2014, 47(1):  61-68.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.007

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【目的】对西花蓟马（Frankliniella occidentalis）实验种群生命表的研究大多在恒温条件下进行，研究结果可用于田间自然条件下种群发生的预测。然而，西花蓟马在自然界中接触的不是恒温，而是昼夜波动的温度。论文旨在比较恒温和昼夜波动温度下西花蓟马实验种群的生命表参数，探讨用恒温构建的西花蓟马生命表结果来预测自然条件下蓟马种群发生动态的准确性。【方法】分别在恒温（26℃）和均温相同的昼夜波动温度（20—32℃）条件下，构建西花蓟马实验种群在菜豆豆荚上的年龄-阶段特异生命表，比较2种温度条件下西花蓟马的生活史和种群参数。因为卵的孵化率随着成虫年龄变化，所以根据孵化卵的数量来计算年龄-特异繁殖率，以准确揭示西花蓟马的生物学特性。用bootstrap方法来计算种群生长参数的平均数和标准误；用U检验（Mann-Whitney test）（Sigmaplot 12.0）估计恒温和波动温度下西花蓟马种群参数、发育历期和繁殖力间的差异。【结果】恒温和波动温度对西花蓟马的成虫前期发育历期、总产卵前期、成虫前期存活率以及生命表参数等有明显影响（P<0.05），而对成虫寿命和繁殖力等影响不显著。西花蓟马成虫前期发育历期在恒温（11.86 d）下显著长于在波动温度（11.36 d）下。总产卵前期在恒温与波动温度下分别为12.50和11.37 d，达到显著差异水平。成虫前期在恒温下存活率（0.48）显著高于波动温度下存活率（0.44）。西花蓟马成虫寿命在恒温（雌虫13.56 d，雄虫10.15 d）和波动温度（雌虫11.37 d，雄虫9.71 d）下无显著差异。西花蓟马繁殖力在恒温（35.38卵/雌）和波动温度（34.74卵/雌）下无显著差异。内禀增长率（r）、周限增长率（λ）和净增殖率（R0）在恒温下分别为0.121/d、1.129/d和7.538，在波动温度下分别为0.127/d、1.135/d和8.831。西花蓟马在波动温度下的种群增长要比在恒温下快。【结论】与自然的昼夜波动温度条件相比，恒温可能过高或过低的估计了许多生命表参数，从而影响种群动态监测结果及其在害虫综合治理中的应用。

喷雾方式对农药雾滴在水稻群体内沉积分布的影响

徐德进, 顾中言, 徐广春, 许小龙

中国农业科学. 2014, 47(1):  69-79.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.008

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【目的】分析喷雾方式对农药雾滴在水稻群体内沉积分布的影响，研究提出稻田合理的喷雾方式，提高稻田农药利用率。【方法】在水稻分蘖期、孕穗期和扬花期，用配有空心圆锥雾喷头的手动喷雾器叶面喷洒和配有气力式弥雾喷头的弥雾机下倾45°角喷洒指示剂丽春红-G溶液，收集并测定沉积在植株上层、中层和下层不同点位载玻片上的雾滴指示剂丽春红-G沉积量。【结果】以不同喷雾方式施药，水稻叶片正面、背面及垂直方向不同点位的丽春红-G沉积量有显著差异。在水稻分蘖期、孕穗期、扬花期用手动喷雾器叶面喷雾和弥雾机45°角下倾喷雾，丽春红-G的沉积量在水稻群体空间内的分布趋势均表现为上层＞中层＞下层。在水稻分蘖期用手动喷雾器叶面喷雾，13.3%玻片上丽春红-G的沉积量接近于平均数；52.9%玻片上丽春红-G沉积量低于平均数；33.75%玻片上丽春红-G的沉积量高于平均数。在水稻分蘖期用弥雾机45°角下倾喷雾，20.4%玻片上丽春红-G的沉积量接近于平均数；45.4%玻片上丽春红-G沉积量低于平均数；34.2%玻片上丽春红-G沉积量高于平均数。在水稻孕穗期和扬花期用手动喷雾器叶面喷雾，分别有33.3%和28.1%的玻片上没有丽春红-G的沉积；而用弥雾机45°角下倾喷雾，没有丽春红-G沉积的玻片比例分别为13.9%和5.0%。在水稻孕穗期用手动喷雾器和弥雾机喷雾，分别只有6.4%和11.7%玻片上的沉积量接近于平均值，而在扬花期时该比例分别为7.2%和17.2%。在水稻分蘖期、孕穗期和扬花期用手动喷雾器叶面喷雾，喷雾雾滴主要沉积在表示叶片正面的载玻片上，其沉积量占总沉积量的66.3%、85.1%和84.9%，其中在植株上层表示叶片正面载玻片上的沉积量占总沉积量的38.7%、42.2%和45.6%，在表示叶片背面和垂直面玻片上的沉积量很少。弥雾机下倾45°角喷雾，在表示叶片背面和垂直面玻片上的沉积量多于手动喷雾器叶面喷雾，但在表示叶片正面玻片上的沉积量仍占总沉积量的50.5%、50.6%和53.1%，其中植株上层表示叶片正面玻片上的沉积量占总沉积量的32.9%、27.9%和31.5%。【结论】如果以单位面积载玻片上的平均沉积量作为防治病虫害的有效剂量，那么在水稻群体内同时存在剂量浪费与剂量不足的现象。手动喷雾器压顶喷雾，喷雾雾滴主要沉积在植株上层叶片正面，沉积量占到总沉积量的1/3以上，而在叶片背面和茎秆上的沉积量很少，尤其是在植株基部叶片和茎秆上，沉积量趋向于零。采用弥雾机下倾45°角喷雾，喷雾雾滴在植株上层叶片正面的沉积量仍超过总沉积量的1/4，但在施药量低于手动喷雾器压顶喷雾条件下，各层叶片背面和茎秆上的沉积量都显著高于手动喷雾器叶面喷雾，说明弥雾机下倾45°喷洒，农药雾滴能够进入植株中下层，在叶片背面及茎秆上沉积。

肺炎克雷伯氏菌S001草甘膦靶标酶基因的克隆及其抗性验证

张纯1, 吴丹丹1, 2, 冯莉1, 田兴山1, 郭爱玲2

中国农业科学. 2014, 47(1):  80-89.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.009

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【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用，抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点，其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多，基因资源丰富，论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株，克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证，以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株；通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定；利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001，并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001序列的基本特征；利用重叠 PCR法对aroAS001变异位点进行定点突变获得aroAS001-mut序列后，将aroAS001和aroAS001-mut基因片段转入aroA基因缺陷型菌株DH5α/△aroA中进行基因功能互补和草甘膦抗性水平验证。【结果】分离出一株高抗草甘膦菌株，经形态学和分子生物学鉴定该菌株为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），命名为kpS001；克隆该菌株草甘膦靶标酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因aroAS001，序列分析结果显示由该基因所编码的氨基酸序列具有典型的Class I EPSPS特征，但与已报道肺炎克雷伯氏菌的aroA相比其第227位碱基发生突变，致使对应的氨基酸发生变异。对该基因差异位点进行核酸定点突变获得aroAS001-mut基因片段后，将aroAS001和aroAS001-mut基因片段分别转入缺陷型大肠杆菌菌株DH5α/△aroA进行功能互补验证，与对照菌株相比，转入aroAS001和aroAS001-mut的重组菌株均能在含200 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中能够正常生长，表现出良好的抗性，之后随着草甘膦浓度增加其生长状态开始受到抑制，当草甘膦浓度达到350 mmol?L-1时，菌株生长基本完全被抑制。【结论】肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株是一株高抗草甘膦菌株，由aroAS001编码的草甘膦靶标酶EPSPS属于Class I EPSP合成酶，aroAS001对草甘膦具有优良抗性，能在含350 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中生长，该基因可以作为备选基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

水稻-大麦长期轮作体系钾肥效率及土壤钾素平衡

唐旭, 计小江, 李超英, 吴春艳, 杨生茂, 刘玉学, 吕豪豪, 陈义

中国农业科学. 2014, 47(1):  90-99.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.010

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【目的】研究水旱轮作系统中土壤自然供钾力、钾肥利用率和土壤钾素表观平衡，为农田钾素的可持续性管理提供理论依据。【方法】设置不施肥（CK）、施氮磷肥（NP）和施氮磷钾肥（NPK）3个处理，利用20年稻麦水旱轮作定位试验数据，研究大麦和水稻地上部生物量、产量及籽粒和秸秆中含钾量对不同施肥处理的响应。【结果】在一年两熟和三熟制稻麦轮作系统中，20年不施肥（CK）的作物平均每年可生产籽粒8.24和9.22 t•hm-2，其相当于相应轮作体系平衡施肥（NPK）的75.6%和71.9%，因此施肥对作物产量提高的贡献率分别为24.4%和28.1%，施钾肥对作物籽粒产量提高的贡献分别为11.8%和14.0%。钾肥对旱季作物的增产贡献率高于水季，其中钾肥对大麦产量提高的贡献率平均为17.9%，比水稻的高36.1%。在一年两熟和三熟轮作制中，不施肥的作物平均每年从土壤中吸收的钾量相当于相应平衡施肥的59.1%和58.3%。作物地上部吸钾量的绝大部分来源于秸秆。其中大麦地上部吸钾量的81.7%来源于秸秆，水稻为74.2%—87.6%。旱季土壤钾素自然供应能力低于水季。大麦生长期平均每年土壤钾素自然供应能力为69.8%，比早稻、连作晚稻和单季晚稻分别低15.5%、19.7%和19.4%。随着试验时间的延长，大麦生长期土壤钾素自然供应能力以每年1.6%的速率降低，但水稻生长期土壤供钾能力在时间上没有显著变化，20年定位试验后仍维持在80%以上。尽管施钾肥降低了作物钾素内部利用率，但是年度间各施肥处理作物钾素内部利用率没有显著变化。在平衡施肥条件下，每吸收1 kg钾素，大麦、早稻、连作晚稻和单季晚稻可生产籽粒平均为42.4、44.7、41.3和44.8 kg。每施入1 kg钾肥可生产籽粒分别为83.5、79.7、71.6和69.7 kg。旱季钾肥效率高于水季。在一年两熟轮作制中钾肥表观利用率平均为29.5%，而在一年三熟轮作制中，表观利用率可达41.5%。由于作物对钾素不断的吸收，造成在一年两熟和三熟水旱轮作系统中不施肥（CK）的土壤每年钾素亏缺148.2和182.7 kg•hm-2，而且施氮磷肥加速了土壤钾素的耗竭，每年多携带走钾素57.8和65.0 kg•hm-2。尽管施钾肥缓解了土壤钾素不足，但在一年两熟和三熟轮作制中施钾土壤平均每年仍亏钾分别为146.5和85.5 kg•hm-2。【结论】在水旱轮作系统中，水稻生长期土壤供钾能力高于麦季，但旱季钾肥的利用效率高于水季，在年施钾量（K2O）187.5 kg•hm 2的条件下，土壤钾素仍表现亏缺，因此，应该重视土壤钾素平衡问题。

基于典范对应分析的甘肃引黄灌区土壤盐渍化特征研究

杨思存1, 逄焕成2, 王成宝1, 李玉义2, 霍琳1, 姜万礼1

中国农业科学. 2014, 47(1):  100-110.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.011

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【目的】研究甘肃引黄灌区耕地土壤全盐量（TS）、pH和盐分离子组成的空间分布特征及数量关系，并探讨它们之间的相互关系、影响程度以及对盐碱地类型、分布的影响。【方法】以兴电和景电两个典型灌区为研究取样区，样点布局既涵盖了上游新垦盐碱荒地、中游轻度盐渍化耕地、下游中重度盐渍化耕地和弃耕盐碱荒地，又兼顾了耕地土壤盐渍化类型（硫酸盐型、氯化物-硫酸盐型、硫酸盐-氯化物型）和程度（轻度、中度、重度）的差异。运用常规统计学方法研究了土壤TS、pH、盐分离子的剖面分布特征，运用典范对应分析方法（CCA）研究了土壤TS、pH与盐分离子含量之间的数量关系及各土层TS、pH、盐分离子与研究对象前2个CCA排序轴的相关系数、特征值和解释方差。【结果】甘肃引黄灌区耕地土壤为轻度至重度盐化，0—40 cm土层含盐量随土层深度的增加而降低，40—80 cm土层含盐量随土层深度的增加而增加。剖面中的阳离子以Na+为主，阴离子以SO42-为主，土壤pH介于7.93—9.98之间。不同土层内，K+与HCO3-、Ca2+与Mg2+始终有较好的关联性，Na+与Cl-之间的关联性越往下层越强，SO42-与Na+之间主要是负相关，K+与Na+以及SO42-、Cl-、HCO3-之间的关联性不强。在0—100 cm全剖面上，pH的空间分布受HCO3-的影响较大，TS受Na+、Cl-、SO42-的影响较大。分层与全剖面的情况有所不同，0—20 cm土层内TS和pH的空间分布主要受控于SO42-含量，20—40cm土层内主要受控于Cl-和Na+含量，40—60 cm土层内受Ca2+、Mg2+、SO42-和HCO3-的共同影响，60—80 cm土层内Mg2+是主要影响因素，80—100 cm土层内主要受控于Mg2+和Cl-。CCA第1排序轴反映了TS的变化情况，第2轴反映了pH的变化情况，第1轴特征值在0.53—0.70，解释方差在38.7%—57.7%；第2轴特征值在0.36—0.64，解释方差在30.6%—44.7%。【结论】甘肃引黄灌区的盐渍化耕地中同时存在盐分表聚和底聚两个过程，上游新垦盐碱荒地和中游轻度盐渍化耕地以底聚为主，下游中重度盐渍化耕地和弃耕盐碱荒地以表聚为主。60—80 cm的泥质胶结砂层含盐量高达93.7 g•kg-1，对水盐运移和盐分离子分布产生了重要影响，是造成灌区发生土壤次生盐渍化的主要原因之一。盐渍化耕地的钠质化现象只在重度次生盐渍化区发生，TS、Na+和SO42-是决定项目区盐碱地类型和分布的主要因素。典范对应分析通过箭头连线的长短、所处的象限、箭头之间的夹角以及与角符号间距离的远近等，在CCA二维排序图上可以直观地给出各盐分离子之间以及土壤TS、pH值与盐分离子之间的关系，并通过各土层TS、pH、盐分离子与研究对象前2个CCA排序轴的相关系数、特征值和解释方差等，来确定不同土层的主控因子和影响甘肃引黄灌区盐碱地类型和分布的主要因素，是一种更加科学的区域盐碱地特征及改良利用情况评价方法。

园艺

中国50个甘蓝代表品种EST-SSR指纹图谱的构建

王庆彪, 张扬勇, 庄木, 杨丽梅, 刘玉梅, 吕红豪, 方智远

中国农业科学. 2014, 47(1):  111-121.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.012

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【目的】研究甘蓝DNA指纹鉴定方法,并构建50份中国甘蓝代表品种DNA指纹数据库，为甘蓝品种特异性、真实性、纯度鉴定提供参考依据。【方法】首先，利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和来源不同的甘蓝材料对已开发的甘蓝EST-SSR引物进行筛选，获得多态性引物；然后将可用于甘蓝DNA指纹鉴定的核心引物正义链5′末端分别标记TAMRA、HEX、 ROX、6-FAM四种荧光，利用DNA分析仪检测不同等位变异的扩增片段大小，并确定每个等位变异的标准品种。利用核心引物扩增结合标准品种的片段大小，构建中国50个甘蓝代表品种的SSR指纹数据库。通过人工构建模拟群体对‘中甘21’品种真实性进行鉴定，进而对该指纹鉴定技术进行验证。【结果】利用6份来自中国不同生态条件、植物学性状差异较大的甘蓝品种对978对EST-SSR引物进行初步筛选，获得带型清晰、具有多态性的引物128对。进一步根据引物扩增带型清晰、多态性信息指数较高、不同等位变异的带型易于区分、在染色体上分布均匀原则，筛选出20对核心引物。该套引物可以检测甘蓝染色体20个位点的58个等位变异，平均每条染色体上被检测位点2.22个，平均每个位点包含2.9个等位变异，其中引物BoE607、BoE723等位变异数最多为5个，PIC值处于0.34—0.76之间。通过DNA分析仪检测显示等位变异扩增片段长度范围143—296 bp。利用20对核心引物构建50份中国甘蓝代表品种DNA指纹数据库，并阐述了甘蓝SSR-DNA指纹鉴定的应用和技术流程。本研究还对来自甘蓝主产区的31份‘中甘21’品种进行真实性鉴定，结果显示指纹鉴定与田间鉴结果完全一致。【结论】筛选获得20对核心引物，用于构建中国50个甘蓝代表品种DNA指纹数据库，通过构建人工模拟群体对‘中甘21’品种的真实性进行鉴定，准确率达100%。

黄瓜黑色果刺基因染色体定位及候选基因分析

刘书林1, 顾兴芳1, 苗晗1, 王烨1, YiqunWeng2, ToddCWehner3, 张圣平1

中国农业科学. 2014, 47(1):  122-132.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.013

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【目的】黄瓜作为重要的果菜类蔬菜，果实品质一直是黄瓜育种研究的重点。果实品质包括内在品质和外观品质，其中外观品质对黄瓜的商品性具有重要影响。果刺颜色作为黄瓜重要的品质性状之一，对其进行遗传分析和基因定位将有助于了解果刺颜色遗传的分子机理，为黄瓜果实性状改良提供理论依据和技术支撑，同时也可为刺色基因的精细定位及克隆奠定基础。【方法】研究利用黄瓜白色果刺自交系GY14（P1）和黑色果刺自交系NC76（P2）为亲本构建遗传群体，进行黄瓜果刺颜色的遗传分析。以F2分离群体为试材，应用分离群体分组分析法（BSA）和 2 112 对SSR引物进行 SSR 分析，结合9 930黄瓜全基因组序列信息和100份核心种质重测序结果开发新标记，对初定位区域进行标记加密。采用 JoinMap 4.0 作图软件和 MapInspect 软件构建连锁群并完成连锁群与染色体的对应，实现黄瓜黑色果刺性状的基因定位。运用生物信息学，在定位区域进行候选基因分析。利用包含156个株系的重组自交系（RILs）群体，对黑色果刺基因紧密连锁的两侧翼分子标记进行验证，确定标记用于分子标记辅助选择(MAS)育种的准确性。【结果】研究表明，黄瓜自交系NC76的黑色果刺符合质量性状遗传特点，由显性单基因B控制，黑色对白色为显性。初步定位筛选获得了与B基因连锁的8对SSR引物，将B定位于黄瓜4号染色体（Chr.4）上，最近的连锁标记为SSR22231，遗传距离为10.8 cM；根据初定位区域的序列信息，设计合成了新的SSR引物212对和Indel引物25对，利用这些引物对双亲和F2群体DNA进行分析，最终构建了一个包含14个SSR标记和1个InDel标记的分子标记连锁群，获得与B连锁的两侧翼标记SSRB-181和SSRB-130，遗传距离分别为2.0 cM和1.6 cM，该区段物理距离为422.1 kb，有60个预测候选基因，推测Csa4G003095和Csa4G001690是与黑色果刺形成相关性较大的候选基因。与B紧密连锁的两侧翼标记用于MAS育种的准确率分别为96.8%和96.2%，其中SSRB-181对黑色果刺植株鉴定的准确率达到100%，将在MAS育种发挥重要作用。【结论】黄瓜自交系NC76的黑色果刺性状由显性单基因控制，该基因位于Chr.4上422.1 kb范围内, 两侧翼标记为SSRB-181和SSRB-130，遗传距离为3.6 cM。本研究结果为黑色果刺基因的精细定位和克隆及MAS育种奠定了良好基础。

茶树CHS基因结构及编码区单核苷酸多态性分析

张丽群1, 韦康1, 王丽鸳1, 成浩1, 刘本英2, 龚武云1

中国农业科学. 2014, 47(1):  133-144.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.014

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【目的】通过试验获得茶树CHS基因（CsCHS）gDNA序列，以进一步确定CsCHS基因结构；研究CsCHS编码区单核苷酸多态性，并结合茶树多酚含量进行关联分析，寻找基因中可能存在的与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【方法】根据NCBI数据库中已有CsCHS序列设计特异性引物，再分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增，经克隆、测序获得CsCHS1、CsCHS2、CsCHS3三个基因的gDNA和cDNA全长序列，通过序列比对方法确定CsCHS结构。利用Compute pI/Mw、SOPMA等软件对所得序列进行生物信息学分析，预测和比较CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构。以茶多酚含量差异较大的57份茶树品种为材料，分别以57份材料的cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，然后利用PCR产物直接测序法筛查CsCHS编码区序列的单核苷酸多态性。结合CsCHS编码区序列单核苷酸多态性和57份材料多酚含量，利用软件TASSEL进行关联分析，筛选基因中可能与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【结果】试验获得CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的cDNA序列长度分别为1 277、1 320和1 242 bp，各自均包含一个长度为1 170 bp的开放阅读框；CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的gDNA序列长度分别为1 600、1 330和1 607 bp。通过gDNA序列和cDAN序列比对，结合真核生物内含子GT-AG法则，确定CsCHS1、CsCHS3分别包含2个外显子和1个内含子，内含子大小分别为323和356 bp，CsCHS2可能没有内含子。根据CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3 cDNA序列推导三者对应氨基酸序列，比较三条氨基酸序列发现三者氨基酸同源性较高，达到92.6%—95.4%，CHS蛋白亚家族中的特征性保守位点在这三条序列中都能找到，生物信息学分析结果显示CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构高度相似。CsCHS1编码区序列中共发现71个SNP位点，SNP出现频率为1SNP/16.48 bp，无Indel，基因核苷酸多样性（π）值为0.01088；CsCHS2编码区序列中共发现55个SNP位点，SNP出现频率分别为1SNP/21.27 bp，CsCHS2核苷酸多样性（π）值（0.00530）明显低于CsCHS1；因扩增CsCHS3 cDNA序列的PCR反应成功率低，未对该基因遗传多样性进行分析。通过关联分析分别从CsCHS1和CsCHS2中找到2个和4个与茶叶多酚含量相关的SNP位点。【结论】CsCHS1和CsCHS3属于保守型CHS基因，且CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3蛋白质结构高度相似，推测三者可能在茶树的不同部位或不同生长阶段发挥类似作用；CsCHS1和CsCHS2活跃，二者编码区内可能存在突变热点区。

贮藏·保鲜·加工

不同宰前禁食时间对羊肉品质影响的研究

夏安琪, 李欣, 陈丽, 何凡, 刘金凯, 王振宇, 倪娜, 张德权

中国农业科学. 2014, 47(1):  145-153.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.015

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【目的】动物在装卸和运输过程中的断料断水以及宰前休息期人为控制的禁食禁水行为称为宰前禁食。不当的宰前禁食处理可能降低畜禽胴体出品率，对肉的食用品质和加工性能产生不良影响。研究不同宰前禁食时间处理对羊肉品质的影响，确定适宜于肉羊的宰前禁食时间，对生产优质羊肉有重要意义。【方法】选取6月龄敖汉细毛羊公羊30只，分别进行宰前禁食0 h（对照）、12 h和24 h处理，研究羊肉食用品质（pH值、肉色、剪切力、持水力）、感官品质（膻味、嫩度、多汁性、总体可接受性）、卫生品质（菌落总数、大肠菌群总数）及宰后成熟过程中糖原含量、肌节长度和肌原纤维蛋白降解程度的变化规律。【结果】宰前禁食24 h处理组羊肉在宰后0 h、45 min、4 h的pH显著高于禁食12 h组和对照组（P＜0.05）。随着成熟时间延长，pH值差异逐渐消失，3个处理组之间羊宰后24 h和48 h pH差异不显著（P＞0.05）。宰前禁食24 h组羊肉蒸煮损失显著低于禁食12 h组和对照组（P＜0.05）。3个处理之间羊肉L*、a*、b*、ΔE、滴水损失、剪切力值及感官评价膻味、嫩度、多汁性和总体可接受性打分差异均不显著（P＞0.05）。宰后成熟24 h后，不同宰前禁食时间处理组羊肉的菌落总数及大肠菌群总数均在国标规定范围之内，不同处理组之间羊肉菌落总数差异不显著（P＞0.05）。随禁食时间的延长大肠菌群总数呈下降趋势，宰前禁食处理组羊肉大肠菌群菌落总数低于对照组。3个宰前禁食处理组羊宰后0 h、45 min、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h羊肉的糖原含量差异不显著（P＞0.05）。随宰后成熟时间的延长，糖酵解程度加大，糖原含量呈下降趋势。随宰前禁食时间的延长，肌节长度增加。宰前禁食24 h处理组肌节长度大于禁食12 h处理组，禁食12 h处理组肌节长度大于对照组（P＜0.05）。宰前禁食处理组羊肉宰后0 h羊肉肌原纤维蛋白降解程度一致，没有显著条带出现或缺失。宰后成熟24 h时，3个处理组在27 kD均出现条带，且宰前禁食12 h和24 h处理组的27 kD条带颜色深于对照组，表明禁食12 h和24 h处理组羊肉蛋白降解程度高于对照组。【结论】宰前禁食12 h和24 h使羊宰后肌肉卫生品质提高，并且促进宰后蛋白质降解。宰前禁食24 h使蒸煮损失降低。宰前禁食12 h和24 h对羊肉极限pH、糖原含量及肉质指标无影响。与对照组相比，宰前禁食12 h和24 h有益于羊肉卫生品质，对食用品质及感官品质无影响。

畜牧·兽医·资源昆虫

阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化

史新娥, 吴国芳, 宋子仪, 路宏朝, 贾龙, 朱嘉宇, 杨公社

中国农业科学. 2014, 47(1):  154-160.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.016

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【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下，骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管，促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成，但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此，笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响，希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1—3日龄健康大白猪为材料，采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞，接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天，用免疫荧光染色方法染肌管，DAPI染核，并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%—80%时，将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin，WM）的分化培养基，分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞，提取总RNA和总蛋白，采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁，呈梭形。第4天细胞数量增加，部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05），非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05），而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天，虽然也出现了蜂窝状生长，但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示，WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化，抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化，延迟肌管的形成，并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之，阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。

甘南牦牛GDF-10基因多态与生产性状的相关性分析

李天科1, 2, 梁春年1, 2, 郎侠1, 2, 裴杰1, 2, 吴晓云1, 2, 褚敏1, 2, 秦文1, 2, 阎萍1, 2

中国农业科学. 2014, 47(1):  161-169.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.017

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【目的】GDF-10基因又称作骨形成蛋白3b，最早通过骨形成蛋白寡聚核苷酸序列的PCR扩增所得，与骨骼的形成和发育有关。很多研究已经表明GDF-10基因在骨骼的形态变化过程中发挥着重要作用。本实验通过研究甘南牦牛GDF-10基因多态性与生产性状间的相关性，证明GDF-10基因与骨骼发育的相关性，发现与牦牛生产性状相关的分子标记，为加快牦牛选育进程，提高牦牛生产性能提供参考。【方法】以298头甘南牦牛血样为材料，随机选取其中的30个DNA样混合组成DNA池，设计9对引物对GDF-10基因外显子1，2和3进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶回收后测序。运用BLAST 和Chromas软件通过测序峰图找出突变位点，然后采用高分辨率熔解曲线分析技术（high resolution melting curve，HRM）进行基因型分型和统计等位基因频率。采用SHEsis和PHASE软件对GDF-10基因多态位点进行配对连锁不平衡和单倍型分析，采用SPSS17.0进行基因多态位点与生产性状关联性分析。【结果】检测到甘南牦牛GDF-10基因外显子3的 3个多态位点12116（G/A）、12152（C/T）、和13041（T/C）。群体遗传学分析显示，3个多态位点均表现为低度多态（PIC＜0.25）；?2检验表明牦牛群体在13041（T/C）位点未达到Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），其它两个多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）；多态位点配对连锁不平衡分析发现，三个突变位点之间存在弱连锁平衡；关联分析表明，甘南牦牛GDF-10基因不同突变位点的基因型与体斜长、体高、胸围、体重差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.001），与管围差异不显著（P＞0.05）；单倍型分析后在群体中发现了7种单倍型组合，其中ATC和ATT组合与牦牛的体尺性状和体重显著相关。【结论】甘南牦牛GDF-10基因3个多态位点和两个单倍型组合与牦牛的体高、体长、体重和胸围显著相关，可以尝试作为牦牛生产性状的候选分子标记，为牦牛遗传资源的保护、开发与新品种的选育提供科学依据。

苦马豆素抗牛病毒性腹泻病毒的研究

郝宝成1, 2, 武凡琳2, 邢小勇2, 项海涛2, 温峰琴2, 王学红1, 权晓弟1, 2, 胡永浩2, 梁剑平1, 2平1, 2

中国农业科学. 2014, 47(1):  170-181.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.018

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【目的】疯草是中国西部影响草地生态和畜牧业健康发展的毒草之一。主要有豆科棘豆属和黄芪属有毒植物等，在冬季牧草严重缺乏的时节，牛羊等牲畜被迫采食后可引起中毒和生产性能下降，甚至死亡，每年给我国草地生态和畜牧业造成的直接经济损失达几十亿元，是危害最严重的毒草。目前，我国西部天然草地动物因疯草中毒死亡所造成的经济损失仍持续剧增。苦马豆素被认为是引起动物疯草中毒的主要毒性成分。由于疯草分布广泛，资源丰富，如何改善草地生态，合理开发利用疯草成为研究的课题和方向。近几十年来, 随着对疯草研究的深入和扩展,人们发现苦马豆素不仅具有良好的抗肿瘤效果，还可作为免疫调节剂、抗HIV及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等药物使用。目前，国内在对苦马豆素抗肿瘤、调节机体免疫方面研究较热，但是,对苦马豆素在抗病毒活性、作用机理方面的研究尚无相关报道。为了探讨茎直黄芪中生物碱苦马豆素（swainsonine，SW）抗牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）的作用机制，明确其体外抗病毒作用效果，为抗BVDV的药物筛选提供参考依据。【方法】利用细胞培养技术，采用CPE观察法和MTT比色法相结合的方法测定不同浓度SW对牛肾原代细胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用，确定药物的安全浓度和TD50，并分别采用先加药后感染病毒、先感染病毒后加药、药毒作用2 h后加入、感染病毒同时给药后再加药四种作用方式，检测不同浓度SW对BVDV入侵的阻断作用、复制的抑制作用、直接杀伤作用和综合作用，并计算不同作用方式下的治疗指数。【结果】结果显示：SW浓度小于0.256 μg•mL-1范围内对MBDK细胞无毒性作用，在大于0.512 μg•mL-1浓度下MBDK细胞表现出一定程度的病变,TD50为2.512 μg•mL-1，按Reed-Muench 氏法计算BVDV TCID50为10-4.7/0.1mL;在体外随苦马豆素质量浓度的增加,其抗BVDV作用具有很好的量效关系,且与作用方式有关，比较四种作用方式下的治疗指数1.05、2.47、2.08和3.21，说明SW对BVDV的综合作用（65.29%，P＜0.01）和复制（65.05%，P＜0.01）的抑制作用较好，亦有一定的直接杀伤作用，但对其入侵的阻断作用不佳。【结论】SW在体外有良好抗BVDV活性作用，并推测苦马豆素（SW）抗病毒的主要效应可能是SW能进入细胞内抑制BVDV的复制增殖以及直接灭活游离BVDV而发挥作用。

研究简报

稻茬小麦公顷产量9000 kg群体糖氮代谢特征

丁锦峰1, 2, 訾妍1, 成亚梅1, 潘婷1, 封超年1, 2, 朱新开1, 2, 李春燕1, 2, 彭永欣1, 2, 郭文善1, 2

中国农业科学. 2014, 47(1):  182-190.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.019

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【目的】探讨稻茬小麦籽粒产量9 000 kg•hm-2群体糖氮代谢特征及关键生育期糖氮营养诊断指标。【方法】2010—2012年，在稻麦两熟条件下，以中筋小麦扬麦20为材料，采用三因素裂区设计，以施氮量（纯N）为主区，设210 kg•hm-2、262.5 kg•hm-2两个水平；以施氮比例为副区，设基肥﹕壮蘖肥﹕拔节肥﹕穗肥分别为3﹕1﹕3﹕3、5﹕1﹕2﹕2两个水平；以穗肥追氮时期为裂区，设剑叶露尖、孕穗期、抽穗期和开花期4个水平。通过试验构建稻茬小麦不同产量群体，分析不同产量群体植株可溶性糖、氮含量及糖氮比动态特征及其与产量的关系，提出籽粒产量9 000 kg•hm-2左右稻茬小麦关键生育期糖氮代谢诊断指标。【结果】随小麦生育进程推移，不同产量群体植株可溶性糖含量及糖氮比在越冬始期和孕穗至开花期出现峰值，返青期出现低谷，花后下降直至成熟；植株氮含量逐渐下降，其中越冬始期至拔节期迅速降低，拔节至孕穗期降幅减慢，孕穗期至成熟期缓慢下降。籽粒产量9 000 kg•hm-2以上群体孕穗期植株可溶性糖、氮含量及开花期植株氮含量显著高于籽粒产量9 000 kg•hm-2以下群体；成熟期植株可溶性糖含量低于籽粒产量9 000 kg•hm-2以下群体，2010—2011年度差异达显著水平，2010—2011年度差异未达显著水平；成熟期植株糖氮比显著低于籽粒产量9 000 kg•hm-2以下群体；其他生育期植株可溶性糖、氮含量及糖氮比群体间差异均未达显著水平。孕穗期植株可溶性糖、氮含量及开花期植株氮含量与产量呈线性正相关，乳熟期植株可溶性糖及氮含量与产量呈抛物线关系，成熟期植株可溶性糖含量与产量呈线性负相关。籽粒产量9 000 kg•hm-2左右群体孕穗期、开花期、乳熟期及成熟期植株可溶性糖含量分别为14.56%—16.78%、14.52%—16.82%、10.59%—11.23%、1.62%—1.76%，氮含量分别为1.55%—1.64%、1.47%—1.57%、1.28%—1.30%、1.15%—1.20%，糖氮比分别为9.37—10.25、9.80—10.69、8.29—8.77、1.41—1.48。【结论】稻茬小麦实现籽粒产量9 000 kg•hm-2需要在越冬始期至拔节期具有较高的糖、氮营养和协调的糖氮比，关键在于孕穗期至开花期具有高可溶性糖及氮含量，开花后具有高碳素积累量及向籽粒的转化率。

不同生长时期冬枣受绿盲蝽危害后应激防御酶活性的变化

李林懋1, 2, 门兴元1, 叶保华2, 于毅1, 张安盛1, 李丽莉1, 周仙红1, 庄乾营1

中国农业科学. 2014, 47(1):  191-198.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.020

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【目的】比较绿盲蝽刺吸与人工针刺模拟危害后，冬枣不同组织的应激防御酶活性，以及受绿盲蝽不同程度危害的冬枣叶、蕾、花、幼果应激防御酶的变化。【方法】在冬枣各生长期（芽期、蕾期、花期、幼果期）易受危害部位（嫩叶、蕾、花、幼果）接入不同数量（1—3头）绿盲蝽和人工针刺模拟危害，危害24 h后，采摘不同危害程度的冬枣组织，采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；采用紫外吸光法测定过氧化氢酶（CAT）活性。【结果】冬枣嫩叶组织遭人工针刺和绿盲蝽刺吸胁迫后所产生的SOD、POD、CAT活性显著高于正常叶片，其中绿盲蝽刺吸嫩叶所产生的应激SOD和CAT活性显著高于人工针刺；冬枣蕾受到人工针刺和绿盲蝽刺吸胁迫后，SOD活性没有变化，POD活性显著增加，受绿盲蝽刺吸胁迫后CAT活性显著高于人工针刺胁迫；冬枣花受到人工针刺和绿盲蝽刺吸胁迫后，SOD和CAT活性没有变化，POD活性显著增加，绿盲蝽刺吸胁迫下POD活性比人工针刺活性更高；冬枣幼果受到人工针刺和绿盲蝽刺吸胁迫后，SOD和CAT活性没有变化，POD活性显著增加。受绿盲蝽不同危害程度的应激酶活性测定结果表明，受害后冬枣各组织内3种防御性酶随受害程度的加重发生不同程度的变化。叶片和花受绿盲蝽不同程度危害后，SOD活性呈现随着受害程度的加重先升高后降低的趋势；POD、CAT活性随受害程度的加重均呈上升的趋势；冬枣蕾受绿盲蝽不同程度危害后，SOD活性变化不显著，POD和CAT活性呈现上升趋势。冬枣幼果受绿盲蝽不同程度危害后，SOD活性随着受害程度的加重先降低，后上升；POD活性随受害程度的加重均呈先下降再上升的趋势。【结论】绿盲蝽的危害胁迫能诱导寄主植物产生一系列应激生化反应。冬枣不同组织受胁迫后，参与防御的酶可能不同，嫩叶受胁迫后，3种防御酶均会发生变化，而蕾、花、幼果等繁殖器官受胁迫后，POD活性变化更为明显；绿盲蝽刺吸胁迫（除了物理损伤外，还分泌唾液进行化学危害）比人工针刺（仅有物理损伤）往往能够诱导更高的防御酶活性；随着绿盲蝽的危害加重，冬枣不同组织的受损程度不同，不同的酶活性表现不同。

卵巢摘除对山羊血清GH水平和组织中GHR基因表达的影响

张磊1, 王燕燕1, 周占琴1, 李广1, 付明哲1, 张锁良2, 尹海科2, 张胜刚2, 任宝华2

中国农业科学. 2014, 47(1):  199-208.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.01.021

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【目的】探讨卵巢摘除对母山羊产肉性能，血清中生长激素（growth hormone, GH）水平以及背最长肌、股二头肌、肝脏、脂肪组织中生长激素受体基因(growth hormone receptor, GHR) 表达的影响，揭示摘除母山羊卵巢提高其育肥效果的原因。【方法】将体重相近的5月龄布尔山羊杂种（布尔山羊♂×关中奶山羊♀）母羊40只作为研究对象。试验开始前一个月，对所有羊只进行驱虫和防疫工作。试验开始时将母羊随机分为处理组和对照组，每组20只，摘除处理组母羊的卵巢，对照组不摘除。在试验的第0，10，20，30，40 和50 天早晨8：00对所有试验羊进行空腹采血，立即分离血清，采用羊生长激素酶联免疫分析试剂盒测定血清中GH水平。50 d后分别从处理组和对照组随机选取5只试验羊进行屠宰试验，测定其屠宰率、胴体产肉率、眼肌面积和骨肉比。同时，立即采取肝脏、背最长肌、股二头肌及肾周脂肪组织样，每个组织至少采集3份生物学重复样，用锡箔纸包好标记后立即投入液氮中，带回实验室放入-80℃冰箱保存，然后利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）相对定量技术和2-△△Ct法检测背最长肌、股二头肌、肝脏和肾周脂肪中GHR基因mRNA的相对表达量。【结果】对照组母羊血清GH浓度在试验的第20天为8.63 μg•L-1，处理组母羊达到9.50 μg•L-1，显著高于对照组(P＜0.05)，且随着试验进行呈上升趋势。处理组母羊血清GH浓度在第50 天时达到了11.55 μg•L-1，高出对照组（9.34 μg•L-1）2.21 μg•L-1，且两组间差异极显著（P＜0.01）。另外，发现处理组母羊的屠宰率、胴体产肉率和眼肌面积均高于对照组，且处理组母羊屠宰率达到了45.62% 显著高于对照组的42.41%（P＜0.05），但是骨肉比则显著低于对照组（P＜0.05）。实时荧光定量PCR的结果显示处理组母羊肝脏中GHR基因mRNA的表达量是对照组的3.21倍（P＜0.01）；GHR基因在处理组母羊背最长肌中的相对表达水平最高，是对照组的4.87倍，且两组间差异极显著（P＜0.01）；股二头肌中GHR基因表达量是对照组的3.17倍，差异极显著（P＜0.01）；在肾周脂肪中，处理组母羊GHR基因的相对表达量是对照组的1.91倍，显著高于对照组（P＜0.05）。【结论】摘除母山羊卵巢后，其屠宰率、血清GH水平以及肝脏、背最长肌、股二头肌和肾周脂肪GHR基因表达均显著上升，骨肉比显著下降。这提示摘除母畜卵巢可能通过增加其血清GH水平和部分靶组织中GHR基因的表达提高母羊的屠宰率，降低骨肉比，从而有利于母羊的产肉性能的提高。