当期目录

2017年 第50卷 第16期 刊出日期：2017-08-16

  

作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制

张敏，朱明，李文宗，马洁，刘悦萍，江海洋，王磊，徐妙云

中国农业科学. 2017, 50(16):  3063-3070.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.001

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【目的】探究ath-miR169d在拟南芥叶片发育过程中的作用，明确其调控的分子机制，为增强叶菜类植物的光合效率以及增加生物量和提高作物产量提供理论依据。【方法】选取ath-miR169d过表达和降低表达的拟南芥转基因株系，以及野生型拟南芥，在22℃、相对湿度60%、16 h/8 h光周期条件下培养，观察不同生长阶段叶片发育表型的差异；同时构建pmiR169d::GUS表达载体，转化农杆菌EHA105，并利用蘸花法转化野生型拟南芥（Columbia，Col-0），获得转基因拟南芥，利用GUS染色对ath-miR169d在拟南芥不同组织器官中的表达模式进行研究；选取8周龄的过表达材料和野生型对照株系，对其叶片表皮细胞形态进行扫描电镜分析；对4周龄过表达材料和野生型对照株系的幼苗顶端分生组织和叶片中总IAA进行定量分析，并进行基因芯片表达谱分析，筛选差异表达基因；通过实时荧光定量PCR对生长素信号途径部分差异表达关键基因的表达情况进行分析。【结果】Ath-miR169d过表达拟南芥株系莲座叶数目较野生型少，叶片小，而ath-miR169d降低表达的拟南芥株系的莲座叶较野生型多，叶片大，且在抽薹和种子成熟之后还持续长出新叶，而野生型莲座叶则在种子成熟之后逐渐衰老干枯；扫描电镜观察到ath-miR169d过表达拟南芥株系叶片中表皮细胞小于野生型；表达模式分析表明，ath-miR169d主要在顶端分生组织（shoot apical meristem，SAM）和叶片维管系统中表达，且新叶中表达强。SAM是产生生长素的部位，IAA测定结果表明ath-miR169d过表达拟南芥株系中IAA含量显著降低，为野生型植株的38.6%，同时基因芯片表达谱分析也验证了ath-miR169d参与调控植物体内激素信号转导途径。进一步研究发现，ath-miR169d过表达株系中生长素合成关键基因YUC2和转运体蛋白基因PIN1均显著下调表达，而具有转录抑制功能的生长素响应因子1和2基因（ARF1和ARF2）表达上调；STTM miR169d低表达株系中这4个基因的表达则为相反趋势，该结果与观察到的表型相一致。【结论】Ath-miR169d通过介导生长素信号途径参与了拟南芥叶片发育的调控，ath-miR169d表达量发生变化会影响叶片的数量和大小，最终影响整个植株的生物量。

谷子转录因子SiNAC18通过ABA信号途径正向调控干旱条件下的种子萌发

窦祎凝，秦玉海，闵东红，张小红，王二辉，刁现民，贾冠清，徐兆师，李连城，马有志，陈明

中国农业科学. 2017, 50(16):  3071-3081.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.002

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【目的】谷子（Setaria italica L.）具有显著耐旱性。研究旨在通过反向遗传学方法分析并鉴定在干旱条件下影响植物萌发过程的重要调控因子，为研究作物干旱条件下种子萌发的调控机制创造条件。【方法】使用ClustalX 2.0和MEGA 5.05软件对谷子SiNAC18蛋白序列及其同源序列进行多序列比对，并构建系统进化树；利用real-time PCR方法检测SiNAC18在不同胁迫条件下的表达模式；通过瞬时转化的方法分析SiNAC18蛋白亚细胞定位；在拟南芥中过表达SiNAC18，分析SiNAC18的生物学功能；分析SiNAC18在转基因拟南芥中可能控制的下游基因。【结果】SiNAC18全长1 074 bp，编码由357个氨基酸组成的亲水性蛋白，分子量约为38.8 kD；系统进化树分析表明SiNAC18属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组，与拟南芥基因AtNAC29同源性最高；氨基酸序列比对结果显示，SiNAC18与其他物种包括水稻、拟南芥、大豆和玉米中同源性最高的NAC类转录因子蛋白的N端都具有A、B、C、D和E这5个保守结构域，蛋白C端具有高度多态性，证明SiNAC18的N端序列与其结合下游基因启动子元件相关；real-time PCR结果显示，SiNAC18在干旱（PEG）、ABA、高盐（NaCl）及过氧化氢（H₂O₂）处理条件下的表达量明显上升；亚细胞定位结果表明SiNAC18蛋白定位于细胞核中；基因功能分析结果显示，在ABA和PEG胁迫处理下，SiNAC18转基因拟南芥与野生型种子的萌发率存在明显差异：在正常生长条件下，野生型拟南芥WT和SiNAC18转基因拟南芥的萌发率基本一致，在PEG浓度为10%和15%的MS培养基上，SiNAC18转基因拟南芥的萌发率显著高于WT。在2和5 μmol·L^-1 ABA处理条件下，转基因拟南芥的萌发率显著低于WT；下游基因表达分析结果显示，ABA信号途径相关基因AtRD29A，脯氨酸合成相关基因AtP5CR和AtPRODH以及过氧化物酶基因AtPRX34在SiNAC18转基因株系中的表达量高于WT中的表达量，表明SiNAC18通过调控这些下游基因影响转基因植物在干旱条件下的萌发率。【结论】谷子NAC类转录因子基因SiNAC18可能通过ABA信号途径、氧化胁迫调控等途径正向调控植物在干旱条件下的萌发过程。

大豆组成型三重反应基因GmCTR1的克隆与功能分析

张楠楠，薛冬，崔晓霞，赵晋铭，郭娜，王海棠，邢邯

中国农业科学. 2017, 50(16):  3082-3091.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.003

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【目的】植物激素乙烯参与植物的生长发育以及生物与非生物胁迫过程。组成型三重反应基因CTR1作为乙烯受体下游一个负调控因子，结合乙烯受体共同参与乙烯的信号转导途径。本研究通过对大豆（Glycine max）的组成型三重反应基因CTR1进行克隆和诱导表达分析，以及在大豆发状根中过表达该基因后进行疫霉根腐病的抗性分析，探究CTR1在大豆与疫霉菌互作过程中的功能。【方法】利用同源克隆的方法，以拟南芥的AtCTR1序列为探针，在大豆基因组数据库中搜索同源性最高的基因即为大豆的GmCTR1（Glyma.13G151100），并从Williams82中将GmCTR1克隆出来。对GmCTR1进行多重序列比对、系统进化分析和疫霉菌的诱导表达分析。构建植物过表达载体pBinGFP2: GmCTR1。应用发根农杆菌介导的遗传转化方法获得大豆发状根，经GFP荧光筛选得到大豆过表达GmCTR1的阳性发状根和转入空质粒的阴性对照发状根。对过表达GmCTR1发状根和阴性对照发状根侵染疫霉菌后，检测病斑长度、疫霉生物量和抗性相关基因的表达。【结果】根据同源序列比对结果，将与拟南芥AtCTR1（AT5G03730）同源性最高（75.3%）的大豆基因Glyma.13G151100命名为GmCTR1，从Williams82中克隆得到GmCTR1的CDS序列。该基因的CDS序列全长2 511 bp，编码836个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，蛋白质量为92.35 kD，等电点为6.51。多重序列比对结果显示，GmCTR1氨基酸具有CTR1同源蛋白的典型结构域和关键特征。构建系统发育树进行进化分析发现，GmCTR1与菜豆（Phaseolus vulgaris）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的CTR1亲缘关系十分相近，在同一个分支上，且与菜豆的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明，在大豆疫霉菌P6497侵染后，GmCTR1受诱导逐渐上调表达，在侵染48 h后表达水平达到最高，随后表达量降低。利用酶切连接方法将GmCTR1的CDS序列构建到植物过表达载体pBinGFP2中，PCR和酶切验证获得了重组质粒pBinGFP2: GmCTR1。对发状根接种疫霉菌后发现，过表达GmCTR1减弱了对疫霉根腐病的抗性，疫霉菌侵染36 h后过表达发状根与对照相比病斑长度显著增长。过表达GmCTR1发状根中疫霉菌的生物量与对照相比增加，与大豆抗病反应相关基因的表达水平显著降低。【结论】GmCTR1在大豆与疫霉菌的互作过程中发挥一定的负调控作用。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

施氮量对间作小麦蚕豆根系分泌槲皮素和橙皮素的影响

刘英超，肖靖秀，汤利，郑毅

中国农业科学. 2017, 50(16):  3092-3100.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.004

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【目的】系统探讨间作条件下，不同施氮水平不同生育期小麦和蚕豆根系分泌槲皮素和橙皮素的动态变化及累积特征，为进一步探明间作增产控病机制提供依据。【方法】通过盆栽试验，采用小麦与蚕豆根系尼龙分隔（MB）和塑料分隔（PB）两种间作种植模式，测定间作小麦蚕豆不同氮水平（低氮1/2N：常规施氮量的一半；常规施氮N；高氮3/2N：常规施氮量的1.5倍）条件下，不同生育期根系分泌槲皮素和橙皮素数量。【结果】施氮水平和间作体系根系不同分隔方式影响作物生物量和根冠比。随着施氮量增加，小麦和蚕豆生物量增加45%—62.5%和3.2%—18.9%，根冠比降低33.8%—47.3%和11.8%—26.9%；与塑料分隔相比，相同施氮水平条件下，作物生长60 d时，尼龙分隔小麦和蚕豆生物量分别提高4.2%—25%、19%—38.6%，随生长天数增加差异逐渐不显著。间作根系不同分隔方式和施氮量均能影响小麦蚕豆根系槲皮素和橙皮素的分泌量。随施氮量增加，小麦蚕豆槲皮素和橙皮素分泌量减少，与低氮条件相比，常规施氮和高氮条件下，小麦槲皮素分泌量减少了23.4%和62.3%，橙皮素分泌量减少了32.2%和64.5%；蚕豆槲皮素分泌量减少了35.4%和44.1%，橙皮素减少了11.9%和23.9%。相同氮水平条件下，尼龙分隔小麦蚕豆槲皮素和橙皮素分泌量高于塑料分隔，低氮和常规施氮条件下，尼龙分隔小麦槲皮素的分泌量分别高于塑料分隔15.3%和27.1%，橙皮素的分泌量分别高于塑料分隔21%和13.7%；蚕豆根系尼龙分隔槲皮素分泌量高于塑料分隔34.6%和56.6%，橙皮素高于塑料分隔16.9%和5.1%；高氮条件下两种根系分隔方式之间差异不显著。【结论】间作根系不同分隔方式影响小麦和蚕豆根系槲皮素和橙皮素的分泌，但这种影响受施氮水平的调控，低氮和常规施氮条件下，尼龙分隔小麦和蚕豆根系槲皮素和橙皮素分泌量高于塑料分隔，高氮条件下差异不显著。

基于开花期卫星遥感数据的大田小麦估产方法比较

谭昌伟，杜颖，童璐，周健，罗明，颜伟伟，陈菲

中国农业科学. 2017, 50(16):  3101-3109.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.005

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【目的】卫星遥感具有覆盖范围广、获取速度快、信息量大、动态性强等优势，能够及时准确地获取作物产量信息，反映作物产量空间变化趋势。遥感技术作物估产已成为现代农业生产中研究热点。通过改善遥感估产建模方法，以实现进一步提高大田作物遥感估产精度，为宏观了解不同区域作物产量形成情况及变化趋势提供直观、可靠的参考。【方法】论文结合2011—2012年江苏省大丰、兴化、姜堰、泰兴、仪征5个县区的定点观测试验，以国产卫星产品HJ-1A/1B影像为遥感数据，于小麦开花期开展大田定位观测区卫星遥感植被指数、关键生长指标与收获期单产间的定量分析。通过对产量与小麦生长指标以及植被指数进行定量关系分析，进一步增强遥感反演的机理性和重演性。将卫星遥感变量与小麦产量进行相关关系分析作为遥感估产的直接建模方法，间接建模方法则是选取与产量相关性较好的遥感变量以及与遥感变量相关性较好的主要苗情指标，利用筛选得到的敏感遥感变量，首先监测对应的小麦生长指标，结合该小麦生长指标与产量间的定量关系，进而建立间接估产模型，利用此模型进行小麦遥感间接估产。利用直接和间接建模方法，以相关性最高为原则，筛选估算产量的敏感卫星遥感变量。以2012年试验数据为建模样本，采用线性回归分析方法，分析小麦开花期苗情指标、产量与卫星遥感变量两两之间的相关性，分别构建以遥感植被指数为基础的大田小麦估产模型，与地面实测结果一起建立模型共同分析。以2011年试验数据为验证样本，选取评价指标拟合度（R²）和均方根误差（RMSE）,对两类模型的估算精度进行验证和比较，以提高遥感反演的定量化水平和可信度。【结果】分别以差值植被指数（difference vegetation index，DVI）和比值植被指数（ratio vegetation index，RVI）为基础的单因子直接估产模型的均方根误差（root mean square error，RMSE）为918 kg·hm^-2和1 399.5 kg·hm^-2，以DVI和RVI遥感变量构建双变量估产模型的RMSE为1 036.5 kg·hm^-2，以归一化植被指数（normalized difference vegetation index，NDVI）和叶片氮积累量为基础构建的间接估产模型的RMSE为805.5 kg·hm^-2，说明开花期HJ-1A/1B影像估算小麦区域产量是可行的，且精度较高；经比较，以NDVI和叶片氮积累量为基础的间接估产模型精度明显高于直接估产模型，相较于DVI直接估产模型RMSE降低了112.5 kg·hm^-2，相较于RVI直接估产模型RMSE降低了594 kg·hm^-2，相较于双因子模型RMSE降低了231 kg·hm^-2。【结论】国产卫星HJ-1A/B可以较好满足估测小麦产量要求，且利用间接方法建立作物遥感估产模型要好于直接方法，研究结果为利用遥感技术更为准确估算大田小麦产量提供了一种新的途径。

局部恢复供水对苗期玉米生长、根系吸收能力及解剖结构的影响

牛晓丽，胡田田，张富仓，段爱旺，刘战东，申孝军

中国农业科学. 2017, 50(16):  3110-3121.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.006

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【目的】作物对局部灌溉的响应研究已受到广泛关注，能否采用局部灌溉还需考虑局部灌溉前的土壤水分状况。研究水分亏缺后局部恢复供水下玉米生长、水分吸收的动态变化以及补偿效应的生理机制有重要意义。【方法】以聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG-6000）调控营养液的渗透势模拟水分亏缺，采用分根技术，通过水培试验模拟前期水分亏缺后局部根区恢复供水，设置3个水分亏缺程度（-0.2、-0.4、-0.6 MPa）和1个对照（无PEG），于处理后0、0.25、0.5、1、3、5、7、9 d连续动态监测各根区根系的生长和导水率状况，玉米干物质累积以及叶水势。并在此基础上，于处理后0、1、5、9 d连续动态测定对照和-0.2 MPa两个处理各根区根系解剖结构特征。【结果】水分亏缺6 d后局部恢复供水，恢复供水区根干重和导水率平均增长速率显著大于持续胁迫区（P＜0.05）；-0.2 MPa亏缺后局部恢复供水下，0—0.25 d时，恢复供水区根干重平均增长速率较对照明显增大（P＜0.05），且持续到局部恢复供水后5 d，表现出根系生长的补偿效应；-0.4和-0.6 MPa亏缺后局部恢复供水处理分别于0.25—0.5 d和0.5—1 d时恢复供水区根干重平均增长速率较对照明显增大（P＜0.05），产生根系生长的补偿效应，可见，根系生长的补偿效应发生随水分亏缺程度增大而延迟；-0.2 MPa亏缺后局部恢复供水5 d时，恢复供水区根系导水率平均增加速率恢复到对照水平，产生根系吸水的补偿效应，继续增大亏缺程度或延长恢复供水时间，补偿效应均消失，说明局部恢复供水有效刺激恢复供水区根系吸水补偿效应的临界水分亏缺程度为≥-0.2 MPa。此外，-0.2 MPa亏缺后局部恢复供水5 d，恢复供水区根系直径与导管直径显著小于1 d（P＜0.05），但仍维持或超过对照水平，皮层厚度占根系直径的比例与对照无显著差异（P＞0.05），9 d时，根系直径与导管直径明显减小（P＜0.05），较对照减小19%，皮层厚度占根系直径的比例仍显著大于对照（P＜0.05），与根系吸水补偿效应的产生与消失同步，从根系解剖结构特征方面揭示了恢复供水区根系吸水补偿效应的生理机制。【结论】局部恢复供水可有效刺激恢复供水区根系生长和吸水的补偿效应，但与局部恢复供水前水分亏缺程度和局部恢复供水时间有关，恢复供水区根系解剖结构的变化是补偿效应产生或消失的一个生理机制。该研究可为更好的发挥局部灌溉在农业节水中的作用提供理论依据。

植物保护

中国79个小麦品种（系）抗条锈病评价及基因分子检测

黄亮，刘太国，肖星芷，屈春艳，刘博，高利，罗培高，陈万权

中国农业科学. 2017, 50(16):  3122-3134.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.007

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【目的】了解中国小麦品种的条锈病抗性水平，掌握条锈病抗性基因的分布与利用情况，加强小麦品种的合理应用，促进品种布局与推广，延长品种使用年限，保障小麦生产安全。【方法】在温室中采用条锈菌CYR32、CYR33、G22-9、G22-14对中国小麦主产区的79个小麦品种（系）进行苗期抗性鉴定，喷雾接种的幼苗在（10±1）℃的黑暗保温桶中保湿12—18 h，取出置于白天16—18℃，夜晚14—16℃温室中，光周期为L﹕D=16 h﹕8 h，15 d后按0—9级分级标准进行调查；在河北廊坊大田中采用条锈菌CYR32、CYR33对79个小麦品种（系）进行成株期抗性鉴定，接种适期为小麦拔节期，接种前3 d灌水确保田间土壤温度。采用1 g夏孢子﹕300 mL矿物油的条锈菌夏孢子悬浮液喷雾接种诱发行感病品种铭贤169，待矿物油晾干后，喷水并覆塑料薄膜保湿12—16 h，待充分发病后调查病害的普遍率、严重度和侵染型，调查两次，以最高等级作为病情发病的级数；利用小麦抗条锈病基因Yr5、Yr10、Yr18、Yr26和1B/1R易位系的相应分子标记Wmc175F/R、SC₂₀₀F/R、csLv34 F/R、We173 F/R和AF1/AF4对供试小麦进行分子检测；结合系谱分析、抗病性鉴定和分子检测结果分析确定参试小麦品种的抗性基因情况。【结果】在所有的参试小麦品（系）中，苗期对CYR32和CYR33均具有抗性的16份，占20.3%；对条锈菌致病类型G22-9和G22-14均具有抗性的4份，占5.1%；对CYR32、CYR33、G22-9和G22-14这4个小种均具有抗性的4份，占5.1%；成株期对CYR32和CYR33表现中抗及以上水平的24份，占30.4%；对CYR32表现全生育期抗性的12份，占15.2%；对CYR33表现全生育期抗性的16份，占20.3%；对CYR32和CYR33均表现全生育期抗性的11份，占14.0%。苗期对4个菌系均具有抗性并且成株期对CYR32和CYR33表现中抗或以上水平的共4份，占5.1%。结合系谱分析、抗病性鉴定和分子检测结果得出，供试小麦品种中4份携带Yr5，占5.1%；8份携带Yr10，占10.1%；3份携带Yr18，占3.8%；仅1份携带Yr26，占1.3%；35份携带1B/1R，占44.3%；4份携带2个抗性基因；远丰139携带Yr5、Yr10和Yr26。【结论】中国主产麦区的79个小麦品种（系）对当前条锈菌流行小种抗性水平普遍较低，1B/1R易位系使用率依然较高，在今后的育种工作中应加大Yr5、Yr18等有效抗性基因的利用，育成多基因聚合的有效持久抗性品种，进一步减少对1B/1R易位系的使用。

玉米大斑病菌环腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表达分析

申珅, 李贞杨, 赵玉兰, 李盼, 韩建民, 郝志敏, 董金皋

中国农业科学. 2017, 50(16):  3135-3144.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.008

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【目的】获得玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）环腺苷酸磷酸二酯酶（cAMP phosphodiesterase, PDE）基因，并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达，为深入探索cAMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、白色念珠菌（Candida albicans）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和黑曲霉（Aspergillus niger）6种真菌PDE基因的保守序列，利用简并引物PCR对基因保守片段进行扩增，结合RACE和Genome Walking技术获得基因全长及其侧翼序列；利用MEGA 5.0软件对PDE蛋白预测编码产物进行多重序列比对，并采用邻近法构建系统发育树；利用GSDS分析基因结构，ProtParam分析理化性质，SOMPA预测二级结构，SMART数据库在线分析保守结构域；收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料，利用qRT-PCR技术研究StPDE在病菌侵染结构形成过程中不同阶段的转录水平。【结果】玉米大斑病菌基因组中存在1个高亲和力磷酸二酯酶基因（StH-PDE）和1个低亲和力磷酸二酯酶基因（StL-PDE）。其中，StH-PDE全长3 208 bp，包含5个内含子和6个外显子，ORF为2 898 bp。StL-PDE全长5 054 bp，包含4个内含子和5个外显子，ORF为3 090 bp。StH-PDE和StL-PDE分别含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型cAMP磷酸二酯酶催化结构域。不同的植物病原真菌中PDE同源基因分别呈现出高度的相似性，其中，StH-PDE与Magnaporthe grisea、Cordyceps militaris、Metarhizium acridum等病原真菌的高亲和力磷酸二酯酶基因聚于同一进化支，StL-PDE与Ascochyta rabiri、Scedosporium apiospermum、Fusarium oxysporum、Metarhizium album等病原真菌的低亲和力磷酸二酯酶基因聚于相同进化支。人造疏水介质诱导下，与菌丝相比，StH-PDE和StL-PDE在分生孢子中的表达水平均显著上调，其中StH-PDE和StL-PDE分别上调了约2倍和52倍。孢子萌发初期两个基因表达水平显著下调，随着萌发的进行，表达水平缓慢回升，至附着胞形成阶段，基因表达出现了第2次高峰，随后表达水平再次下调。在整个过程中，StH-PDE的最高表达水平则出现在附着胞形成时期，达到了菌丝体中的近7倍、分生孢子中的近2倍，而StL-PDE的表达水平始终低于其在分生孢子中的表达水平。StH-PDE和StL-PDE在病菌侵染寄主过程中的表达水平变化趋势与其在人工疏水介质诱导下的表现基本一致。在孢子萌发早期表达显著下调，随着时间延长，缓慢回升，至接种后18和24 h StH-PDE表达水平上调，超过萌发初期。【结论】在病菌侵染结构发育过程中，StH-PDE和StL-PDE均呈现下调-上调-下调的表达水平变化趋势。StH-PDE在附着胞时期表达水平最高，StL-PDE在分生孢子中的相对表达水平最高。

异色瓢虫3个小分子热激蛋白序列及低温诱导表达分析

汪慧娟，赵静，施佐堃，邱玲玉，王甦，张帆，王世贵，唐斌

中国农业科学. 2017, 50(16):  3145-3154.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.009

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【目的】异色瓢虫(Harmonia axyridis)是一种重要的捕食性天敌昆虫，广泛应用于农林害虫的生物防治中。本研究旨在分析探索低温胁迫条件对3个小分子热激蛋白（small heat shock protein，sHSP）抗寒基因相对表达量的影响，为异色瓢虫低温冷藏及其抗寒机制研究提供科学依据。【方法】在转录组获得异色瓢虫基因序列的基础上，根据特异性引物获得HaHSP47.74（基因登录号：KX161871）、HaHSP21.53（基因登录号：KX161873）和HaHSP21.52（基因登录号：KX161874）基因cDNA的开放阅读框序列(open reading frame，ORF），采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）技术测定异色瓢虫3个sHSP基因在不同发育阶段、短时降温和短时降温后恢复处理、低温储存处理下以及不同色斑的表达水平。【结果】在不同发育阶段处理中，HaHSP47.74和HaHSP21.53在蛹期及成虫期高表达；HaHSP21.52在4龄幼虫第4天表达量显著高于对照组。在短时降温处理中，HaHSP47.74在降温至0℃和-5℃时表达量显著高于对照组；HaHSP21.53和HaHSP21.52在降温过程中表达量显著降低。在短时降温后恢复处理中，3个sHSP基因表达量无显著差异。在低温储藏条件下，实验种群：黑底雌瓢虫HaHSP47.74表达水平在储存第5天时显著升高，黄底雌瓢虫HaHSP47.74在储存5—15 d时表达量显著升高；黑底雌瓢虫HaHSP21.53在储存5—20 d时显著性高表达，黄底雌瓢虫HaHSP21.53在15 d时显著性高表达；黑底和黄底雌瓢虫HaHSP21.52无显著性高表达；越冬种群：黑底和黄底雌瓢虫HaHSP47.74、HaHSP21.53、HaHSP21.52在低温储存中均无显著性高表达。【结论】sHSP在异色瓢虫发育阶段可能发挥着作用。短时降温胁迫能够诱导sHSP基因高表达。实验种群在低温储存条件下HaHSP47.74和HaHSP21.53均出现了显著性高表达，表明这两个基因在瓢虫受到冷驯化时起到了作用。此外，不同色斑型异色瓢虫的抗寒机制和抗寒能力有所差异。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

石灰性紫色水稻土不同土壤深度中厌氧氨氧化细菌对施肥的响应

王蓥燕, 卢圣鄂, 李跃飞, 涂仕华, 张小平, 辜运富

中国农业科学. 2017, 50(16):  3155-3163.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.010

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【目的】研究长期不同施肥处理对水稻土厌氧氨氧化细菌（anaerobic ammonium oxidation bacteria, AAOB）群落结构和垂直分布特征的影响，深入认识不同施肥处理下石灰性紫色水稻土厌氧氨氧化作用的微生物调控机制，为该地区科学施肥、培肥地力提供理论依据。【方法】利用化学分析、末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）和荧光定量PCR技术分别对不同施肥处理下石灰性紫色水稻土理化性质、厌氧氨氧化细菌丰度及群落结构进行分析。【结果】理化性质结果显示，相对于无肥处理（CK），氮（N）、氮磷钾肥（NPK）及氮磷钾配施农家肥（NPKM）均会降低土壤pH和硝态氮含量，而增加土壤有机质、全氮和铵态氮含量。随土壤深度增加，土壤pH增加，全氮和硝态氮含量降低，铵态氮含量变化趋势不明显。qPCR结果显示，就土壤层次而言，厌氧氨氧化细菌在0—20 cm层的丰度最高，20—40 cm层最低；就施肥处理而言，氮肥（N）对厌氧氨氧化细菌的丰度促进最为明显。T-RFLP结果表明，厌氧氨氧化细菌在0—20 cm土层群落组成最为丰富，Shannon-wiener多样性指数最高；寡氮肥下其群落组成最为简单，无肥处理下群落结构最为复杂。厌氧氨氧化细菌优势种群属于Candidatus Brocadia。冗余梯度分析（RDA）显示，pH影响是石灰性紫色水稻土厌氧氨氧化细菌群落结构差异的主要环境因子。【结论】本研究显示寡氮处理会降低石灰性紫色水稻土中厌氧氨氧化细菌的多样性但促进其丰度。表层土（0—20 cm）是厌氧氨氧化细菌分布的主要层次。

长期施肥对休闲季土壤呼吸温度敏感性的影响

张彦军

中国农业科学. 2017, 50(16):  3164-3174.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.011

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【目的】在农作物-休闲轮作系统中，研究长期施肥条件下休闲季土壤呼吸温度敏感性（Q₁₀）的变化机理，为科学调控黄土高原雨养区的农田温室气体排放提供依据。【方法】依托长武农田生态试验站的长期定位施肥试验，在小麦收获后的休闲季测定不同施肥处理下（CK、N、NP、M、NPM）的土壤呼吸速率、土壤温度、土壤水分、底物的数量 (土壤有机碳和根茬碳)和质量 (土壤碳氮比和根茬碳氮比，依次简写为土壤C﹕N和根茬C﹕N)，研究长期施肥影响休闲季Q₁₀变异的机理。【结果】在休闲季，不同施肥处理下的土壤呼吸速率差异显著 （P＜0.05），长期施肥导致土壤呼吸速率增加了6%—127%。土壤温度、土壤水分、底物的数量和质量均是影响土壤呼吸速率的重要因素（P＜0.05）。土壤温度对土壤呼吸速率的影响，利用指数关系模型进行拟合 (P＜0.05)，且土壤温度可以解释40%—57%的土壤呼吸变异性。而土壤呼吸速率对土壤水分的响应则用抛物线关系模型进行拟合（P＜0.05），且土壤水分可以解释56%—74%的土壤呼吸变异性。同时，底物的数量和质量对土壤呼吸速率的影响，利用线性关系模型进行模拟（P＜0.05），且底物的数量和质量可以解释高达66%—94%的土壤呼吸变异性。长期单施氮肥处理（N）对土壤有机碳影响不显著（P＞0.05），而NP、M和NPM处理下的土壤有机碳则增加了12%—36%。同时，N处理下的根茬碳减少了34%， 而NP、M和NPM处理下的根茬碳则增加了15%—63%。N和NP处理下的土壤C﹕N影响不显著（P＞0.05），而M和NPM处理下的土壤C﹕N则增加了12%—13%。不同施肥处理下的根茬C﹕N则降低了8%—38%。在休闲季，长期施肥导致Q₁₀降低了12%—56%，而长期施肥处理下Q₁₀的差异与底物的数量（土壤有机碳和根茬碳）和质量（土壤C﹕N和根茬C﹕N）或者二者的交互作用密切相关（P＜0.05）。Q10随着底物数量和土壤C﹕N的增加均呈现出线性降低的趋势（P＜0.05），且底物的数量和土壤 C﹕N可以解释61%—95%的Q₁₀变异性，而Q₁₀随着根茬C﹕N的增加呈现出线性增加的趋势（P＜0.05），且根茬C﹕N可以解释72%的Q₁₀变异性。同时对Q₁₀的贡献呈现出根茬碳＞根茬C﹕N＞土壤有机碳＞土壤C﹕N的趋势（2.16 vs. 1.22 vs. 0.48 vs. 0.03）。【结论】在农作物-休闲轮作系统中，长期施肥通过影响底物的数量和质量影响休闲季Q₁₀的变化，对科学评价黄土高原雨养区的农田温室气体排放具有重要意义。

长期施用氮磷肥对旱地冬小麦籽粒产量和锌含量的影响

惠晓丽，王朝辉，罗来超，马清霞，王森，戴健，靳静静

中国农业科学. 2017, 50(16):  3175-3185.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.012

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【目的】小麦是中国北方地区的主要粮食作物，主要种植在低锌的石灰性土壤上，其籽粒锌含量普遍偏低，因此小麦籽粒锌营养强化是近年研究的热点。小麦氮磷与锌的吸收利用存在互作效应。利用从2004年起在中国西北旱地潜在缺锌的石灰性土壤上开展的长期定位试验，研究长期氮磷施用下的小麦产量与锌含量的变化。【方法】田间试验采用完全随机区组设计，设不施肥（CK）、单施氮肥（N160，施160 kg N·hm^-2）、单施磷肥（P100，施100 kg P₂O₅·hm^-2）和氮磷配施（N160P100，施160 kg N·hm^-2、100 kg P₂O₅·hm^-2）4个处理。于2012—2016年连续4年进行田间取样，分析小麦的生物量、产量、产量构成，及锌含量与锌吸收和分配。【结果】与不施肥相比，长期单施氮肥使小麦穗数降低9%，籽粒产量和地上部生物量均降低12%，而籽粒锌含量由不施肥处理的29.4 mg·kg^-1提高到42.8 mg·kg^-1，提高幅度为46%，籽粒和地上部的锌吸收量分别增加29%和37%，地上部的氮锌比和磷锌比分别降低13%和45%；长期单施磷肥使小麦穗数、籽粒产量和地上部生物量分别增加18%、15%和16%，籽粒锌含量、籽粒和地上部的锌吸收量却分别降低31%、19%和17%，同时地上部的氮锌比和磷锌比分别提高19%和83%；氮磷配施的小麦穗数、籽粒产量和地上部生物量也显著增加，增加幅度分别为40%、46%和38%，籽粒和地上部的锌吸收量还分别提高36%和34%，但籽粒的锌含量仅降低8%，同时地上部的氮锌比和磷锌比分别提高43%和27%。与单施磷肥相比，氮磷配施不仅提高了籽粒产量，还提高了籽粒锌含量，主要原因是施用氮肥能够增加小麦锌吸收，减缓了磷肥对小麦锌吸收的抑制作用。【结论】在生产实践中，单施氮肥虽可以提高小麦籽粒的锌含量，达到食物锌营养强化的目的，但长期单施氮肥会导致土壤养分不平衡，不利于维持和提高小麦产量。长期单施磷肥虽能够提高小麦籽粒产量，但抑制小麦锌吸收，不利于籽粒锌累积，降低籽粒含量。因此，在黄土高原旱地石灰性土壤上，建议合理进行氮磷配施，以保证小麦生产高产优质。

园艺

外源褪黑素对干旱胁迫下番茄叶片光合作用的影响

杨小龙，须晖，李天来，王蕊

中国农业科学. 2017, 50(16):  3186-3195.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.013

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【目的】褪黑素是一种广泛存在于高等植物体内的小分子物质，被认为是一种新的植物生长调节剂和生物刺激剂，对于提高植物抗逆性具有重要作用。探索外源褪黑素对干旱胁迫下番茄叶片光合作用的影响，为揭示褪黑素调节植物抗逆性的机制打下基础。【方法】以番茄‘辽园多丽’为试材，首先采用叶片喷施和根施不同浓度褪黑素进行预处理：CK：叶片喷施清水、根施50 mL清水；R5、R50、R100、R150、R250：叶片喷清水，分别根施50mL 5、50、100、150和250 µmol?L^-1褪黑素；L5、L50、L100、L150、L250：根施50 mL清水，叶片分别喷施5、50、100、150和250 µmol?L^-1褪黑素；连续处理3 d后将植株移至温室中，以不浇水作为干旱处理（其中CK0：叶片喷施清水、根施50 mL清水预处理后正常浇水，CK1：叶片喷施清水、根施50 mL清水预处理后干旱处理）。干旱胁迫5 d后，通过比较暗适应下PSII最大光化学量子产量Fv/Fm和PSI最大氧化状态Pm，确定根施和叶片喷施的最佳浓度处理。然后利用光合荧光同步测量系统分析根施和叶片喷施褪黑素对干旱胁迫下番茄叶片气体交换参数，PSII和PSI的光能分配和电子传递速率，类囊体膜的完整性和ATP酶活性的调节。【结果】根施和叶片喷施不同浓度褪黑素均提高了干旱胁迫下番茄叶片的Fv/Fm和Pm，并且随浓度增加表现出先升高后降低的趋势，L100和R100处理下的Fv/Fm和Pm最大，显著高于对照。L100和R100显著缓解了干旱胁迫对气体交换参数的抑制，其中叶片净光合速率（Pn）分别为2.04和1.71 µmol?m^-2?s^-1，显著高于对照（CK1）（0.52 µmol?m^-2?s^-1）；蒸腾速率（E）分别为0.66和0.54 mmol?m^-2?s^-1，显著高于CK1（0.25 mmol?m^-2?s^-1），并且显著提高了番茄叶片气孔导度（GH₂O）和最大水分利用效率（WUE），降低了气孔限制值（Ls），而L100优于R100处理。快速光响应曲线结果表明L100和R100处理提高了干旱胁迫下番茄幼苗PSII的光化学反应效率Fv'/Fm'及PSII光化学淬灭系数qP，表明褪黑素处理更利于干旱胁迫下番茄叶片PSII光化学反应的高效进行；干旱胁迫下番茄幼苗环式电子传递速率得到显著加强，而L100和R100处理降低了环式电子传递速率，但加强了线性电子传递速率，且L100处理下番茄叶片ETRI和ETRII均高于R100处理；L100、R100处理提高了干旱胁迫下番茄叶片的Y（I）、Y（II），表明褪黑素处理有利于干旱胁迫下番茄叶片吸收光能向光化学反应的方向分配；暗适应后，L100和R100处理番茄叶片P515诱导曲线均高于CK1，照光后，CK0处理番茄幼苗P515信号快速下降，其次是L100和R100处理，而CK1处理降低较慢，表明褪黑素具有保护叶绿体类囊体膜和ATP合成酶免受干旱胁迫伤害的作用。【结论】根施和叶片喷施外源褪黑素能缓解干旱胁迫对番茄幼苗光合性能的抑制，加强光合运转效率，而叶片喷施是一种更简单高效的处理方式；褪黑素能加强作物光合作用对环境胁迫的适应性，对于农作物的生长发育具有调节作用。

超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷积累和盐胁迫抗性

安建平，宋来庆，赵玲玲，由春香，王小非，郝玉金

中国农业科学. 2017, 50(16):  3196-3204.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.014

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【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF6（cytokinin response factor 6），鉴定其在调节花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用，揭示MdCRF6的功能，为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果（Malus domestica‘Gala’）为研究材料，利用同源序列比对和PCR技术，分离细胞分裂素响应基因MdCRF6。使用MEGA 5.0软件构建苹果MdCRF6与拟南芥CRFs间系统进化树；通过SMART软件和DNAMAN软件分析MdCRF6蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量PCR方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁迫的响应。通过电泳迁移率试验（EMSA），验证MdCRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建MdCRF6植物超表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化获得转MdCRF6苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青苷积累和盐抗性方面的差异，结合基因表达分析，初步鉴定MdCRF6在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF6（基因序列号：MDP0000783818），该基因开放阅读框（ORF）为1 047 bp，编码含有348个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明，苹果MdCRF6蛋白在N端包含保守的CRF结构域，在C端包含保守的AP2/ERF结构域，并且与拟南芥AtCRF6同源性最高。基因表达分析显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应，分别在10 μmol·L^-1 BA和100 mmol·L^-1 NaCl处理3 h和6 h时表达量最高。EMSA试验结果验证MdCRF6原核表达蛋白能够绑定DRE序列。在苹果愈伤组织中超表达MdCRF6，发现MdCRF6转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制，同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示，MdCRF6显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果MdCRF6与拟南芥AtCRF6具有高度的同源性，其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达MdCRF6抑制其花青苷积累，降低植物抗盐性。推测苹果MdCRF6可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子，抑制基因的表达，从而负调节花青苷积累和抗盐性。

食品科学与工程

不同类型桃果肉酚类物质及抗氧化活性分析

卢娟芳，刘盛雨，芦旺，席万鹏

中国农业科学. 2017, 50(16):  3205-3214.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.015

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【目的】探讨不同类型桃果肉中酚类物质组成、含量及其抗氧化活性的差异,为桃的品质育种和科学利用提供参考。【方法】以水蜜桃、蟠桃和油桃3种类型共15个品种的桃果肉为试验材料，使用高效液相色谱法（high performance liquid chromatograph，HPLC）检测各品种中的酚类物质，采用1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid diammonium salt，ABTS）自由基清除能力和铁离子还原能力（Ferric reducing/antioxidant power，FRAP）3种方法测定抗氧化能力，并利用相关性分析酚类物质与抗氧化活性的关系。【结果】供试品种总酚与总黄酮含量的变异范围分别为0.35—2.54 mg CHA·g^-1 FW和0.08—3.32 mg RE·g^-1 FW。整体上蟠桃总酚及总黄酮含量高于水蜜桃和油桃，‘早露蟠桃’的含量最高。3种类型桃果实中共检测到酚酸6种（没食子酸、香草酸、原儿茶酸、阿魏酸、新绿原酸、绿原酸）和类黄酮4种（儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素）。表儿茶素、儿茶素、绿原酸和新绿原酸在桃果实中的含量最为丰富，不同类型桃果实的酚类物质组成与含量明显不同。其中，水蜜桃以表儿茶素和绿原酸为主，变异范围为37.57—105.49 µg·g^-1和40.19—49.8 µg·g^-1；蟠桃以表儿茶素、绿原酸、新绿原酸和儿茶素为主，变异范围分别为35.94—297.32 µg·g^-1、36.14—80.57 µg·g^-1、1.45—29.26 µg·g^-1和0—44.64 µg·g^-1；油桃以绿原酸和儿茶素为主，变异范围为30.97—48.05 µg·g^-1和9.22—53.73 µg·g^-1。DPPH清除速率、ABTS和FRAP值分别为0.21—7.01 µmol TE·g^-1 FW、0.66—8.57µmol TE·g^-1 FW和0.59—5.60µmol TE·g^-1 FW，综合抗氧化指数依次为：蟠桃>水蜜桃>油桃。供试品种中，‘早露蟠桃’多酚含量与抗氧化能力最高。总酚、总黄酮、新绿原酸、表儿茶素与DPPH清除速率、FRAP及ABTS均呈极显著的正相关关系（P<0.01）。【结论】不同类型桃果实中酚类物质及抗氧化能力差异较大，表儿茶素和绿原酸是水蜜桃的主要酚类物质，表儿茶素、儿茶素、绿原酸和新绿原酸是蟠桃的主要酚类物质，绿原酸、儿茶素是油桃的主要酚类物质。蟠桃的酚类物质含量和抗氧化能力均高于水蜜桃和油桃，表儿茶素和绿原酸在桃果实抗氧化能力中起着重要的作用。

畜牧·兽医·资源昆虫

牦牛DGAT1基因多态性及其与乳质性状关联分析

高小莉，胡江，郭淑珍，石斌刚，谢建鹏，罗玉柱，王继卿，牟永娟

中国农业科学. 2017, 50(16):  3215-3225.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.016

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 【目的】检测牦牛DGAT1基因多态性，评估基因突变对牦牛乳品质性状的影响，以期丰富牦牛重要经济性状的分子遗传研究基础。【方法】采用PCR-SSCP方法，检测甘南牦牛、天祝白牦牛、青海牦牛及野血牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17区突变，分析基因突变对乳品质性状的影响。【结果】牦牛DGAT1基因intron5-exon7区发现c.562+32_c.562+33insCCGCCC的插入/缺失，等位基因M、基因型MM频率最高为优势等位基因和基因型，各类群牦牛PIC＜0.5属中度或低度多态；intron15-exon17区检测到c.1249-23C＞T和c.1336C＞T的突变，其中exon17发现的c.1336C＞T突变导致编码氨基酸p.Arg447Cys转变，等位基因A频率最高为优势等位基因，甘南牦牛、天祝白牦牛和青海牦牛中基因型AA为优势基因型，野血牦牛基因型AB为优势基因型，各类群牦牛0.25＜PIC＜0.5属中度多态；两区域3处突变位点构建出6种单倍型和11种单倍型组合，突变位点间存在连锁关系且接近于连锁平衡。关联分析表明，甘南牦牛intron5-exon7区基因型与乳质性状无显著相关；intron15-exon17区基因型BB个体乳品质性状最低，且乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量中显著低于其他基因型个体（P＜0.05）；携带等位基因A的个体乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量及无脂固体含量显著高于未携带者（P＜0.05），携带等位基因C的个体乳脂率也显著高于未携带者（P＜0.05），而携带等位基因B的个体乳脂率、总固体物质含量显著低于未携带者（P＜0.05）；单倍型组合H1H3个体的乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量和无脂固体物质含量均较高，且乳脂率及总固体物质含量显著高于其他单倍型组合（P＜0.05），而H2H2单倍型组合个体则较低，除乳糖率以外的其他乳品质性状均显著低于其他7种单倍型组合（P＜0.05）。【结论】牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17区为低度和中度多态，intron6存在c.562+32_c.562+33insCCGCCC的插入/缺失，intron15和exon17分别检测到c.1249-23C＞T突变和c.1336C＞T的非同义突变。intron15-exon17区突变影响甘南牦牛乳品质性状，选留携带等位基因A的个体和淘汰携带等位基因B的个体、或选留H1H3单倍型组合及淘汰H2H2单倍型组合个体，均可显著改善后代群体的乳品质。

苏博美利奴羊胎儿皮肤毛囊结构及形态发育研究

阿布来提·苏来曼，田月珍，许琴，何军敏，赵冰茹，徐新明，付雪峰，热娜古丽·艾尼瓦尔江，黄锡霞，田可川

中国农业科学. 2017, 50(16):  3226-3235.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.017

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【目的】研究苏博美利奴羊毛囊的组织结构与形态发育过程，为解析细毛羊毛囊发育的分子调控机制奠定组织学基础。【方法】采用石蜡切片技术分析胎龄为第65、85、105和135天的苏博美利奴羊胎儿头部、颈侧、颈上缘、鬐甲、背部、体侧、肩甲、腹部、荐部及股部等10个不同部位皮肤的组织学特性。【结果】苏博美利奴羊毛囊结构同其它动物一样，由毛球、连接组织鞘、外根鞘、内根鞘和毛干等几部分组成。在胎龄65d时初级毛囊(primary follicles, PF)已经发生形成毛芽，毛芽延长，继续向真皮层深入，形成柱状结构，通过由大量真皮细胞在末端聚集，形成帽子结构，各部位表皮均形成完整的结构。胎龄85d时毛囊上部形成一个膨大部，在毛乳头上方形成锥形结构，毛球基本形成，毛乳头长度明显大于宽度；在初级毛囊基底部可见次级毛囊（secondary follicles ,SF）的囊泡结构，并形成皮脂腺原始细胞。在胎龄105d时次级毛囊大量形成，伴随着初级毛囊毛芽伸长，次级毛囊毛芽向真皮层深入，毛乳头直径逐渐增大，皮脂腺开始形成；原始次级毛囊颈部隆突部开始再分化出再分化次级毛囊(secondary-derived follicles ,SD)，并可见汗腺，毛管发育完整；已形成完整的毛囊群结构，主要为三元毛囊群，每个毛囊群由1—3个初级毛囊和围绕其周围的几个次级毛囊组成。胎龄135d时大量形成再分化次级毛囊，形成成熟的汗腺，大部分初级毛囊和部分次级毛囊发育成熟，毛囊形成角质化毛干并穿出体表。【结论】苏博美利奴羊胚胎皮肤初级毛囊约50—55d开始形成；胎龄65—75d是初级毛囊形成的重要时期；胎龄80—85d是次级毛囊形成期，此时期，初级毛囊大量形成；胎龄105—135d是次级毛囊大量再分化，再分化次级毛囊形成及发育的关键时期。为了解苏博美利奴羊毛囊的结构及毛囊从发生到发育成熟的形态变化过程，为相关领域研究提供参考依据。

家蚕组织蛋白酶L（BmCathepsin L）基因鉴定、表达及其功能分析

潘光照，张奎，李重阳，赵羽卒，申利，徐曼，苏晶晶，林西，崔红娟

中国农业科学. 2017, 50(16):  3236-3246.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.018

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【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L（BmCat L），分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下mRNA表达量的变化趋势，为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库（SilkDB）中序列BGIBMGA006893设计引物，利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列，通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测；在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列，利用Clustalx（1.83）和MEGA 6.0 软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段，经PCR扩增，测序验证后将其连接至pET-28载体，转化至Rosseta感受态表达菌株，经IPTG在适宜温度条件下诱导，获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化，获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒，检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出，家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上，基因编号为BGIBMGA006893, nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp，编码228个氨基酸，含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测，得出该蛋白酶的分子量为26.132 kD，等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞，在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白，最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示，其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律，从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列，发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达，推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。