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2022年 第55卷 第23期 刊出日期：2022-12-01

  

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中国农业科学. 2022, 55(23):  0.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022-12-6-0

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作物遗传育种·种质资源·分子遗传学

半糯粳稻品种核心标记的筛选及DNA指纹图谱的构建

赵春芳,赵庆勇,吕远大,陈涛,姚姝,赵凌,周丽慧,梁文化,朱镇,王才林,张亚东

中国农业科学. 2022, 55(23):  4567-4582.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.001

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目的 构建一套基于水稻重要性状基因标记的品种DNA指纹鉴定体系，为加强主栽优良食味半糯粳稻品种的种质管理与品种保护奠定基础。方法 以34个江浙沪主栽优良食味半糯粳稻品种为供试材料，通过已知标记多态性鉴定、公共数据库基因序列比对、基因组重测序等多种方法对水稻重要性状调控基因的关键差异位点进行筛选，开发核心SNP或InDel标记；利用As-PCR技术将SNP标记发展为依据电泳条带鉴别的简单PCR标记，通过电泳条带特征化和类型分析获得基因型信息，构建半糯粳稻品种的DNA指纹图谱库。结果 筛选出来源于40个水稻重要性状调控基因的54个核心标记，包括18个SNP标记和36个InDel标记；54个标记在20个品种中共检测到155个有效特征化条带，转化为155个0/1数据位点，建立各品种的DNA指纹数据库，可区分全部供试品种。遗传多样性分析表明，品种间遗传相似性变异范围为0.47—0.90，其中，南粳7718与苏香粳100的相似性系数最小，而南粳9308与南粳9036的相似性系数最大，二者存在8个数据位点差异。亲缘关系分析可将供试品种划分为6个分支，其中，南粳7718为独立分支，表明其与其他品种间的亲缘关系较远。核心标记鉴定效果的进一步验证表明，该套标记可以对14个半糯粳稻新品种进行有效区分，聚类图显示其分布于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 3个类群，证实各品种间基因型信息的差异性；并利用该套标记鉴定了一个未知半糯水稻的品种真实性，根据基因型和聚类分析，将其判定为南粳9108。结论 经优化筛选，获得可准确区分当前主推半糯粳稻品种的54个核心标记，并发展为可电泳检测的简单PCR标记，利用该套标记组合构建了34个江浙沪地区主栽优良食味半糯粳稻品种的DNA指纹图谱。

小麦响应干旱胁迫环状RNA的鉴定

李宁,柳坤,刘彤彤,史雨刚,王曙光,杨进文,孙黛珍

中国农业科学. 2022, 55(23):  4583-4599.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.002

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目的 干旱是限制全球小麦生产的主要非生物胁迫之一，探索小麦应对干旱的分子调控机制对小麦分子育种具有重要意义。环状RNA（circRNA）已被证实在植物抵御外界环境胁迫的过程中扮演着重要角色。鉴定小麦响应干旱胁迫的circRNA，有助于构建小麦干旱胁迫响应的调控网络，为解析小麦的抗旱性机制奠定基础。方法 以2个抗旱性差异显著的小麦品种（周麦13和冀麦38）为试验材料，对其在干旱及对照条件下的根部样本进行circRNA测序。鉴定小麦circRNA并对其进行特征分析，筛选与干旱胁迫响应相关的差异表达circRNA，并对其靶向microRNA（miRNA）进行预测。进一步根据miRNA及其靶基因在干旱胁迫下的表达模式，构建小麦响应干旱胁迫的潜在circRNA-miRNA-mRNA调控模块。结果 共鉴定获得1 409个小麦circRNA，其中，多数（68.91%）为外显子circRNA，且仅有133个circRNA在2个品种中被同时鉴定获得。在干旱胁迫下共鉴定获得239个差异表达circRNA，其中138个circRNA在抗旱型品种周麦13（ZM13）中特异性差异表达，19个circRNA在2个品种中同时差异表达。共预测到34个靶向miRNA以及1 408个miRNA靶基因。根据这些差异表达circRNA、靶向miRNA以及miRNA靶基因在干旱胁迫后的表达模式，共筛选出5个分别以tae-miR9664-3p、tae-miR1122b-3p、tae-miR9662a-3p、tae-miR6197-5p和tae-miR1120c-5p为中心的小麦响应干旱胁迫的潜在circRNA-miRNA-mRNA调控模块。结论 小麦circRNA具有明显的品种特异性，且在不同抗旱型小麦品种之间具有不同的表达模式。共鉴定到239个响应干旱胁迫的小麦circRNA以及5个潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控模块。

耕作栽培·生理生化·农业信息技术

长期不同施肥措施冬小麦-夏玉米轮作体系周年氨挥发损失的差异

伊英杰, 韩坤, 赵斌, 刘国利, 林佃旭, 陈国强, 任昊, 张吉旺, 任佰朝, 刘鹏

中国农业科学. 2022, 55(23):  4600-4613.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.003

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目的 基于定位试验平台，比较长期不同施肥处理下小麦-玉米轮作体系周年土壤氮素氨挥发损失的差异，为降低氨挥发损失、提高氮肥利用率提供理论依据。方法 2019—2021年，依托山东农业大学黄淮海玉米技术创新中心定位试验平台，以冬小麦品种石麦15和夏玉米品种郑单958为试验材料，以不施氮肥为对照（CK），采用有机肥（腐熟牛粪M）和无机氮肥（U）两种氮肥类型，设置两个施氮量分别为380 kg N·hm^-2（M1、U1、U2M2）和190 kg N·hm^-2（U2、M2），试验共计6个处理，其中氮肥在两季作物间的分配是小麦47.4%、玉米52.6%。采用通气法比较各处理土壤氨挥发速率、累积损失量、籽粒产量及氮肥利用效率的差异。结果 两个种植周期内不同施肥处理均显著影响土壤氨挥发。各处理施肥后氨挥发损失速率变化趋势基本一致，小麦和玉米两季的土壤氨挥发均主要发生在施肥后0—7 d，之后处理间的差异逐渐变小。小麦玉米轮作体系周年氨挥发损失量可达8.6—79.4 kg N·hm^-2，以U1处理最高，达到79.4 kg N·hm^-2，其氨挥发损失量较U2、U2M2、M1、M2和CK分别增加18.5%、111.7%、162.3%、20.5%和825.7%，表明高施氮量增加土壤氨挥发损失量，无机氮肥较有机肥增加氨挥发损失量。U2M2、M1和M2处理的氨挥发损失率比U1处理降低80.9%、61.3%、24.8%，表明有机氮肥与无机氮肥配施或单施有机氮肥可显著降低氨挥发损失。周年籽粒产量以U2M2处理最高，达到24 621.8 kg·hm^-2，较U1、U2、M1、M2分别增产10.1%、24.7%、11.7%和32.7%。U2M2处理周年氮肥利用率达52.6%，较U1、U2、M1和M2处理分别提高11.3%、4.1%、13.4%和10.7%。U2M2处理降低了氨挥发损失、同步提高了产量和氮肥利用率，是冬小麦玉米周年轮作的理想施肥策略。结论 施用有机肥可以显著降低小麦玉米轮作体系的周年氨挥发损失量，提高周年籽粒产量和氮肥利用效率。考虑到有机肥源及施用便捷性可将有机无机配施作为当前小麦玉米轮作生产体系降低氨挥发损失、提高氮肥利用效率的主要施肥方式。

昼夜变温下高温与干旱胁迫对Bt棉毒蛋白含量的影响及其生理机制

尹彦雨, 邢雨桐, 吴天凡, 王李妍, 赵子胥, 胡天然, 陈源, 陈媛, 陈德华, 张祥

中国农业科学. 2022, 55(23):  4614-4625.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.004

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目的 明确Bt棉叶片Cry1Ac毒蛋白含量对昼夜变温下高温干旱胁迫响应及其生理机制，为生产中Bt棉抗虫性的安全稳定利用提供参考。方法 2019—2020年在扬州大学农学院，以常规种泗抗1号（SK-1）和杂交种泗抗3号（SK-3）为材料，以温度和土壤水分含量为因子，温度分别设为34℃（白天，7：00—19：00）/28℃（夜间，19：00—7：00）（A1）、38℃/28℃（A2）；土壤水分含量分别为田间土壤最大持水量的50%（B1）和60%（B2），并以32℃/28℃、田间土壤最大持水量的75%为对照（CK）。各处理分别持续4、7、10 d（DAS）。结果 不同处理导致叶片中Cry1Ac毒蛋白含量降低，且随着胁迫时间的延长，下降幅度增加。处理间相比，A1B2处理下降幅度最少，7 DAS后开始显著低于CK；A1B1处理下降幅度其次，4 DAS后显著低于CK；A2B1、A2B2处理在4 DAS显著下降。可溶性蛋白（SP）含量、硝酸还原酶（NR）、谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）、谷氨酰胺合成酶（GS）、游离氨基酸（aa）和谷氨酸合成酶（GOGAT）等活性变化趋势与毒蛋白一致，且呈极显著正相关，而Bt基因表达量、单宁含量、蛋白酶、肽酶活性则呈上升趋势。逐步回归和通径分析筛选出NR、GPT、GS等3个关键指标可反映Bt棉Cry1Ac毒蛋白含量高低，且三者对Cry1Ac毒蛋白含量有较大的正效应。结论 昼夜变温下高温和干旱互作导致Bt棉Cry1Ac毒蛋白含量降低，且随持续期延长下降幅度逐渐增大。其中34℃/28℃和田间土壤最大持水量60%胁迫7—10 d内与对照无显著差异。但与昼夜持续高温相比，昼夜变温的高温胁迫下Cry1Ac毒蛋白含量下降幅度减小和时期明显推迟。NR、GPT、GS是决定Cry1Ac毒蛋白含量高低的关键指标。

植物保护

中国野生毛葡萄转录因子VqWRKY6与VqbZIP1互作调控抗白粉病功能分析

张洁, 姜长岳, 王跃进

中国农业科学. 2022, 55(23):  4626-4639.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.005

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目的 欧洲葡萄作为世界葡萄主栽品种，具有产量高、品质佳的优点，但对病害抵抗能力差。白粉病是严重危害葡萄栽培的一种真菌性病害，中国野生葡萄资源丰富，可为抗病育种提供充足种质资源。论文旨在筛选调控抗白粉病的葡萄转录因子基因，探究转录因子基因调控抗白粉病的作用机理，为选育葡萄抗病品种提供优质的基因资源。方法 从中国野生毛葡萄‘商-24’中克隆得到转录因子基因VqWRKY6，使用DANMAN和MEGA-X软件对序列进行分析。利用PEG介导转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析发挥转录调控作用的位置，利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明VqWRKY6能够和转录因子VqbZIP1互作形成转录复合体。以感病葡萄‘赤霞珠’叶片为试材，通过农杆菌介导法瞬时转化到‘赤霞珠’葡萄叶片，叶片进行白粉菌（Uncinula necator）接种后，观察发病症状，用台盼蓝染色在显微镜下观察菌丝发育进程，使用DAB染色观察活性氧积累，比较共同过表达VqWRKY6和VqbZIP1的葡萄叶片、单独过表达VqWRKY6的葡萄叶片、单独过表达VqbZIP1的葡萄叶片和对照组叶片的差异。使用实时荧光定量PCR技术对抗病基因在白粉菌诱导下的表达水平进行分析。结果 VqWRKY6定位于葡萄2号染色体，编码342个氨基酸，属于WRKY家族的group Ⅲ亚家族。亚细胞定位和酵母转录激活试验证明，VqWRKY6在细胞核内发挥转录调控功能且在酵母中有转录激活活性。‘赤霞珠’叶片共同过表达VqWRKY6和VqbZIP1后，叶片表面白粉菌菌丝扩繁速率显著慢于单独过表达VqWRKY6和单独过表达VqbZIP1的叶片，共同过表达VqWRKY6和VqbZIP1的叶片组织中活性氧含量显著高于单独过表达VqWRKY6和单独过表达VqbZIP1的叶片；此外，VqWRKY6和VqbZIP1的协同调控能够激活茉莉酸（JA）途径的PR3、PR4，基因表达量显著上调。结论 VqWRKY6和VqbZIP1协同作用可能通过激活JA抗病途径，促进活性氧产生，增强抗病基因表达，抑制白粉菌的生长，从而提高葡萄对白粉病的抗性。因此，中国野生毛葡萄‘商-24’是重要的抗病种质资源，而VqWRKY6与VqbZIP1可作为重要的抗病基因资源。

陌夜蛾性信息素类似物的合成及其生物活性

任梓齐, 康玉洁, 李海珍, 王连刚, 马好运, 李慧, 王留洋, 梅向东, 宁君

中国农业科学. 2022, 55(23):  4640-4650.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.006

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背景 陌夜蛾（Trachea atriplicis）作为一种重要食叶害虫，近年来，由于其数量以及危害程度的不断增加，已对我国华北、华东等地区的农林业造成重大危害，尤其是对荞麦等作物的产量构成严重威胁。目的 以陌夜蛾性信息素主要组分顺-11-十六碳烯乙酸酯（Z11-16:Ac）为母体结构，合成6种具有不同生物活性的性信息素类似物，为陌夜蛾的综合治理开辟一种新型环境友好的防治策略。方法 选用性信息素组分的前体顺-11-十六碳烯-1-醇（Z11-16:OH）为原料，在缚酸剂和催化剂的作用下，与酸酐或酰氯发生反应，通过硅胶柱层析进行分离纯化后，合成性信息素类似物共6种。包括极性基团为氨基甲酸酯的性信息素类似物M3、M4，极性基团末端引入不饱和键的性信息素类似物M5、M6，以及卤素原子修饰的性信息素类似物M7、M8。通过触角电生理试验（EAG）测定不同剂量性信息素类似物直接刺激下的EAG响应值，并于北京市延庆区进行田间试验对性信息素类似物的生物活性进行验证。结果 EAG试验表明，类似物M1、M2、M6、M7和M8具有显著的剂量-效应关系。其中陌夜蛾雄蛾触角对类似物M7的响应最为强烈，在100 μg剂量下响应值达2.36 mV，是同剂量条件下Z11-16:Ac响应值的77.9%。而M3—M5在10—1 000 μg剂量下，与性信息素组分Z11-16:Ac的相对响应值之间存在显著差异（P<0.05），M5的EAG响应整体活性表现较差，最高相对响应值仅为性信息素组分的21.2%。田间试验表明，类似物M1和M5在添加剂量为1 μg时，平均诱捕量分别为38.00和35.67头/诱捕器/15 d，与性信息素对照相比存在显著差异；类似物M7在添加剂量为100 μg时，平均诱捕量为29.67头/诱捕器/15 d，显著高于性信息素对照；类似物M4具有潜在的抑制活性，随着其添加剂量的增加，平均诱捕量逐渐减少，当添加剂量为1 000 μg时，平均诱捕量仅有3.33头/诱捕器/15 d。 结论经过EAG试验和田间试验验证，类似物M1、M5和M7具有显著的增效活性，可以用作性信息素的增效剂，类似物M4具有显著的抑制活性，可以用作性信息素的抑制剂。研究结果可为使用性信息素类似物绿色防控陌夜蛾提供理论依据。

土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境

水稻油菜轮作下稻草还田和钾肥对土壤团聚体及钾素分布的影响

刘淑军,李冬初,黄晶,刘立生,吴丁,李照全,吴远帆,张会民

中国农业科学. 2022, 55(23):  4651-4663.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.007

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目的 通过田间定位试验探究水稻-油菜轮作和水稻-冬闲模式下不同施肥措施对稻田土壤团聚体特性及团聚体钾素分布的影响，为我国南方水旱轮作区钾素资源可持续利用提供依据。方法 利用始于2016年不同轮作模式钾肥定位试验，选取CK（F）（不施肥和冬闲）、NPK（F）（氮磷钾肥和冬闲）、NPK（R）（氮磷钾肥和冬种油菜）、NPK（SR+R）（氮磷钾肥配稻草还田和冬种油菜）、NP50%K（SR+R）（氮磷减钾50%配稻草还田和冬种油菜）5个处理，在试验第3年（2019年）于油菜收获后取0—20 cm土层土样，分析土壤团聚体组分以及团聚体组分中交换性钾和非交换性钾含量变化，并进一步探讨土壤团聚体稳定性及团聚体组分中钾素的分布规律。结果 （1）所有处理均以<0.053 mm团聚体组分最高。与NPK（F）相比，NPK（R）处理提高了1—2、0.5—1、0.25—0.5 mm团聚体的比例，增幅为26.2%—82.6%，土壤团聚体的稳定性增加，>0.25 mm团聚体组分比例、平均重量直径（MWD）和平均几何直径（GMD）显著提高了30.6%、31.2%和82.0%。水稻-油菜轮作模式下，稻草还田配施化肥（NPK（SR+R））比施化肥处理（NPK（R））显著提高了>2 mm团聚体比例，增幅为69.7%。（2）所有处理土壤各团聚体组分中交换性钾含量随团聚体粒级的减小逐渐降低，水稻-油菜轮作模式下，稻草还田配施化肥（NPK（SR+R））比施化肥处理（NPK（R））显著提高了所有粒级团聚体组分的交换性钾含量，增幅为22.2%—46.0%。相比较NPK（SR+R），减钾处理（NP50%K（SR+R））显著降低了>0.5 mm团聚体中交换性钾的含量，降幅为19.4%—20.6%。与水稻-冬闲下的化肥处理（NPK（F））相比，水稻-油菜轮作下3个施肥处理均降低了团聚体中的非交换性钾含量。（3）所有处理以<0.053 mm团聚体中钾对全土钾的贡献率最高。水稻-油菜轮作（NPK（R））比水稻-冬闲（NPK（F））显著提高了1—2和0.5—1 mm团聚体中钾对全土钾的贡献率，增幅分别为82.6%、52.1%（交换性钾）和105.5%、36.9%（非交换性钾）。结论 水稻-油菜轮作可提高MWD、GMD、大团聚体比例和大团聚体中钾对全土钾的贡献率，改善土壤结构。在该轮作模式下稻草还田配施化肥可提高所有粒级团聚体中交换性钾含量，改善稻田土壤钾素供应，但水稻-油菜轮作因需钾量高而降低了团聚体中的非交换性钾含量，应适当增加钾肥投入。

不同肥力棕壤玉米根茬和茎叶残体碳氮的固定特征

李佳燕,孙良杰,马南,王丰,汪景宽

中国农业科学. 2022, 55(23):  4664-4677.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.008

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目的 秸秆还田是增加土壤碳固定和改善土壤养分状况的重要措施之一。研究玉米不同部位残体碳、氮在土壤中的固定特征，明确秸秆还田的土壤增碳培肥机制。方法 以沈阳农业大学棕壤长期定位试验站为平台，采集不施肥和有机肥配施化肥处理的土壤分别作为低肥力（LF）和高肥力（HF）土壤，并分别与¹³C和¹⁵N双标记的玉米茎叶（S）、玉米根茬（R）混合，在25℃条件下进行室内培养试验。试验于第1、30、60、180和360 天取样并测定土壤总有机碳（SOC）、全氮（TN）含量及其同位素丰度，分析玉米不同部位残体碳、氮在不同肥力水平土壤中的固定特征。结果 添加玉米残体显著提高土壤SOC，一年后仍能提高14.0%。添加玉米残体后，土壤系统中有一小部分氮素可能以反硝化方式流失，且外源玉米残体氮和土壤原有老氮均有损失。与添加根茬相比，添加茎叶更有利于外源新碳、氮的增加，而且具有更强的激发老碳、氮分解/损失的效应，不利于土壤老碳、氮的固持；根茬残体则更趋向于被分解，使土壤老碳、氮得到相对的保护和固定。外源残体碳虽然在低肥力土壤中的固定较少，但是对低肥力土壤碳库的提升具有更大的贡献。添加残体后低肥力土壤的C/N和¹³C/¹⁵N（代表土壤中来自于外源残体的C/N）显著高于高肥力土壤。但本研究结果表明¹³C/¹⁵N并不是限制低肥力土壤中残体分解和固定的主要因素，其主要原因可能在于底物长期选择条件下的特异性土著土壤微生物群落较为稳定，对于外源有机质加入的干扰具有抵抗力造成的。结论 土壤中添加玉米不同部位残体均可显著提高土壤碳、氮水平，但其内在的残体新碳/氮和土壤老碳/氮的固定策略相异。低肥力土壤较高肥力土壤对外源碳的固定少，其对不同部位残体的固定在本研究中并不受到来自于外源残留残体C/N的影响。

我国三个典型流域人类活动净氮输入量估算及其影响因素

张天鹏,闫铁柱,金平忠,雷秋良,连慧姝,李影,李晓虹,区惠平,周脚根,杜新忠,武淑霞,刘宏斌

中国农业科学. 2022, 55(23):  4678-4687.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.009

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目的 人类活动氮素过量投入是引起面源污染的重要原因之一。阐明人类活动净氮输入量的时空分布特征及其影响因素，为解决面源氮素污染问题提供数据支持。方法 利用人类活动净氮输入量（net anthropogenic nitrogen input，NANI）模型，通过统计年鉴和文献综述获得NANI相关数据和参数，对农业化的香溪河流域、城镇化的太湖流域和全面推进农业绿色发展模式的洱海流域的净氮输入量进行评估。结果 从NANI强度上看，3个典型流域NANI平均值按照大小排序为：太湖流域（13 241 kg·km^-2·a^-1）、香溪河流域（2 183 kg·km^-2·a^-1）、洱海流域（1 582 kg·km^-2·a^-1）。从来源上看，氮肥施入（Nfer）和食品/饲料氮（Nim）是NANI最大来源，占比58%—97%，对NANI贡献从大到小排序为：氮肥施入、食品/饲料氮输入、氮沉降输入、作物固氮输入。从时间尺度看，2019年同2010年相比，香溪河流域NANI中食品/饲料氮输入比例下降23个百分点，氮沉降比例上升34个百分点；洱海流域NANI中氮肥施入比例下降86个百分点；太湖流域NANI中食品/饲料氮输入比例上升31个百分点，作物固氮量和氮沉降输入比例下降14个百分点和12个百分点。从影响因素上看，3个典型流域NANI与城镇人口密度均呈现显著相关性（P<0.05），且随城镇人口密度的增加NANI随之升高；耕地面积占比与NANI的拟合上，香溪河流域有显著影响（P<0.05），但洱海流域和太湖流域均无显著影响（P>0.05）。结论 香溪河流域中昭君镇、峡口镇和黄粮镇，洱海流域中下关镇、上关镇和凤仪镇，太湖流域中张家港市、嘉兴市秀城区、杭州市拱墅区和上海市南汇区是NANI的关键源区；以农业为主的香溪河流域化肥施入是NANI的主要来源；城镇化程度较高的太湖流域食品/饲料氮和肥料氮投入是NANI主要来源；农业绿色发展措施可显著减少人类活动净氮输入量。因此，在关键源区大力推广农业绿色发展措施，同时有效降低饲料和肥料的投入量，有利于控制农业面源污染。

园艺

人工疏果对‘爱媛28’橘橙果实糖酸含量及代谢基因表达的影响

宋江涛,谌丹丹,公旭晨,商祥明,李春龙,蔡永喜,岳建平,王帅玲,张卜芬,谢宗周,刘继红

中国农业科学. 2022, 55(23):  4688-4701.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.010

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背景 ‘爱媛28’橘橙是杂交柑橘品种（Citrus nanko × C. amakusa），因其优良的果实品质，受到人们的青睐。疏果是农业生产过程中常用的一种提高果实品质的技术，不仅能使果实体积明显增大，而且还能够增加果实可溶性固形物含量。但是，疏果增加果实可溶性固形物含量的具体机制仍然不清楚。目的 本研究以枳（Poncirus trifoliata）为基砧、椪柑（Citrus reticulata）为中间砧的4年生‘爱媛28’橘橙作为试验材料，探索疏果影响果实糖酸含量变化的具体机制。 方法 在‘爱媛28’果实幼果期进行疏果，每隔半个月左右测定疏果果实与未疏果果实的横纵茎，采样并测量单果重与糖酸含量，选择糖酸含量差异明显的时期测定糖酸代谢相关酶的活性及其对应编码基因的相对表达量。结果 疏果显著增加‘爱媛28’果实在生长中后期的横纵茎和单果重，显著加快果实柠檬酸含量的降解速度，但并未影响果实成熟时最终的柠檬酸含量；显著增加了果实的葡萄糖和蔗糖含量，但对果糖含量没有显著影响。疏果显著增强蔗糖代谢过程中的蔗糖合成酶SSⅡ（合成方向）、蔗糖合成酶SSⅠ（分解方向）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和柠檬酸分解代谢过程中的胞质顺乌头酸酶（Cyt-ACO）、胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDH）和谷氨酰胺合成酶（GS）的活性。疏果显著促进蔗糖代谢过程中CitSS3在早期的相对表达量和CitSPSs在所有时期的相对表达量，以及柠檬酸分解代谢过程中CitACO3、CitNADP-IDH1、CitACLα1/β、CitGAD1和CitGSs在早中期的相对表达量。结论 人工疏果主要通过增强蔗糖合成代谢过程中蔗糖磷酸合成酶的酶活来促进果实可溶性糖的积累，提高柠檬酸分解代谢过程中相关酶的活性和基因表达水平，加快柠檬酸降解，从而在提升果实品质中发挥重要作用。

桃XTH家族基因鉴定及其在桃果实贮藏过程中的表达特性

郭绍雷, 许建兰, 王晓俊, 宿子文, 张斌斌, 马瑞娟, 俞明亮

中国农业科学. 2022, 55(23):  4702-4716.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.011

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目的 通过桃木葡聚糖内糖基转移/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）基因家族鉴定与不同肉质桃贮藏过程中相关基因的表达分析，发掘PpXTHs家族成员中参与桃果实软化的重要候选基因，为深入解析PpXTHs在果实采后贮藏过程中的功能研究奠定基础。方法 根据XTH蛋白保守结构域Glyco_hydro_16 domain和XET_C domain，利用Hmmer 3.1软件对桃蛋白质数据库进行搜索，鉴定桃XTH基因家族成员；利用在线软件ProtParam预测其分子量、理论等电点等理化性质；利用在线分析工具Plant-mPLoc预测其亚细胞定位；MEGA11软件构建系统进化树；运用在线工具MEME对其保守motif进行分析，Tbtools呈现蛋白保守结构域和基因结构图谱；MapChart软件绘制基因在染色体上的分布图；利用实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)技术检测PpXTHs在不同肉质桃贮藏过程中的表达特性。结果 在桃基因组共鉴定XTH基因家族成员27个，分布在7条染色体上。系统进化树显示，PpXTHs家族成员可分为祖先类群、Ⅰ/Ⅱ亚家族以及ⅢA和ⅢB亚家族。蛋白结构域分析显示所有PpXTHs成员均含有Glyco_hydro_16和XET_C两个蛋白保守结构域。qRT-PCR结果表明，属于ⅢB亚家族的PpXTH33随着溶质桃贮藏期延长，表达量上调，且表达量显著高于同期硬质桃贮藏过程的表达水平；PpXTH33克隆测序结果显示其CDS序列与桃参考基因组一致，长度为924 bp，编码307个氨基酸；激光共聚焦显微镜观察发现PpXTH33与GFP融合蛋白可能主要于细胞壁与细胞核上产生绿色荧光信号。结论 桃27个PpXTHs家族成员蛋白结构均含有2个XTH蛋白保守结构域，不均匀分布在7条染色体上。PpXTHs在溶质桃和硬质桃贮藏过程中的表达特性显示，PpXTH33与桃采后果实软化密切相关。

低O₂/高CO₂气调结合1-MCP对‘玉露香’梨贮藏品质的影响

贾晓辉, 张鑫楠, 刘佰霖, 马风丽, 杜艳民, 王文辉

中国农业科学. 2022, 55(23):  4717-4727.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.012

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目的 明确低O₂/高CO₂对玉露香梨贮藏期保绿效果及品质维持的效果，为生产上延长‘玉露香’梨贮藏寿命提供理论依据与技术支撑。方法 分别将商业成熟的‘玉露香’梨进行1.0 μL·L^-1 1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）处理，1% O₂、3% CO₂气调（controlled atmosphere，CA）贮藏以及1.0 μL·L^-1 1-MCP结合1% O₂、3% CO₂气调贮藏，以普通冷藏为对照，分别于贮藏210和240 d及货架7 d时，测定果皮颜色、叶绿素含量、果实硬度、可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸等果实外观和内在品质指标，采用气相色谱法检测果实乙醇、乙醛含量以及乙烯释放量和呼吸强度，调查并计算果柄、果心褐变指数。结果 与普通冷藏相比，1-MCP、CA以及CA+1-MCP均可使‘玉露香’梨果实外观保持较好的绿色，有效减轻果面油腻化程度，在冷藏240 d及240+7 d货架时，CA+1-MCP对果皮绿色维持及油腻化控制效果更明显。1-MCP和CA均可抑制果实硬度、可溶性固形物和可滴定酸的下降，CA可抑制果心和果柄褐变，但CA降低了果实抗坏血酸含量，CA+1-MCP减缓了CA对果实抗坏血酸的破坏作用。CA+1-MCP对乙醇和乙醛的抑制作用在贮藏240 d时效果更明显，且20 mg·L^-1的乙醇含量在‘玉露香’梨耐受阈值以下。CA+1-MCP和1-MCP对果实乙烯释放量具有较好的抑制效果；240 d时，CA+1-MCP和CA对果实呼吸强度的抑制效果好于1-MCP。结论 ‘玉露香’梨较耐低O₂和高CO₂，CA+1-MCP对‘玉露香’梨的保鲜效果体现在210 d以后。因此，冷藏期在210 d以内，采用1.0 μL·L^-1的1-MCP处理；而冷藏期210 d以上，则需1% O₂、3% CO₂的低O₂/高CO₂的CA结合1.0 μL·L^-1的1-MCP处理，可保持果实较好的外观和内在品质。

食品科学与工程

基于TMT定量蛋白质组学揭示纳米包装双孢蘑菇采后冷藏生理代谢规律

王朝,方东路,张攀容,姜雯,裴斐,胡秋辉,马宁

中国农业科学. 2022, 55(23):  4728-4742.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.013

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背景 双孢蘑菇采后极易发生开伞、失水及褐变等品质劣变现象，极大地影响了其贮藏品质和商业价值。前期研究已证实纳米包装可有效延缓双孢蘑菇采后的品质劣变，但其保鲜机制仍不清晰。目的 本研究通过串联质谱标记（TMT）定量蛋白质组学技术，对纳米包装和普通聚乙烯包装的双孢蘑菇贮藏期间的差异表达蛋白进行分析，进一步探究纳米包装保鲜双孢蘑菇的作用机制。方法 以双孢蘑菇为研究对象，用纳米包装对其进行保鲜，并以普通聚乙烯包装作为对照。对贮藏期间双孢蘑菇进行蛋白提取和胰蛋白酶解，并通过TMT标记及液相色谱串联质谱检测，筛选出差异表达蛋白，结合生物信息学分析，研究差异蛋白所参与的主要代谢途径，同时利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术，在基因层面验证差异蛋白的表达水平。 结果 纳米包装有效维持了双孢蘑菇的外观品质，并且延缓了细胞膜透性的增加。随着贮藏时间的增加，两组包装的差异蛋白数目增多，在贮藏中期（6 d）和贮藏末期（10 d），差异蛋白分别达到62个和148个，其中纳米包装和普通包装有共同差异蛋白22个。结合生物信息学分析，发现这些差异蛋白主要与能量代谢和脂代谢等功能途径相关。对脂代谢途径进行重点分析，结果显示纳米包装对双孢蘑菇的膜脂代谢具有调控作用，相较于普通包装组，纳米包装组的脂肪酸合成酶、磷酸胆碱孢苷酰转移酶和磷脂酸磷酸酯酶呈上调趋势，同时下调了膜脂降解关键酶如磷脂酶D和脂肪酶的活性；从基因水平上来看，编码这些蛋白的基因表达与组学结果相一致。 结论 利用TMT定量蛋白质组学技术，能对不同包装双孢蘑菇贮藏期间的差异蛋白进行筛选和分析。纳米包装调节了双孢蘑菇的膜脂代谢，抑制了膜脂降解相关酶的表达，有效延缓了细胞膜透性的增加，维持了细胞膜结构和功能，进而延缓双孢蘑菇贮藏期间的品质劣变。

畜牧·兽医

二花脸公猪不同耐冻性精子的蛋白质组学分析

童世锋,任智彬,林斐,葛雨竹,陶景丽,刘杨

中国农业科学. 2022, 55(23):  4743-4752.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.014

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目的 二花脸猪是我国优良的地方猪种之一，冷冻精液可提高二花脸公猪的利用率，并加强其种质资源保护，但目前生产的二花脸猪冷冻精液基本不能满足生产需要。研究通过分析二花脸公猪不同耐冻性精子的蛋白质组学，以促进二花脸公猪精子耐冻性蛋白质标志物的筛选，从遗传水平分析精子耐冻性的影响因素，为提高精子耐冻性提供参考依据。方法 通过冻存14头二花脸种公猪的精液，再对冷冻精液的冻后质量进行分析，根据精子冻后活率和冻后活力的高低筛选出耐冻性好和差（good freezability ejaculates, GFE和poor freezability ejaculates, PFE）的公猪各3头，利用串联质谱标记(tandem mass tag, TMT)技术对GFE组和PFE组的精子蛋白进行定量蛋白质组学分析，鉴定出GFE组和PFE组精子中的差异蛋白(differentially abundant proteins, DAPs)。利用GO富集分析对差异蛋白的功能进行注释，利用 KEGG富集分析对差异蛋白的生物通路进行注释，通过STRING蛋白质互作数据库进行差异蛋白的互作网络分析并利用Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。结果 研究发现GFE组和PFE组间共存在138个差异蛋白，PFE组与GFE组相比,有109个DAPs上调，29个DAPs下调。GO富集分析表明，共124个DAPs富集到47个GO term，主要富集到“细胞进程”“单有机体过程”“分子结合”“细胞”“细胞组分”等GO term。KEGG富集分析表明，DAPs主要富集到“肾素-血管紧张素系统”“补体和凝血级联”“血小板活化”等通路。从PPI网络可见53个节点和69 条连接边线，有8个具有强互作关系的蛋白ALB、ACRBP、ACR、ZAN、ZPBP2、HSPA5、FGB、FGG，这些蛋白质的功能主要富集于“单受精”“有性生殖”“精细胞发育”等与动物生殖生理以及精子发生密切相关的功能。进一步分析表明，GFE组和PFE组间的DAPs主要包括氧化还原相关蛋白（GSTM3、PRDX5、ALB、PDIA1、PDIA4等）、精子发生与功能相关蛋白（HSPA5、MFGE8、DNAH1、DNAH7、CUL3等）、能量相关蛋白（HK1、PGM1等）以及凋亡与炎症相关蛋白（THBS1、ELSPBP1、CP等）；PPI网络图分析可知3个DAPs（MME、ANPEP和PRCP）在肾素-血管紧张素系统（RAS）中相互作用。结论 二花脸公猪不同耐冻性精子的蛋白质组分存在明显差异，可能对精子的冷冻性能产生影响，这些DAPs可作为精子耐冻性的候选蛋白标志物。

基于全基因组重测序的山羊产羔数性状关键调控基因的筛选

李恒,字向东,王会,熊燕,吕明杰,刘宇,蒋旭东

中国农业科学. 2022, 55(23):  4753-4768.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.015

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目的 对产羔数不同的山羊进行全基因组重测序分析，挖掘参与调控川中黑山羊产羔数性状关键调控基因，为解析山羊产羔数性状遗传机制及分子遗传改良提供理论依据。方法 选择6只产4—6羔的川中黑山羊为高繁组（high fecundity, HF）和6只产单羔的川中黑山羊为低繁组（low fecundity, LF），采集颈静脉血液样本提取基因组DNA，构建350 bp双末端测序文库，利用Illumina HiSeq PE150平台对12个文库进行全基因组重测序。测序产出的净数据经BWA软件比对至山羊参考基因组ARS1，所获得的高质量SNPs通过两种全基因组扫描分析方法（Fst、Hp）的综合分析确定候选区域，候选区域的注释基因分别利用g:Profiler和KOBAS在线数据库进行GO分析与KEGG通路分析，以筛选调节川中黑山羊产羔数性状候选基因。为了进一步鉴定调节山羊产羔数目的关键遗传标记，根据基因组重测序变异分析，对繁殖候选基因的同义与非同义SNPs进行定位筛选，后续将12个山羊样本的扩增产物进行Sanger测序以验证重测序结果。结果 12只山羊共获得431.50 Gb 净数据，经变异检测与注释发现，HF组山羊共发现7 771 417个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)，LF组山羊检测到8 935 907个SNPs，且LF组各类SNPs 均多于HF组。设置同时达到top 5%最大ZFst值和top 5%最小ZHp值的窗口为候选区域，在低杂合性、高遗传分化的区域共注释130个强选择信号，其中HF组、LF组以及共享窗口的注释基因分别为84、59和13个，经GO富集与KEGG通路分析发现，19个候选基因参与川中黑山羊的繁殖、繁殖过程和胚胎发育等调控，包括11个HF组特异性候选基因（ADCY10、DRD1、HS6ST1、IGFBP7、MSX2、NOG、NPHP4、PAPPA、PRLHR、TDRP和XYLT1），5个LF组特异性候选基因（ANXA5、IGF1、EDNRA、FANCL 和TAC1）和3个HF组与LF组共享窗口基因（AKR1B3、HDAC4和OPRM1）。同时，大多数GO分析，如G蛋白偶联受体活性、激素反应和神经肽信号通路等，都包含这19个候选基因。此外，14个HF候选基因有9个显著富集在代谢途径、神经活性配体-受体相互作用、糖胺聚糖-硫酸乙酰肝素/肝素的生物合成、钙离子信号通路、cAMP信号通路和叶酸生物合成等KEGG通路中（P<0.05）。19个繁殖候选基因中共有2个同义突变（MSX2 G771T，ADCY10 A4662G）与2个非同义突变（PRLHR G529A，DRD1 A281T），且仅定位于HF候选基因中。Sanger测序发现，MSX2、PRLHR和DRD1突变位点均可检测到多态性，与基因组重测序结果一致，其中PRLHR G529A多态性导致第177位丙氨酸突变为苏氨酸，DRD1 A281T多态性导致翻译提前终止。结论 本研究共发现11个HF组特异性候选基因，推测是川中黑山羊多羔性状的关键调控基因，PRLHR外显子G529A与DRD1外显子A281T突变可能是调控山羊多羔性状的关键遗传标记，在改良山羊繁殖性能方面具有较大的应用价值。

鸡Wnt3a的SNPs筛选及其与皮肤毛囊密度性状关联分析

屠云洁,姬改革,章明,刘一帆,巨晓军,单艳菊,邹剑敏,李华,陈智武,束婧婷

中国农业科学. 2022, 55(23):  4769-4780.  doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.016

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目的 Wnt信号通路在动物皮肤毛囊的发生发育中具有重要作用, 前期研究结果表明Wnt3a可能是影响鸡皮肤毛囊密度性状的重要候选基因。为进一步验证Wnt3a在皮肤毛囊生长发育中的作用, 研究以金陵花鸡为研究对象, 筛选Wnt3a SNPs, 并分析其与毛囊密度性状的相关性, 以期找到对皮肤毛囊密度有显著影响的分子标记, 为培育屠体美观的屠宰型肉鸡的“分子编写育种”提供参考。方法 采用PCR扩增直接测序法对Wnt3a 的SNPs位点进行筛查, 分析单个SNP标记与皮肤毛囊密度性状的相关性。采用Haploview软件分析这些SNP位点的连锁不平衡（LD）程度, 并分析不同单倍型组合与毛囊密度性状的相关性。结果 共发现14个SNP位点, 在第2外显子发现1个SNP位点（SNP1）, 为同义突变；第2内含子发现4个突变位点（ SNP2—SNP5）, 在第3内含子发现9个SNP位点（SNP6—SNP14）。卡方检验表明, 第2外显子的1个突变位点（SNP1）和第2内含子的3个突变位点（SNP3—SNP5）的3个位点均处于哈代-温伯格平衡状态（P>0.05）, 第3内含子的9个SNPs（SNP6-SNP14）偏离哈代-温伯格平衡（P<0.05）。SNP1—SNP5的He均小于0.50, PIC均小于0.25, 这5个SNP位点遗传多样性较低。第3内含子的9个突变位点, SNP6、SNP7、SNP9位点PIC<0.25, 其他6个突变位点 0.25< PIC<0.5, 为中度多态。单标记关联分析表明, 公、母鸡SNP2位点的AG基因型的毛囊密度显著高于GG基因型（P< 0.05）；母鸡SNP8位点的AA与GG基因型的毛囊密度显著高于AG基因型（P < 0.05）, 在公鸡中3种基因型的毛囊密度差异不显著。14个SNPs连锁不平衡分析表明, SNP3、SNP4和SNP5的强连锁产生了2种单倍型, H1（GAT）频率为0.882和H2（TCC）频率为0.118；SNP6—SNP13之间的强连锁产生了5种单倍型, 其中H1（ACATTATC）和H2（ACGTCCCA）, H3（ACGTTCCA）, H4（GTGCTATA）, H5（ACGTCCCC）, 单倍型频率分别为0.469、0.275、0.123、0.113、0.014。SNP3、SNP4和SNP5连锁产生的2 种单倍型组合后产生了3种单倍型组合, 关联分析发现在公、母鸡中3种单倍型组合的毛囊密度均差异不显著；将SNP6—SNP13连锁产生的5种主要单倍型组合后, 公鸡有7种组合单倍型组合, 毛孔数量差异不显著；母鸡有8种主要单倍型组合, 其中H1H1（AACCAATTTTAATTCC）毛囊密度最大。SNP2和SNP8位点与皮肤毛囊密度显著相关, 单倍型组合H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）为母鸡优势单倍型。结论 筛选到Wnt3a的14个SNPs位点, 其中, SNP2（rs2587721 G >A）和SNP8（rs2555967G>A）位点与毛囊密度显著相关, 8个SNPs（SNP6—SNP13）位点处于强连锁不平衡, 母鸡H1H1单倍型毛囊密度最大。Wnt3a的SNP2和SNP8位点的单倍型组合H1H1（AGAA）、H1H2（AGAG）和SNP6—SNP13连锁产生的H1H1（AACCAATTTTAATTCC）单倍型组合与母鸡毛囊密度显著相关, 可以为鸡毛囊密度“分子编写育种”提供重要遗传信息。